CN109157693A - 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备 - Google Patents

人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备 Download PDF

Info

Publication number
CN109157693A
CN109157693A CN201810703353.6A CN201810703353A CN109157693A CN 109157693 A CN109157693 A CN 109157693A CN 201810703353 A CN201810703353 A CN 201810703353A CN 109157693 A CN109157693 A CN 109157693A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
blood
blood group
hybrid strain
group incompatibility
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810703353.6A
Other languages
English (en)
Inventor
翁炳焕
李兰娟
苏岚
张龙
陈丹青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810703353.6A priority Critical patent/CN109157693A/zh
Publication of CN109157693A publication Critical patent/CN109157693A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/362—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits changing physical properties of target cells by binding them to added particles to facilitate their subsequent separation from other cells, e.g. immunoaffinity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3621—Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3627—Degassing devices; Buffer reservoirs; Drip chambers; Blood filters
    • A61M1/3633—Blood component filters, e.g. leukocyte filters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3687—Chemical treatment
    • A61M1/3689—Chemical treatment by biological cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A61M2202/0429—Red blood cells; Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2205/00—General characteristics of the apparatus
    • A61M2205/02—General characteristics of the apparatus characterised by a particular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2210/00—Anatomical parts of the body
    • A61M2210/12—Blood circulatory system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种用于医学领域的人‑鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，以促红细胞生成素为诱导剂，培养Rh阳性“O”型人骨髓细胞，以增加定向发育的红系细胞，继之将培养后的人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合为杂交细胞，再以促红细胞生成素诱导杂交细胞定向分化，以HAT筛选杂交细胞克隆，以Rh抗体筛选能在体外无限扩增的Rh阳性细胞杂交株，经产业化扩增后作为吸附剂，制成吸附器，然后与血液分离器共同构成体外吸附装置，通过吸附母胎血型不合孕妇外周血浆中的致病性Rh抗体，创建不清除血浆及其有益成份的无需血浆置换液的廉价安全的母胎血型不合溶血病的治疗新方法。

Description

人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
技术领域
本发明涉及医学领域母胎血型不合治疗杂交株的制备，主要用于母胎Rh血型不合孕妇血浆中抗胎儿红细胞抗体的吸附清除。
背景技术
人类有ABO、Rh、MN、Lew和Kell等26种血型，其中最重要的是ABO血型和Rh血型，ABO血型根据红细胞携带的A抗原、B抗原、AB抗原或无A和B抗原分为A型、B型、AB型和O型；Rh血型根据红细胞是否携带D抗原分为Rh阳性和Rh阴性，Rh阳性的红细胞上含有D抗原，能与抗-D血清发生免疫凝集。在我国汉族人群中Rh阴性的频率约为0.4％，而西北地区少数民族以及某些国家Rh阴性的频率高达10％以上，所以这些地区和国家Rh血型不合溶血病的发生率较我国汉族人群高。
血型抗原遗传自父母双亲，胎儿红细胞可以携带来自于父亲的血型抗原，表现为不同于母体的血型，此时当胎儿的红细胞进入母体的血液循环时，可诱发母体产生抗体，进而通过胎盘进入胎儿体内，结合并破坏胎儿红细胞，导致胎儿和/或新生儿的溶血病。其中母胎ABO血型不合的发生率较高，但胎儿溶血病的发生率较低，即使发生亦较轻，极少引起核黄疸和水肿，妊娠期无需特殊处理。而Rh血型不合由于Rh阴性母体产生大量的抗Rh阳性胎儿红细胞的Rh抗体(IgG抗-D)，进入胎儿血液循环后，IgG抗-D与Rh阳性胎儿红细胞表面的D抗原发生免疫结合，致使大量的胎儿红细胞被破坏，使胎儿严重贫血、缺氧、心衰、肝脏损伤、低蛋白血症、全身水肿、胸水、腹水甚至胎死宫内。在新生儿时期，Rh血型不合溶血出现黄疸的时间较ABO血型不合溶血者早，最早可在出生后12小时内出现，多数在24小时内出现。由于溶血产生的大量胆红素不能及时排除，使新生儿黄疸加重，大量的胆红素渗入脑细胞而引起核黄疸，常死于严重贫血、心力衰竭、核黄疸，死亡率很高。
虽然某些孕妇可通过预先注射Rh抗体来预防母胎Rh血型不合溶血病的发生，但目前大多数国家已禁止使用D抗原免疫志愿者，因此多克隆Rh抗体的来源已十分有限，而将EB病毒转化淋巴细胞或先转化后杂交制备的Rh抗体用于体内，仍存在EB病毒、HIV和肝炎病毒等病原体的潜在致病性问题，以及用杂交瘤技术制备的Rh抗体因带有鼠癌基因或含有鼠源蛋白而易引起过敏反应等，从而使通过体内注射Rh抗体预防Rh溶血病的方法受到了限制。
目前临床上对母胎Rh血型不合溶血病的治疗主要有孕期血浆置换、胎儿输血、终止妊娠和新生儿换血治疗。如对高胆红素血症的新生儿主要采用换血治疗或蓝光照射、注射免疫球蛋白；妊娠期抗-D效价在1∶32以上时需考虑宫内输血，包括胎儿腹腔内输血或血管内输血，这两者均有一定风险且无一被证实有效；妊娠期抗-D效价在1∶64以上时，需考虑血浆置换治疗，即在体外循环通路中以滤过法分离孕妇的血细胞和血浆，去除血浆并以等量的新鲜冰冻血浆或5％白蛋白作为置换液补充回输(每次置换量为2 000～3 000ml、速度为20～30ml/min、治疗时间为2～4h、每1～3d治疗1次)。或每次取孕妇全血约400ml，低温离心后去其血浆约300ml，补充等量同型新鲜血浆，还输自身红细胞。血浆置换能与被去除的血浆量成比例地降低致病抗体的滴度(效价)，从而能延长胎儿在母体内的存活和发育时间，是母胎ABO、Rh或其它血型不合孕妇临床早期保胎治疗的良好选择，无明显的不良反应，具有较好的疗效。但血浆置换只能去除血液中的部分抗体，不能终止抗体的继续产生，也不能逆转已发生的母胎血型不合溶血病，需要进行不间断的血浆置换才有效，仅适用于曾在妊娠20～22周前发生过胎儿水肿或配偶为纯合子致病抗原的孕妇，特别是在去除部分致病抗体的同时，也去除了含多种有益成份的大量血浆，虽然以置换液作了补充，但无法完全补足被去除的血浆及其有益成份，而且替补的置换液用量大，费用昂贵，异体血浆易致传染病和输液反应等，这也限制了血浆置换的普遍开展。
有文献报道，可以采用Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞，经特殊处理后，制成Rh阳性红细胞吸附器(柱)，进而与血液分离器组装成体外循环装置，用于清除孕妇体内的Rh抗体，即将孕妇的外周血引出体外循环装置，以血液分离器分离出血浆和血细胞，血浆中的Rh抗体经过Rh阳性红细胞吸附器(柱)时，其中的Rh抗体被Rh阳性红细胞吸附，吸附Rh抗体后的血浆流出吸附器(柱)后，与之前分离的血细胞汇合，然后回输体内，达到治疗目的。从理论上看这种治疗方法明显优于现有的治疗方法，但存在的问题是，这些文献还没有提出Rh阳性“O”型红细胞的体外扩增方法，所用的Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞只能直接取自Rh阳性的人体或恒河猴。因没有建立在体外无限扩增Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞的方法，所以这些文献报道的治疗方法对Rh阳性“O”型人或恒河猴具有依赖性，难以达到脱离生物体的产业化应用，并具有异体血源输入的风险。
另有文献报道，克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)于1975证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞杂交，形成能分泌针对相应抗原的高特异性抗体--单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。骨髓瘤细胞可以在体外连续传代，而脾细胞不能在体外繁殖。如果将小鼠的骨髓瘤细胞与能分泌某种抗体或因子的淋巴细胞杂交，则杂交细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外无限繁殖的缺点，这种杂交的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
根据以上文献报道，申请人以Rh阳性“O”型人红细胞与能无限生长的鼠骨髓瘤细胞进行融合，试图制备既具有Rh阳性“O”型人红细胞的抗原性又具有骨髓瘤细胞无限生长特性的融合细胞，以通过融合细胞的无限扩增而扩增Rh阳性“O”型人红细胞(成份)，以建立人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备方法，但始终未获得成功。继之又试图分别以EB病毒、SV40LT(猴肾病毒SV40大T抗原)、hTERT(端粒酶逆转录酶)转染的方法制备永生化骨髓细胞株，并试图培养、筛选出Rh阳性“O”型人红细胞系，用以建立Rh阳性“O”型人红细胞的体外扩增方法，也始终未能获得成功。申请人还试图找到或试制出能吸附Rh抗体的非红细胞类材料，也至今未果。
为了实现只去除致病抗体而不会去除血浆及其多种有益成份的廉价、安全和无副作用的母胎血型不合溶血病的治疗，以及为了节省血源，必须创建一种Rh阳性“O”型红细胞(成份)的无限扩增方法，以产业化制备Rh阳性“O”型红细胞(成份)，进而作为吸附剂用于Rh抗体吸附器(柱)的产业化制备。
发明内容
为了解决长期困绕的母胎血型不合溶血病的治疗问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供母胎血型不合治疗杂交株的制备方法，另一目的是要提供所制杂交株在治疗母胎血型不合溶血病中的应用。
本发明的目的是这样实现的：以促红细胞生成素为诱导剂，培养Rh阳性“O”型人骨髓细胞，以增加定向发育的红系细胞，继之将人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞配制成混合细胞，经聚乙二醇的作用融合为杂交细胞，再以促红细胞生成素诱导杂交细胞定向分化，以HAT筛选杂交细胞克隆，以Rh抗体试剂筛选能在体外无限扩增的Rh阳性红细胞杂交株，经进一步扩增后作为吸附剂，制成吸附器，用于吸附母胎血型不合溶血病的致病抗体。
较具体的说，以含1.5～2.5IU/ml促红细胞生成素的骨髓细胞培养基培养含有多种造血干细胞但无法在体外无限传代的Rh阳性“O”型人骨髓细胞24h～48h，然后将经培养的人骨髓细胞与能在体外无限传代的鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)以2∶1混合，在30％聚乙二醇融合剂(PEG1500)的作用下，使人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合为兼具两细胞成份和特性的杂交细胞，继之以含0.9～1.5IU/mL促红细胞生成素、2×HAT和15％胎牛血清的DMEM培养基选择培养，以筛选杂交细胞克隆，然后分别挑取各克隆细胞进行分瓶扩大培养或在6孔板中进行分孔扩大培养，最后分别取适量的来自各克隆的扩增细胞，分别与Rh抗体(含抗-D)血清混合，在3～5分钟内出现凝集颗粒者即为所制的能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红细胞杂交株，进而作为吸附剂，用于制备Rh抗体吸附器，然后与血液分离器共同构成体外循环装置，通过吸附母胎血型不合孕妇外周血浆中的Rh抗体，达到治疗目的。
本发明根据已广泛应用但仅局限于单克隆抗体制备的鼠免疫B细胞与鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤技术，设计了Rh阳性“O”型人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞的融合方法，在传统杂交瘤技术的基础上创造性地引用了促红细胞生成素，增加了以促红细胞生成素为诱导剂的骨髓细胞融合前培养步骤，以促使红系早期细胞的定向分化和增量，从而增加红系的融合率。而且促红细胞生成素参与了骨髓细胞融合、杂交细胞筛选及其克隆化传代扩增的全程诱导，有利于红系各期细胞及红细胞D抗原的分化成熟，由此制备出能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红细胞杂交株，经产业化扩增后作为吸附剂，制成吸附器，然后与血液分离器共同构成体外循环装置，通过吸附母胎血型不合孕妇外周血浆中的致病性Rh抗体，创建不清除血浆及其有益成份的无需血浆置换液的廉价安全的母胎血型不合溶血病的治疗新方法。
具体实施方式
图1是本发明所制的杂交细胞克隆图。
图2是本发明所制的杂交细胞与相应抗体的免疫凝集图。
图3是本发明提出的母胎血型不合治疗杂交细胞株的应用示意图。
图4是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构示意图。
图5是根据本发明提出的吸附器的内部结构示意图
在图1中，Rh阳性“O”型人骨髓细胞经促红细胞生成素定向诱导而分化的未成熟红细胞系，在PEG的作用下，与鼠骨髓瘤细胞融合后，经HAT筛选1～2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交细胞克隆图。
在图2中，对所获得的如图1所示的杂交细胞克隆作进一步的筛选培养、克隆化传代和促红细胞生成素定向诱导，然后取被认为红细胞D抗原已经分化成熟的杂交细胞，配成细胞悬液，与抗D(IgM+IgG)血型定型试剂按比例混合，经玻片法凝集试验，得到抗原和抗体免疫结合反应结果的颗粒状免疫凝集图，如图2中的玻片左边(1)表示凝集颗粒，右边(2)为阴性对照。
图3中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的吸附器(8、9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。
图4中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的小分子血浆成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是可开关的阀门。
图5中，1是吸附器，2是位于吸附器内的Rh阳性红系杂交株，3是进入吸附器的Rh抗体，4是Rh抗体被Rh阳性红系杂交株结合所形成的抗原抗体复合物，5为RBC碎片。
下面结合图1、图2、图3、图4和图5，对本发明的实施方案作详细的描述。
1、待融合细胞
(1)待融合的骨髓细胞：留取经接种培养和染色体核型分析确诊为无血液病等严重疾病的Rh阳性“O”型人剩余骨髓细胞。
(2)骨髓瘤细胞：鼠SP2/0瘤细胞，购自Sigma公司。
2、实验试剂
(1)促红细胞生成素
(2)DMEM培养基、HAT选择培养基和PEG购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；DMSO(二甲基亚砜)为国产分析纯试剂。
(3)Rh抗体血清(IgG抗-D)：购自Sigma公司。
3、细胞融合方法
(1)骨髓细胞融合前的促红细胞生成素诱导培养：在传统骨髓细胞培养基中配入1.5～2.5IU/mL促红细胞生成素，在接种骨髓细胞后轻轻摇匀，置37℃培养24h～48h。设计该步骤的目的是以促红细胞生成素为诱导剂，促使骨髓细胞向红系早期细胞定向分化，以增加红系的细胞数量，从而提高红系细胞的融合率。
(2)骨髓细胞融合前的准备：经1.5～2.5IU/mL促红细胞生成素诱导培养的骨髓细胞以DMEM培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×108～2×108，以台盼兰染色、相差显微镜检查活细胞数，活细胞数高于80％者为合格。
(3)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3～4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5～10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h)。
(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础培养基在3～5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4、融合细胞的筛选
观察96孔板中的细胞生长情况，7～10天后仅为有效融合的细胞能够生长，此时弃去HAT培养基，更换含有HT的完全培养基，继续培养，可观察到圆形光亮的杂交细胞克隆(图1)。
5、杂交细胞的单克隆筛选和克隆化培养
(1)单克隆筛选(亚克隆法)：当融合细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去除培养液，选择杂交细胞生长状态良好的培养孔，显微镜下标记细胞生长位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置将细胞克隆吸取到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，使后面每个孔中的细胞数为0～1个，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待后面(倒数)孔中的细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，选择(倒数)后面孔中的细胞再行单克隆筛选，制备单克隆杂交细胞。
(2)克隆化培养：将经亚克隆筛选的单克隆杂交细胞进行传代培养，使杂交细胞扩增到所需细胞数量，以用于筛选Rh阳性“O”型红系杂交株(母胎血型不合治疗杂交株)。
6、母胎血型不合治疗杂交株(Rh阳性“O”型红系杂交株)的筛选
(1)“O”型红系杂交株的筛选：取经克隆化培养的单克隆杂交细胞，按常规“ABO”血型的鉴定方法，分别与抗-A、抗-B血清混合，两者均不发生凝集者为“O”型红系杂交株。
(2)Rh阳性“O”型红系杂交株的筛选：取经上述筛选的“O”型红系杂交株，分别与Rh抗体(含抗-D)血清混合，按常规Rh血型的鉴定方法，在3～5分钟内出现凝集者(玻片法凝集试验：图2)即为所制的能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红细胞杂交株(母胎血型不合治疗杂交株)。
(3)母胎血型不合治疗杂交株的冻存：上述制备的杂交株，按细胞株的常规冻存方法，冻存于-196℃的液氮中，备用于产业化制备。
7、母胎血型不合治疗杂交株的产业化制备
(1)母胎血型不合治疗杂交株的产业化扩增：所制备的母胎血型不合治疗杂交株具有无限扩增的性能，可以用于产业化传代培养和扩增。
(2)母胎血型不合治疗杂交株的净化：取产业化制备的母胎血型不合治疗杂交株，分别在4℃和37℃的条件下，以1500r/min×5min的离心速度，以等体积的生理盐水清洗杂交株4～5次，以去除杂交株表面可能附着的抗体及有害物质。
(3)母胎血型不合治疗杂交株血红蛋白的去除：以0.04mol/L Na2HPO4和0.04mol/LNaH2PO4配制渗透浓度分别为25mmol/L和35mmol/L的PH7.4的PB裂解液，在4℃和2500r/min×10min的离心条件下，反复交替洗涤红细胞，通过渗透浓度的交替变化，去除杂交株的血红蛋白，最后以生理盐水清洗至上清液无色。
(4)母胎血型不合治疗杂交株的抗原性测试：①用抗-D标准品检测杂交株D抗原：将所制杂交株与抗-D标准品在37℃孵育5min，离心后，取上清液检测抗-D标准品的效价，根据效价降低数值来确定杂交株的抗原性。具体方法是：取试管10支，分别编号1～10，第1管加入40％杂交株沉淀1.0ml，其他各管加生理盐水0.5ml，然后从第1管吸取杂交株沉淀0.5ml加入到第2管，混匀后吸0.5ml至第3管，以同样操作稀释至第10管，最后管吸出0.5ml弃去，每管加抗-D标准品0.5ml，37℃孵育5min，离心后轻轻混匀，以出现完全凝集的最大稀释倍数代表杂交株的抗原性，稀释倍数越大，抗原性越强，吸附Rh抗体的能力越强。②用Rh(D)标准红细胞测定上清液抗体效价，抗-D标准品效价(已知)减去上清液抗体效价即为杂交株的抗原性(效价)。上清液抗体效价检测方法为：取10支试管，分别编号1～10，各管加入生理盐水1ml，取上清液1ml加入到第1管混匀后移出1ml转至第2管，以同样操作稀释至第10管，最后管吸出1ml液体弃去，将稀释好的血清40μl与Rh(D)标准红细胞10μl混合，孵育10分钟，离心5分钟判读结果，最大稀释倍数的凝集管即为抗原性强度(效价)，效价应在1∶1500以上。
(5)杂交株的血红蛋白含量测试：以低渗等方法破坏杂交株，以常规化学发光分析法或荧光分析法，定性和定量检测杂交株中的血红蛋白含量，应低于正常人血浆的参考值低限。
(6)母胎血型不合治疗杂交株的贮存液及贮存方法：3.5％甘露醇保存液：取甘露醇17.5g、枸橼酸三钠1.5g、枸橼酸0.2g、葡萄糖7.93g、磷酸二氢钠0.94g、腺嘌呤0.14g、氯化钠4.97g，溶于500ml的蒸馏水中。将上述经抗原性测试合格的母胎血型不合治疗杂交株配制成80％的杂交株细胞悬液，4℃贮存备用。
8、母胎血型不合治疗杂交株用于制备吸附器
(1)制备原理：母胎Rh血型不合溶血病是因为孕妇血浆中的游离Rh抗体进入胎儿体内，使胎儿红细胞被破坏而致病。但Rh抗体能被相应的Rh阳性红细胞吸附。
(2)吸附器制备材料：选用无补体激活、无炎症反应、无白细胞、血小板、血氧分压、补体C3aC5a改变的接近于人类血管内皮的高生物相容性材料，可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料表面的均匀性、亲水性，减少对凝血及氧化应激的影响。在吸附器内表面加亲水凝胶，可以提高生物相容性。将某些抗凝物质固化在吸附器内表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至实现无肝素化，如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，可减少过敏体质的过敏反应；将肝素共价结合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力学性能和提高吸附器内表面的抗凝血性能。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有较好的组织相容性和抗凝血效果。
(3)吸附器外壳规格：制成50mm×60mm的底径小、顶径大的圆柱形容器，或制成方形、漏斗形，容积约200～300ml，进口处设有缓冲区和顶径细胞筛网，顶径细胞筛网目数为500目，出口处设有底径细胞筛网和细胞滤网，底径细胞筛网目数为50目，细胞滤网目数为200目，底径细胞筛网与细胞滤网之间亦设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。
(4)吸附器的充填：取母胎血型不合治疗杂交株装入吸附器，至4/5，加入3.5％甘露醇保存液，使杂交株浓度达80％，轻摇混匀，封盖，置4℃保存备用。临用前重复进行离心去甘露醇保存液和补足杂交株细胞的操作，使杂交株细胞紧密充满吸附器。
9、吸附器构成母胎血型不合致病抗体吸附治疗装置
本发明的吸附治疗装置即由吸附器、血浆分离器及其他附件构成的体外循环装置。
(1)吸附器：制备方法如上所述，内部充填能吸附致病抗体的母胎血型不合治疗杂交株。
(2)血浆分离器(分离血细胞和血浆)：①制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备，如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为；正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞。白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。②制备材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。③规格：就分离器的外形，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构，以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状。按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。
(3)其他附件：①动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测吸附器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是吸附器微孔堵塞时，动脉压就会升高。静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当吸附器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足、静脉血回流以及针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。②空气监测(Air Detector)：用来监测血液管路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。③血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环，以维持治疗的顺利进行。通常血泵具有转速检测功能，以监测病人的血流，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管道的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。④肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可防止凝血的发生。⑤此外还包括温度控制、配液、除气、电导率监测、超滤监测和漏血监测等部分。
10、母胎血型不合致病抗体吸附治疗装置的使用方法
(1)安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、吸附器及各循环管路等。
(2)排气：以无菌生理盐水充液分离器、吸附器及各循环管路，排除血浆分离器、吸附器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。
(3)通液：将动脉血路管1接通患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。
(4)抗凝：从肝素泵向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。
(5)启动：将动脉血路管(1)接通治疗者的动脉血管，将静脉管路(5)接通治疗者的静脉血管，然后打开血液泵，血流量为100～150ml/min，如图3，当动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)时，分离出来的血浆在血浆泵(6)的作用下经循环管路(7)到达第一吸附器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向第二吸附器(9)灌注血浆，在第一吸附器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时第二吸附器(9)开始放出血浆，两个并联的吸附器(8、9)交替进行。如图4，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆及其成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。如图5，当Rh抗体(3)随血浆进入吸附器(1)时，被吸附器中的Rh阳性杂交株(2)结合成抗原抗体复合物(4)而不再往下移动，被破坏的细胞碎片(5)及与之结合而成的大分子抗原抗体复合物不能通过吸附器出口的网筛而被阻留，吸附后的血浆与血浆分离器分离出来的血细胞汇合后回输，如此直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束，如果配套电脑程序控制，整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用会更加方便、自动化和安全。
11、促红细胞生成素(EPO)的创新使用效果验证
(1)促红细胞生成素(EPO)能提高红系融合率：分别以不含促红细胞生成素的传统骨髓培养基和含有1.5～2.5IU/mL促红细胞生成素的本发明骨髓培养基在同等条件下进行骨髓细胞接种和培养以及在同等条件下对培养后的骨髓细胞进行细胞融合、克隆筛选及红系D抗原鉴定(鉴定方法参照本发明前述，在10管中有1管及以上出现3～5个细胞凝集者判断为D抗原阳性细胞)，结果发现，经促红细胞生成素诱导培养的骨髓细胞的红系融合率明显增加。如表1所示，3例骨髓细胞标本分别经本发明所述的方法实验，结果以促红细胞生成素诱导培养的骨髓细胞经细胞融合、克隆筛选及红系D抗原鉴定，发现具有红细胞D抗原的红系克隆数量总共为81个，而未以促红细胞生成素诱导培养的骨髓细胞经细胞融合、克隆筛选及红系D抗原鉴定，发现具有红细胞D抗原的红系克隆数量总共为26个，两者有明显的差别，说明促红细胞生成素能在骨髓细胞培养中刺激红系的定向分化，从而能提高红系的融合率。
表1 骨髓细胞的促红细胞生成素(EPO)诱导培养对红系融合率的影响
(2)促红细胞生成素(EPO)能使D抗原分化成熟：以不含促红细胞生成素的传统骨髓培养基培养5例骨髓细胞，将培养后的骨髓细胞分别均分为2份，分别以含0.9～1.5IU/mL促红细胞生成素的15％胎牛血清DMEM培养基和不含促红细胞生成素的15％胎牛血清DMEM培养基在同等条件下进行细胞融合、克隆筛选及传代培养，然后进行D抗原鉴定(鉴定方法参照本发明前述，在10管中有1管及以上出现3～5个细胞凝集者判断为D抗原阳性细胞，即Rh阳性)，确认Rh阳性的克隆数量，结果如表2。从表2可知，以促红细胞生成素介导细胞融合、克隆筛选及传代培养的结果，总共筛选到61个Rh阳性细胞克隆，而未经促红细胞生成素介导者，仅筛选到23个Rh阳性细胞克隆，两者有明显的差别，说明促红细胞生成素能使D抗原分化成熟。
表2 促红细胞生成素(EPO)对红细胞系D抗原定向分化的影响
12、本发明的应用效果验证
为了验证本发明清除Rh抗体的功效，设计了简易的测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，吸取本发明所制的母胎血型不合治疗杂交株细胞沉淀至250mm刻度，再接着吸取适量的经100℃溶化后保温在42℃备用的1.0％琼脂糖C1-4B，琼脂糖冷却后成为半固体，能将杂交株固定在管内，以此制成简易的园柱形吸附器。另外购买新鲜冰冻血浆200mL及Rh抗体(人抗D型血清干粉标准品，广州联泰生物技术有限公司)，以新鲜血浆配成1∶200、1∶400、1∶500抗体滴度，按常规Rh(抗D)滴度检测方法(参考说明书)，进一步检测确认上述所配制的抗体滴度是否相符，称为滤前(Rh)抗体(滴度)，然后各取10ml滤前抗体分别注入3支血沉管的上端空管，待流经血沉管后，收集流出液，称为滤后(Rh)抗体，按常规Rh(抗D)滴度检测方法确认滴度，再分别将滤后抗体经含有母胎血型不合治疗杂交株的血沉管中作第2次滤出，如此重复3次滤过及抗体滴度检测，结果(表3)说明，Rh抗体滤过简易的吸附器后，大部分Rh抗体已被相应的母胎血型不合治疗杂交株吸附，经第1次、第2次、第3次滤过后，Rh抗体的平均滴度分别从滤前的1∶367降为滤后的1∶183、1∶92、1∶57，说明随着滤过次数的增加，Rh抗体会不断地被母胎血型不合治疗杂交株吸附清除，从而达到降低孕妇(新生儿)血浆Rh抗体滴度而治疗母胎血型不合溶血病的目的。
表3 Rh抗体滤过母胎血型不合治疗杂交株的吸附器前后滴度检测结果(l/x)

Claims (9)

1.一种人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在骨髓细胞融合前的细胞增量培养及在增量培养后的骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞的融合、杂交细胞筛选、克隆化培养和传代扩增中，以促红细胞生成素刺激红系的定向分裂、Rh抗原的分化成熟，制成能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红系杂交株，用于制备吸附器，进而与血浆分离器构成母胎血型不合致病抗体吸附治疗装置。
2.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在骨髓细胞融合前的细胞增量培养中，将促红细胞生成素按1.5～2.5IU/mL的用量配入常规骨髓细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在细胞融合、杂交细胞筛选、克隆化培养和传代扩增中，将促红细胞生成素按0.9～1.5IU/mL的用量配入15％胎牛血清的DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述Rh阳性“O”型人红系杂交株以0.04mol/L Na2HPO4和0.04mol/L NaH2PO4配制的渗透浓度分别为25mmol/L和35mmol/L的PB裂解液交替洗涤其含有的血红蛋白。
5.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述吸附器内部灌注以含3.5％甘露醇的细胞保存液配成的80％Rh阳性“O”型人红系杂交株浓度的细胞悬液，用于吸附流经吸附器的血浆中的Rh抗体。
6.根据权利要求1、5所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述3.5％甘露醇的细胞保存液为甘露醇17.5g、枸橼酸三钠1.5g、枸橼酸0.2g、葡萄糖7.93g、磷酸二氢钠0.94g、腺嘌呤0.14g、氯化钠4.97g，溶于500ml的蒸馏水中。
7.根据权利要求1、5所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述吸附器的外壳容积为200～300ml，进口处设有缓冲区和顶径细胞筛网，顶径细胞筛网目数为500目，出口处设有底径细胞筛网和细胞滤网，底径细胞筛网目数为50目，细胞滤网目数为200目，底径细胞筛网与细胞滤网之间亦设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。
8.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述血浆分离器空心纤维滤膜直径为270μm～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2μm～0.6μm，纤维长度为13.5μm～26μm，能滤过血浆但不能滤过所有的细胞成分。
9.根据权利要求1所述的人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述致病抗体吸附治疗装置包括动脉血路管(1)的一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的吸附器(8、9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连。
CN201810703353.6A 2018-06-15 2018-06-15 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备 Pending CN109157693A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810703353.6A CN109157693A (zh) 2018-06-15 2018-06-15 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810703353.6A CN109157693A (zh) 2018-06-15 2018-06-15 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109157693A true CN109157693A (zh) 2019-01-08

Family

ID=64897481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810703353.6A Pending CN109157693A (zh) 2018-06-15 2018-06-15 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109157693A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694471A (zh) * 2015-03-25 2015-06-10 奥思达干细胞有限公司 体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法
CN106110421A (zh) * 2016-07-01 2016-11-16 翁炳焕 恒河猴红细胞吸附器
CN106267422A (zh) * 2016-07-01 2017-01-04 翁炳焕 Rh血型不合溶血病治疗仪
CN107663515A (zh) * 2016-07-28 2018-02-06 苏州方舟基因药业有限公司 一种定向制备人红细胞的方法及制剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694471A (zh) * 2015-03-25 2015-06-10 奥思达干细胞有限公司 体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法
CN106110421A (zh) * 2016-07-01 2016-11-16 翁炳焕 恒河猴红细胞吸附器
CN106267422A (zh) * 2016-07-01 2017-01-04 翁炳焕 Rh血型不合溶血病治疗仪
CN107663515A (zh) * 2016-07-28 2018-02-06 苏州方舟基因药业有限公司 一种定向制备人红细胞的方法及制剂

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106110421B (zh) 恒河猴红细胞吸附器
US5215927A (en) Method for immunoselection of cells using avidin and biotin
CN106267422B (zh) Rh血型不合溶血病治疗仪
EP0260280B2 (en) Immunoselection method
US5225353A (en) Method for immunoselection of cells using avidin and biotin
WO2002101029A1 (fr) Methode de separation et de concentration cellulaires pour la regeneration renale
CN106110424B (zh) 母胎Rh血型不合免疫吸附治疗仪
CN106267407B (zh) 母胎Rh血型不合血液净化治疗仪
CN106267418B (zh) 母胎血型不合抗体吸附治疗仪
CN106110423B (zh) 母胎血型不合吸附治疗仪
CN109157692A (zh) 人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
CN106267410B (zh) 艾滋病感染细胞分离器
CN106267423B (zh) 人Rh阳性红细胞吸附器
CN109157694A (zh) 一种母胎血型不合免疫吸附治疗仪
CN106267405B (zh) 母胎血型不合溶血病治疗仪
CN106344986B (zh) 母胎血型不合治疗吸附器
JP2002087971A (ja) 生体組織再生用細胞の分離方法及び装置
CN109157693A (zh) 人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
CN109157691A (zh) 猴-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
CN109157690A (zh) 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
CN109157695A (zh) 基于清除致病抗体的母胎血型不合治疗装置
CN106110425B (zh) Aids血浆净化治疗仪
CN106075626B (zh) 一种艾滋病血液净化治疗仪
CN106267421B (zh) 母胎血型不合血浆净化器
CN106178162B (zh) 艾滋病治疗细胞器

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190108

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication