ES2346182T3

ES2346182T3 - Eliminacion con reovirus de celulas neoplasicas mediadas por ras de composiciones celulares mixtas.

Info

Publication number: ES2346182T3
Application number: ES01931251T
Authority: ES
Inventors: Donald Morris; Bradley G. Thompson; Matthew C. Coffey
Original assignee: Oncolytics Biotech Inc
Current assignee: Oncolytics Biotech Inc
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2021-05-02
Also published as: US20080032279A1; WO2001083711A3; IL193659A; BR0110474A; US7727534B2; IL152390A; NZ522179A; DK1278824T3; CA2407894A1; US20060029598A1; AR028039A1; US7431932B2; EP1278824B1; IL193659A0; EP1278824A2; CA2407894C; JP2008278897A; WO2001083711A2; US6994858B2; US20100248205A1

Abstract

Un método para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de una composición celular que se sospecha que contiene dichas células neoplásicas, comprendiendo dicho método poner en contacto la composición celular con reovirus en condiciones que provoquen la oncolisis de las células neoplásicas mediadas por ras.

Description

Eliminación con reovirus de células neoplásicas mediadas por ras de composiciones celulares mixtas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de composiciones celulares mixtas infectando las composiciones celulares mixtas con reovirus que lisan selectivamente las células neoplásicas mediadas por ras en las composiciones.

Referencias

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Antecedentes de la invención

Normalmente, la proliferación celular está regulada tanto por señales promotoras del crecimiento como por señales que inhiben el crecimiento. Estos dos tipos de señales para cada célula normalmente llegarían a un equilibrio de un modo que refleja la necesidad del cuerpo por la célula particular. Si una célula falla en la respuesta las señales que inhiben en crecimiento o responde en exceso a las señales promotoras del crecimiento, proliferaría de forma anormalmente rápida (mencionada como célula neoplásica) y finalmente puede desarrollar un cáncer, un neoplasma maligno.

La quimioterapia, un método actual para tratar el cáncer, se basa en líneas generales en la propiedad de rápida proliferación de las células cancerosas. Como las células cancerosas proliferan rápidamente, son más sensibles a fármacos que inhiben la proliferación celular. En teoría, eligiendo cuidadosamente la dosificación de los fármacos quimioterapéuticos, se puede inhibir la proliferación de las células cancerosas sin dañar seriamente las células normales. Sin embargo, algunas células normales, tales como células madre hematopoyéticas, también proliferan rápidamente. Por lo tanto, cualquier dosis que sea dañina para las células cancerosas a menudo también daña las células madre hematopoyéticas. Por otro lado, si la dosificación no es suficientemente alta para eliminar las células cancerosas, existe el riesgo de que el cáncer reaparezca por después de que se termine la quimioterapia.

Como es difícil encontrar una dosificación que elimine selectivamente las células cancerosas, la quimioterapia de elevada dosis seguida de transplante de células madre progenitoras hematopoyéticas autólogas ha obtenido aplicación extensiva como enfoque terapéutico en muchos cánceres (véase, por ejemplo, Winter, 1999; Nieto y Shpall, 1999). En este enfoque, se retira una parte de las células madre hematopoyéticas de un paciente con cáncer, y el paciente se trata después con quimioterapia de elevada dosis que es letal para las células de proliferación rápida, tales como las células cancerosas y las células madre hematopoyéticas. Posteriormente, el paciente recibe el transplante de células madre hematopoyéticas autólogas que se había retirado previamente del mismo paciente para regenerar el sistema hematopoyético.

Un grave inconveniente de esta terapia es que cuando las células madre progenitoras hematopoyéticas se retiran de los pacientes, a menudo se contaminan con células cancerosas. Esto es especialmente un problema cuando el paciente tiene un cáncer de origen hematopoyético, pero pacientes con un tumor sólido también pueden sufrir contaminación de las células madre hematopoyéticas, particularmente si el tumor sólido ha metastatizado. Como resultado, cuando las células retiradas se transplantan de nuevo para reestablecer el sistema hematopoyético, algunas células cancerosas también pueden colocarse de nuevo en el paciente con cáncer donde pueden proliferar otra vez y contribuir a la recurrencia del cáncer. Por lo tanto es deseable purgar los autoinjertos antes del transplante.

Se han empleado varios métodos para purgar los autoinjertos (Spyridonidis et al., 1998; Bensinger 1998). El autoinjerto puede tratarse con quimioterapia para eliminar las células neoplásicas contaminantes in vitro. Sin embargo, como se ha analizado anteriormente, es difícil encontrar una dosificación para el fármaco quimioterapéutico que elimine selectivamente las células neoplásicas o células cancerosas pero que deje intactas las células madre hematopoyéticas normales. Los autoinjertos también pueden tratarse con una toxina conjugada con anticuerpos que reconozcan un antígeno que sea específico para las células neoplásicas, pero dicho antígeno específico de tumor no siempre existe.

Se han propuesto adenovirus recombinantes que expresan p53 de tipo silvestre humano para terapia génica contra el cáncer y purga de la médula ósea (Seth et al., 1996). También se ha propuesto el virus del herpes simple atenuado para purgar de neuroblastoma la médula ósea en escenarios de transplante (Wu et al., 1998).

También es posible separar las células madre de las otras células en base a un marcador de superficie específico de células madre (CD34) usando citometría de flujo, columnas de afinidad o perlas magnéticas. Sin embargo, seleccionando solamente ciertas células hematopoyéticas, por ejemplo, las células CD34^{+}, también pueden eliminarse otras células hematopoyéticas tales como células T, células B, monocitos y células natural killer (asesinas naturales), y puede retardarse la recuperación inmune (Bensinger, 1998). Este método también provoca la pérdida de aproximadamente la mitad de las células CD34^{+} y la retención de algunas células cancerosas contaminantes (Spyridonidis et al., 1998). Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un método altamente selectivo con un rendimiento razonable para purgar los autoinjertos que puede contener células neoplásicas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para eliminar las células neoplásicas mediadas por ras de composiciones celulares mixtas infectando las composiciones celulares mixtas con reovirus que lisan selectivamente las células neoplásicas mediadas por ras. Como muchas células neoplásicas están asociadas con una vía ras activada, la presente invención puede usarse para eliminar las células neoplásicas contaminantes o espontáneas de una amplia diversidad de composiciones celulares mixtas.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método para eliminar las células neoplásicas mediadas por ras de una composición celular que se sospecha que contiene dichas células neoplásicas, comprendiendo dicho método poner en contacto la composición celular con reovirus en condiciones que provoquen la oncolisis de las células neoplásicas mediadas por ras.

En una realización preferida de la presente invención, una composición celular que comprende células madre hematopoyéticas se trata para eliminar las células neoplásicas mediadas por ras que existen en la composición celular como células neoplásicas contaminantes o de origen espontáneo. Como el reovirus es muy selectivo e infecta de forma lítica solamente células mediadas por ras, este método no afecta a la capacidad de las células madre hematopoyéticas de diferenciarse y reconstituir el sistema hematopoyético. El método puede usarse para purgar las células madre hematopoyéticas de médula ósea o sangre. Las células madre hematopoyéticas pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas.

En otra realización de la invención, el reovirus se usa para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de un transplante de tejido u órgano antes de transplantarlo. Como este método puede aplicarse sin considerar el tipo o edad del transplante o la célula mediada por ras, y como el reovirus es esencialmente inofensivo para las células y tejidos normales, este método puede usarse como práctica rutinaria para "limpiar" cualquier transplante antes del transplante.

En otra realización de la invención, el reovirus puede usarse para tratar líneas celulares cultivadas para eliminar las células que se transforman espontáneamente debido a la activación de la vía ras. Este método también puede usarse para tratar semen u óvulos donantes antes de la inseminación artificial u otros procedimientos relacionados con la reproducción.

El reovirus útil en esta invención puede ser cualquier reovirus. Preferiblemente el reovirus es un reovirus de mamífero, más preferiblemente un reovirus humano. Aún más preferiblemente, el reovirus es un reovirus serotipo 3, mucho más preferiblemente el reovirus cepa Dearing.

En otra realización de la invención, el método comprende adicionalmente la etapa de congelar y almacenar la composición celular tratada con reovirus en una solución que contiene DMSO. El DMSO se usa de forma rutinaria para congelar y almacenar células animales pero desnaturaliza el reovirus. Por lo tanto, este tratamiento eliminar los reovirus infecciosos de la composición celular conservando al mismo tiempo la actividad de la composición en estado congelado durante un periodo prolongado de tiempo.

En otra realización de la presente invención, el reovirus se elimina de la composición celular tratada con reovirus sometiendo la mezcla a anticuerpos anti-reovirales o una combinación de anticuerpos anti-reovirales y el complemento para lisar el reovirus. Como alternativa o adicionalmente, pueden usarse anticuerpos anti-reovirales que reconocen una molécula sobre la superficie de la partícula reoviral para eliminar las partículas reovirales inmovilizando los anticuerpos, aplicando la composición celular a los anticuerpos inmovilizados, y recogiendo la parte de la composición que no se une a los anticuerpos.

Asimismo, pueden administrarse anticuerpos anti-reovirales al receptor del transplante recipiente para eliminar el reovirus in vivo, o se le puede dar al receptor un estimulante del sistema inmune para conseguir este propósito.

En otra realización de la presente invención, el reovirus se elimina de la composición celular tratada con reovirus usando un gradiente que puede separar el reovirus de las células.

Breve descripción de los dibujos Figura 1

Las Figuras 1A-1C muestran la cantidad de células viables en MCF7 (Figura 1A), SKBR3 (Figura 1B) o MDA MB 468 (ATCC Nº HTB132; Figura 1C) que se infectaron con reovirus vivo, virus muerto o sin virus según se indica. La Figura 1D muestra el porcentaje de células MCF7 que eran viables a diversos momentos puntuales después de la infección con reovirus.

Figura 2

La Figura 2 muestra que se indujo apoptosis por infección con reovirus en células MCF7, SKBR3 o MDA MB 468. Las Figuras 2A-2C demuestran el porcentaje de ADN que se fragmentó después de la infección con reovirus. La Figura 2D muestra el porcentaje de tinción de marcador apoptótico Anexina V después de la infección con reovirus. Las Figuras 2E-2G muestran el porcentaje de células APO2.7^{+} en cada tipo celular según se indica.

Figura 3

La Figura 3A muestra la cantidad de células viables a diversos momentos puntuales después de que células madre CD34^{+} se han infectado con reovirus. La Figura 3B muestra el efecto de reovirus sobre cultivo de células madre a largo plazo. Las células madre se infectaron con reovirus y se incubaron durante 2, 24, 48 ó 72 horas, respectivamente, después las células se diluyeron y se cultivaron durante 14 días para permitir que se formaran colonias individuales. Después se determinó la cantidad de cada tipo de colonia, granulocítica (G), eritroide (E) o granuloeritroide macrofágica y megacariocítica (GEMM), para las células infectadas sin virus (NV) o virus vivo (LV), respectivamente. Por ejemplo, NV-G da soporte a colonias granulocíticas derivadas de células que se trataron sin virus, y LV-G da soporte a aquellas células que se trataron con reovirus virus.

Figura 4

Las Figuras 4A-4C muestran los efectos purgantes de reovirus sobre mezclas de producto de aféresis con células MCF7, MDA MB 468 o SKBR3, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a métodos para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de una composición celular usando reovirus, y a composiciones que se han tratado de acuerdo con estos métodos.

Antes de describir la invención en detalle adicional, se definen del siguiente modo los términos usados en esta descripción a menos que se indique otra cosa.

Definiciones

Como se usa en este documento, "células neoplásicas", también conocidas como "células con un trastorno proliferativo", se refiere a células que proliferan sin las propiedades de inhibición de crecimiento normales. Un nuevo crecimiento que comprende células neoplásicas es un neoplasma o tumor. Un neoplasma es un crecimiento tisular anormal, que generalmente forma una masa distinta, que crece por proliferación celular de forma más rápida que el crecimiento de tejido normal. Los neoplasmas pueden mostrar ausencia parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal. Como se usa en este documento, se pretende que un neoplasma abarque neoplasmas hematopoyéticos así como neoplasmas sólidos.

Un neoplasma puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor o cáncer maligno). Los tumores malignos pueden clasificarse ampliamente en tres tipos principales. Los neoplasmas malignos que surgen de estructuras epiteliales se llaman carcinomas, los neoplasmas malignos que se originan a partir de tejidos conectivos tales como músculo, cartílago, grasa o hueso se llaman sarcomas y los tumores malignos que afectan a estructuras hematopoyéticas (estructuras que pertenecen a la formación de células sanguíneas) incluyendo componentes del sistema inmune, se llaman leucemias y linfomas. Otros neoplasmas incluyen, aunque sin limitación, neurofibromatosis.

Como se usa en este documento, "células neoplásicas activadas por ras" o "células neoplásicas mediadas por ras" se refieren a células que proliferan a una velocidad anormalmente elevada debido a, al menos en parte, la activación de la vía ras. La vía ras puede activarse mediante una mutación estructural del gen ras, un nivel elevado de expresión del gen ras, una estabilidad elevada del mensaje del gen ras, o cualquier mutación u otro mecanismo que conduzca a la activación de ras o un factor o factores cadena abajo o cadena arriba de ras en la vía ras, aumentando de este modo la actividad de la vía ras. Por ejemplo, la activación del receptor de EGF, el receptor de PDGF o Sos provoca la activación de la vía ras. Las células neoplásicas mediadas por ras incluyen, aunque sin limitación, células cancerosas mediadas por ras, que son células que proliferan de un modo maligno debido a la activación de la vía ras.

Como se usa en este documento, "composición celular" significa una composición que comprende células. La composición puede contener materia no celular. Por ejemplo, la sangre completa es una composición celular que contiene plasma, plaquetas, hormonas y otra materia no celular además de células tales como eritrocitos y leucocitos. Una composición celular puede contener células de diverso tipo, origen u organización. Por ejemplo, tejidos y órganos que contienen diferentes tipos celulares ordenados en estructuras definidas se consideran composiciones celulares.

Como se usa en este documento, "reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus. El nombre reovirus ( R espiratory and e nteric o rphan virus (virus respiratorio, entérico y huérfano)) es un acrónimo descriptivo que sugiere que estos virus, aunque no están asociados con ninguna patología conocida en seres humanos, puede aislarse de los tractos tanto respiratorio como entérico (Sabin, 1959). El término "reovirus" se refiere a todos los virus clasificados en el género reovirus.

El reovirus humano consta de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o T1L), tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos son fácilmente identificables en base a ensayos de neutralización e inhibición de hemaglutinina. (Véase, por ejemplo, Fields et al, 1996).

El reovirus puede ser de origen natural o puede estar modificado. El reovirus es "de origen natural" cuando puede aislarse de una fuente de la naturaleza y no se ha modificado intencionadamente por los seres humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente de campo", es decir, de un ser humano que se ha infectado con el reovirus.

El reovirus puede modificarse pero aún ser capaz de infectar de forma lítica una célula de mamífero que tenga una vía ras activa. Los reovirus pueden pretratarse química o bioquímicamente (por ejemplo, por tratamiento con una proteasa, tal como quimiotripsina o tripsina) antes de la administración a las células proliferantes. El pretratamiento con una proteasa elimina la envuelta externa o cápside del virus y puede aumentar la infectividad del virus. El reovirus puede recubrirse en un liposoma o micela (Chandron y Nibert, 1998) para reducir o evitar una respuesta inmune por parte del mamífero que ha desarrollado inmunidad contra el reovirus. Por ejemplo, el virión puede tratarse con quimiotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micelas de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva partícula subviral infecciosa.

El reovirus puede ser un reovirus recombinante de dos o más tipos de reovirus con fenotipos patogénicos diferentes de modo que contenga diferentes determinantes antigénicos, reduciendo o evitando de este modo una respuesta inmune por un mamífero previamente expuesto a un subtipo de reovirus. Dichos viriones recombinantes pueden generarse por co-infección de células de mamífero con diferentes subtipos de reovirus con el reordenamiento e incorporación resultantes de las proteínas de envuelta de subtipo diferentes en las cápsides resultantes del virión.

La "resistencia" de las células a infección con reovirus indica que la infección de las células con el virus no provoca producción o rendimiento viral significativo. Las células que son "susceptibles" son aquellas que muestran inducción de efectos citopáticos, síntesis de proteínas virales, y/o producción de virus. Se descubrió que la resistencia a infección por reovirus era a nivel de traducción génica, en lugar de en la transcripción temprana: aunque se producían transcritos virales, no se expresaban proteínas virales. Sin limitarse a una teoría, se cree que la transcripción de los genes virales en células resistentes está correlacionada con la fosforilación de una proteína celular de aproximadamente 65 kDa, que se ha determinado que es una proteína quinasa activada por ARN bicatenario (PKR), que no se observó en células no transformadas. La fosforilación de PKR conduce a la inhibición de la traducción. Cuando se suprimía la fosforilación por 2-aminopurina, un inhibidor conocido de PKR, sucedía una potenciación drástica de la síntesis de proteína reoviral en las células no transformadas.

Como se usa en este documento, "oncolisis" o "disminución de células neoplásicas" se refiere a una disminución de al menos aproximadamente el 20% en la viabilidad de las células neoplásicas diana. La viabilidad puede determinarse por un recuento de células viables de las células tratadas, y el grado de disminución puede determinarse comparando la cantidad de células viables en células tratadas con la existente en células no tratadas, o comparando el recuento de células viables antes y después del tratamiento con reovirus. La disminución en la viabilidad es preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%.

Como se usa en este documento, un "receptor de transplante" es un mamífero que recibe un transplante de composiciones celulares. Preferiblemente el receptor es un ser humano, y más preferiblemente un receptor es un ser humano que está recibiendo el transplante en el tratamiento del cáncer.

Como se usa en este documento, "CPE" como marcador apoptótico se refiere a los efectos citopáticos típicamente asociados con la apoptosis que son observables bajo el microscopio, tales como formación de ampollas en la membrana celular, condensación nuclear y condensación de la cromatina.

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Métodos

La presente invención se refiere al uso de reovirus para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de composiciones celulares que se sospecha que contienen dichas células neoplásicas. Como la vía ras activada está asociada con muchos tumores, esta invención puede aplicarse a composiciones celulares que se sospecha que tienen cualquiera de una gran diversidad de células neoplásicas.

Para reovirus de mamífero, la señal de reconocimiento de superficie celular es el ácido siálico (Armstrong, 1984; Gentsch y Pacitti, 1985; Paul et al., 1989). Debido a la naturaleza ubicua del ácido siálico, el reovirus se une de forma eficaz a una multitud de líneas celulares y por tanto puede dirigirse potencialmente a muchos tejidos diferentes; sin embargo, hay diferencias significativas en la susceptibilidad a la infección con reovirus entre líneas celulares. Una razón para esta discrepancia en la susceptibilidad puede ser la actividad de la vía ras en cada tipo celular.

Recientemente se ha descubierto que los reovirus lisan selectivamente células neoplásicas activadas por ras in vitro, in vivo y ex vivo (Coffey et al., 1998; documento WO 99/08692). Normalmente, las células no son susceptibles a infección con reovirus. Sin embargo, cuando se activa la vía ras, el reovirus puede replicarse de forma satisfactoria en las células y finalmente provoca la lisis de las células hospedadoras. Por ejemplo, cuando se transforman células NIH 3T3 resistentes a reovirus con Ras activado o Sos, una proteína que activa Ras, se potenciar la infección con reovirus (Strong et al., 1998). Asimismo, los fibroblastos de ratón que son resistentes a infección con reovirus llegan a ser susceptible después de la transfección con el gen del receptor de EGF o el oncogén v-erbB (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996).

Sin limitarse a una teoría, parece que la replicación del reovirus está regulada a nivel traduccional (Strong et al., 1998; Norman et al., 2000). En células NIH 3T3 no transformadas, transcritos virales tempranos activan la proteína quinasa activada por ARN bicatenario (PKR), que inhibe la traducción, inhibiendo de este modo la replicación viral. Ras activado (o un elemento activado de la vía ras) supuestamente inhibe o invierte la activación de PKR. Por lo tanto, prosigue la síntesis de proteínas virales, se crean partículas virales, y las células finalmente se lisan.

El oncogén ras es el motivo de una gran cantidad de tumores. Suceden mutaciones activadoras del propio gen ras en aproximadamente el 30% de todos los tumores humanos (Bos, J.L., 1989), principalmente en carcinomas pancreáticos (90%), colorrectales esporádicos (50%) y pulmonares (40%), y leucemia mieloide (30%). La activación de factores cadena arriba o cadena debajo de ras en la vía ras también está asociada con tumores. Por ejemplo, la sobre-expresión de HER2/Neu/ErbB2 o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es habitual en cáncer de mama (25-30%), y la sobre-expresión del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o el receptor de EGF es predominante en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se sabe que tanto el receptor de EGF como el receptor de PDGF activan ras después de la unión a su ligando respectivo, y v-erbB codifica un receptor activado de forma constitutiva que carece del dominio extracelular.

En esta invención se demuestra que el reovirus causaba de forma eficaz la oncolisis de tres sistemas de modelo de cáncer de mama, MCF7, SKBR3 y MDA MB 468, induciendo la apoptosis en las células infectadas (Ejemplo 1). Por tanto, el tratamiento con reovirus provocó una disminución marcada en la viabilidad de células MCF7, SKBR3 y MDA MB 468, aunque los controles tratados sin virus o con virus muerto crecieron con normalidad (Figuras 1A-1D). La disminución en la en viabilidad estuvo acompañada por características que se asocian con apoptosis, tales como fragmentación del ADN, tinción positiva de anexina V o APO 2.7 (Figuras 2A-2G) y efectos citopáticos, tales como formación de ampollas en la membrana celular, condensación nuclear y condensación de la cromatina observadas bajo el microscopio.

Como la infección con reovirus habitualmente se bloquea a nivel traduccional en células normales pero no en células neoplásicas mediadas por ras, se examinó el grado de síntesis de proteínas en células MCF7 tratadas con reovirus y células madre CD34^{+} (Ejemplo 2). De hecho, se sintetizaron proteínas virales en la línea celular de cáncer infectada con reovirus, pero no en células madre CD34^{+} que también se trataron con reovirus (datos no mostrados). Este resultado sugiere que será seguro tratar células madre hematopoyéticas con reovirus, ya que no se sintetizaron proteínas reovirales en células madre tratadas con reovirus y la síntesis de proteínas celulares prosiguió de forma normal. Para confirmar este punto, se determinó la viabilidad de las células CD34^{+} tratadas con reovirus en diversos momentos puntuales después del tratamiento con reovirus (Ejemplo 3). Las cantidades de células en poblaciones tratadas con reovirus vivos o sin virus fueron similares después de cada momento puntual (Figura 3A), lo que indica que las células CD34^{+} no son susceptibles a infección con reovirus.

Para que el reovirus se útil para purgar células madre hematopoyéticas en tratamientos quimioterapéuticos de elevada dosis, es esencial que el tratamiento con reovirus no altere la capacidad de las células madre de diferenciarse en todos y cada uno de los linajes hematopoyéticos para reconstituir el sistema hematopoyético completo. Por lo tanto, se evaluó el efecto a largo plazo del tratamiento con reovirus (Ejemplo 3). Las células CD34^{+} tratadas sin virus o con virus vivo no mostraron esencialmente ninguna diferencia en su capacidad de diferenciarse en granulocitos, células eritroides o células granuloeritroides macrofágicas y megacariocíticas incluso después de 72 horas de tratamiento con reovirus (Figura 3B). La proporción entre estos tres linajes también permaneció igual después de este tratamiento prolongado. Por consiguiente, el tratamiento con reovirus no eliminaba las células CD34^{+} ni cambiaba su potencial para reconstituir el sistema hematopoyético.

Además, el reovirus es capaz de purgar una composición celular mixta, como se demuestra por la eliminación selectiva de células MCF7, SKBR3 o MDA MB 468 en una mezcla de células cancerosas y producto de aféresis que contenía células madre CD34^{+} (Ejemplo 4). Midiendo CD34 y la citoqueratina, un marcador específico de células epiteliales tales como MCF7, SKBR3 o MDA MB 468, se demostró que el reovirus eliminaba esencialmente las células cancerosas de la composición celular mixta (Figuras 4A-4C) mientras que dejaba intactas las células madre. Por lo tanto, el tratamiento con reovirus es un método eficaz para purgar células neoplásicas de composiciones de células madre hematopoyéticas.

Por consiguiente, en la realización preferida de esta invención, se tratan autoinjertos que contienen células madre con reovirus antes del transplante para eliminar las células neoplásicas mediadas por ras contaminantes o espontáneas. Esto aumenta la eficacia del tratamiento con quimioterapia de elevada dosis/transplante autólogo de células madre hematopoyéticas. Será de particular interés el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, leucemia mielogénica aguda, cánceres de células germinales (testiculares), tumores cerebrales, y tumores de mama, ya que la quimioterapia de elevada dosis y el transplante antólogo de células madre se han realizado de forma eficaz en pacientes con estos tumores. Sin embargo, se contempla que el presente método será también útil en otros cánceres para eliminar cualquier célula neoplásica mediada por ras, ya que puede suceder la activación de la vía ras en cualquier tipo celular o tisular.

Pueden retirarse células madre progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea del paciente de forma anticipada al tratamiento. Como alternativa, en un paciente con cáncer que ha estado recibiendo quimioterapia tradicional, no de elevada dosis, aparecen muchas células madre típicamente en la sangre periférica. Por lo tanto, pueden retirarse células madre progenitoras hematopoyéticas de la sangre en forma de producto de aféresis, que pueden almacenarse durante un largo tiempo antes de transplantarse. La presente invención puede aplicarse a autoinjertos que contienen células madre que se recogen de cualquier fuente tisular, incluyendo médula ósea y sangre.

Aunque los reovirus normalmente no se asocian con ninguna enfermedad conocida, pueden ser más infecciosos para pacientes con cáncer cuyos sistemas inmunes están debilitados debido a la quimioterapia. Por consiguiente, en otra realización de esta invención, las composiciones de células madre que se han tratado con reovirus se congelan en una solución que contiene DMSO y se descongelan antes del transplante. Aunque el DMSO se usa rutinariamente para congelar y almacenar células animales, desnaturaliza los reovirus, eliminando de este modo los reovirus infecciosos de la preparación de células madre. Esto reduce el riesgo que de los reovirus puedan causar infecciones indeseadas cuando se introducen en el receptor del transplante mediante transplante de células madre.

En otra realización, las composiciones celulares tratadas con reovirus se tratan con anticuerpos anti-reovirales o una combinación de anticuerpos anti-reovirales y el complemento para inactivar o lisar el reovirus. Como alternativa o adicionalmente, pueden usarse anticuerpos anti-reovirales que reconocen una molécula sobre la superficie de la partícula reoviral para eliminar las partículas reovirales de la composición celular tratada con reovirus. Por tanto, se inmovilizan los anticuerpos en una columna, perlas o cualquier otro material o dispositivo conocido en la técnica, se aplica la composición celular a los anticuerpos inmovilizados, y se recoge la parte de la composición que no se une a los anticuerpos de acuerdo con un procedimiento adecuado para el método de inmovilización particular.

Otro método que puede usarse para eliminar los reovirus de la mezcla tratada con reovirus es someter la mezcla a un gradiente que separa las células del virus, y recoger la capa que contiene solamente las células.

Se puede dar al receptor del transplante tratamientos para estimular el sistema inmune para reducir el riesgo de infección con reovirus. Este tratamiento puede realizarse antes de, de forma contemporánea con, o después del transplante, pero se realiza preferiblemente antes del transplante. Como tratamiento alternativo o junto con el estimulante del sistema inmune, se puede dar al receptor anticuerpos anti-reovirales para reducir el riesgo de infección con reovirus.

Además de las células madre hematopoyéticas, la presente invención puede aplicarse ampliamente para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de muchas otras composiciones celulares. Por ejemplo, pueden usarse reovirus como práctica a rutinaria para "limpiar" (eliminar células neoplásicas mediadas por ras de) cualquier transplante de tejido u órgano. La aplicación de la presente invención no está limitada por el tipo de célula o tejido porque como se ha analizado anteriormente, el receptor para el reovirus es ubicuo, y el mecanismo en células normales para inhibir la replicación de reovirus, PKR, es también ubicuo. Por lo tanto, cualquier célula puede convertirse en una célula neoplásica mediada por ras y volverse susceptible a infección con reovirus. Será de particular interés el uso de los métodos reivindicados para limpiar la sangre completa o cualquier parte de la misma para una posterior transfusión. Asimismo, el transplante de tejidos u órganos de forma creciente ha llegado a ser habitual, y será beneficioso que el transplante pueda tratarse para eliminar células neoplásicas mediadas por ras antes del transplante. El hígado, el riñón, el corazón, la córnea, un injerto cutáneo, las células de los islotes pancreáticos, la médula ósea o cualquier parte de los mismos son sólo unos pocos ejemplos de los tejidos u órganos a los que puede aplicarse esta invención.

El tejido u órgano puede ser autólogo, alogénico o xenogénico. El tejido u órgano también puede obtenerse de un animal transgénico, puede ser un tejido/órgano que se desarrolla in vitro a partir de células madre, o puede expandirse ex vivo. El tejido u órgano a tratar con reovirus puede ser de origen embrionario o adulto. Por ejemplo, pueden tratarse células neuronales embrionarias antes de transplantarse en un paciente con Alzheimer. Asimismo, la invención puede usarse para tratar semen u óvulos donantes ex vivo.

La aplicación de la presente invención no está limitada a los transplantes. En su lugar, puede "limpiarse" cualquier composición celular con reovirus para cualquier propósito. Por tanto, todos los ejemplos descritos anteriormente son aplicables incluso si el tejido u órgano no está pretendido para el transplante.

También pueden tratarse líneas celulares de forma rutinaria para protegerlas contra células neoplásicas mediadas por ras espontáneas o contaminantes. De nuevo, cualquier línea celular será un buen candidato para este método excepto, por supuesto, una línea celular transformada mediante la activación de la vía ras.

Recientemente, muchos laboratorios han intentado establecer xenoinjertos transplantables en serie de tejido de cáncer de próstata humano inoculado en ratones inmunocomprometidos. Sin embargo, a menudo sucede contaminación con células cancerosas de ratón durante el pase en serie de los xenoinjertos y estas células finalmente pueden crecer más que las células de cáncer de próstata humano (Gao et al., 1999). La presente invención será una solución simple a este problema si el cáncer contaminante está mediado por ras y el xenoinjerto no.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar esta invención y no tienen que entenderse de ningún modo como limitantes del alcance de la presente invención.

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Ejemplos

En los siguientes ejemplos, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen sus significados generalmente aceptados.

\muM: = micromolar

mM: = milimolar

M: = molar

ml: = mililitro

\mul: = microlitro

mg: = miligramo

\mug: = microgramo

PAGE: = electroforesis en gel de poliacrilamida

rpm: = revoluciones por minuto

FBS: = suero bovino fetal

DTT: = ditiotrietol

SDS: = dodecil sulfato sódico

PBS: = solución salina tamponada con fosfato

DMEM: = medio de Tagle modificado por Dulbecco

\alpha-MEM: = medio de Tagle \alpha-modificado

\beta-ME: = \beta-mercaptoetanol

MOI: = multiplicidad de infección

PFU: = unidades formadoras de placas

PKR: = proteína quinasa activada por ARN bicatenario

EGF: = factor de crecimiento epidérmico

PDGF: = factor de crecimiento derivado de plaquetas

DMSO: = dimetilsulfóxido

CPE: = efecto citopático

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Ejemplo 1 Oncolisis inducida por reovirus y apoptosis en cáncer de mama

Para determinar el efecto del reovirus sobre la viabilidad de células neoplásicas, primero se usaron tres sistemas de modelo de cáncer de mama, MCF7 (ATCC número HTB-22), SKBR3 (ATCC número HTB-30) y MDA MB 468 (ATCC número HTB 132). Las células de cada línea celular se cultivaron hasta el 50-60% de confluencia y se infectaron con reovirus serotipo 3, cepa Dearing, a una multiplicidad de infección de 40. El reovirus se obtuvo y se mantuvo como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 6.136.307. Las células infectadas y no infectadas con reovirus se recogieron a las 0, 24, 48 y 72 horas después de la infección y se determinó la viabilidad.

Los resultados se muestran en las Figuras 1A-1D. El recuento de células viables en células MCF7 (Figura 1A), SKBR3 (Figura 1B) o MDA MB 468 (Figura 1C) infectadas con reovirus bajó significativamente después de la infección, mientras que las células infectadas con virus muerto o sin virus proliferaron como se esperaba. El tratamiento con reovirus causó que la viabilidad de MCF7 (Figura 1D) y SKBR3 bajara desde el 93% hasta el 16% en 72 horas después de la infección. En células MDA MB 468, las cantidades de células intactas tratadas con virus bajaron hasta el 12,7%, 8,8% y 3,6% de los recuentos celulares originales, respectivamente, a las 24, 48 y 72 horas después de la infección. Por tanto, el reovirus causaba oncolisis de forma eficaz en los tres tipos de células
cancerosas.

Las células murieron por apoptosis. Pudieron observarse marcadores apoptóticos típicos tales como CPE, Anexina-V y ADN ladder en un transcurso de tiempo paralelo a la disminución de la viabilidad. Las Figuras 2A-2G muestran el porcentaje de células con fragmentación del ADN (2A-2C), tinción de Anexina V (2D) o APO2.7^{+} (2E-2G) en diversos momentos puntuales después de la infección con reovirus. Las células tratadas con reovirus mostraron todos los signos de apoptosis a un nivel drástico en comparación con los controles sin virus o virus muerto, lo que demuestra que el reovirus inducía apoptosis en estas tres líneas celulares. La apoptosis en los controles pareció aumentar lentamente con el tiempo también, probablemente debido a que las células empezaban a morir cuando habían crecido de forma demasiado densa.

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Ejemplo 2 El reovirus inhibía selectivamente la síntesis de proteínas en células cancerosas pero no en células madre CD34^{+}

Para una comprobación adicional de la infección viral selectiva de células cancerosas, se emprendió un marcaje con ^{35}S/SDS/PAGE de las proteínas virales. La síntesis de proteínas virales fue evidente después de 1-2 días en células MCF7 infectadas con reovirus, mientras que la síntesis de proteínas celulares disminuyó al mismo tiempo, lo que indica que el reovirus había adquirido la maquinaria celular. A los 4 días después de la infección, ya no podía detectarse síntesis de proteínas, lo que sugiere que se habían eliminado todas las células. En los experimentos de control donde las células se infectaron con reovirus muero o sin virus, no hubo síntesis de proteínas virales, mientras que la síntesis de proteínas celulares estaba al nivel normal. En contraste, el marcaje con ^{35}S de células madre CD34 en presencia o ausencia de reovirus mostró ausencia de síntesis de proteínas virales hasta 72 horas después de la adición de virus. Por lo tanto, el reovirus infecta de forma selectiva células MCF7 pero no células madre CD34^{+}.

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Ejemplo 3 El tratamiento con reovirus no inhibía la proliferación celular ni alteraba el potencial de diferenciación de células CD34^{+}

Coherente con los resultados de síntesis de proteínas, el recuento de células viables indicó que el tratamiento con reovirus no disminuía la cantidad de células viables en células CD34^{+} (Figura 3A) en comparación con el control sin virus.

Aunque la cantidad de células CD34^{+} no se veía afectado por la infección con reovirus, quedaba la cuestión de si el reovirus cambiaba el potencial de las células madre CD34^{+} de diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos en la proporción apropiada. Si era éste el caso, las células madre tratadas con reovirus no serían un buen candidato para la reconstitución del sistema hematopoyético completo. Para investigar esta posibilidad, se incubaron células CD34^{+} con reovirus durante 2, 24, 48 ó 72 horas, respectivamente. Después se eliminó el reovirus y las células se diluyeron y se cultivaron en medio fresco durante 14 días para permitir que se formaran colonias. Cada colonia se examinó para determinar si pertenecía al linaje granulocítico, eritroide, o granuloeritroide macrofágico y megacariocítico. Como se muestra en la Figura 3B, las células madre tratadas con virus vivo (LV) producían cantidades similares de granulocitos (G), eritrocitos (E) o células granuloeritroides macrofágicas y megacariocíticas (GEMM) como el control sin virus (NV). Por lo tanto, el tratamiento con reovirus no cambiaba el potencial de diferenciación de células CD34^{+}.

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Ejemplo 4 El reovirus eliminaba selectivamente las células cancerosas de una composición celular mixta

Se mezclaron células neoplásicas con producto de aféresis y se sometieron a infección con reovirus para investigar si el reovirus podía eliminar selectivamente las células neoplásicas de la composición celular mixta. El producto de aféresis se preparó de acuerdo con un procedimiento previamente descrito (Stewart et al., 1999; Duggan et al., 2000). Cuando las mezclas de producto de aféresis (90%) y MCF7 (10%) se trataron con reovirus y se ensayaron diariamente para el recuento y la viabilidad celular, hubo una eliminación de 100 veces en las cantidades de células MCF7 citoqueratina-positivas mientras que las células madre CD34^{+} permanecieron intactas y viables (Figura 4A). El reovirus era similarmente eficaz en la eliminación selectiva de células MDA MB 468 (Figura 4B) o SKBR3 (Figura 4C) de si mezcla con producto de aféresis, respectivamente. Estos resultados demuestran que el reovirus puede eliminar selectivamente las células neoplásicas en una mezcla celular y dejar intactas las células madre.

Claims

1. Un método para eliminar células neoplásicas mediadas por ras de una composición celular que se sospecha que contiene dichas células neoplásicas, comprendiendo dicho método poner en contacto la composición celular con reovirus en condiciones que provoquen la oncolisis de las células neoplásicas mediadas por ras.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la composición celular comprende células madre hematopoyéticas.

3. El método de la reivindicación 2, en el que las células madre hematopoyéticas se han recogido de médula ósea.

4. El método de la reivindicación 2, en el que las células madre hematopoyéticas se han recogido de la sangre.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la composición celular comprende un tejido, un órgano o cualquier parte de un tejido o un órgano.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el tejido o el órgano se selecciona entre el grupo compuesto por hígado, riñón, corazón, córnea, piel, pulmón, células de los islotes pancreáticos, y sangre completa.

7. El método de la reivindicación 5, en el que el tejido, el órgano o la parte del tejido o el órgano es útil para transplante.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la composición celular comprende células cultivadas, semen u óvulos.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el reovirus es un reovirus de mamífero.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el reovirus es un reovirus aviar.

11. El método de la reivindicación 9, en el que el reovirus de mamífero es un reovirus humano.

12. El método de la reivindicación 9, en el que el reovirus de mamífero es virus serotipo 3.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el virus serotipo 3 es la cepa Dearing.

14. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la etapa de congelar y almacenar la composición tratada con reovirus en una solución que contiene DMSO.

15. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la etapa de tratar la composición tratada con reovirus con anticuerpos anti-reovirales y el complemento.

16. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la etapa de someter las células tratadas a un gradiente que separar las células del reovirus y recoger la capa que contiene células.

17. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente formular la composición celular en forma de una composición farmacéutica.

18. Un kit que comprende una composición celular que se puede obtener por el método de la reivindicación 1 y un anticuerpo anti-reoviral.