CN109172907A - 一种艾滋病免疫吸附治疗仪 - Google Patents

Abstract

一种用于医学领域的艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，由循环管路将血液分离器、血浆分离器和吸附器依次连接成体外循环吸附装置，其中血液分离器用于滤除因数个HIV感染细胞融合而形成的多核巨细胞，之后的血浆分离器用于分离单个血细胞和血浆，所分离的血浆滤过吸附器时，其中的HIV被吸附，滤出的血浆与所分离的单个血细胞汇合后再次进入体外循环吸附装置，所述吸附器从出口处至进口处分层充填由低至高梯度效价的HIV抗体包被的固相载体。

Description

一种艾滋病免疫吸附治疗仪

技术领域

本发明涉及生物医学领域中一种艾滋病免疫吸附治疗仪的制备及应用，主要用于艾滋病患者血浆中HIV的吸附清除，以防控和治疗艾滋病。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100 万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

人类免疫缺陷病毒是一种感染人类免疫细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种，直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜(来自宿主细胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度，内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分。

HIV进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。 HIV的gp120与CD4受体结合可直接激活受感染的细胞凋亡，甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起CD4+细胞的大量破坏，结果造成以CD4+T细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8 比例倒置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力。HIV进入宿主CD4+细胞后也可以表现为长期潜伏而不表现出临床症状，其基因组RNA 反转录成双链DNA，与病毒整合酶进入宿主细胞核内，在整合酶的作用下，双链DNA整合到宿主细胞基因组内，被整合的病毒DNA称为前病毒，可潜伏数月甚至多年不复制，造成AIDS 数月至多年的潜伏期。在AIDS的潜伏期，HIV主要在淋巴结的巨噬细胞和树突状细胞内繁殖，这些细胞是体内的HIV贮存库，可释放至外周血或转染外周血中的CD4+T细胞，有丝分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激发HIV前病毒基因在感染的CD4+T细胞内转录复制。经大量增殖后，HIV病毒颗粒不断从被破坏的感染细胞释放并游离于血液，然后再进入新的 CD4+T细胞，继续感染过程。而且细胞被HIV感染后，表达于感染细胞表面的gp120和gp41 能介导感染与未感染细胞间的融合，例如感染HIV的CD4⁺T细胞表达的gp120与未感染细胞的CD4结合，导致细胞融合而形成多核巨细胞。另外，HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白 (Gp120，Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内能与HIV起免疫反应，有保护作用。

从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染HIV的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。 (3)HIV整合酶抑制剂：通过抑制HIV病毒DNA与宿主细胞DNA整合而发挥作用，与HIV逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制HIV病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与CD4结合、阻断HIV与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于T淋巴细胞表面CC趋化因子受体5(CCR5)来阻断HIV进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节T细胞动态平衡。(6)HIV疫苗治疗：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：HIV基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、 RNA诱饵、RNA干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入II期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调CD4+T细胞表面CCR5来降低 HIV的易感性、延缓艾滋病的进展和减少HIV的扩散，中和单克隆抗体2G12、2F5和4E10应用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养HIV自体的CD4+T细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的CD4+T 细胞数量，而回输CD4+T细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。

凝胶中抗原-抗体沉淀反应于1905年首先应用于研究利泽甘氏现象，1932年应用于鉴定细菌菌株，1946年Oudin在试管中进行免疫扩散试验，用于分析抗原混合物，1948年Elek 和Ouchterlony分别建立了琼脂双向双扩散法，用于同时鉴定、比较两种以上抗原或抗体。凝胶中抗原-抗体沉淀反应的介质凝胶琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，抗原和抗体的分子量一般都在20 万以下，在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小，基本上呈自由扩散形式。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，这种沉淀就形成了一个“特异性屏障”，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，简称沉淀线或沉淀带，是目前用已知抗体检测未知量相应抗原的常规实验诊断项目，所以，曾有专利文献根据琼脂凝胶扩散的原理，设计了艾滋病的治疗方案，即制备不同感染株的HIV抗体，将HIV抗体预先固定在凝胶中，制成净化器，当患者经体外循环分离出的血浆流经净化器时，血浆中的HIV被预先固定在凝胶中的相应抗体结合而被阻留在净化器内。但存在的问题是，因琼脂凝胶的孔径小，致使血浆滤过的速度太慢而影响治疗效果。

总之，目前各种药物及生物制品无法有效地杀灭体内的艾滋病毒，且价格贵，副作用大，需研究更理想的艾滋病治疗方法。

发明内容

为了解决艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种艾滋病免疫吸附治疗仪，及其制备和应用。

本发明的目的是这样实现的：制备HIV抗体，将所制HIV抗体配成梯度效价，然后取不同效价的HIV抗体分别包被固相载体，将所制固相载体按包被抗体从低到高的效价分层灌注或固定在吸附器内的出口处至入口处，进而通过循环管路将血液分离器、血浆分离器和吸附器连接成体外循环吸附装置。

更具体地说，制备HIVgp120和/或gp41抗体，分别将所制HIV抗体配成梯度效价，然后取不同效价的HIVgp120或gp41抗体分别包被固相载体，或将相同梯度效价的HIVgp120和gp41抗体混合，然后将不同效价的混合抗体包被固相载体，进而将所制固相载体按包被抗体从低到高的效价分层灌注或固定在吸附器内的出口处(底层)至入口处(顶层)，最后通过循环管路将血液分离器、血浆分离器和吸附器连接成体外循环吸附装置，其中血液分离器能够滤除血液中被HIV感染的巨细胞，之后的血浆分离器能够分离血浆和单个血细胞，最后的吸附器能够吸附血浆中的HIV，当体外循环血液进入血液分离器时，其中由HIV感染细胞融合形成的细胞内含有HIV的巨细胞被滤除，继之当血液进入血浆分离器时被分离为血细胞和血浆，血浆进入吸附器时其中的HIV被固相载体上的包被抗体吸附，清除HIV后的血浆从吸附器滤出并与之前分离的血细胞汇合后重复体外循环吸附过程，使血液细胞内外的HIV被清除。

本发明的吸附器通过灌注或固定包被HIV抗体的固相载体而制成，利用抗原抗体免疫反应机制，以固相载体表面固定的HIV抗体吸附血浆中的HIV，不同类型的包被固相载体适用于不同的治疗对象，其中由1种HIV抗体包被的固相载体可专用于1种相应HIV病毒的吸附，即用于该种相应HIV感染的对象；由数种HIV抗体包被的固相载体可专用于相应数种HIV病毒的吸附，即用于数种HIV同时感染的对象；由不同效价HIV抗体包被的固相载体适用于不同HIV效价的感染者；而由固相载体按包被抗体从低到高的效价分层灌注或固定在吸附器内的出口处至入口处，是因为抗原与抗体的免疫反应需要“合适比例”，在吸附器内制成分层梯度效价的包被载体可使不同HIV含量的患者都能对应于相应的梯度，从而满足“合适比例”的要求，另外因为从“入口处至出口处”的HIV抗体效价从高到低的设置是因为刚进入吸附器时的HIV含量相对较高，随着往下过滤而被吸附从而使HIV含量逐渐降低，从理论上说为了达到“合适比例”，HIV含量降低的梯度应与吸附器内固相载体包被HIV抗体效价从高到低的梯度设置相一致，所以本发明的吸附器基于免疫反应机制、治疗对象的个体差异而进行设计，而本发明的血液分离器基于“HIV感染细胞表面的gp120和gp41能介导感染细胞与未感染细胞的融合而形成多核巨细胞”的机制而设计血液分离器，按细胞的体积滤除细胞内含有 HIV的多核巨细胞，从而能清除细胞内外的HIV。

附图说明

图1是本发明的一种艾滋病免疫吸附治疗仪的应用示意图。

图2是本发明提出的血液分离器的内部结构示意图。

图3是本发明提出的血浆分离器的内部结构示意图。

图4是本发明提出的吸附器的内部结构示意图。

图1中，循环管路(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素和血液泵(2)与含有废液出口(5)的血液分离器(3)相连，血液分离器(3)经血液出口(4)、血液泵(6)、循环管路(7)与血浆分离器(8)相连，血浆分离器(8)的血浆出口经血浆泵(9)和循环管路(10)与两个并联的吸附器(11、12)相连，两个吸附器的出口管路(13)与血浆分离器 (8)的血细胞出口管路(14)汇合后经静脉管路(15)汇流体循环。

图2表示图1中的血液分离器(3)的内部结构。图2中，血液分离器(1)的内腔(2) 的管壁上有很多微孔(3)，多核巨细胞(4)不能滤过微孔(3)而被阻留在内腔(2)，从而可被清除，能通过微孔(3)的中、小体积的单个血细胞(5)进入外腔(6)，然后经出口(7) 流出，进而经图1所示的血浆分离器(8)分离出血细胞和血浆。

图3表示图1中的血浆分离器(8)的内部结构。图3中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的单个血细胞，5是能通过微孔(3)的血浆化学成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是具有可开关阀门的血细胞出口。

图4中，1为吸附器，2为包被HIV抗体的固相载体，3为进入吸附器的HIV，4为HIV 与包被于固相载体表面的HIV抗体结合物，5为从固相载体表面脱落的HIV抗原抗体复合物。

具体实施方式

下面结合图1、图2、图3和图4，对本发明的实施方案作详细的描述。

一、HIV抗体的制备

本发明所涉及的抗体可以委托专业商家制备，或直接从专业商家购买，如上海瑞齐生物科技有限公司及上海领潮生物科技有限公司等单位都专业从事HIV-1gp120抗体、gp41抗体的制备和销售。方法包括杂交瘤技术制备单克隆抗体、EB病毒转化技术制备单克隆抗体、杂交瘤技术与EB病毒转化技术相结合制备单克隆抗体和基因工程抗体，具体列举如下。

(一)HIV-1gp120抗体的制备

1、采用淋巴细胞EB病毒转化与杂交瘤技术相结合制备HIV-1gp120单克隆抗体

标本来源有以下几种途经：取传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV免疫和EBV转染的淋巴细胞)；购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；取自作为科研而保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞 (PBMC)，调节浓度为2x10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培养过夜，制备待杂交B细胞，用ELISA方法筛选抗HIV-1外膜蛋白(gp120)阳性孔，转移细胞至 24孔板继续培养2周，重复用ELISA法测定抗gp120确认阳性者，连续克隆二次并大量扩增培养。将阳性细胞株与人鼠异质骨髓瘤细胞(由浙江大学免疫系购得)混合(3∶1)后，加入 1ml50％PEG使二者融合，然后重悬细胞在IMDM培养液中培养过液，第二天加入小鼠腹腔细胞(由浙江大学免疫系购得)作为滋养细胞，继续培养3周后用ELISA筛选抗gp120抗体，挑选强阳性孔杂交瘤细胞扩增培养，并进行多次克隆直至获得稳定的细胞系，以此细胞系培养、制备HIV-1抗体，采用ELISA检测试剂盒，按说明书操作，测定抗体的Ig亚类，并以常规ELISA法测定抗体的效价和特异性，选出特异性强、效价高的抗体。

2、采用基因重组HIV-1gp120结合杂交瘤技术制备抗体

(1)试剂与重组抗原：涉及试剂：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纤维膜条由北京万泰药业公司提供BamH I内切酶Xho I内切酶、核酸共沉淀剂、T4 DNALigase购自宝生物有限公司；Liagen胶回收试剂盒购自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培养基购自Gibco公司；优级新生牛血清购自明海生物工程有限公司；SupersignalWest PicoTrial Kit、TMB Substrate Kit购自Pierce公司；小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem购自Sigma公司。HIV-抗体诊断试剂盒购自上海科华生物有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自博士德有限公司。重组质粒构建及鉴定：载体质粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase连接gp120基因片段，重组质粒转化入大肠杆菌XL1-blue，进行测序。重组蛋白的诱导表达及鉴定：重组质粒转化入XL1-Blue大肠杆菌中，在IPTG诱导剂作用下25℃，190r/min震荡，过夜，4 000r/min离心10min，收集细菌，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。融合蛋白纯化和鉴定：表达产物离心收集沉淀经PBS悬起，用30W超声粉碎仪裂解细菌后，将其离心收集上清过滤，滤液用AKTA PURIFYERi00蛋白纯化仪、GST柱纯化，得到融合蛋白GST-HIV，浓缩离心管进行浓缩，S21型生物分光光度计测量浓度，SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

(2)动物免疫：BALB/c小鼠6周龄，雌性，4只，免疫前取小鼠静脉血，分离血清留做阴性血清。将50-100μg的GST-HIV融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐剂与融合蛋白乳化后加强免疫小鼠，免疫剂量和途径同前，重复免疫2-3次，最后一次加强免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV 融合蛋白。

(3)单抗检测方法的建立：第三次免疫后一周尾静脉采血，用方阵法确定阳性血清的最佳工作浓度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被浓度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、 1∶100四个稀释度，使用包被缓冲液稀释抗原，纵向包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，洗涤3次，每次间隔3分钟。将阳性血清和阴性血清分别由1∶1000开始作倍比稀释，横向加样到第10孔，每孔100μL，置于湿盒中37℃温育1h，洗涤3次，每次间隔3分钟。酶标抗体HRP-羊抗鼠IgG按照说明书作1∶10000稀释，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤 3次。加入现配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反应适当时间，每孔加100μL终止液终止反应，检测其0D492值。阳性杂交瘤细胞筛选方法建立。按照方阵法中实验条件和方法，分别以GST-HIV融合蛋白为实验组，诱导表达后重组菌(含质粒pET-32a)蛋白为对照组，筛选阳性克隆。操作步骤如下：在96孔酶标板上以最适包被浓度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被过夜。取出包被板后加入洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加待测细胞上清(1∶5 稀释)100μL，37℃温箱孵育50min，之后洗涤3次，每次洗涤3min；每孔再加入二抗100 μl，37℃温箱孵育30min，洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加入现配的OPD底物液100μL，室温避光反应10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4终止液100μl用于终止反应；将检测板放在酶标仪上测OD492值。对照组的设立：阳性对照组为适当稀释的阳性血清，阴性对照组是和一抗有相同稀释度的无关单抗的细胞上清。间接ELISA筛选结果判定。每组检测 OD492值，以P(样品值)/N(阴性值)≥2.0者判为阳性值。筛选阳性克隆标准：细胞上清与正筛选组(纯化后融合蛋白包被)反应呈阳性，同时与负筛选组(诱导后的含pET-32a 质粒的菌体蛋白)反应呈阴性的检测孔为阳性样品。

(4)细胞融合：骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出1管冻存的骨髓瘤细胞，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/min离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合前使用适量胰酶消化后使用离心管收集，加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/min 离心5-10min，重复洗涤细胞2次。脾细胞准备：融合前，取1只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉颈处死，在75％乙醇中浸湿。取出后仰放固定于解剖板上，无菌环境下取脾脏，将脾脏移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基础培养基，用平口镊子反复挤压破碎后，使用无菌注射器反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。计活细胞数后1000r/min离心 10min，加入基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合。细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HA T培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

(5)阳性克隆株的筛选：观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，通过之前建立的单抗筛选方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆。采用改进的有限稀释法——梯度有限稀释法连续对间接ELISA初步筛选出的阳性细胞孔进行3-4轮的亚克隆。选择有生长状态良好的阳性杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞培养上清进行抗体检侧。对检测结果为阳性的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测上清效价稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

(6)杂交瘤细胞株的保存与传代培养：保存与复苏：保存前12小时调整细胞生长状态。取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/m离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/m离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/m离心5min，弃去上清，细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。传代培养阳性杂交瘤细胞连续传10代，采用间接ELISA的方法测定培养上清抗体效价，观察效价的变化，观察此阳性杂交瘤细胞株是否能稳定分泌抗体。

(7)单抗小鼠腹水的制备：低速离心收集培养后的杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水。采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2- 3天，同样方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m离心5min，吸取上清液，分装，-20℃保存。

(8)单抗的特性鉴定：特异性：Weston-Blotting实验参照《分子克隆》方法进行，半干法转印，程序如下：首先以纯化的CD4融合蛋白和诱导后重组菌蛋白经12％SDS-PAGE，一组用做对照，一组用做转印。电泳完毕，将胶切割后和同样大小的6张滤纸放入阴极缓冲液中；将NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去离子水中，1-3min后再与6张同样大小大的滤纸一起放入阳极液中；用阴极缓冲液将电泳槽的阴极板涂抹湿润，取出阴极缓冲液中的滤纸和凝胶依次放在阴极板，轻轻压出气泡。再将阳极缓冲液中NC膜和6张滤纸从阳极液中取出依次铺在凝胶上，轻轻压出气泡。最后轻轻盖上电泳槽阳极板。接通电源后，根据NC膜的面积，2mA/cm2电流大小，转印2h；转印结束后，胶取出后进行染色，转移膜取出后，用 PBS稀释的5％脱脂奶粉封闭，4℃冰箱静置过夜。封闭过夜后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。洗涤过后，加入1∶10稀释的单抗细胞上清，在摇床上轻摇，室温反应60min。弃去一抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。根据Dot-ELISA摸索的条件，加入1∶5000稀释度的二抗，在摇床上轻摇，室温反应50min。弃去二抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。将有蛋白条带的NC膜做好标记，加入DAB显色剂，反应适当时间后用去离子水冲洗终止反应。效价以纯化的CD4融合蛋白为检测抗原，采用间接ELISA 方法测定杂交瘤细胞上清和单抗腹水的效价。单抗亚类鉴定选用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗即用试剂盒测定，按照试剂盒操作说明书来操作，步骤如下：将适当稀释的纯化后 CD4融合蛋白包被于酶标板，每孔100uL，置4℃冰箱过夜。将酶标板中的包被液拍干，然后用洗涤缓冲液洗一次，3min。然后将待测的杂交瘤细胞培养上清加入孔中，每孔100μL，置37℃温箱温育30min。拍干后用洗涤缓冲液洗五次，3min/次。将本试剂盒中的6种酶标记物分别加入孔中，每孔100μL，置于37℃温育30min。继续用洗涤缓冲液洗五次，3min/ 次。加OPD底物液避光显色15分钟后加入终止液，用酶标仪检测0D492值，0D492值明显高出其它孔的类型即为HIV-1gp120单抗Ig类别。

(9)HIV-1gp120单抗经进一步精制后应用(可委托专业商家完成)。

(二)HIV-1gp41抗体的制备

同HIV-1gp120抗体的制备，单抗经进一步精制后应用(可委托专业商家完成)。

二、包被固相载体的制备

1、固相载体的材料

要求生物相容性好，为与人类血管内皮接近的丙烯酸酯之类高分子材料，无补体激活和炎症反应，无白细胞、血小板、血氧分压、补体C3aC5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料表面的均匀性、亲水性，减少对凝血及氧化应激的影响。在固相载体表面加亲水凝胶，通过控制湿纺过程而生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，可以提高生物相容性。将某些抗凝物质固化在载体表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至实现无肝素化。如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，可减少过敏体质的过敏反应；将肝素共价结合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力学性能和提高吸附器内表面的抗凝血性能；在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。

2、固相载体的规格

(1)微球状；可以制成实心微球或空心微球，要求有更大的表面积。

(2)微管状：可以制成实心管或空心管，要求有更大的表面积。

(3)其他形状：可根据需要设计成小圆片或扁圆片等形状，要求有更大的表面积。

3、固相载体的包被

(1)将HIV-1gp120、HIV-1gp41抗体分别配成1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶ 512、1∶1024、1∶2048的效价。

(2)取上述配制的不同效价的HIVgp120或gp41抗体，参照文献或委托公司，分别包被固相载体，或将相同梯度效价的HIVgp120和gp41抗体混合，然后将不同效价的混合抗体包被固相载体。

三、吸附器的制备

1、吸附器的材料

同固相载体的材料，要求有较好的生物相容性，为与人类血管内皮接近的丙烯酸酯类高分子材料，不引起补体激活和炎症反应，无白细胞、血小板、血氧分压、补体C3aC5a的改变。

2、吸附器的规格

制成圆柱形或漏斗形，容积约200～300ml，液体进口处设有顶径细胞筛网，顶径细胞筛网目数为500～800目，液体进口与顶径细胞筛网之间设有促进系统稳定循环的缓冲区，出口处设有底径细胞筛网和细胞滤网，底径细胞筛网目数为50～100目，细胞滤网目数为100～ 200目，构成了防止细胞碎片进入循环的第二道防线，底径细胞筛网与液体出口之间亦设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

3、吸附器的制备方法

将本发明上述制备的包被固相载体内置或固定在吸附器内，制成不同抗体及其效价组合的吸附器。具体方法为：

(1)取1种效价为1∶8的HIV-1gp120抗体包被的固相载体，充填或固定在吸附器的底层，然后依次取效价为1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶512、1∶1024、1∶2048的HIV-1gp120 抗体包被的固相载体，分别分层充填或固定在吸附器内，使吸附器内的包被固相载体从吸附器的进口处(顶层)至出口处(底层)分为8层，HIV-1gp120抗体效价分别为1∶2048、1∶ 1024、1∶512、1∶128、1∶64、1∶32、1∶16、1∶8。

(2)取1种效价为1∶8的HIV-1gp41抗体包被的固相载体，充填或固定在吸附器的底层，然后依次取效价为1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶512、1∶1024、1∶2048的HIV-1gp120 抗体包被的固相载体，分别分层充填或固定在吸附器内，使吸附器内的包被固相载体从吸附器的进口处(顶层)至出口处(底层)分为8层，HIV-1gp120抗体效价分别为1∶2048、1∶ 1024、1∶512、1∶128、1∶64、1∶32、1∶16、1∶8。

(3)取效价均为1∶8的HIV-1gp120和HIV-1gp41抗体，等量混合，此时混合抗体的稀释效价变为1∶16，实际抗体效价(实际含量)变为1∶4，取由此包被的固相载体，充填或固定在吸附器的底层，然后依次取效价分别为1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶512、1∶1024、1∶2048的混合抗体包被的固相载体，分层充填或固定在吸附器内，使吸附器内的混合抗体包被的固相载体从吸附器的进口处(顶层)至出口处(底层)分为8层，HIV-1gp120 和HIV-1gp41混合抗体效价(实际含量)分别为1∶1024、1∶512、1∶128、1∶64、1∶32、 1∶16、1∶8、1∶4。

四、血液分离器的制备

1、制备原理：①血细胞、细菌、病毒的分子大小：人体血液中有形成份(细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。细菌的大小为：球菌的直径约在 0.75-1.25μm之间，杆菌长度约在2-5μm，螺旋菌长约100-200μm。病毒的大小以纳米(nm) 为单位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒间大小差异很大，最小的如植物的联体病毒(Geminiviruses)直径仅18-20nm，最大的动物痘病毒(Poxviruses)大小达 300-450nm×170-260nm，最长的如丝状病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小为80nm× 790-14000nm，多数单个病毒粒子的直径在100nm左右，艾滋病毒为100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相关成份：多核巨细胞(HIV感染细胞表面的gp120与CD4+细胞结合而成的大体积的HIV感染细胞)、gp120细胞(表面有gp120但以单个细胞存在的HIV感染细胞)、基因整合细胞(艾滋病感染初期或潜伏期，整合有HIV双链DNA，但细胞表面没有 gp120的HIV感染细胞)、正常白细胞(未感染HIV的单个细胞存在的粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)、红细胞、血小板、化学成份(蛋白质、糖类、脂类、电解质等)、游离的HIV、细菌及其他微生物。③多核巨细胞为天然的大体积细胞；gp120细胞和基因整合细胞可通过抗原和抗体的免疫反应使细胞凝集为大体积多细胞聚合体；游离的HIV可通过载体颗粒/免疫反应转变为大体积成份。④根据上述3点，可以制备能通过单个细胞但不能通过大体积细胞或颗粒的血液分离器。⑤选用具有选择性吸附功能的材料，经本发明的体外血液循环支路筛除血液中的HIV感染细胞。

2、血液分离器的材料与要求：同本发明的血液净化器，选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应和白细胞、血小板、血氧分压、C3a、C5a的改变。

3、血液分离器的型号与规格：血液分离器的外形制备成柱形结构(以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯)、扁平结构(以聚醋无纺布等材料作滤芯)等形状；孔径制备成150～250μm、 50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等型号。

4、血液分离器的应用原则：根据艾滋病患者的病情选用不同型号的分离器，原则上先选用大孔径型号做预筛滤，然后选用较小孔径的型号。重度艾滋病患者常发生严重的机会性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大体积的真菌、螺旋菌、肿瘤细胞及其他异物，则选用孔径为150～250μm或50～150μm的分离器；如为筛滤HIV感染的单核巨噬细胞或因细胞内感染了HIV而相互粘合或融合形成的较大体积的多核巨细胞、多细胞聚合体及吸附有HIV 的颗粒性物质，则选用中等偏大孔径的血液分离器，如15～40μm的血液分离器；为了置换易受HIV感染的CD4+细胞，则选用8～15μm、5～8μm、3～5μm之类的型号。这几种型号近似或小于血液中单个红细胞、中性粒细胞、小淋巴细胞的体积，但红细胞、中性粒细胞及巨噬细胞具有变形运动的特性，能通过比自身体积更小的微孔。

五、血浆分离器的制备

1、制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞) 的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8 微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。

3、型号与规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状；按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为 0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

六、体外吸附装置的构件

1、关键构件：吸附器、血液分离器、血浆分离器。

2、附加构件：包括血泵、肝素泵、动静脉压和空气监测、温度控制系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分组成。

(1)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持血液吸附治疗的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。

(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。

(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测血液分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，基于本发明的关键构件和附加构件，可通过引入计算机调控而制成人性化操作、个体化治疗、自动监控、液晶显示、安全警报、信号解除等微电脑模块化处理的治疗仪。

七、体外吸附装置(治疗仪)的操作

1、安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、吸附器及各循环管路等。

2、排气：以无菌生理盐水充液分离器、吸附器及各循环管路，排除分离器、吸附器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

3、通液：将循环管路(1)接通动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

4、抗凝：从肝素泵向循环液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。

5、启动：将动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，将静脉管路(15)接通静脉血管，然后打开血液泵(2)，血流量为100～150ml/min。

如图1，当动脉血液经循环管路(1)、肝素和血液泵(2)进入血液分离器(3)时，因HIV感染而形成的大体积多核巨细胞被阻留在血液分离器(3)内，单个血细胞和血浆依次经血液出口(4)、血液泵(6)和循环管路(7)流入血浆分离器(8)，分离的血浆依次经血浆泵(9)和血路管(10)流入此时开放的净化器(11)，约10分钟充满血浆，开始放出血浆，经出口管路(13)流出，同步向净化器(12)灌注血浆，在净化器(11)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时净化器(12)开始放出血浆，两个并联的净化器(11、12)交替进行。

如表示图1中的血液分离器(3)的内部结构的图2，血液分离器(1)的内腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨细胞(4)不能滤过微孔(3)而被阻留在内腔(2)，从而可被清除，能通过微孔(3)的中、小体积的单个血细胞(5)及血浆进入外腔(6)，然后经出口 (7)流出，进而经图1所示的血浆分离器(8)分离出血细胞和血浆。

如表示图1中的血浆分离器(8)的内部结构的图3，血浆分离器(1)的内腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通过微孔(3)的单个血细胞(4)经具有可开关阀门的血细胞出口(8)流出，进入图1所示的血细胞出口管路(14)；能通过微孔(3)的血浆及其化学成分 (5)进入血浆分离器外腔(6)，然后经血浆流出口(7)、图1所示的血浆泵(9)和血路管 (10)进入吸附器。

如表示图1中吸附器(11、12)内部结构的图4，当含有HIV(3)的血浆进入吸附器时，其中的HIV(3)被固定在固相载体(2)表面的HIV抗体结合成抗原抗体复合物(4)，被结合后的HIV不再往下移动，另外从包被固相载体上脱落的抗原抗体复合物又被吸附器的底径细胞筛网阻挡在(5)处。

被吸附HIV后的净化血浆经图1所示的出口管路(13)与血浆分离器(8)分离的单个细胞在出口管路(14)汇合后经静脉管路(15)汇流。如此净化血液、清除HIV，直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束。

整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用方便、自动化和安全。

Claims (8)

1.一种用于医学领域的艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，由循环管路将血液分离器、血浆分离器和吸附器依次连接成体外循环吸附装置，其中血液分离器用于滤除因两个或以上HIV感染细胞融合而形成的多核巨细胞，之后的血浆分离器用于分离单个血细胞和血浆，所分离的血浆滤过吸附器时，其中的HIV被吸附，滤出的血浆与所分离的单个血细胞汇合后再次进入体外循环吸附装置，所述吸附器从出口处至入口处分层充填由低至高梯度效价的HIV抗体包被的固相载体。

2.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述血液分离器由内腔和外腔构成，内腔通过管壁上的微孔与外腔相通，所述微孔的孔径为1～250μm，能通过单个血液细胞但不能通过两个及以上相互粘合或融合而成的大体积细胞。

3.根据权利要求2所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述血液分离器的微孔孔径为150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm或1～2μm。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，还包含预筛滤的部分，选用微孔孔径为150～250μm、50～150μm的分离器进行预筛滤，用以分离特大体积的真菌、螺旋菌和/或肿瘤细胞。

5.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述血浆吸附器容积为200～300ml，液体进口处设有顶径细胞筛网，顶径细胞筛网目数为500～800目，液体进口与顶径细胞筛网之间设有促进系统稳定循环的缓冲区，出口处设有底径细胞筛网和细胞滤网，底径细胞筛网目数为2.0～5.0目，细胞滤网目数为100～200目，底径细胞筛网与液体出口之间亦设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

6.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述固相载体以生物相容性材料制成微球状、微管状、小片状或扁圆片状。

7.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述包被指分别将效价为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶512、1∶1024、1∶2048的HIV-1gp120抗体和/或HIV-1gp41抗体结合于固相载体表面。

8.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗仪，其特征在于，所述分层充填和梯度效价指吸附器从出口处至入口处依次充填8层效价为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶512、1∶1024、1∶2048的HIV-1gp120抗体和/或HIV-1gp41抗体包被的固相载体。