CN106267410A - 艾滋病感染细胞分离器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域的艾滋病感染细胞分离器，其特征是以高生物相容性材料制成能通过单个血细胞和化学成份但不能通过两个及以上粘合而成的大体积细胞、孔径为150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm、相对应标定为I～VII型的细胞分离器，同时制备HIVgp120和CD4抗体，HIV感染细胞表面的gp120能自身或在gp120抗体或CD4抗体作用下粘合另外的CD4+细胞，形成大体积的多核巨细胞，选用I～II型分离器分离特大体积的真菌、螺旋菌、肿瘤细胞，选用III～VII型分离HIV感染的大体积多核巨细胞、多细胞聚合体、易受HIV感染的CD4+细胞，艾滋病感染细胞在分离器与其他部件构成的体外循环中被分离清除。

Description

艾滋病感染细胞分离器

技术领域

本发明涉及艾滋病感染细胞分离器，主要应用于生物医学领域中艾滋病患者血液中被艾滋病毒感染的CD4+细胞的筛滤清除，从而达到治疗艾滋病的目的。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

HIV是感染人类免疫细胞的反转录病毒，直径约120纳米，大致呈球形，外膜是类脂包膜(来自宿主细胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合，向内是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分；HIV进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力；HIV进入宿主CD4⁺细胞后也可以表现为长期潜伏而不表现出临床症状，其基因组RNA反转录成双链DNA，与病毒整合酶进入宿主细胞核内，在整合酶的作用下，双链DNA整合到宿主细胞基因组内，被整合的病毒DNA称为前病毒，可潜伏数月甚至多年不复制，造成AIDS数月至多年的潜伏期。在AIDS的潜伏期，HIV主要在淋巴结的巨噬细胞和树突状细胞内繁殖，这些细胞是体内的HIV贮存库，可释放至外周血或转染外周血中的CD4⁺T细胞，有丝分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激发HIV前病毒基因在感染的CD4⁺T细胞内转录复制。此外，HIV病毒颗粒从感染的细胞释放至细胞外以前，表达于感染细胞表面的gp120和gp41能介导感染细胞与未感染细胞之间的融合，如感染的CD4⁺T细胞表达的gp120与未感染细胞的CD4结合，导致细胞融合而形成多核巨细胞。所以可设法清除血液中含有大量HIV的大体积多核巨细胞，以及将含有大量HIV的小体积单个细胞转变为大体积多细胞聚合体予以清除。

HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以仅依靠自身免疫功能无法将其清除。但可以应用目前技术上已经很成熟的各种常规多克隆或单克隆抗体等制备方法，进行产业化、工业化制备高滴度的HIV(Gp120，Gp41)抗体(市场有供应产品)及CD3、CD4抗体，由于抗体能与抗原发生特异性结合，所以感染HIV的细胞或含有CD3、CD4细胞分别能被HIV(Gp120，Gp41)抗体或CD3、CD4抗体结合形成大体积的多细胞聚合体而根据体积不同在体外予以筛滤清除，达到治疗艾滋病的目的。

从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染HIV的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)HIV整合酶抑制剂：通过抑制HIV病毒DNA与宿主细胞DNA整合而发挥作用，与HIV逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制HIV病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与CD4结合、阻断HIV与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于T淋巴细胞表面CC趋化因子受体5(CCR5)来阻断HIV进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节T细胞动态平衡。(6)HIV疫苗治疗：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：HIV基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、RNA诱饵、RNA干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入II期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调CD4+T细胞表面CCR5来降低HIV的易感性、延缓艾滋病的进展和减少HIV的扩散，中和单克隆抗体2G12、2F5和4E10应用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养HIV自体的CD4+T细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的CD4+T细胞数量，而回输CD4+T细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。

血液净化技术，是指把患者的血液引出体外并通过一种净化装置，除去其中某些致病物质，净化血液，再回输入体内，达到治疗疾病的目的，早期的血液净化常指血液透析技术，用于尿毒症患者肾替代治疗，随着医学的进步和血液净化装置的发展，在血液透析的基础上派生出不同的血液净化方式，如血浆置换、血液灌流、免疫吸附、血液滤过等，不同血液净化技术的应用，大大改善了某些疑难复杂疾病的治疗，如应用血浆置换技术清除大分子免疫复合物类致病因子以减轻、调节和治疗某些免疫性疾病。20世纪80年代以来，浙大一院李兰娟团队开始运用血浆置换治疗肝衰竭，即将肝衰竭患者的血液引出体外，分离出血浆，经吸附除去有害物质后，重新回输患者体内，取得了较好疗效，并在此基础上创立了非生物型、生物型、混合型人工肝支持系统，以及所涉及的人工肝透析器、血液滤过器、活性炭(树脂)吸附器、生物反应器等人工肝支持系统部件的改良和创新。但未见国内外将血液净化技术应用于艾滋病治疗的文献报道。

总之，各种药物及生物制品无法杀灭体内的艾滋病毒，且价格贵，副作用大，至今尚无治疗艾滋病的有效方法，已成为久攻不克的世界性难题。

发明内容

为了解决久攻不克的艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供艾滋病感染细胞分离器；另一目的是要提供分离器的制备及应用。

本发明的目的是这样实现的：以生物相容性好的高分子材料制成能通过单个血细胞和化学成份但不能通过2个及以上粘合而成的大体积细胞、孔径为150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm相对应标定为I～VII型的细胞分离器，同时制备HIVgp120抗体和CD4抗体，艾滋病感染细胞表面的gp120能自身或在HIVgp120抗体或CD4抗体作用下粘合另外的CD4+细胞，形成大体积的多核巨细胞或多细胞聚合体，选用I～II型分离器分离特大体积的真菌、螺旋菌、肿瘤细胞，选用III～VII型分离HIV感染的单核巨噬细胞、多核巨细胞、多细胞聚合体、吸附有HIV的颗粒性物质以及易受HIV感染的CD4+细胞，艾滋病感染细胞在分离器与其他部件构成的体外循环中被分离清除。

本发明根据艾滋病感染细胞表面的gp120能自身或在相应抗体的作用下粘合另外的CD4+细胞，形成大体积的多核巨细胞或多细胞聚合体的特点，制备特定孔径型号的分离器，结合血浆置换技术建立的体外循环装置分离艾滋病患者血浆中的含大量HIV的感染细胞粘合而成的大体积细胞，能有效阻断新生的CD4+T细胞再被HIV感染，能使体内HIV不断被清除而减少直至消失，从而达到免疫重建的治疗目的，与目前无法杀灭HIV和有效阻断从血浆到CD4+T细胞的循环感染途径、且费用昂贵、药副作用大的常规抗逆转录病毒治疗方法相比，本发明以体外机械滤除HIV的方法替代长期以来无法杀灭HIV的体内治疗方法，更经济、无药副作用，实现了人工将HIV从体内转移到体外清除的治疗新方法，鉴于HIV在体内不但不被免疫吞噬细胞杀灭反而被保护在细胞内而进一步生长增殖，而各种传统治疗方法都是想把HIV消灭在体内，存在观念束缚的共性问题，本发明所采取的是人工将HIV引出体外加以清除的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的艾滋病感染细胞分离器的应用示意图。

图2是艾滋病感染细胞分离器的内部结构示意图。

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端与分离器(7)的内腔(6)的入口(4)相连通，中间有流量阀(2)和进样口(3)，内腔(6)的管壁(5)有很多能通过各种单个血细胞和化学成份但不能通过2个及以上细胞粘合而成的大体积细胞的微孔，内腔(6)通过管壁(5)的这些微孔与外腔(8)相通，外腔(8)与静脉血路管(9)的一端相连通，静脉血路管(9)的另一端与静脉血管相连通，静脉血路管(9)有流量阀(10)。

图2中，分离器(1)的内腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨细胞(4)不能滤过微孔(3)而被阻留在内腔(2)，从而可被清除，能通过微孔(3)的中、小体积的单个细胞(5)进入外腔(6)，然后经出口(7)流出。

下面结合图1和图2，对本发明提出的艾滋病感染细胞分离器的实施方案作详细的描述。

1、艾滋病感染细胞分离器的制备

(1)制备原理：①血细胞、细菌、病毒的分子大小：人体血液中有形成份(细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。细菌的大小为：球菌的直径约在0.75-1.25μm之间，杆菌长度约在2-5μm，螺旋菌长约100-200μm。病毒的大小以纳米(nm)为单位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒间大小差异很大，最小的如植物的联体病毒(Geminiviruses)直径仅18-20nm，最大的动物痘病毒(Poxviruses)大小达300-450nm×170-260nm，最长的如丝状病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小为80nm×790-14000nm，多数单个病毒粒子的直径在100nm左右，艾滋病毒为100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相关成份：多核巨细胞(HIV感染细胞表面的gp120与CD4+细胞结合而成的大体积的HIV感染细胞)、gp120细胞(表面有gp120但以单个细胞存在的HIV感染细胞)、基因整合细胞(艾滋病感染初期或潜伏期，整合有HIV双链DNA，但细胞表面没有gp120的HIV感染细胞)、正常白细胞(未感染HIV的单个细胞存在的粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)、红细胞、血小板、化学成份(蛋白质、糖类、脂类、电解质等)、游离的HIV、细菌及其他微生物。③多核巨细胞为天然的大体积细胞；gp120细胞和基因整合细胞可通过抗原和抗体的免疫反应使细胞凝集为大体积多细胞聚合体；游离的HIV可通过载体颗粒/免疫反应转变为大体积成份。④根据上述3点，可以制备能通过单个细胞但不能通过大体积细胞或颗粒的艾滋病免疫筛滤器，或选用具有选择性吸附功能的材料，经本发明的体外血液循环支路筛除或吸附清除艾滋病患者血液中的HIV(感染细胞)。

(2)材料与要求：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。在筛滤器内表面加亲水凝胶，将2甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-丁基异丁烯酸固化在醋酸纤维素膜上，通过控制湿纺过程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有较高的溶质清除率和水通透性，血液和细胞相容性好，可用于血液滤过。将某些具有抗凝作用的物质固化在筛滤器内表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，还可降低肝素用量，并有可能实现无肝素化筛滤。如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，筛滤效果可能会更好，并可减少筛滤期间的过敏反应，；固化壳聚糖和肝素共价物的聚丙烯腈表面也显示了良好的血液相容性，并可抑制铜绿假单孢菌的活性，降低细胞毒性反应。将肝素共价结合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力学性能，又能提高透析膜的抗凝血性能。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。另外，将相关抗体包被在筛滤器的内表面，有利于相关抗原或含相关抗原细胞成份的筛滤清除。此外，要注意所选用的材料要么能选择性地吸附欲清除的细胞或HIV，要么对各种待分离成份都无选择吸附作用、仅取决于分子筛(微孔大小)分离清除。随着高分子材料和纳米技术的不断发展，与人类血管内皮接近的材料在不久的将来会出现。

(3)型号与规格：就分离器的外形来说，可以制备成柱形结构(以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯)、扁平结构(以聚醋无纺布等材料作滤芯)等形状；就孔径来说，可以制备成孔径为150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等多种型号，作为一次性用品使用，或在内腔设置废液出口，以增加使用次数。

(4)应用原则：根据艾滋病患者的病情选用不同型号的分离器，原则上先选用大孔径型号做预分离，然后选用较小孔径的型号。重度艾滋病患者常发生严重的机会性感染，血液中含有不同大小体积的成份。如含有特大体积的真菌、螺旋菌、肿瘤细胞及其他异物，则选用孔径为150～250μm或50～150μm的分离器；如为筛滤HIV感染的单核巨噬细胞、多核巨细胞、多细胞聚合体及吸附有HIV的颗粒性物质，以及为了置换易受HIV感染的CD4+细胞，则选用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之类的型号。这几种型号近似或小于血液中单个红细胞、中性粒细胞、小淋巴细胞的体积，但红细胞、中性粒细胞及巨噬细胞具有变形运动的特性，能通过比自身体积更小的微孔。

(5)本发明所涉及的艾滋病感染细胞分离器为一次性用品，用后按院内感染要求处理。

2、艾滋病感染细胞分离器的应用

(1)应用机理：在本发明的艾滋病感染细胞分离中，单个血细胞及化学成份因体积小而顺利通过微孔，而含有HIV的大体积细胞不能通过微孔而残留在分离器的内腔，通过定期更换分离器(一次性使用)而被清除。这种能被滤除的含有艾滋病毒的大体积细胞分为3种，第一种是艾滋病患者体内固有的(自身产生的)，因为HIV病毒颗粒从感染的细胞释放至细胞外以前，表达于感染细胞表面的gp120和gp41能介导感染细胞与未感染细胞之间的融合，如感染的CD4+T细胞表达的gp120与未感染细胞的CD4结合，导致细胞融合而形成多核巨细胞；第二种能被滤除的含有艾滋病毒的大体积细胞是通过免疫反应形成的，即经进样口3加入HIVgp120抗体后，HIV抗体凝集表面表达有gp120的CD4+细胞(HIV感染细胞)，形成大体积的多细胞聚合体而被滤除。当然这种经进样口3外加的本来就可用于免疫治疗的HIV抗体可回流到体内，并在体内形成同样的多细胞聚合体，同样可以经本发明的分离器筛滤清除；第三种能被滤除的含有艾滋病毒的大体积细胞是在艾滋病感染初期或潜伏期，整合有HIV双链DNA的CD4+细胞。当经进样口3加入CD4(或CD3)抗体时，CD4+细胞(CD3+细胞)被凝集成多细胞聚合体而被滤除，具有早期防治作用，但不管是否胞内感染了HIV，所有的CD3+/CD4+细胞都是滤除对象，具有HIV易感细胞置换的意义，需在其他替代药物及防感染的条件下(白细胞成份输血、免疫增强剂、防感染病房等)才可启用。

(2)应用路径：由图1给出，艾滋病感染细胞的分离基于血浆置换技术，由体外循环支路构成，艾滋病患者的动脉血液(全血)经动脉血路管(1)进入分离器内腔(6)，通过内腔管壁(5)的微孔流入外腔(8)，然后经静脉血路管(9)回流入患者的静脉。流量阀(2)和流量阀(10)具有调节血流量和速度的功能，并能分别调节分离器内、外腔的压力，从而产生压力差，可以阶段性地消除可能的微孔堵塞现象。进样口(3)供加入抗凝剂(肝素)、免疫抗体及其他所需成份之用。由图2给出，当体外循环的血液进入分离器(1)的内腔(2)时，血浆和中、小体积的单个细胞(5)经微孔(3)滤入外腔(6)，然后经出口(7)流出，而因寄居有HIV而形成的多核巨细胞(4)被微孔(3)阻留在内腔(2)，从而被分离清除。

3、艾滋病感染细胞分离器的附加应用部件

图1给出的艾滋病感染细胞分离器是本发明的基本构成部份，在此基础上还可以改装以下部件，包括血泵、肝素泵、动静脉压和空气监测、温度控制系统、配液系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分。

(1)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持血液分离的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。

(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。

(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，在本发明基本构成体系的基础上，有望进一步研发自动化治疗仪器，发展为操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理系统。

4、艾滋病感染细胞分离器的使用方法

(1)安装：以无菌操作连接筛滤器各部，包括动脉血路管1、分离器7和静脉血路管9。

(2)排气：以无菌生理盐水充液分离器及其动、静脉体外循环管道，排除分离器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后，关闭流量阀2和流量阀10。

(3)通液：将动脉血路管1接通艾滋病患者的动脉血管，先打开流量阀2，然后打开流量阀10，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

(4)抗凝：从进样口3向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。

(5)启动：再次关闭流量阀2或流量阀10，将静脉血路管9接通艾滋病患者的静脉血管，然后打开流量阀2和流量阀10，开始艾滋病感染细胞的分离治疗，血流量为100～150ml/min。

(6)抗体：根据病情需要，确定是否加免疫抗体、加哪些抗体及其用量，可从进样口3持续加入，如果仅为滤除患者体内固有的多核巨细胞，则不加抗体；如果仅为滤除表面表达有gp120的单个细胞形式存在的CD4+细胞(HIV感染细胞)，则加HIVgp120抗体；如果要滤除整合有HIV双链DNA但表面没有表达gp120的单个细胞形式存在的CD4+细胞，则加CD4抗体(或CD3抗体)。

(7)清堵：关闭流量阀10，轻轻挤压一下静脉血路管9，可以排除管壁5的微孔堵塞。

(8)根据需要定时更换分离器及动、静脉循环管道，本发明的分离器为一次性用品。

5、本发明所涉及的HIVgp120抗体的制备

本发明所涉及的抗体可以委托专业商家制备，或直接从专业商家购买，如上海瑞齐生物科技有限公司及上海领潮生物科技有限公司等单位都专业从事HIV-1gp120抗体、gp41抗体及CD3、CD4抗体等各种抗体的制备和销售。下面列举几种常规的抗体制备方法。

(1)采用艾滋病毒免疫的淋巴细胞制备抗体

取浙江大学传染病实验室样本库中冻存的HIV-1感染者的淋巴细胞株(经HIV免疫即经HIV全病毒免疫和EBV转染的淋巴细胞)，或购买所得的血站新鲜血细胞并进行过HIV感染株免疫的淋巴细胞，或直接取自HIV-1感染者自身的外周血，或取自为做研究冻存的脐血，采用Histopaque淋巴细胞分离液从血细胞中分离所得单个核细胞(PBMC，主要为实时发现的已被HIV免疫的淋巴细胞)，调节浓度为2x10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培养过夜，制备待杂交B细胞，用ELISA方法筛选抗HIV-1外膜蛋白(gp120)阳性孔，转移细胞至24孔板继续培养2周，重复用ELISA法测定抗gp120确认阳性者，连续克隆二次并大量扩增培养。将阳性细胞株与人鼠异质骨髓瘤细胞(由浙江大学免疫系购得)混合(3∶1)后，加入1ml 50％PEG使二者融合，然后重悬细胞在IMDM培养液中培养过液，第二天加入小鼠腹腔细胞(由浙江大学免疫系购得)作为滋养细胞，继续培养3周后用ELISA筛选抗gp120抗体，挑选强阳性孔杂交瘤细胞扩增培养，并进行多次克隆直至获得稳定的细胞系，以此细胞系培养、制备HIV-1抗体，采用ELISA检测试剂盒，按说明书操作，测定抗体的Ig亚类，并以常规ELISA法测定抗体的效价和特异性，选出特异性强、效价高的抗体。同理制备HIV-1gp41抗体。

(2)采用基因重组HIV-1gp120制备抗体

①试剂与重组抗原：涉及试剂由浙江大学传染病实验室购买或备用，包括：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纤维膜条由北京万泰药业公司提供BamH I内切酶Xho I内切酶、核酸共沉淀剂、T4 DNA Ligase购自宝生物有限公司；Liagen胶回收试剂盒购自QIAquick公司；RPMI 1640于粉培养基购自Gibco公司；优级新生牛血清购自明海生物工程有限公司；SupersignalWest Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit购自Pierce公司；小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem购自Sigma公司。HIV-抗体诊断试剂盒购自上海科华生物有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自博士德有限公司。重组质粒构建及鉴定：载体质粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase连接gp120基因片段，重组质粒转化入大肠杆菌XL1-blue，进行测序。重组蛋白的诱导表达及鉴定：重组质粒转化入XL1-Blue大肠杆菌中，在IPTG诱导剂作用下25℃，190r/min震荡，过夜，4 000r/min离心10min，收集细菌，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。融合蛋白纯化和鉴定：表达产物离心收集沉淀经PBS悬起，用30W超声粉碎仪裂解细菌后，将其离心收集上清过滤，滤液用AKTA PURIFYER100蛋白纯化仪、GST柱纯化，得到融合蛋白GST-HIV，浓缩离心管进行浓缩，S21型生物分光光度计测量浓度，SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

②动物免疫：BALB/c小鼠6周龄，雌性，4只，免疫前取小鼠静脉血，分离血清留做阴性血清。将50-100μg的GST-HIV融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐剂与融合蛋白乳化后加强免疫小鼠，免疫剂量和途径同前，重复免疫2-3次，最后一次加强免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

③单抗检测方法的建立：第三次免疫后一周尾静脉采血，用方阵法确定阳性血清的最佳工作浓度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被浓度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100四个稀释度，使用包被缓冲液稀释抗原，纵向包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，洗涤3次，每次间隔3分钟。将阳性血清和阴性血清分别由1∶1000开始作倍比稀释，横向加样到第10孔，每孔100μL，置于湿盒中37℃温育1h，洗涤3次，每次间隔3分钟。酶标抗体HRP-羊抗鼠IgG按照说明书作1∶10000稀释，每孔100μL，37℃温育1h，洗涤3次。加人现配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反应适当时间，每孔加100μL终止液终止反应，检测其OD492值。阳性杂交瘤细胞筛选方法建立。按照方阵法中实验条件和方法，分别以GST-HIV融合蛋白为实验组，诱导表达后重组菌(含质粒pET-32a)蛋白为对照组，筛选阳性克隆。操作步骤如下：在96孔酶标板上以最适包被浓度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被过夜取出包被板后加入洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加待测细胞上清(1∶5稀释)100μL，37℃温箱孵育50min，之后洗涤3次，每次洗涤3min；每孔再加入二抗100μl，37℃温箱孵育30min，洗涤3次，每次洗涤3min；每孔加入现配的OPD底物液100μL，室温避光反应10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4终止液100μl用于终止反应；将检测板放在酶标仪上测OD492值。对照组的设立：阳性对照组为适当稀释的阳性血清，阴性对照组是和一抗有相同稀释度的无关单抗的细胞上清。间接ELISA筛选结果判定。每组检测OD492值，以P(样品值)/N(阴性值)≥2.0者判为阳性值。筛选阳性克隆标准：细胞上清与正筛选组(纯化后融合蛋白包被)反应呈阳性，同时与负筛选组(诱导后的含pET-32a质粒的菌体蛋白)反应呈阴性的检测孔为阳性样品。

④细胞融合：骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合前使用适量胰酶消化后使用离心管收集，加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次。脾细胞准备：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉颈处死，在75％乙醇中浸湿。取出后仰放固定于解剖板上，无菌环境下取脾脏，将脾脏移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基础培养基，用平口镊子反复挤压破碎后，使用无菌注射器反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。计活细胞数后1000r/m离心10min，加入基础培养基调整总细胞数到1×10⁸-2×10⁸用于细胞融合。细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mLHA T培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

⑤阳性克隆株的筛选：观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，通过之前建立的单抗筛选方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆。采用改进的有限稀释法——梯度有限稀释法连续对间接ELISA初步筛选出的阳性细胞孔进行3-4轮的亚克隆。选择有生长状态良好的阳性杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞培养上清进行抗体检侧。对检测结果为阳性的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测上清效价稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

⑥杂交瘤细胞株的保存与传代培养：保存与复苏：保存前12小时调整细胞生长状态。取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/m离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/m离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/m离心5min，弃去上清，细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。传代培养阳性杂交瘤细胞连续传10代，采用间接ELISA的方法测定培养上清抗体效价，观察效价的变化，观察此阳性杂交瘤细胞株是否能稳定分泌抗体。

⑦单抗小鼠腹水的制备：低速离心收集培养后的杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水。采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2-3天，同样方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m离心5min，吸取上清液，分装，-20℃保存。

⑧单抗的特性鉴定：特异性：Weston-Blotting实验参照《分子克隆》方法进行，半干法转印，程序如下：首先以纯化的CD4融合蛋白和诱导后重组菌蛋白经12％SDS-PAGE，一组用做对照，一组用做转印。电泳完毕，将胶切割后和同样大小的6张滤纸放入阴极缓冲液中；将NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去离子水中，1-3min后再与6张同样大小大的滤纸一起放入阳极液中；用阴极缓冲液将电泳槽的阴极板涂抹湿润，取出阴极缓冲液中的滤纸和凝胶依次放在阴极板，轻轻压出气泡。再将阳极缓冲液中NC膜和6张滤纸从阳极液中取出依次铺在凝胶上，轻轻压出气泡。最后轻轻盖上电泳槽阳极板。接通电源后，根据NC膜的面积，2mA/cm2电流大小，转印2h；转印结束后，胶取出后进行染色，转移膜取出后，用PBS稀释的5％脱脂奶粉封闭，4℃冰箱静置过夜。封闭过夜后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。洗涤过后，加入1∶10稀释的单抗细胞上清，在摇床上轻摇，室温反应60min。弃去一抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。根据Dot-ELISA摸索的条件，加入1∶5000稀释度的二抗，在摇床上轻摇，室温反应50min。弃去二抗，再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min。将有蛋白条带的NC膜做好标记，加入DAB显色剂，反应适当时间后用去离子水冲洗终止反应。效价以纯化的CD4融合蛋白为检测抗原，采用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和单抗腹水的效价。单抗亚类鉴定选用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗即用试剂盒测定，按照试剂盒操作说明书来操作，步骤如下：将适当稀释的纯化后CD4融合蛋白包被于酶标板，每孔100uL，置4℃冰箱过夜。将酶标板中的包被液拍干，然后用洗涤缓冲液洗一次，3min。然后将待测的杂交瘤细胞培养上清加入孔中，每孔100μL，置37℃温箱温育30min。拍干后用洗涤缓冲液洗五次，3min/次。将本试剂盒中的6种酶标记物分别加入孔中，每孔100μL，置于37℃温育30min。继续用洗涤缓冲液洗五次，3min/次。加OPD底物液避光显色15分钟后加入终止液，用酶标仪检测OD492值，OD492值明显高出其它孔的类型即为HIV-1gp120单抗Ig类别。

⑨HIV-1gp120单抗经进一步精制后应用(可制备可由专业商家操作完成)。

6、本发明所涉及的CD4抗体、gp41抗体、CD3抗体的制备

目前已有商品化制备的细胞因子(CD2、CD3、CD4)类单抗上市，可委托商家构建基因重组CD4抗原，采用杂交瘤技术制备，制备的基本方法同HIV-1gp120单抗的制备。

7、实验验证

本发明人按照本发明的基本方法，做了如下的简易验证实验。

取由浙江省传染病控制中心等实验室生物样本库提供的已确诊的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分别取数份相同ABO血型的抗凝全血混合成为5例，使血液量足够大，然后委托浙江省医院中心血站按成份输血的血液成份分离方法，经血液成份分离系统分离出白细胞、红细胞、血浆，取白细胞成份按常规离心沉淀，吸弃上清液，以适量的生理盐水悬浮白细胞沉淀，然后加入合适比例的gp120抗体(上海广锐生物科技有限公司生产)，混匀后置37℃反应5分钟，然后以孔径为20～30um的血液成份分离系统分离出大体积的白细胞(称为大白细胞)，对滤过的白细胞滤液再进一步以孔径为15～25um的血液成份分离系统分离出中等体积的白细胞(称为中白细胞)，滤液中的白细胞为小体积的白细胞(称为小白细胞)，分别收集大、中、小白细胞分离悬液，常规离心沉淀，吸弃上清液，以定量移液器分别吸取等量的大、中、小白细胞沉淀，常规方法(机械或细胞裂解液)裂解细胞(如用同种裂解液，需加量相等)，离心沉淀后取上清液，然后根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表1)说明，AIDS患者不同体积大小的白细胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白细胞中HIV-p24的平均含量分别为275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白细胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，减少了54.4％；在大、中、小白细胞中HIV-P24的总含量分别为1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白细胞中HIV-p24总含量相差742.9pg/ml，减少了54.3％，经统计学检验，t＝2.43，p＜0.05。说明AIDS患者体内的大体积白细胞或经gp120抗体作用后而形成的大体积白细胞中含有较高含量的HIV，可以通过实施本发明的技术方案被分离清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白细胞中HIV-p24检测结果(p24：pg/ml)

Claims (10)

1.一种用于生物医学领域的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，分离器(7)含有内腔(6)，内腔(6)的管壁(5)由生物相容性好的高分子材料制成，内腔(6)通过管壁(5)上的微孔与外腔(8)相通，所述微孔的孔径为1～250μm，能通过单个细胞和化学成份但不能通过2个及以上粘合而成的大体积细胞。

2.根据权利要求1所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，所述分离器的微孔孔径为150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm。

3.根据权利要求2所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，选用微孔孔径为150～250μm、50～150μm的分离器分离特大体积的真菌、螺旋菌和/或肿瘤细胞；选用微孔孔径为15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm的分离器分离HIV感染的单核巨噬细胞、多核巨细胞、多细胞聚合体、吸附有HIV的颗粒性物质和/或易受HIV感染的CD4+细胞。

4.根据权利要求1-3任一所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，在分离器内腔(6)中加入抗体，以分离在抗体作用下形成的含艾滋病毒的多细胞聚合体。

5.根据权利要求4所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，所述抗体包括HIVgp120抗体、gp41抗体、CD3抗体和/或CD4抗体。

6.根据权利要求1-5任一所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，所述生物相容性好的高分子材料是聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉或纳米材料。

7.根据权利要求1-6任一所述的艾滋病感染细胞分离器，其特征在于，所述分离器是柱形或扁平结构。

8.权利要求1-7所述的艾滋病感染细胞分离器在制备体外血液循环装置中的应用，其特征在于，所述体外循环管路包括动脉血路管(1)，其一端连接分离器(7)的内腔(6)的入口(4)，中间有进样流量阀(2)和进样口(3)，外腔(8)连接静脉血路管(9)，静脉血路管(9)有出样流量阀(10)。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，启用体外血液循环装置时，血液(全血)经动脉血路管(1)进入筛滤器内腔(6)，通过内腔管壁(5)的微孔流入外腔(8)，然后经静脉血路管(9)流出。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，进样流量阀(2)和出样流量阀(10)具有调节血流量和速度的功能，并能分别调节分离器内、外腔的压力，从而产生压力差，可以阶段性地消除可能的微孔堵塞现象，进样口(3)供加入抗凝剂、免疫抗体及其他所需成份之用。