CN106344986A - 母胎血型不合治疗吸附器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学领域的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于以EB病毒永生化经Rh阳性红细胞致敏并能产Rh抗体的Rh阴性B细胞，将之与骨髓瘤细胞溶合为B细胞杂交瘤细胞，制备Rh抗体，转而作为抗原免疫动物制备抗Rh抗体，以1.0％琼脂糖配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100滴度梯度，按滴度从高到低依次取8～10ml加入高分子材料制成的圆柱形容器，使凝胶从上到下形成从低到高的抗体滴度的分层分布，血浆流经治疗器时，Rh抗体被固定在凝胶中的抗Rh抗体分层结合，被破坏红细胞产生的大分子有害物也被凝胶微孔阻留，去除Rh抗体及致病物的血浆回输体内，从而避免孕妇Rh抗体过多进入胎儿血液所致的母胎血型不合溶血病。

Description

母胎血型不合治疗吸附器

技术领域

本发明涉及医学领域中母胎血型不合治疗吸附器，主要用于母胎血型不合孕妇血浆中抗胎儿红细胞抗体及溶血病患儿血浆中被破坏红细胞产生的致病物质的吸附清除。

背景技术

胎儿继承父亲和母亲各一半的基因成分，胎儿红细胞可以携带来自父体的抗原，表现为胎儿的血型不同于母体。当胎儿的红细胞进入母体的血液循环后，诱导母体的免疫系统产生抗体，抗体经过胎盘进入胎儿血液循环系统，结合胎儿红细胞，使胎儿红细胞被破坏，导致胎儿和新生儿的母胎血型不合溶血性疾病。

人类红细胞血型有26种，包括ABO血型、Rh血型以及MN、Lew、Kell和Fya等血型系统，但能引起母胎血型不合溶血病的血型以Rh血型和ABO血型为最常见。Rh血型抗原是由1号染色体上3对紧密连锁的等位基因决定的，共有6种抗原，即C和c，D和d，E和e。由于D抗原最早被发现，抗原性最强，故临床上凡是D抗原阳性者称为Rh阳性，无D抗原者称为Rh阴性。Rh血型抗原的抗原性决定了溶血病的严重程度，以D抗原的抗原性最强，其次为E抗原，再次为C、c和e抗原，d抗原的抗原性最弱，目前尚无抗d抗体发现。

虽然ABO血型不合的发生率很高，但胎儿溶血发生率很低，即使发生溶血，症状亦较轻，极少发生核黄疸和水肿，妊娠期无需特殊处理。而Rh血型不合虽然少见，但其引起母胎血型不合溶血病的病情程度要重于ABO血型不合，所以对Rh血型不合的诊断及预防极其重要。Rh血型不合由于母体产生大量抗胎儿红细胞的IgG抗体，进入胎儿体内后破坏大量的胎儿红细胞，使胎儿严重贫血、心衰、肝脏缺氧损伤、低蛋白血症，表现为胎儿全身性水肿、胸水、腹水等。在新生儿时期，Rh血型不合性溶血较ABO血型不合出现黄疸时间早，最早出现在出生后12小时内，多数出现在24小时内。由于溶血产生的大量胆红素不能及时从肝脏排除，使新生儿黄疸加重，大量的胆红素渗入脑细胞而引起核黄疸，常死于严重贫血、心力衰竭、核黄疸，死亡率很高。

目前临床上对母胎血型不合溶血病的孕期治疗主要有血浆置换、胎儿输血和终止妊娠。其中胎儿输血包括胎儿腹腔内输血和胎儿血管内输血，均具有一定风险，且无一被证实有效；孕妇血浆置换就是在体外循环通路中以滤过法分离孕妇的血细胞和血浆，去除血浆并以等量的置换液(新鲜冰冻血浆或5％白蛋白)补充回输，每次置换量2000～3000ml、速度20～30ml/min、治疗时间2～4h、每1～3d治疗1次；或每次取孕妇全血约400ml，低温离心后去其血浆约300ml，补充等量同型新鲜血浆，还输自身红细胞(RBC)。血浆置换能与被去除的血浆量成比例地降低致病抗体的滴度(效价)，从而能延长胎儿在母体内的存活和生长发育时间、能延迟终止妊娠的时间，是母胎ABO、Rh或其它血型不合的孕妇在临床早期保胎治疗上的良好选择，具有较好的疗效，也无其他不良反应。但血浆置换只能去除血液中的部分抗体，不能中止抗体的继续产生，也不能逆转已发生的母胎血型不合溶血病，需要不间断地进行血浆置换才有效，仅适用于曾在妊娠20～22周前发生过胎儿水肿的孕妇，或配偶为致病抗原的纯合子者，特别是在去除部份致病抗体的同时，也一同去除了大量的血浆(多种有益成份)，虽然以置换液作了补充，但无法完全补足被去除血浆及其各种有益成份，而且替补的置换液量大、费用昂贵，补充异体血浆易致传染病和输液反应等各种副作用，这就限制了血浆置换的普遍开展。

所以，迫切需要一种仅去除致病抗体、不去除血浆(多种有益成份)、无需使用血浆置换液的廉价、安全、无副作用的母胎血型不合溶血病的治疗新方法。

凝胶中抗原-抗体沉淀反应于1905年首先应用于研究利泽甘氏现象，1932年应用于鉴定细菌菌株，1946年Oudin在试管中进行免疫扩散试验，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分别建立了琼脂双向扩散法，用于鉴定两种以上抗原或抗体。凝胶中抗原-抗体沉淀反应的介质凝胶琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中基本呈自由扩散。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，这种沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。这样，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此种反应称为琼脂凝胶扩散，是目前用已知抗体检测未知量相应抗原的常规实验诊断项目，通常将一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人Ig抗血清的琼脂板，当待检血清在琼脂板中扩散时，在抗原和抗体比例合适处发生结合，形成肉眼可见的白色沉淀而不再扩散，另外当母胎血型不合产生抗胎儿红细胞抗体时，抗体与红细胞结合后在补体的参与下致红细胞破坏，产生较大分子的破坏产物，能被某些特定大小的微孔所阻留。但至今未见据上述机制设计治疗血型不合溶血病的报道。

发明内容

为了解决久攻不克的母胎血型不合溶血病的治疗问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供母胎血型不合溶血病治疗吸附器；另一目的是要提供吸附器的制备及应用方法。

本发明的目的是这样实现的：以EB病毒永生化经Rh阳性红细胞致敏后能产生相应抗体(Rh抗体)的Rh阴性B淋巴细胞，并将之与人或鼠骨髓瘤细胞溶合成为B淋巴细胞杂交瘤细胞，制备Rh抗体，转而作为免疫原免疫动物制备抗Rh抗体，检测效价，分别以起载体作用的经100℃溶化后保温在56℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％琼脂糖C1-4B生理盐水配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效价梯度的应用抗体，按效价从低到高依次取15～20ml加入以丙烯酸酯之类高分子材料制成的在出入口设置了能阻挡特定致病微粒网筛的圆柱形容器内，使先加入的应用抗体冷却至半固体凝胶后才接着加下一次，制成使容器中的凝胶从进样端到出样端形成从高到低的抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布的吸附器，有利于血浆灌流及分子筛和免疫结合的作用，当体外循环中被分离的血浆流经吸附器时，Rh抗体被固定在凝胶中的抗Rh抗体分层结合成固定的复合物，被破坏的红细胞碎片及与之结合而成的大分子免疫复合物被近吸附器出口端浓度渐高而分子筛渐小的琼脂凝胶阻留，去除致病物质的血浆从吸附器流出后回输体内，从而达到避免孕妇Rh抗体进入胎儿血液和减轻病情的治疗目的。

Rh抗体是母胎Rh血型不合溶血病的致病因子，而抗Rh抗体是Rh抗体的免疫性抗体，能与Rh抗体发生免疫反应而形成复合物，本发明以免疫学技术制备抗Rh抗体，以特定的比例固定于琼脂糖介质制成吸附剂，能与滤过血浆中的Rh抗体发生结合而形成固定的免疫复合物而被清除，琼脂凝胶所形成的滤孔随着琼脂糖浓度的增高而减少，近吸附器进口处的琼脂糖浓度低，滤孔就大，有利于血浆灌流及高滴度抗Rh抗体与Rh抗体的结合，而近出口处的浓度渐高，滤孔就渐小，易于阻留溶血病患者红细胞破坏所形成的碎片及与之结合而成的大分子免疫复合物，在吸附器出口处设置的能阻挡特定大小微粒的网筛也具有阻留红细胞破坏产物的作用，对致病物质形成了特异性免疫吸附和非特异性机械阻挡的双重屏障，特制琼脂糖介质冷却后凝成半固体，内部形成均匀多孔的网状结构，有利于游离抗原和抗体以及血浆成份的均匀扩散，避免了血浆液流的死腔，增加了抗Rh抗体吸附Rh抗体的均匀性和表面积，增强了吸附治疗的的效果，吸附了Rh抗体后的血浆滤出吸附器后回输体内，实现了人工将Rh抗体从体内转移到体外的治疗，是一种仅去除致病抗体，不去除血浆及其多种有益成份的无需使用血浆置换液的廉价、安全、无副作用的母胎Rh血型不合溶血病的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的母胎血型不合治疗吸附器的应用示意图。

图2是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构图。

图3是根据本发明提出的母胎血型不合治疗吸附器的内部结构图

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与2个并联的吸附器(8)、吸附器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。

图2中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的小分子血浆成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是可开关的阀门。

图3中，1是吸附器，2是进入吸附器的Rh抗体，3是被固定在琼脂凝胶中的抗Rh抗体，4是Rh抗体被抗Rh抗体结合吸附形成的抗原抗体免疫复合物，5是未被抗Rh抗体结合吸附而往下移动的Rh抗体，6是琼脂凝胶颗粒之间形成的微孔。

下面结合图1、图2和图3，对本发明提出的母胎血型不合治疗吸附器的实施方案作详细的描述。

1、制备Rh阴性淋巴细胞

(1)原代细胞获取：购买浙江省血站新鲜浓缩Rh阴性白细胞300ml；另购买新鲜Rh阳性红细胞悬液300ml。(2)Rh阴性淋巴细胞分离制备(分离液避光4度保存，用前在37度水浴中加温，整个分离过程温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量)：无菌抽取20mL新鲜浓缩Rh阴性白细胞，PBS液稀释3～5倍，充分混匀后取6mL用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min，20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一条以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为单个核细胞(PBMC)，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另一50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min，20℃)10min，弃上清，50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min，20℃)15min，弃上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA pH7.2)2mL重悬细胞，主要为Rh阴性淋巴细胞(T细胞和B细胞)。

2、制备Rh阴性致敏淋巴细胞

将Rh阴性淋巴细胞和Rh阳性红细胞悬液以1000r/min离心5min，去上清，常规细胞培养液洗涤1～2次，将两种沉淀细胞等量混合，加5倍量的常规细胞培养液(RPMI-1640)，37℃，5％CO2培养24h，然后用RPMI-1640液洗涤离心(1000r/min，3min)，以去除细胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解红细胞，迅速离心(1000r/min，3min)，去除上清液内的裂解红细胞碎片，PBS洗涤离心3次，RPMI-1640洗涤离心1次，以清除混悬液中残存的Tris-NH4Cl，避免其影响细胞的存活，此时，混悬液中主要含有Rh阴性致敏淋巴细胞。

3、制备Rh阴性致敏B细胞株(EB病毒转化Rh阴性致敏淋巴细胞)

按常规EB病毒转化淋巴细胞技术，取Rh阴性致敏淋巴细胞，调节浓度为2x 10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于37℃，5％CO2培养过夜，制备待杂交的EB病毒转化的致敏淋巴细胞。(1)试剂：RPM1640培养基：内含20％胎牛血清(Gibco){56℃灭活30分钟}、1.6～1.8％HEPES、1.2％谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素；环胞酶素A(CyA)：5ml(250mg)/瓶，用1640培养基稀释成0.2mg/ml，使用时终浓度为2ug/ml(0.5％)；EB病毒(EBV)液：购自中国科学院遗传所，储存于零下80度，使用时从冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的滤膜过滤，不要超过0.5～1小时。(2)方法：取Rh阴性致敏淋巴细胞，加6ml 1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟；弃上清液，加入2ml 1640全培养基(全培养基加入前，置37度水浴10分钟)，然后加入环胞霉素A(4％)和1.2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37度，5％CO2培养箱中；如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液；当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基；每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象；约6～8周，当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清，配成细胞悬液备用，主要为Rh阴性致敏B细胞株[如果要冻存，则加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)]。

4、筛选Rh阴性效应B细胞株(筛选产Rh抗体的EB病毒转化Rh阴性致敏淋巴细胞)

效应B细胞株是指能产生Rh抗体的B细胞株，以抗人球蛋白试验或常规ELISA法筛选产Rh抗体淋巴细胞：(1)直接抗人球蛋白试验：检测B淋巴细胞株(B细胞株)表面是否表达Rh抗体。购买抗人球蛋白血清和抗-D血清，以生理盐水洗涤1次并配成5％淋巴细胞株悬液，取1滴细胞悬液与2滴抗人球蛋白血清混匀，置室温5min后低速离心，轻轻混和，肉眼或镜下观察，发现淋巴细胞株凝集者为细胞表面表达有Rh抗体(同时配制未致敏的5％淋巴细胞悬液加抗人球蛋白血清做阴性对照；以Rh(D)阳性红细胞加抗-D血清做阳性对照)。(2)间接抗人球蛋白试验：检测淋巴细胞株培养上清液是否含有Rh抗体。以生理盐水洗涤2次并配成5％Rh(D)阳性O型红细胞悬液，各取红细胞悬液、淋巴细胞株培养上清液及抗人球蛋白血清1滴混匀，置室温5min后低速离心，轻轻混和，肉眼或镜下观察，发现红细胞凝集者为淋巴细胞株培养上清液含有Rh抗体(同时以红细胞悬液与抗人球蛋白血清混合管为阴性对照、以红细胞悬液与抗-D血清混合管为阳性对照)。以此直接或间接抗人球蛋白试验筛选出能分泌较高效价(较高倍数稀释后仍试验阳性)Rh抗体的B细胞株(孔)，继续传2～3代。

5、制备Rh阴性效应杂交瘤细胞(制备Rh阴性效应B细胞株杂交瘤细胞)

(1)培养基及主要试剂：DMEM培养基、HAT、HT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(-甲基亚砜)为国产分析纯试剂。(2)骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3～4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/min离心5-10min，重复洗涤细胞2次。(3)待杂交Rh阴性效应B细胞株准备：以基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。(4)细胞融合：将Rh阴性效应B细胞株与骨髓瘤细胞以5～10∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3～5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/min离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。(5)培养杂交瘤细胞：观察96孔培养板中细胞生长情况，7～10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择生长状态良好的杂交瘤细胞的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测杂交瘤细胞功能。(6)筛选Rh阴性效应杂交瘤细胞：Rh阴性效应杂交瘤细胞是指能产生Rh抗体的杂交瘤细胞，方法同筛选产Rh抗体的效应B细胞株，以直接或间接抗人球蛋白试验筛选出能分泌较高效价Rh抗体的Rh阴性效应杂交瘤细胞(克隆)，重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测功能稳定后取出，转入培养瓶大量培养[如欲冻存和复苏，则在保存前12小时调整细胞生长状态，取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/min离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/min离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/min离心5min，弃去上清，以备作扩大培养]。(7)扩增Rh阴性效应杂交瘤细胞：将Rh阴性效应杂交瘤细胞使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。按常规方法反复传代扩增培养。

6、制备Rh抗体

(1)从Rh阴性效应杂交瘤细胞培养上清液中以常规方法分离、纯化Rh抗体。(2)Rh抗体单抗小鼠腹水的制备：低速离心收集培养后的Rh阴性效应杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL，小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水，采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2～3天，同样方法再取腹水，收集到的腹水，10000r/min离心5min，吸取上清液，分装，-20℃保存。上清液中含有大量的Rh抗体，按常规方法分离、纯化Rh抗体、以抗人球蛋白试验或ELISA法测定抗体的效价。

7、制备抗Rh抗体

(1)实验动物：免疫用实验动物选用的是浙江大学动物学院杂交白山羊，体重30斤左右的健康青壮年母羊二只，免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记，采用随群圈养的饲养方式，每天保证羊只得到适量的运动，运动时间在傍晚，每次运动大概半小时左右，这样利于身体健壮，避免羊只过肥，增加机体的免疫力，饮水充足，并给予适量的精料、青草、玉米、麸皮、小麦、维生素等等，使其营养均衡。经常查看实验羊只健康状况。(2)免疫源：本发明制备的Rh抗体(Rh抗体即抗-D血清，有市售产品)接种前混合0.1mL抗原、1.9mL无菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐剂制成免疫原乳剂备用。(3)山羊的免疫：选取两只山羊，标记为山羊A、山羊B，接种抗原。免疫部位为前后腹股沟，每处腹股沟分2个点注射，总共有8个注射点，注射方式为皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每个注射点注射免疫原0.5mL，约含32μg抗原。免疫前两只山羊分别抽血10mL，标记为0dP1，-20℃保存；免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP1，以ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存，3～4周开始第二次免疫，免疫原为0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP2，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。第三次免疫时间为6～8周后，免疫原为0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP3，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存，如果此时血清效价没达到1∶10⁶以上，则需要再免疫一次；如果血清效价已达10⁶以上则不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分离血清，-20℃保存备用。(4)抗Rh抗体血清制备：一般每次免疫后7～10天即可于羊颈静脉采血检测，由助手协助保定动物，使其保持站立姿势，颈部剪毛、无菌棉球擦拭消毒后，寻找到颈静脉手持注射器采血，将注射器位置固定取血5～10mL。分离出血清后进行效价检测。在第三次免疫后7～10天，经效价检测合格后一次可取血30-50mL，在无菌条件下分离血清，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境(例如超净工作台)中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出(不能冰冻，否则产生溶血)，经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存，使用前须经过签定合格后再分装保存备用。(5)抗血清效价的测定：抗血清效价采用ELISA测定方法，包被时是将样品用包被液稀释到1∶1000的浓度后，在酶标板上每孔加100μL，然后放在铝盒中放入4℃冰箱里过夜，第二天早上拿出来拍干包被液，用PBST洗涤三次，每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入10％血清的封闭液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h，然后再拿出来拍干封闭液，用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀释，用4％牛血清的PBST稀释，放入37℃，水浴1～2h)，然后再拿出来拍干一抗液，PBST洗涤酶标板三次，每次间隔5分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h，再拿出来拍干二抗液用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，每孔加50μL底物显色液，闭光显色10～20分钟后加入2M的H2SO4溶液50μL终止反应，后用酶标仪测OD值(半小时内)。或以最大稀释倍数的抗人球蛋白试验结果阳性者作为抗体的效价。

本发明制备的Rh抗体即Ig抗-D，抗Rh抗体即抗Ig抗-D，按本发明的技术方案同样能制备Ig抗-A、Ig抗-B、Ig抗-E、Ig抗-C及抗Ig抗-A、抗Ig抗-B、抗Ig抗-E、抗Ig抗-C，并进一步制备免疫吸附吸附器。本发明在制备Rh抗体后，在进行抗Rh抗体的制备时，除了通过免疫山羊制备外，还可以通过免疫小鼠，然后取小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞溶合，然后按常规杂交瘤技术制备抗Rh抗体。

8、吸附器的制备

(1)制备原理：将能吸附致病物质的活性物质(配基)以交联或偶联的方式固定在高分子载体上制成吸附剂，以生物或理化亲和的特异结合来吸留、清除相应的致病物质。目前可用作免疫吸附剂配基的有蛋白A、特定的抗原或抗体(抗人IgG抗体)、C1q、聚赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等；可用作载体的有琼脂糖凝胶、葡聚糖、二氧化硅凝胶、聚乙烯醇珠、树脂等。吸附剂应具有特异选择性、稳定而可再生性、生物相容性(无毒、无变态反应、无物理化学反应、不激活补体和凝血系统)。

本发明基于母胎血型不合溶血病的病因是孕妇血浆中存在Rh抗体，而Rh抗体能被抗Rh抗体免疫中和以及琼脂糖冷却后凝成半固体，内部形成一种较大孔径的均匀多孔网状结构，游离的抗原或抗体能在琼脂凝胶中自由扩散的机制制作。

(2)制备材料：要求生物相容性好，无补体激活、无炎症反应、无白细胞、血小板、血氧分压、补体C3aC5a的改变。要求通过共价、接枝、聚合等方法改进材料表面的均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响。在吸附器内表面加亲水凝胶，如固化2甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-丁基异丁烯酸在醋酸纤维素膜上，通过控制湿纺过程而生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，可以提高生物相容性。将某些抗凝物质固化在载体或吸附器内表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至实现无肝素化，如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，可减少过敏体质的过敏反应；将肝素共价结合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力学性能和提高吸附器内表面的抗凝血性能。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。要注意所选用的吸附器制备材料要么能选择性地吸附欲清除的物质，要么对各种成份都无吸附作用。

(3)吸附器外壳的规格

制成50mm×60mm的底径小、顶径大的圆柱形容器，或制成方形、漏斗形，容积约200～300ml，上下部均设有细胞筛网，顶径筛网目数为500目，底径筛网目数为50目，液体出口处设置目数为200目的细胞滤网，构成了防止细胞碎片进入循环的第二道防线，液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

(4)制备方法：将所制备的抗体分别以起载体作用的经100℃溶化后保温在56℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％琼脂糖C1-4B生理盐水配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效价梯度的应用抗体，按效价从低到高依次取15～20ml加入以丙烯酸酯之类高分子材料制成的在出入口设置了能阻挡特定大小致病微粒网筛的圆柱形容器内，要求先加入的应用抗体冷却至半固体凝胶后才接着加下一次，制成使容器中的凝胶从进样端到出样端形成从高到低的抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布的吸附器，当体外循环中被分离的血浆流经吸附器时，Rh抗体被固定在凝胶中的抗Rh抗体分层结合成不再移动的免疫复合物，红细胞破坏产生的大分子致病物质及免疫复合物被近吸附器出口端浓度渐高而分子筛渐小的琼脂凝胶阻留，在出入口设置了能阻挡特定大小致病微粒网筛的吸附器也具有阻留红细胞破坏产物的作用，去除Rh抗体及致病物质的血浆从吸附器流出后回输体内，从而避免孕妇Rh抗体进入胎儿血液和减轻病情的治疗目的。

本发明不但以琼脂糖C1-4B为载体，还包括能吸附抗Rh抗体的高生物相容性材料为载体，将抗Rh抗体固定于树脂类载体颗粒上，通过固定载体颗粒而固定抗Rh抗体，用以吸附Rh抗体；还包括将能直接吸附Rh抗体和/或抗Rh抗体的高生物相容性材料制成吸附器和/或粘附于循环管路的内表面，用以吸附Rh抗体和/或抗Rh抗体。

9、吸附器的应用

吸附器应用时，需与相关构件共同组成体外循环支路。

(1)体外循环支路的构件及用途

①吸附器：内含抗Rh抗体、琼脂凝胶介质，用于清除Rh抗体、RBC碎片、Rh抗体与RBC碎片形成的免疫复合物等。

②血浆分离器：用于分离血细胞和血浆。

(I)制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(II)制备材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。

(III)规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状；按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

③动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测吸附器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是吸附器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当吸附器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

④空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

(5)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持治疗的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。

(6)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。

此外还包括温度控制系统、配液系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分。总之，在本发明基本构成体系的基础上，有望进一步发展为自动化、人性化、个性化、模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理系统。

(2)吸附器在体外循环支路中的使用方法

①安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、吸附器及各循环管路等各部。

②排气：以无菌生理盐水充液分离器、吸附器及各循环管路，排除分离器、吸附器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

③通液：将动脉血路管1接通艾滋病患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

④抗凝：从肝素泵向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。

⑤启动：将动脉血路管(1)接通治疗者的动脉血管，将静脉管路(5)接通治疗者的静脉血管，然后打开血液泵，血流量为100～150ml/min，如图1，当动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)，分离出来的血浆在血浆泵(6)的作用下经循环管路(7)到达吸附器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向吸附器(9)灌注血浆，在吸附器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时吸附器(9)开始放出血浆，两个并联的吸附器(8)、吸附器(9)交替进行。如图2，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆及其成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。如图3，当Rh抗体(2)进入吸附器(1)时，被固定在凝胶中的抗Rh抗体(3)结合成免疫复合物(4)而不再往下移动，被破坏的红细胞碎片及与之结合而成的大分子抗原抗体复合物也不能通过凝胶微孔而被阻留，未被结合的Rh抗体(5)可以经琼脂凝胶孔流出，吸附后的血浆与血浆分离器分离出来的血细胞汇合后回输。如此直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束。如果配套电脑程序控制，整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用会更加方便、自动化和安全。

10、吸附器的应用效果验证：为了解吸附器的功效，本发明设计了简易的测试方法：取所制备的抗Rh抗体，加入到经100℃溶化后保温在50℃备用的1.0％琼脂糖C1-4B中，混合后滴度为1∶300～500；取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，分别吸取1.0％琼脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷却后琼脂糖成为半固体；购买浙江省中心血站新鲜冰冻血浆200mL，另购买Rh抗体(人抗D型血清干粉标准品，广州联泰生物技术有限公司)，以新鲜冰冻血浆配成1∶128、1∶256、1∶512抗体滴度，按常规RH(抗D)滴度检测方法(参考说明书)，检测确认抗体滴度，称为滤前(Rh)抗体，然后各取10ml滤前抗体分别注入3支血沉管的上端空管，待流经血沉管下层的含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖C1-4B并从血沉管内流出后，收集流出液，称为滤后(Rh)抗体，按常规RH(抗D)滴度检测方法确认滴度，再分别将滤后抗体经含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖血沉管滤出，如此重复3次滤过及抗体滴度检测，结果(表1)说明，Rh抗体滤过简易吸附器后，部分Rh抗体已被相应的抗Rh抗体吸附，经第1次、第2次、第3次滤过后，Rh抗体的平均滴度分别从滤前的1∶298降为滤后的1∶149、1∶48、1∶17，说明随着滤过次数的增加，Rh抗体会不断地被清除，从而达到降低Rh抗体滴度而治疗母胎血型不合溶血病的目的。

表1 Rh抗体滤过含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖简易吸附器前后滴度检测结果(1/x)

Claims (10)

1.一种用于医学领域的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，将混含有抗Rh抗体的琼脂糖凝胶灌注于出口处设置网筛的吸附器，使凝胶从吸附器的进样端至出样端形成从高到低的抗Rh抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度的分层分布，构成抗Rh抗体免疫吸附以及凝胶微孔和净化器筛网机械阻挡的共同净化屏障，用于清除体外循环支路中血浆Rh抗体和红细胞溶解物。

2.根据权利要求1所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述吸附器的进样端至出样端琼脂糖的分层浓度分别为0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％。

3.根据权利要求1所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述吸附器的进样端至出样端琼脂糖凝胶中抗Rh抗体的分层效价分别为1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100。

4.根据权利要求1和3任一所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述的Rh抗体由B淋巴细胞杂交瘤细胞制备。

5.根据权利要求4所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述B淋巴细胞杂交瘤细胞由Rh阴性B淋巴细胞与人和/或鼠骨髓瘤细胞溶合制备。

6.根据权利要求5所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述Rh阴性B淋巴细胞由EB病毒永生化经Rh阳性红细胞致敏后能产生相应抗体的B淋巴细胞制备。

7.根据权利要求1所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述吸附器的外壳容积为200～300ml，上下部均设有细胞筛网，顶径筛网目数为500目，底径筛网目数为50目，液体出口处设置目数为200目的细胞滤网，液体进出口与网筛之间设有缓冲区。

8.根据权利要求1所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述分离器空心纤维滤膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm，能滤过血浆但不能滤过所有的细胞成分。

9.根据权利要求1所述的母胎血型不合治疗吸附器，其特征在于，所述混含有抗Rh抗体的琼脂糖凝胶还包括具有相同吸附抗体功能的高生物相容性材料，以高生物相容性材料制成颗粒，和/或制成吸附器，和/或粘附于循环管路的内表面，用以吸附Rh抗体和/或抗Rh抗体。

10.根据权利要求1-9任一所述的母胎血型不合治疗吸附器在制备体外循环装置中的应用，其特征在于，所述体外循环装置包括动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的吸附器(8)、吸附器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。