CN106267414B - 艾滋病免疫净化器 - Google Patents

Abstract

一种用于医学领域的艾滋病免疫净化器，其特征在于制备能分离血细胞和血浆的分离器，制备HIVgp120和gp41抗体以及结合羊抗Ig的HIVgp120和gp41抗体，以外源基因转染构建CD4+T细胞株并以其表面特有分子抗体为生长刺激剂扩增，以上制备物配制于琼脂凝胶，以高生物相容性材料包裹而成净化器，使凝胶从上到下形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布，其中与羊抗Ig结合和未结合的gp120及gp41抗体、CD4+T细胞均被固定在琼脂凝胶中起吸附HIV的作用，所制净化器与分离器及调控程序组合使用，体外循环中的血液被分离器分成血浆和血细胞，血浆经净化器滤除HIV后与血细胞汇合，然后回输。

Description

艾滋病免疫净化器

技术领域

本发明涉及医学领域中艾滋病免疫净化器的制备及应用，主要用于艾滋病患者血浆艾滋病毒的清除，从而达到治疗艾滋病的目的。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

HIV进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。HIV的gp120与CD4受体结合可直接激活受感染的细胞凋亡，甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起CD4+细胞的大量破坏，结果造成以CD4+T细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力。HIV进入宿主CD4+细胞后也可以表现为长期潜伏而不表现出临床症状，其基因组RNA反转录成双链DNA，与病毒整合酶进入宿主细胞核内，在整合酶的作用下，双链DNA整合到宿主细胞基因组内，被整合的病毒DNA称为前病毒，可潜伏数月甚至多年不复制，造成AIDS数月至多年的潜伏期。在AIDS的潜伏期，HIV主要在淋巴结的巨噬细胞和树突状细胞内繁殖，这些细胞是体内的HIV贮存库，可释放至外周血或转染外周血中的CD4+T细胞，有丝分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激发HIV前病毒基因在感染的CD4+T细胞内转录复制。经大量增殖后，HIV病毒颗粒不断从被破坏的感染细胞释放并游离于血液，然后再进入新的CD4+T细胞，继续感染过程。

HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以仅依靠自身免疫功能无法将其清除。另外一个很重要的原因应该是，根据抗体杀灭、清除抗原的机理推测，免疫性抗体与抗原结合后，要产生免疫效应，要么通过激活补体，介导ADCC效应溶解细胞性抗原，但HIV不是细胞性抗原；要么通过趋化作用吸引吞噬细胞吞噬抗原，但HIV反而在吞噬细胞内被保护、增殖；要么抗体与抗原结合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原结构多变，往往使抗体难以识别。

从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染HIV的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)HIV整合酶抑制剂：通过抑制HIV病毒DNA与宿主细胞DNA整合而发挥作用，与HIV逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制HIV病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与CD4结合、阻断HIV与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于T淋巴细胞表面CC趋化因子受体5(CCR5)来阻断HIV进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节T细胞动态平衡。(6)HIV疫苗治疗：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：HIV基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、RNA诱饵、RNA干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入II期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调CD4+T细胞表面CCR5来降低HIV的易感性、延缓艾滋病的进展和减少HIV的扩散，中和单克隆抗体2G12、2F5和4E10应用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养HIV自体的CD4+T细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的CD4+T细胞数量，而回输CD4+T细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。

凝胶中抗原-抗体沉淀反应于1905年首先应用于研究利泽甘氏现象，1932年应用于鉴定细菌菌株，1946年Oudin在试管中进行免疫扩散试验，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分别建立了琼脂双向双扩散法，用于同时鉴定、比较两种以上抗原或抗体。凝胶中抗原-抗体沉淀反应的介质凝胶琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，这种沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡在免疫学上与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的那些分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。这样，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此种反应称为琼脂凝胶扩散，或琼脂扩散，或免疫扩散，其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，简称沉淀线或沉淀带。是目前用已知抗体检测未知量相应抗原的常规实验诊断项目，也是《中国药典》2010版中规定用于流感病毒疫苗血凝素含量检测的标准方法。通常将一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人Ig抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待检血清在琼脂板中向四周扩散，在抗原和抗体浓度比例合适处发生结合，形成肉眼可见的白色沉淀环而不再扩散。由此可见，当一种溶液通过半固体凝胶时，其中的大分子溶质就被分子筛作用的凝胶孔阻留在凝胶中，特别是其中的抗原能被预先固定在凝胶中的抗体结合而被吸附在凝胶中。所以，可根据琼脂凝胶扩散的原理，制备不同感染株的HIV抗体，将HIV抗体预先固定在凝胶中，当患者经体外循环分离出的血浆流经凝胶时，血浆中的HIV被预先固定在凝胶中的相应的抗体结合而阻留在凝胶中，同时因1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，也能阻留100～120nm的HIV，经如此抗体吸附和凝胶分子筛的作用，即可人工体外清除HIV。

CD4分子是HIV的受体，HIV易感于CD4+T细胞，CD4+T细胞是T淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，但某些T细胞特别是经永生化成细胞系(株)后可长期存活、无限扩增。国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Ad12-SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。国外研究还表明，导入外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对正常的生长特征。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型等。所以，可制备CD4+T细胞株，经大量扩增后，用于吸附、清除血浆中的HIV。

总之，各种药物及生物制品无法有效杀灭体内的艾滋病毒，且价格贵，副作用大，至今尚无治疗艾滋病的有效方法，已成为久攻不克的世界性难题。

发明内容

为了解决久攻不克的艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供艾滋病免疫净化器；另一目的是要提供艾滋病免疫净化器的制备及应用方法。

本发明的目的是这样实现的：制备能分离血细胞和血浆的分离器，制备HIVgp120和gp41抗体，再以gp120和gp41抗体为抗原制备羊抗gp120和gp41抗体，以外源基因转染构建CD4+T细胞株并以其表面特有分子抗体为生长刺激剂扩增，以高生物相容性材料包裹CD4+T细胞而制备能防止细胞及其碎片滤出并能为清除HIV提供场所的净化器，将gp120和gp41抗体以及羊抗gp120和gp41抗体混合，使羊抗gp120和gp41抗体被完全结合，但剩有高滴度的gp120和gp41抗体，将抗体以反向梯度滴度配入经100℃溶化后保温在39～42℃的梯度浓度的琼脂糖，按抗体滴度从低至高依次取琼脂糖加入净化器，待冷却至半固体凝胶后再加下一次，使净化器中的凝胶从上到下形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂浓度的分层分布，有利于血浆灌流及分子筛和免疫清除的作用，其中与羊抗HIV抗体结合和未结合的gp120及gp41抗体、CD4+T细胞均被固定在琼脂糖凝胶而起吸附HIV的作用，所制备的净化器进而与分离器及调控程序组合使用，体外循环中的血液被分离器分成血浆和血细胞，血浆经净化器滤除HIV后与血细胞汇合，然后回输。

本发明的技术核心由血浆分离器及净化器构成，其中血浆分离器用于分离血细胞和血浆，净化器中的净化剂由固定于琼脂凝胶的HIV抗体、与羊抗Ig结合的HIV抗体、CD4+T细胞株制成，其中与羊抗Ig结合的HIV抗体其结合物的分子量比未结合的HIV抗体分子量大，不易通过凝胶分子筛，以及所含羊抗Ig易与琼脂凝胶固定结合的特点，HIV抗体也随之更易被固定于琼脂凝胶，血浆中的HIV与被固定于琼脂凝胶的HIV抗体相遇时会发生结合反应而形成抗原抗体复合物，从而通过HIV抗体被固定于琼脂凝胶，因CD4+T细胞表面的CD4分子是HIV的受体而成为HIV的易感细胞，与HIV相遇时能吸附HIV，被吸附的HIV随CD4+T细胞被固定于琼脂凝胶，而且琼脂凝胶所形成的滤孔随着琼脂糖浓度的增高而减少，净化器进口处琼脂糖浓度低，滤孔就大，有利于血浆灌流及高滴度抗体或细胞与HIV的结合反应；而出口处浓度高，滤孔就小，易于阻留HIV或大分子结合物，净化器组合了多种特异和非特异的HIV清除成份，以免特种毒株因免疫差异所致的无效治疗，所以在体外循环中，血液被分离器分离出血浆和血细胞后，血浆流经净化器时其中的HIV被净化剂吸附而清除，净化后的血浆与血细胞汇合后回输，本发明以体外机械滤除HIV的方法替代长期以来无法有效杀灭HIV的常规体内抗逆转录药物治疗方法，实现了人工将HIV从体内机械清除的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的艾滋病免疫净化器的应用示意图。

图2是根据本发明提出的分离器的内部结构示意图。

图3是根据本发明提出的净化器的内部结构示意图。

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的净化器(8)、净化器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。

图2中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的血浆及化学成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是具有可开关阀门的血细胞出口。

图3中，1是游离的HIV，2、4分别为固定于琼脂凝胶(6)中的HIV抗体、CD4+T细胞，3、5分别为HIV与HIV抗体、CD4+T细胞结合后而被阻留在琼脂凝胶(6)中的结合物，7为被琼脂凝胶(6)分子筛阻留的较大体积的HIV。

下面结合图1、图2和图3，对本发明提出的艾滋病免疫净化器的实施方案作详细的描述。

一、艾滋病血液净化剂的制备

(一)CD4+T细胞株的制备

1、原代淋巴细胞的来源

有以下种途经：①用于科研保存的传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴细胞)；②购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；③从商家直接购买的T淋巴细胞系(株)；④用于科研保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；⑤直接取自HIV-1感染者的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)。

2、CD4+T细胞的制备

①主要试剂与仪器：CD4、CD8免疫磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；异硫氰酸荧光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴细胞分离液(上海恒信生化试剂有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％台盼蓝染色液(上海生工生物工程技术服务公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分离系统(德国美天旎生物技术有限公司)；EpicsXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)。②单个核细胞(PBMC)的分离(密度梯度离心法)：无菌取20mL血样(500IU/mL2mL肝素钠抗凝)；PBS液将血液稀释2～3倍，充分混匀后将6mL抗凝静脉血用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min，20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为PBMC，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另一50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min，20℃)10min，弃上清50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min，20℃)15min，弃上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重悬细胞，取15uL细胞悬液加入血球计数板上显微镜下计数4个大方格内的细胞(PBMC)总数。③CD4+T细胞和CD8+T细胞的分离纯化：PBMC细胞悬液均分至两个1.5mLEppendorf管，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清，重悬细胞每80uLBuffer含细胞数10⁷个，每10⁷个细胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混匀，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗涤细胞，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清500uLBuffer重悬细胞，将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500uLBuffer漂洗，将500uL细胞悬液通过分离柱，用500uLBuffer冲洗分离柱重复操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴细胞或非CD8+T淋巴细胞，自分离器中取出分离柱，用1000uLBuffer加压冲洗分离柱，收集流出液，此为CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞(细胞活力检测：细胞纯化前后分别取15uL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合，显微镜下观察不着色发亮者为活细胞，着色胀大者为死细胞，计算200个细胞中活细胞的百分比)。

3、体外扩增CD4+T细胞

有文献报道利用T细胞表面CD3分子的单克隆抗体作为细胞生长的刺激剂，大量培养艾滋病患者分离的T细胞后，作为自身治疗性细胞回输。但HIV也随着HIV感染细胞的培养繁殖而在胞内增殖，增量T细胞的回输也导致了增量HIV的回输。本发明以SV40和/或hTERT永生化CD4+T细胞，并以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂，大量扩增CD4+T细胞。

以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂的方法是：将抗CD3单抗(CD4+T细胞同时含有CD3分子)包被到培养板上刺激单个核细胞(淋巴细胞)生长，称为抗CD3抗体包被法，可获得很好的扩增效果，应用这种方法扩增的淋巴细胞已用于肿瘤的二期临床治疗并取得了一定的疗效。国外文献报道[Shimizu等]亦用此方法培养了5例晚期艾滋病患者的淋巴细胞，培养4周就可获得1000倍的扩增，且扩增的细胞群中CD4+/CD8+T均可大量扩增(CD4+T细胞更明显)。另一种是抗CD3/CD28双抗交联法，即将抗CD3/CD28双抗交联于滋珠上作为刺激剂培养HIV感染者外周血单个核细胞(淋巴细胞)，可以扩增大量的CD4+T细胞，并且扩增的CD4+T细胞具有对抗HIV感染的能力，其培养过程中病毒也低于检测水平，之后发现这可能与CD28提供了第二信号，选择性诱导分泌大量的Th1细胞因子和趋化因子有关，用此方法扩增的CD4+T细胞已用于HIV感染者的临床治疗回输，无风险但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T细胞的方法是：以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选的阳性重组子的克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT永生化的CD4+T细胞。

以SV40永生化CD4+T细胞的方法是：以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40永生化的CD4+T细胞。

①以hTERT永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)hTERT的提取：(i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于质粒pClneo-hTERT的EcoRI与SalI位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoRI与XhoI酶切位点。市售购买pCIneo-hTERT质粒，溶解于适量的超净H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uL H₂O，加限制性内切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液终止反应，按常规PCR法扩增hTERT后，收取扩增物以备电泳。(ii)hTERT电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面大约Imm，用适量的10×加样缓冲液制备hTERT酶切样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的标准对照物，接通电极，使hTERT向阳极移动，然后在1-10V/cm(80V)凝胶的电压下电泳至足够分离hTERT片段的距离时(30min)，关闭电源。(iii)hTERT纯化与回收：从琼脂糖中分离hTERT条带：在长波紫外光源下将含目标hTERT片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待hTERT全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层hTERT的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3MNaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得hTERT沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、hTERT滤膜插片法等将目的hTERT片段从凝胶中分离、纯化出来。

(II)hTERT与pLXSNneo载体的连接：取9μl上述纯化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μl10mmol/LATP、10ul Ligation Mix或大肠杆菌DNA连接酶、2ul pLXSNneo空载体混合，15℃温育24h，构建pLXSNneo-hTERT重组子。

(III)pLXSNneo-hTERT重组子的纯化、扩增、鉴定：(i)大肠杆菌感受态的制备：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。(ii)以感受态大肠杆菌纯化、扩增pLXSNneo-hTERT重组子：用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。(iii)筛选、扩增重组子：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL 70％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。(iv)重组质粒的鉴定与扩增：挑取平皿上的单菌落，接种于3ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃，250r/min摇床中培养，14h后收集培养物，4℃、10000r/min离心5min，按试剂盒说明书小量提取并纯化重组质粒；以EcoRI和HindIII双酶切重组质粒反应体系：限制性内切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重组质粒10ul、加水补足至20ul，37℃酶切1h。酶切产物于80V电压条件下进行0.8％琼脂糖电泳，时间30min，凝胶成像系统拍照；按常规测定重组质粒的序列；重组质粒经酶切、测序鉴定准确后，将含有该质粒的细菌接种至LB培养液中，扩增培养，按大剂量质粒抽提试剂盒说明书进行大剂量质粒抽提纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。

(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。

(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重组子导入T淋巴细胞及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将pLXSNneo-hTERT重组子溶于100μl无血清培养液中；管B，将20μlLipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下静置45min，用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，滴加至上述T淋巴细胞中，加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养至9-10周(约第75代)，仍处于对数生长期，即细胞增加数量与培养时间呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清后，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：(i)观察细胞形态：可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，具有淋巴母细胞化特征。(ii)观察细胞生长曲线：结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)检查染色体：通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，则说明该细胞系没有发生恶性转化；(iv)流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是hTERT整合、表达的结果。(vii)DNA序列测定：按常规测序仪检测，显示hTERT基因序列。(v)转染细胞DNA中hTERT检测：如以免疫组织化学检测，hTERT转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明hTERT已整合入细胞内；(vi)mRNA表达产物测定：取100μl体系的PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。

(VIII)hTERT介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1 200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的永生化CD4+T细胞库备用。

②以SV40永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)SV40大T抗原DNA的提取：(i)SV40DNA酶切：从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uLH₂O，加限制性内切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应以备电泳。(ii)SV40DNA电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的10×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。(iii)从琼脂糖中分离约2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、DNA滤膜插片法等将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化出来。

(II)SV40大T抗原DNA与pcDNA3.1基因载体的连接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×连接缓冲液、1μl 10mmol/L ATP、T4DNA连接酶(20～500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1空载体混合，15℃温育24h，构建成SV40T/pcDNA3.1重组子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定：(i)大肠杆菌感受态的制备：其基本方法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl₂制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，应在每管中加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。(ii)重组子的筛选、扩增与提取：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL 70％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。(iii)重组子的鉴定：上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含重组子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。

(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，-般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的导入及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将SV40T/pcDNA3.1溶于100μl无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)中；管B，将20μlLipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45min。用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，再滴加至上述T淋巴细胞中，然后加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养约6-8周(约第55代)，仍处于对数生长，即培养时间与细胞增加数量呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞。因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡。方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5～10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：(i)观察细胞形态：可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，具有淋巴母细胞化特征。(ii)观察细胞生长曲线：取生长较好的转染细胞，制成细胞悬液，经计数，分别取1.4×10⁴细胞接种于30个含15FBS低糖DMEM培养基培养瓶。每天取2瓶细胞进行计数，计算均值，连续观察直至细胞数量明显下降，培养3天后每隔2天给未计数的细胞换液，采用同样方法观察转染细胞在hepato ZYME-SFM无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)检查染色体：通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如没有，说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是：按5mL培养液中加入预热的250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时，经离心、去上清液、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型；(iv)流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是SV40大T抗原整合、表达的结果。(viii)DNA序列测定：按常规测序仪检测，显示SV40大T抗原DNA序列。(v)转染细胞DNA中SV40大T基因检测：如以免疫组织化学检测，SV40转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入细胞内；也可用RT-PCR法检测T抗原在细胞中的表达，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAAATG CCA TCT AGT GAT-3’；扩增产物长度为268bp，扩增条件为94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循环；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，扩增体系为50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物浓度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl；实验组以第19代细胞的cDNA为模板(参照市售cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，产物-20℃保存)；阴性对照设两个，分别以无菌水、原代细胞的cDNA做模板，阳性对照以SV40 DNA为模板(参照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA，因为SV40病毒无包膜，不使用SDS破膜，取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20℃保存备用)；(vi)mRNA表达产物测定：T抗原mRNART-PCR产物测序：取100μl体系的扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。

(VIII)SV40LT基因介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的CD4+T细胞库备用。

(4)与CD4+T细胞相似功能颗粒的制备：可将CD4分子、基因重组的CD4分子及类似功能的分子通过常规化学偶联、交联、亲和吸附等固定于载体上制成包被有CD4分子的颗粒，或直接取用功能相似的颗粒替代CD4+细胞应用。本发明的CD4+T细胞代表其他CD4+细胞，包括用其他方法制备永生化CD4+T细胞。

(二)HIV-1gp120抗体的制备

本发明所涉及的抗体可以委托专业商家制备，或直接从专业商家购买，如上海瑞齐生物科技有限公司及上海领潮生物科技有限公司等单位都专业从事HIV-1gp120抗体、gp41抗体及羊抗人IgG等各种抗体的制备和销售。方法包括杂交瘤技术制备单克隆抗体、EB病毒转化技术制备单克隆抗体、杂交瘤技术与EB病毒转化技术相结合制备单克隆抗体和基因工程抗体，具体列举如下。

1、采用淋巴细胞EB病毒转化与杂交瘤技术相结合制备HIV-1gp120单克隆抗体

标本来源有以下几种途经：取传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV免疫和EBV转染的淋巴细胞)；购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；取自作为科研而保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，调节浓度为2x 10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培养过夜，制备待杂交B细胞，用ELISA方法筛选抗HIV-1外膜蛋白(gp120)阳性孔，转移细胞至24孔板继续培养2周，重复用ELISA法测定抗gpl20确认阳性者，连续克隆二次并大量扩增培养。将阳性细胞株与人鼠异质骨髓瘤细胞(由浙江大学免疫系购得)混合(3∶1)后，加入1ml50％PEG使二者融合，然后重悬细胞在IMDM培养液中培养过液，第二天加入小鼠腹腔细胞(由浙江大学免疫系购得)作为滋养细胞，继续培养3周后用ELISA筛选抗gpl20抗体，挑选强阳性孔杂交瘤细胞扩增培养，并进行多次克隆直至获得稳定的细胞系，以此细胞系培养、制备HIV-1抗体，采用ELISA检测试剂盒，按说明书操作，测定抗体的Ig亚类，并以常规ELISA法测定抗体的效价和特异性，选出特异性强、效价高的抗体。

2、采用基因重组HIV-1gp120结合杂交瘤技术制备抗体

(1)试剂与重组抗原：涉及试剂：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纤维膜条由北京万泰药业公司提供BamH I内切酶Xho I内切酶、核酸共沉淀剂、T4DNALigase购自宝生物有限公司；Liagen胶回收试剂盒购自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培养基购自Gibco公司；优级新生牛血清购自明海生物工程有限公司；SupersignalWestPico Trial Kit、TMB Substrate Kit购自Pierce公司；小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem购自Sigma公司。HIV-抗体诊断试剂盒购自上海科华生物有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自博士德有限公司。重组质粒构建及鉴定：载体质粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase连接gp120基因片段，重组质粒转化入大肠杆菌XL1-blue，进行测序。重组蛋白的诱导表达及鉴定：重组质粒转化入XL1-Blue大肠杆菌中，在IPTG诱导剂作用下25℃，190r/min震荡，过夜，4 000r/min离心10min，收集细菌，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。融合蛋白纯化和鉴定：表达产物离心收集沉淀经PBS悬起，用30W超声粉碎仪裂解细菌后，将其离心收集上清过滤，滤液用AKTA PURIFYER100蛋白纯化仪、GST柱纯化，得到融合蛋白GST-HIV，浓缩离心管进行浓缩，S21型生物分光光度计测量浓度，SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

(2)动物免疫：BALB/c小鼠6周龄，雌性，4只，免疫前取小鼠静脉血，分离血清留做阴性血清。将50-100μg的GST-HIV融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐剂与融合蛋白乳化后加强免疫小鼠，免疫剂量和途径同前，重复免疫2-3次，最后一次加强免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

(3)单抗检测方法的建立：第三次免疫后一周尾静脉采血，用方阵法确定阳性血清的最佳工作浓度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被浓度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100四个稀释度，使用包被缓冲液稀释抗原，纵向包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，洗涤3次，每次间隔3分钟。将阳性血清和阴性血清分别由1∶1000开始作倍比稀释，横向加样到第10孔，每孔100μL，置于湿盒中37℃温育1h，洗涤3次，每次间隔3分钟。酶标抗体HRP-羊抗鼠IgG按照说明书作1∶10000稀释，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤3次。加人现配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反应适当时间，每孔加100μL终止液终止反应，检测其OD492值。阳性杂交瘤细胞筛选方法建立。按照方阵法中实验条件和方法，分别以GST-HIV融合蛋白为实验组，诱导表达后重组菌(含质粒pET-32a)蛋白为对照组，筛选阳性克隆。操作步骤如下：在96孔酶标板上以最适包被浓度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被过夜。取出包被板后加入洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加待测细胞上清(1∶5稀释)100μL，37℃温箱孵育50min，之后洗涤3次，每次洗涤3min；每孔再加入二抗100μl，37℃温箱孵育30min，洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加入现配的OPD底物液100μL，室温避光反应10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4终止液100μl用于终止反应；将检测板放在酶标仪上测OD492值。对照组的设立：阳性对照组为适当稀释的阳性血清，阴性对照组是和一抗有相同稀释度的无关单抗的细胞上清。间接ELISA筛选结果判定。每组检测OD492值，以P(样品值)/N(阴性值)≥2.0者判为阳性值。筛选阳性克隆标准：细胞上清与正筛选组(纯化后融合蛋白包被)反应呈阳性，同时与负筛选组(诱导后的含pET-32a质粒的菌体蛋白)反应呈阴性的检测孔为阳性样品。

(4)细胞融合：骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/min离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合前使用适量胰酶消化后使用离心管收集，加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/min离心5-10min，重复洗涤细胞2次。脾细胞准备：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉颈处死，在75％乙醇中浸湿。取出后仰放固定于解剖板上，无菌环境下取脾脏，将脾脏移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基础培养基，用平口镊子反复挤压破碎后，使用无菌注射器反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。计活细胞数后1000r/min离心10min，加入基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合。细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

(5)阳性克隆株的筛选：观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，通过之前建立的单抗筛选方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆。采用改进的有限稀释法——梯度有限稀释法连续对间接ELISA初步筛选出的阳性细胞孔进行3-4轮的亚克隆。选择有生长状态良好的阳性杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞培养上清进行抗体检侧。对检测结果为阳性的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测上清效价稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

(6)杂交瘤细胞株的保存与传代培养：保存与复苏：保存前12小时调整细胞生长状态。取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/m离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/m离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/m离心5min，弃去上清，细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。传代培养阳性杂交瘤细胞连续传10代，采用间接ELISA的方法测定培养上清抗体效价，观察效价的变化，观察此阳性杂交瘤细胞株是否能稳定分泌抗体。

(7)单抗小鼠腹水的制备：低速离心收集培养后的杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水。采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2-3天，同样方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m离心5min，吸取上清液，分装，-20℃保存。

(8)单抗的特性鉴定：特异性：Weston-Blotting实验参照《分子克隆》方法进行，半干法转印，程序如下：首先以纯化的CD4融合蛋白和诱导后重组菌蛋白经12％SDS-PAGE，一组用做对照，一组用做转印。电泳完毕，将胶切割后和同样大小的6张滤纸放入阴极缓冲液中；将NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去离子水中，1-3min后再与6张同样大小大的滤纸一起放入阳极液中；用阴极缓冲液将电泳槽的阴极板涂抹湿润，取出阴极缓冲液中的滤纸和凝胶依次放在阴极板，轻轻压出气泡。再将阳极缓冲液中NC膜和6张滤纸从阳极液中取出依次铺在凝胶上，轻轻压出气泡。最后轻轻盖上电泳槽阳极板。接通电源后，根据NC膜的面积，2mA/cm2电流大小，转印2h；转印结束后，胶取出后进行染色，转移膜取出后，用PBS稀释的5％脱脂奶粉封闭，4℃冰箱静置过夜。封闭过夜后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。洗涤过后，加入1∶10稀释的单抗细胞上清，在摇床上轻摇，室温反应60min。弃去一抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。根据Dot-ELISA摸索的条件，加入1∶5000稀释度的二抗，在摇床上轻摇，室温反应50min。弃去二抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。将有蛋白条带的NC膜做好标记，加入DAB显色剂，反应适当时间后用去离子水冲洗终止反应。效价以纯化的CD4融合蛋白为检测抗原，采用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和单抗腹水的效价。单抗亚类鉴定选用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗即用试剂盒测定，按照试剂盒操作说明书来操作，步骤如下：将适当稀释的纯化后CD4融合蛋白包被于酶标板，每孔100uL，置4℃冰箱过夜。将酶标板中的包被液拍干，然后用洗涤缓冲液洗一次，3min。然后将待测的杂交瘤细胞培养上清加入孔中，每孔100μL，置37℃温箱温育30min。拍干后用洗涤缓冲液洗五次，3min/次。将本试剂盒中的6种酶标记物分别加入孔中，每孔100μL，置于37℃温育30min。继续用洗涤缓冲液洗五次，3min/次。加OPD底物液避光显色15分钟后加入终止液，用酶标仪检测OD492值，OD492值明显高出其它孔的类型即为HIV-1gp120单抗Ig类别。

(9)HIV-1gp120单抗经进一步精制后应用(可委托专业商家完成)。

(三)HIV-1gp41抗体的制备

同HIV-1gp120抗体的制备

(四)羊抗人-Ig的制备

将所制HIV-1gp120抗体和gp41抗体为抗原，免疫羊制备抗体。

1、实验动物：免疫用实验动物选用的是浙江大学动物学院杂交白山羊，体重30斤左右的健康青壮年母羊二只，免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。采用随群圈养的饲养方式，每天保证羊只得到适量的运动，运动时间在傍晚，每次运动大概半小时左右，这样利于身体健壮，避免羊只过肥，增加机体的免疫力，饮水充足，并给予适量的精料、青草、玉米、麸皮、小麦、维生素等等，使其营养均衡。经常查看实验羊只健康状况。

2、HIV-1gp120抗体和gp41抗体为抗原：本发明制备的HIV-1gp120抗体和gp41抗体(IgG)浓度分别为2.5mg/mL(可由商家提供)，接种前混合0.1mL抗原、1.9mL无菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐剂制成免疫原乳剂备用。

3、山羊的免疫：选取两只山羊，标记为山羊A、山羊B，接种抗原(HIV-1gp120抗体和HIV-1gp41抗体)。免疫部位为前后腹股沟，每处腹股沟分2个点注射，总共有8个注射点。注射方式为皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每个注射点注射免疫原0.5mL，约含32μg抗原。免疫前两只山羊分别抽血10mL，标记为OdP1，-20℃保存；第一次免疫即一4、免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+弗氏完全佐剂2mL(CFA)；免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP1，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。3～4周开始第二次免疫，二免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP2，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。第三次免疫时间为6-8周后，三免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP3，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。如果此时血清效价没达到1∶10⁶以上，则需要再免一次；如果血清效价已达10⁶以上则不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分离血清，-20℃保存。

4、血清制备：一般每次免疫后7～10天即可于羊颈静脉采血检测。由助手协助保定动物，使其保持站立姿势，颈部剪毛、无菌棉球擦拭消毒后，寻找到颈静脉手持注射器采血，将注射器位置固定取血5-10mL。分离出血清后进行效价检测。在第三次免疫后7～10天，经效价检测合格后一次可取血30-50mL。在无菌条件下分离血清，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境(例如超净工作台)中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出(不能冰冻，否则产生溶血)，经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前须经过签定合格后再分装保存备用。

5、抗血清效价的测定：抗血清效价是采用ELISA测定方法：包被时是将样品用包被液稀释到1∶1000的浓度后，在酶标板上每孔加100μL，然后放在铝盒中放入4℃冰箱里过夜。第二天早上拿出来拍干包被液，用PBST洗涤三次，每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入10％血清的封闭液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h。然后再拿出来拍干封闭液，用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀释，用4％牛血清的PBST稀释，放入37℃，水浴1～2h)。然后再拿出来拍干一抗液，PBST洗涤酶标板三次，每次间隔5分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h。再拿出来拍干二抗液用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，每孔加50μL底物显色液，闭光显色10-20分钟后加入2M的H SO溶液50μL终止反应，后用酶标仪测OD值(半小时内)。

二、血液净化器的制备

1、血液净化细胞柱的制备

以无菌生理盐水清洗所制CD4+T细胞，1000r/min离心，洗净后再以1000r/min离心5min，取细胞沉淀装入丙烯酸酯之类高分子材料制成的200ml圆柱形容器内，充填至4/5以上，将细胞柱封口备用。

2、血液净化凝胶抗体的配备

将gp120和gp41抗体分别与羊抗gp120和gp41抗体混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗体均被完全结合，但剩有足够高滴度的游离的gp120和gp41抗体，然后将含有结合型和游离型gp120抗体的混合抗体以及含有结合型和游离型gp41抗体的混合抗体再次以等效价混合，配成最终混合抗体，分别以梯度浓度的琼脂糖C1-4B溶液配制5种凝胶混合抗体，使HIVgp120和gp41抗体的效价均为1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100而对应的琼脂糖浓度依次为0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％，按抗体效价从低到高以均等体积灌注备用的血液净化细胞柱，使凝胶从上到下形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布但CD4+T细胞占4/5以上。琼脂凝胶所形成的滤孔随着琼脂糖浓度的增高而减少，净化器进口处琼脂糖浓度低，滤孔就大，有利于血浆灌流及高滴度抗体或细胞与HIV的结合反应；而出口处浓度高，滤孔就小，易于阻留HIV或大分子结合物。净化器组合了多种特异和非特异的HIV清除成份，以免特种毒株因免疫差异所致的无效治疗。

配方一：将gp120和gp41抗体与起载体作用的经100℃溶化后保温在39～42℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的琼脂糖C1-4B生理盐水配成反向对应的1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100的梯度滴度的凝胶抗体，按低滴度至高滴度依次取40ml凝胶抗体加入血液净化细胞柱内，要求在先加入的凝胶抗体冷却至37℃成为半固体琼脂凝胶后才接着加下一次，使血液净化细胞柱从上到下(从进口到出口)形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布，其中与羊抗HIV(gp120和gp41)抗体结合的和未结合的gp120抗体、gp41抗体以及CD4+T细胞均被固定在凝胶中起吸附HIV的作用。

配方二：将gp120和gp41抗体以起载体作用的经100℃溶化后冷却至39～42℃的1％含量的琼脂糖C1-4B按倍比配成1∶50～1000的滴度梯度后，再灌注血液净化细胞柱，使血液净化细胞柱从上到下(从进口到出口)形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布，其中与羊抗HIV(gp120和gp41)抗体结合的和未结合的gp120抗体、gp41抗体以及CD4+T细胞均被固定在凝胶中起吸附HIV的作用。

配方三：分别标示不同的HIV感染株所制备的抗体及其对应的按倍比配成的滴度梯度的效价值，比如HIV感染株1滴度1∶100管、1∶200管……；HIV感染株2滴度1∶100管、1∶200管……，依此类推，然后将感染株1滴度1∶100管与10ml39～42℃保温的液态琼脂糖C1-4B混匀后放入血液净化细胞柱，待放置冷却成半固体凝胶后，再将感染株1滴度1∶200管与10ml39～42℃保温的液态琼脂糖C1-4B混匀，混匀液放入血液净化细胞柱的凝胶上层，依此类推。在实际应用中要按组合制备，比如某地区某时期的HIV感染株有A、B、C共3株，制备的抗体有A株1∶100管、1∶200管……；B株1∶100管、1∶200管……；C株1∶100管、1∶200管……；经组合后就是ABC株1∶100管、ABC株1∶200管……ABC株1∶1000管，然后将ABC株1∶1000管与10ml39～42℃保温的液态琼脂糖C1-4B混匀后放入血液净化细胞柱，待放置冷却成半固体凝胶后，再将ABC株1∶900管与10ml39～42℃保温的液态琼脂糖C1-4B混匀，混匀液放入血液净化细胞柱内已冷却成半固体的凝胶上层，依此类推，中间可以间隔选用，比如接着选ABC株1∶500管与10ml39～42℃保温的液态琼脂糖C1-4B混匀，混匀液放入血液净化细胞柱内已冷却成半固体的凝胶上层，液态琼脂糖C1-4B的用量也可以在1ml～10ml内调整(按这样制成的血液净化细胞柱，从进口至出口形成从低到高的梯度抗体含量，鉴于抗原和抗体只有在合适比例时才会起免疫反应、形成沉淀线而阻止同类抗体或抗原的前行，所以不同HIV含量的血浆通过净化剂时，HIV就在不同的层面上被吸附阻留，而且本发明的HIV感染株可以函盖当时几乎所有的感染株，以及吸附剂中与羊抗Ig结合的和未结合的gp120和gp41抗体都是预先固定于凝胶琼脂中的HIV配基，HIV抗体特别是结合有羊抗HIV的HIV抗体与HIV结合所形成的免疫复合物分子量更大，完全能被阻留在凝胶琼脂中而被清除，再加上孔径约为85nm的凝胶琼脂本身就能阻留直径为100～120nm的HIV，所以从理论上推断几乎不会有治疗无效的艾滋病患者)。

3、血液净化器的规格与材料

血液净化细胞柱或血液净化器为底径小、顶径大的圆柱形，或方形、漏斗形，容积为200～300ml，进出口均设有细胞筛网，进口处顶径筛网目数为800目；出口处底径筛网目数为2.0～5.0目(2.5～5.0目相当于0.1～0.2微米或100～200纳米)，具体可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格，用以阻挡120纳米的HIV病毒或更大的细菌；液体出口处设置目数为100目(相当于4微米)的细胞滤网，用以阻挡可能滤出的细胞；液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

血液净化器选用丙烯酸酯之类的高分子材料，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高生物相容性、减少并发症的发生。在净化器内表面加亲水凝胶，将2甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-丁基异丁烯酸固化在醋酸纤维素膜上，通过控制湿纺过程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有较高的血液和细胞相容性。将某些具有抗凝作用的物质固化在载体或净化器内表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，还可降低肝素用量，并有可能实现无肝素化。如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，效果可能会更好，并可减少净化期间的过敏反应，固化壳聚糖和肝素共价物的聚丙烯腈表面也显示了良好的血液相容性，并可抑制铜绿假单孢菌的活性，降低细胞毒性反应。将肝素共价结合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力学性能，又能提高净化器内表面的抗凝血性能。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。随着高分子材料和纳米技术的不断发展，与人类血管内皮接近的材料在不久的将来将会出现。

三、血浆分离器的制备

1、制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。

3、型号与规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状；按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

四、净化器的应用构件及用途

1、关键构件：(1)血浆分离器：用于分离单个血细胞和血浆；(3)血液净化器：用于吸附血浆中的HIV。

2、附加构件：包括血泵、肝素泵、动静脉压和空气监测、温度控制系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分组成。(1)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持血液净化治疗的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测血液分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，在本发明关键构件和附加构件的基础上，引入计算机调控而制成操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性，以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理的血液净化治疗仪。

五、免疫净化器的连接通路与使用方法

1、安装：如图1，以无菌操作连接各部件，包括分离器、净化器及各循环管路。

2、排气：以无菌生理盐水充液分离器、净化器及各循环管路，排除分离器、净化器及其循环管路内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

3、通液：将动脉血路管(1)接通艾滋病患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

4、抗凝：从肝素泵(2)向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500U或20～30U/kg。

5、启动：将动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，将静脉管路(5)接通静脉血管，然后打开血液泵(2)，血流量为100～150ml/min，如图1，动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)，分离出来的血浆在血浆泵(6)的作用下经循环管路(7)到达净化器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向净化器(9)灌注血浆，在净化器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时净化器(9)开始放出血浆，两个并联的净化器(8)、净化器9)交替进行，净化后的血浆经循环管路(10)与血浆分离器(4)所分离的血细胞汇合后经静脉管路(5)回输。如图2，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。如图3，当含有HIV(1)的血浆进入净化器时，其中的HIV(1)分别被固定在琼脂凝胶(6)中的HIV抗体(2)、CD4+T细胞(4)结合成抗原抗体复合物(3)、CD4+T细胞结合物(5)，被结合后的HIV不再往下移动，另外未被结合的100～120nm的HIV又被因浓度更高而孔径更小的约为85nm的1％浓度的下层琼脂凝胶分子筛阻留在(7)处。如此清除HIV，直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束，整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用方便、自动化和安全。

六、艾滋病免疫净化器功效的验证

1、CD4+T细胞株清除HIV功效的验证

为了验证CD4+T细胞株吸附清除HIV的功效，本发明设计了简易的测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取经离心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T细胞至200mm刻度，接着吸取经100℃溶化后保温在39～42℃备用的0.9％琼脂糖C1-4B，达到约10mm长刻度，置血沉架冷却后，琼脂糖成为半固体，能阻止血沉管内细胞流出但不会阻止小分子的水和化学成份之类的物质通过。另取疾控中心及传染病实验室样本库保存的艾滋病患者的5例血浆，各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管上端空管，待流经血沉管下层的CD4+T细胞层并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表1)说明，AIDS血浆滤过含CD4+T细胞的简易净化装置后，部分HIV已被CD4+T细胞吸附，经第1次滤过后，HIV总清除率为22.84％，经第2次滤过后，总清除率为35.31％，经第3次滤过后，总清除率为41.9％。说明随着滤过次数的增加，HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表1 AIDS血浆滤过含CD4+T细胞的简易净化装置前后p24检测结果(pg/ml)

2、HIV-1gp120抗体、gp41抗体清除HIV功效的验证

本发明人按照本发明的基本方法，做了如下的简易验证实验：取HIV-1gp120抗体、gp41抗体(上海瑞齐生物科技有限公司)，加入到经100℃溶化后保温在50℃备用的1.0％琼脂糖C1-4B中，混合后滴度为1∶300～500，取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取1.0％琼脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷却后琼脂糖成为半固体。另取疾控中心和传染病实验室样本库保存的5例艾滋病患者的标本，去细胞后的血浆各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管上端空管，待流经血沉管下层的含有抗体的1.0％琼脂糖C1-4B并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表1)说明，AIDS血浆滤过简易净化装置后，部分HIV已被相应抗体吸附，经第1次滤过后，HIV总清除率为20.01％，经第2次滤过后，总清除率为27.99％，经第3次滤过后，总清除率为37.36％。说明随着滤过次数的增加HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表1 AIDS血浆滤过简易净化装置前后p24检测结果(pg/ml)

上述简易实验表明，血浆中游离的HIV能被本发明的净化剂(HIVgp120抗体、HIVgp41抗体、CD4+T细胞株、琼脂凝胶微孔)清除，表明本发明的艾滋病免疫净化器具有显著的清除血浆HIV的治疗功效。

Claims (9)

1.一种用于医学领域的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述净化器是将HIV抗体和结合了羊抗Ig的HIV抗体及CD4+T细胞株配制于琼脂凝胶，之后灌注于高生物相容性材料制成的圆柱形容器而制成，使其进口处至出口处形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布，用于清除血浆中的HIV；所述净化器的容积为200～300ml，进口处顶径细胞筛网目数为800目，出口处底径细胞筛网目数为2.0～5.0目，细胞滤网目数为100目。

2.根据权利要求1所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述净化器由其出口处的筛网、起固定和分子筛作用的琼脂凝胶、配制其中的CD4+T细胞株、HIV抗体、结合了羊抗Ig的HIV抗体共同构成分子筛机械清除及细胞和抗体免疫清除血浆HIV的屏障。

3.根据权利要求1所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述出口处底径筛网目数制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格。

4.根据权利要求1所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述从高到低的抗体滴度的分层分布指从净化器的进口处至出口处的混合抗体效价依次以1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100分5层。

5.根据权利要求1所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述从低到高的琼脂糖浓度的分层分布指从净化器的进口处至出口处的琼脂糖浓度依次以0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％分5层。

6.根据权利要求1、2、4任一所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述HIV抗体包括HIV-1gp120抗体、HIV-1gp41抗体。

7.根据权利要求1、2任一所述的艾滋病免疫净化器，其特征在于，所述CD4+T细胞株以SV40和/或hTERT作为转染基因、以CD3单克隆抗体和/或CD28双抗体作为细胞生长刺激剂制备。

8.根据权利要求1所述的艾滋病免疫净化器中的净化剂的制备方法，其特征在于，以无菌生理盐水清洗所制的CD4+T细胞，1000r/min离心，洗净后再以1000r/min离心5min，取细胞沉淀装入高生物相容性材料制成的200ml圆柱形容器内，充填至4/5，制成细胞柱，另将gp120和gp41抗体分别与羊抗gp120和羊抗gp41抗体混合，使混合液中的羊抗gp120和羊抗gp41抗体均被完全结合，但剩有大量的gp120和gp41抗体，然后再将两种混合液混合，配成gp120和gp41抗体效价相等的最终混合抗体，分别以梯度浓度的琼脂糖C1-4B溶液配制5种凝胶混合抗体，使HIVgp120和gp41抗体的效价均为1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100而对应的琼脂糖浓度依次为0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％，按抗体效价从低到高以均等体积灌注备用的血液净化细胞柱，使其中的凝胶从上到下形成从高到低的抗体滴度而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布。

9.权利要求1-7任一所述的艾滋病免疫净化器在制备体外净化装置中的应用，其特征在于，所述体外净化装置的连接方式是：动脉血路管(1)的一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的净化器相连，然后依次经循环管路(10)、静脉管路(5)汇流。