MXPA02010744A - Eliminacion de reovirus de celulas neoplasticas mediadas por ras de composiciones celulares mezcladas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un reovirus que puede ser utilizado para remover selectivamente las celulas neoplasticas mediadas por ras de una composicion celular. Es de interes particular purificar los autoinjertos que pueden contener celulas neoplasticas con el reovirus antes del trasplante de los autoinjertos de regreso al receptor, por lo cual se reduce el riesgo de introducir o reintroducir celulas neoplasticas en el receptor.

Description

'ELIMINACIÓN DE REOVIRUS DE CÉLULAS NEOPLÁSTICAS MEDIADAS POR RAS DE COMPOSICIONES CELULARES MEZCLADAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para remover células neoplásticas mediadas por ras de composiciones celulares mezcladas infectando las composiciones celulares mezcladas con el reovirus que lisa selectivamente las células neoplásticas mediadas por ras en las composiciones.

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La totalidad de las publicaciones, patentes y solicitudes de patente anteriores son incorporadas aqui para referencia en .su totalidad al mismo grado que si la descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente individual indicada especifica e individualmente fuera incorporada para referencia en su totalidad.

Antecedentes de la Invención Normalmente, la proliferación celular es regulada tanto por las señales que promueven el crecimiento como las señales que restringen el crecimiento. Estas dos clases de señales para cada célula normalmente podrían afectar un equilibrio de una manera que refleja la necesidad del cuerpo de la célula particular. Si una célula no responde a las señales que restringen el crecimiento o tienen una respuesta mayor de la normal a las señales promotoras del crecimiento, las mismas proliferarán anormalmente rápido (referidas como células neoplásticas) y eventualmente pueden desarrollarse en el cáncer, un neoplasma maligno . La quimioterapia, un método común para el tratamiento del cáncer, generalmente está basado en la propiedad de proliferación rápida de las células cancerosas. Puesto que las células del cáncer proliferan rápidamente, las mismas son más sensibles a los fármacos que inhiben la proliferación celular. En teoria, eligiendo cuidadosamente la dosificación de los fármacos quimioterapéuticos, se puede inhibir la proliferación de las células cancerosas sin dañar seriamente las células normales. Sin embargo, algunas células normales, tales como las células madre hematopoyéticas, también proliferan rápidamente. Por lo tanto, cualquier dosificación la cual sea perjudicial para las células cancerosas frecuentemente también es perjudicial para las células madre hematopoyéticas. Por otra parte, si la dosificación no es lo suficientemente elevada para exterminar las células del cáncer, existe el riesgo de que el cáncer pudiera reaparecer brevemente después que la quimioterapia se haya terminado. A causa de que es difícil encontrar una dosificación la cual extermine selectivamente las células cancerosas, la quimioterapia de dosis elevadas seguido por el trasplante de células madre progenitoras hemotopoyéticas autólogas ha tenido una amplia aplicación como un método terapéutico en muchos cánceres (por ejemplo, véase Winter, 1999; Nieto y Shpall, 1999) . En este método, una porción de las células madre hematopoyéticas es removida de un paciente con cáncer, y el paciente es tratado entonces con quimioterapia de dosis elevadas la cual es letal para las células que proliferan rápidamente, tales como las células del cáncer y las células madre hematopoyéticas . Subsiguientemente, el paciente recibe el trasplante de células madre hamatopoyéticas autólogas las cuales han sido removidas previamente del mismo paciente, para regenerar el sistema hematopoyético. Una seria desventaja de esta terapia es que cuando las células madre progenitoras hematopoyéticas son removidas de los pacientes, las mismas son contaminadas frecuentemente con células cancerosas. Esto es un problema especialmente cuando el paciente tiene un cáncer de origen hematopoyético, pero los pacientes con un tumor sólido también pueden padecer de contaminación de las células madre hematopoyéticas, particularmente si el tumor sólido ha sido sometido a metástasis. Como se resultado, cuando las células removidas son transplantadas nuevamente para restablecer el sistema hematopoyético, algunas células cancerosas también pueden ser colocadas de nuevo en el paciente con cáncer en donde las mismas pueden proliferar nuevamente para contribuir a una recurrencia del cáncer. Por lo tanto, es deseable purificar los autoinjertos antes del trasplante. Se han empleado varios métodos para purificar los autoinjertos (Spyridonidis et al, 1998; Bensinger 1998) . El autoinjerto puede ser tratado con quimioterapia para exterminar las células neoplásticas contaminantes in vi tro . Sin embargo, como se describió anteriormente, es difícil encontrar una dosificación para el fármaco quimioterapéutico el cual extermine selectivamente las células neoplásticas o las células cancerosas pero que deje intactas a las células madre hematopoyéticas normales. Los autoinjertos también pueden ser tratados con una toxina conjugada con anticuerpos los cuales reconocen un antígeno que es específico para las células neoplásticas, pero tal antígeno específico del tumor no siempre existe. También es posible separar las células madre de las otras células con base en un marcador superficial específico de la célula madre (CD34) utilizando citometría de flujo, columnas de afinidad o perlas magnéticas. Sin embargo, seleccionando solamente ciertas células hematopoyéticas, por ejemplo, las células CD34+, otras células hematopoyéticas tales como las células T, células B, monocitos y células exter inadoras naturales, también son eliminadas, y la recuperación inmune puede ser retardada (Bensinger, 1998) . Este método también conduce a la pérdida de aproximadamente la mitad de las células CD34+ y a la retención de algunas células cancerosas contaminantes (Spyridonidis et al, 1998) . Por lo tanto, subsiste una necesidad de un método altamente selectivo con un rendimiento razonable para purificar los autoinjertos que puedan contener células neoplásticas.

Breve Descripción de la Invención La presente invención está dirigida a un método para remover las células neoplásticas mediadas por ras de las composiciones celulares mezcladas infectando las composiciones celulares mezcladas con el reovirus el cual lisa selectivamente las células neoplásticas mediadas por ras. Puesto que muchas células neoplásticas están asociadas con una ruta de ras activada, la presente invención puede ser utilizada para remover las células neoplásticas contaminantes o espontáneas de una amplia variedad de composiciones celulares mezcladas. Así, un aspecto de la presente * invención proporciona un método para remover las células neoplásticas mediadas por ras de una composición celular sospechosa de contener tales células neoplásticas, tal método comprende poner en contacto la composición celular con el reovirus bajo condiciones que conduzcan a la oncólisis de las células neoplásticas mediadas por ras. En una modalidad preferida de la presente invención, una composición celular que comprende las células madre hematopoyéticas es tratada para remover las células neoplásticas mediadas por ras las cuales existen en la composición celular como las células neoplásticas contaminantes o que están presentes espontáneamente. Puesto que el reovirus es altamente selectivo e infecta líticamente a las células mediadas por ras solamente, este método no afecta la capacidad de las células madre hematopoyéticas para diferenciar y reconstituir el sistema hematopoyético. El método puede ser utilizado para purificar las células madre hematopoyéticas de la médula ósea o la sangre. Las células madre hematopoyéticas pueden ser autólogas, alogenéicas o xenogenéicas . En otra modalidad de la invención, el reovirus es utilizado para remover las células neoplásticas mediadas por ras de un transplante de órgano o tejido previo al trasplante. A causa de que este método puede ser aplicado sin importar el tipo o la edad del trasplante o de la célula mediada por ras, y a causa de que el reovirus es esencialmente inofensivo para los tejidos y células normales, este método puede ser utilizado como una práctica de rutina para "limpiar"' cualquier trasplante antes del trasplante. En otra modalidad de la invención, el reovirus puede ser utilizado para tratar las líneas celulares cultivadas para remover las células las cuales son transformadas espontáneamente debido a la activación de la ruta de ras. Este método también puede ser utilizado para tratar el semen o los huevos del donador antes de la inseminación artificial u otros procedimientos relacionados con la reproducción. El reovirus útil en esta invención puede ser cualquier reovirus . Preferentemente el reovirus es un reovirus de mamífero, más preferentemente un reovirus humano. Todavía más preferentemente el reovirus es un reovirus del serotipo 3, aún más preferentemente el reovirus de la Cepa Dearing. En otra modalidad de la invención, el método comprende además el paso de congelar y almacenar la composición celular tratada con el reovirus en una solución que contiene DMSO. El DMSO es utilizado rutinariamente para congelar y almacenar células animales pero puede desnaturalizar los reovirus. Por lo tanto, el tratamiento con DMSO remueve el reovirus infeccioso de la composición celular al mismo tiempo que preserva la actividad de la composición en el estado congelado durante un período de tiempo prolongado . En otra modalidad de la presente invención, el reovirus es removido de la composición celular tratada con el reovirus sometiendo la mezcla a anticuerpos anti-reovirus, o una combinación de anticuerpos de anti-reovirus y un complemento para lisar el reovirus. Alternativa o adicionalmente, los anticuerpos anti-reovirus que reconocen una molécula sobre la superficie de la partícula del reovirus pueden ser utilizados para remover las partículas del reovirus por la inmovilización de los anticuerpos, aplicando la composición celular a los anticuerpos inmovilizados, y colectando la parte de la composición que no se aglutina a los anticuerpos . De manera semejante, los anticuerpos anti-reovirus pueden ser administrados al receptor del trasplante para eliminar el reovirus in vivo, o al receptor se le puede dar un estimulante del sistema inmune para lograr este propósito. En otro modalidad de la presente invención, el reovirus es removido de la composición celular tratada con el reovirus utilizando un gradiente que puede separar el reovirus de las células. También se proporcionan composiciones celulares las cuales han sido tratadas con un reovirus para remover las células neoplásticas. Tales composiciones pueden ser utilizadas para la investigación in vitro, o en el trasplante, inseminación, u otros procedimientos in vivo. El trasplante puede ser autólogo, alogenéico, o aún xenogenéico. Preferentemente el trasplante es autólogo. Más preferentemente, la composición comprende células madre hematopoyéticas .

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 Las Figuras 1A-1C muestran el número de células viables en MCF7 (Figura ÍA) , SKBR3 (Figura IB) o MDA MB 468 (ATCC No. HTB132; Figura 1C) que fueron infectadas con el reovirus vivo, el virus muerto o ningún virus como está indicado. La Figura ID muestra el porcentaje de células MCF7 que estuvo viable en varios puntos del tiempo después de la infección con el reovirus.

Figura 2 Las Figuras 2A-2G muestran que la apoptosis fue inducida por la infección con el reovirus en las células MCF7, SKBR3 o MDA MB 468. Las Figuras 2A-2C demuestran el porcentaje del ADN que fue fragmentado después de la infección con el reovirus. La Figura 2D muestra el porcentaje del teñido con el marcador apoptótico Annexin V después de la infección con el reovirus. Las Figuras 2E-2G muestran el porcentaje de células AP02.7+ en cada tipo de célula como está indicado.

Figura 3 La Figura 3A muestra el número de células viables en varios puntos del tiempo después que las células madre CD34+ han sido infectadas con el reovirus . La Figura 3B muestra el efecto del reovirus sobre el cultivo de las células madre a largo plazo. Las células madre fueron infectadas con el reovirus e incubadas durante 2, 24, 48 o 72 horas, respectivamente, luego las células fueron diluidas y cultivadas durante 14 días para dejar que se formen colonias individuales . El número de cada clase de colonia, granulocitos (G) , eritroides (E) o megacariocitos del macrófago eritroide del granulocito (GE M) , fue determinado entonces para las células infectadas sin virus (NV) o el virus vivo (LV) , respectivamente. Por ejemplo, NV-G significa las colonias de granulocitos derivadas de las células las cuales fueron tratadas sin un virus, y LV-G significa aquellas derivadas de las células que fueron tratadas con el reovirus vivo.

Figura 4 Las Figuras 4A-4C muestran los efectos purificadores del reovirus sobre las mezclas del producto de aféresis con las células de MCF7, MDA MB 468 o SKBR3, respectivamente .

Descripción Detallada de la Invención La invención está dirigida a métodos para remover las células neoplásticas mediadas por ras de una composición celular utilizando reovirus, y a composiciones las cuales han sido tratadas de acuerdo con estos métodos. Previo a la descripción de la invención con detalle adicional, los términos utilizados en esta descripción son como se definen a continuación a menos que se indique de otra manera.

Definiciones Cuando se utilice aquí, "células neoplásticas", también conocidas como "células con . un trastorno proliferativo", se refieren a células las cuales proliferan sin las propiedades de inhibición del crecimiento normales . Un nuevo crecimiento que comprende células neoplásticas es un neoplasma o tumor. Un neoplasma es un crecimiento de tejido anormal, que forma generalmente una masa distinta, la cual crece por la proliferación celular más rápidamente que el crecimiento del tejido normal. Los neoplasmas pueden mostrar la falta parcial o total de organización y la coordinación funcional con el tejido normal. Cuando se utilice aquí, un neoplasma está propuesto para abarcar los neoplasmas hematopoyéticos así como neoplasmas sólidos. Un neoplasma puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cáncer) . Los tumores malignos pueden ser clasificados ampliamente en tres tipos principales. Los neoplasmas malignos que surgen de las estructuras epiteliales son llamados carcinomas, los neoplasmas malignos que se originan de los tejidos conectivos tales como músculos, cartílagos o el hueso, son llamados sarcomas y los tumores malignos que afectan las estructuras hematopoyéticas (estructuras que pertenecen a la formación de células sanguíneas) incluyendo los componentes del sistema inmune, son llamados leucemias y linfomas. Otros neoplasmas incluyen, pero no están limitados a neurofibromatosis. Cuando se utilice aquí, "células neoplásticas activadas con ras" o "células neoplásticas mediadas con ras" se refieren a células que proliferan a una velocidad anormalmente elevada debido, al menos en parte, a la activación de la ruta de ras. La ruta de ras puede ser activada por medio de la mutación estructural del gen ras, el nivel elevado de la expresión del gen ras, la estabilidad elevada del mensaje del gen ras, o cualquier mutación u otro mecanismo el cual conduzca a la activación de ras o un factor o factores antes o después de ras en la ruta de ras, por lo cual se incrementa la actividad de la ruta de ras . Por ejemplo, la activación del receptor de EGF, el receptor de PDGF o Sos conduce a la activación de la ruta de ras. Las células neoplásticas mediadas por ras incluyen, pero no están limitadas a, las células cancerosas mediadas por ras, las cuales son células que proliferan de una manera maligna debido a la activación de la ruta de ras . Cuando se utilice aquí, "composición celular" significa una composición que comprende células. La composición puede contener materia no celular. Por ejemplo, la sangre entera es una composición celular que contiene plasma, plaquetas, hormonas y otra materia no celular además de las células tales como eritrocitos y leucocitos. Una composición celular puede contener células de varios tipos, origen u organización. Por ejemplo, los tejidos y órganos que contienen diferentes tipos de células arreglados en estructuras definidas se consideran composiciones celulares. Cuando se utilice aquí, "reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus. El nombre reovirus (virus huérfano respiratorio y entérico) es un acrónimo descriptivo que sugiere que estos virus, aunque no asociados con cualquier estado de enfermedad conocido en los seres humanos, pueden ser aislados de los tractos tanto respiratorio como entérico (Sabin, 1959) . El término "reovirus" se refiere a todos los virus clasificados en el género reovirus . El reovirus humano consiste de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o TIL) , tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D) . Los tres serotipos son fácilmente identificables con base en los ensayos de neutralización e inhibición de hemaglutinina (Véase, por ejemplo, Fields et al, 1996) . El reovirus puede estar presente de manera natural o estar modificado. El reovirus está "presente de manera, natural" cuando el mismo puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado intencionalmente por los seres humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente del campo", es decir, de un humano quien ha sido infectado con el reovirus. El reovirus puede ser modificado pero todavía capaz de infectar líticamente una célula de mamífero que tiene una ruta de ras activa. El reovirus puede ser pretratado química o bioquímicamente (por ejemplo, por el tratamiento con una proteasa, tal como quimiotripsina o tripsina) previo a la administración a las células proliferativas. El pretratamiento con una proteasa remueve el recubrimiento externo o cápsida del virus y puede incrementar la capacidad de infección del virus . El reovirus puede ser recubierto en un liposoma o micela (Chandron y Nibert, 1998) para reducir o prevenir una respuesta inmune de un mamífero que ha desarrollado inmunidad al reovirus. Por ejemplo, el virión puede ser tratado con quimiotripsina en la presencia de concentraciones formadoras de micelas de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva partícula de subvirión infecciosa. El reovirus puede ser un reovirus recombinante de dos o más tipos de reovirus con diferentes fenotipos patógenos de tal modo que el mismo contenga diferentes determinantes antigénicos, por lo cual se reduce o previene una respuesta inmune por un mamífero previamente expuesto a un subtipo del reovirus. Tales viriones recombinantes pueden ser generados por coinfección de las células de mamífero con diferentes subtipos del reovirus con la reunión e incorporación resultante de proteínas de recubrimiento de diferente subtipo en las cápsidas de virión resultantes. La "resistencia" de las células a la infección con el reovirus indica que la infección de las .células con el virus no condujo a una producción o rendimiento viral significativo. -Las células que son "susceptibles" son aquellas que demuestran la inducción de los efectos citopáticos, la síntesis de la proteína viral, y/o la producción del virus. La resistencia a la infección por el reovirus se encontró que va a ser al nivel de la traducción del gen, en lugar de al inicio de la transcripción: mientras que los transcritos virales fueron producidos, las proteínas del virus no fueron expresadas . Sin que esté limitado por alguna teoría, se piensa que la transcripción del gen viral en las células resistentes correlacionada con la fosforilación de una proteína de la célula de 65 kDa aproximadamente, se determinó que va a ser la proteína cinasa activada con ARN (PKR)de doble hebra, que no fue observada en las células transformadas. La fosforilación de PKR condujo a la inhibición de la traducción. Cuando la fosforilación fue suprimida por la 2-aminopurina, un inhibidor conocido de la PKR, ocurrió una mejora drástica de la síntesis de la proteína del reovirus en las células no transformadas. Cuando se utilice aquí, "oncólisis" o "reducción de la viabilidad de las células neoplásticas" se refiere a una reducción de al menos aproximadamente 20% en la viabilidad de las células neoplásticas de blanco. La viabilidad puede ser determinada por un conteo de células viables de las células tratadas, y el grado de reducción puede ser determinado comparando el número de células viables en las células tratadas con aquel de las células no tratadas, o comparando el conteo de células viables antes y después del tratamiento con el reovirus. La reducción en la viabilidad es preferentemente de al menos aproximadamente 50%, más preferentemente de al menos aproximadamente 70%, todavía más preferentemente de al menos aproximadamente 80%, y aún más preferentemente de al menos aproximadamente 90%. Cuando se utilice aquí, un "receptor del trasplante" es un mamífero que recibe un trasplante de las composiciones celulares. Preferentemente, el receptor es un ser humano, y más preferentemente, el receptor es un ser humano que está recibiendo el trasplante en el tratamiento del cáncer. Cuando se utilice aquí, "CPE" como un marcador apoptótico se refiere a los efectos citopáticos asociados típicamente con la apoptosis los cuales son observables bajo el microscopio, tales como el "ampollado de la membrana celular", la condensación nuclear y la condensación de cromatina.

Métodos La presente invención se refiere al uso de un reovirus para remover las células neoplásticas de las composiciones celulares las cuales son sospechosas de contener tales células neoplásticas. Puesto que la ruta de ras activada está asociada con muchos tumores, esta invención puede ser aplicada a composiciones celulares sospechosas de tener cualquiera de una gran variedad de células neoplásticas. Para los reovirus de mamífero, la señal de reconocimiento de la superficie celular es el ácido siálico (Armstrong, 1984; Gentsch y Pacitti, 1985; Paul et al, 1989) . Debido a la naturaleza ubicua del ácido siálico, el reovirus se aglutina eficientemente a una multitud de líneas celulares y como tales pueden tener potencialmente como blanco muchos tejidos diferentes; sin embargo, existen diferencias significativas en la susceptibilidad a la infección con el reovirus entre las líneas celulares. Una razón para esta discrepancia en la susceptibilidad puede ser la actividad de la ruta de ras en cada tipo de célula. Se ha descubierto recientemente que el reovirus lisa selectivamente las células neoplásticas activadas con ras in vitro, in vivo y ex vivo (Coffey et al, 1998; WO 99/08692) . Normalmente, las células no son susceptibles a la infección con el reovirus. Sin embargo, si la ruta de ras es activada, el reovirus puede replicarse exitosamente en las células y eventualmente conduce a la lisis de las células huésped. Por ejemplo, cuando las células de NIH 3T3 resistentes al reovirus fueron transformadas con Ras o Sos activados, una proteína la cual activa Ras, la infección con el reovirus fue mejorada (Strong et al, 1998) . De manera semejante, los fibroblastos del ratón que son resistentes a la infección con el reovirus llegan a ser susceptibles después de la transfección con el gen receptor de EGF o el oncogen de v-erbB (Strong et al, 1993; Strong et al, 1996) . Sin que esté limitado a una teoría, parece que la replicación del reovirus es regulada al nivel translacional (Strong et al, 1998; Norman et al, 2000) . En las células NIH 3T3 no transformadas, los transcritos virales iniciales activan la proteína cinasa (PKR) activada con el ARN de doble hebra, la cual inhibe la traducción, por lo cual inhibe la replicación viral. El ras activado (o un elemento activado de la ruta de ras) presumiblemente inhibe o invierte la activación con PKR. Por lo tanto, la síntesis de proteína viral procede, las partículas virales son hechas, y las células son Usadas eventualmente. El oncogen de ras tiene importancia para un gran número de tumores. La activación de las mutaciones del gen ras ocurren por sí mismas en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, J.L., 1989), principalmente en los carcinomas pancreáticos (90%) , colorectal esporádico (50%) y del pulmón (40%), y la leucemia mieloide (30%) . La activación de los factores arriba o abajo de ras en la ruta de ras también está asociada con los tumores. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/Neu/ErbB2 o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en el cáncer del pecho (25-30%) , y la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento derivado de los plaquetas (PDGF) o receptor de EGF es prevaleciente en los gliomas y glioblastomas (40-50%) . El receptor EGF y el receptor PDGF ambos se sabe que activan ras durante la aglutinación a su ligando respectivo, y v-erbB codifica un receptor activado constitutivamente que carece del dominio extracelular. Se demostró en esta invención que el reovirus provocó eficientemente la oncólisis de tres sistemas de modelo del cáncer del pecho, MCF7, SKBR3 y MDA MB 468, induciendo la apoptosis en las células infectadas (Ejemplo 1) . Por consiguiente, el tratamiento con el reovirus condujo a una reducción marcada en la viabilidad de las células MCF7, SKBR3 y MDA MB 468, mientras que los controles tratados sin el virus o con el virus muerte crecieron normalmente (Figuras 1A-1D) . La reducción en la viabilidad estuvo acompañada por características las cuales están asociadas con la apoptosis, tales como la fragmentación del JADN, la positividad con el teñido con annexin V o APO 2.7 (Figuras 2A-2G) y efectos citopáticos, tales como el ampollado de la membrana celular, la condensación nuclear y la condensación de cromatina observada bajo el microscopio.

Puesto que la infección por el reovirus está bloqueada usualmente al nivel traduccional en las células normales pero no en las células neoplásticas mediadas por ras, se examinó el grado síntesis de la proteína en las células MCF7 tratadas con el reovirus y las células madre CD34+ (Ejemplo 2) . Realmente, las proteínas virales fueron sintetizadas en la línea celular del cáncer infectada con el reovirus, pero no en las células madre CD34+ las cuales también fueron tratadas con el reovirus (datos no mostrados) . Este resultado sugiere que será seguro tratar las células madre hematopoyéticas con el reovirus, puesto que las proteínas reovirales no fueron sintetizadas en las células madre tratadas con el reovirus y la síntesis de la proteína celular procedió normalmente. Para confirmar este punto, la viabilidad de las células CD34+ tratadas con el reovirus se determinó en varios puntos del tiempo después del tratamiento con el reovirus (Ejemplo 3) . Los números de células en las poblaciones tratadas con el reovirus vivo o sin el virus, fueron semejantes después de cada instante del tiempo (Figura 3A) , indicando que las células CD34+ no son susceptibles a la infección con el reovirus . Para que el reovirus sea útil en la purificación de las células madre hematopoyéticas en tratamientos de quimioterapia de dosis elevadas, es esencial que el tratamiento con el reovirus no altere la capacidad de las células madre para diferenciarse en cada una y en cada linaje hematopoyético para reconstituir el sistema hematopoyético completo. Por lo tanto, el efecto a largo plazo del tratamiento con el reovirus fue evaluado (Ejemplo 3) . Las células CD34+ tratadas ya sea sin el virus o con el virus vivo no mostraron esencialmente ninguna diferencia en su capacidad para diferenciarse en granulocitos, eritroides, o egacariocitos del macrófago eritroide del granulocito aún después de 72 horas de tratamiento con el reovirus (Figura 3B) . La relación entre estos tres linajes también permaneció idéntico después de este tratamiento prolongado. En consecuencia, el tratamiento con el reovirus ni exterminó las células CD34+ ni cambió el potencial de ellas para reconstituir el sistema hematopoyético. Además, el reovirus es capaz de purificar una composición celular mezclada, como se demuestra por el exterminio selectivo de las células MCF7, SKBR3 o MDA MB 468 en una mezcla de células cancerosas y el producto de aféresis el cual contuvo las células madre. CD34+ (Ejemplo 4) . Por la medición de CD34 y la citoqueratina, un marcador específico para las células epiteliales tales como MCF7, SKBR3 o MDA MB 468, se mostró que el reovirus eliminó esencialmente las células del cáncer de la composición celular mezclada (Figuras 4A-4C) mientras que se dejan las células madre intactas. Por lo tanto, el tratamiento con el reovirus es un método eficiente para retirar las células neoplásticas de las composición de la célula madre hematopoyética. En consecuencia, en una modalidad de esta invención, los autoinjertos que contienen la célula madre, son tratados con el reovirus previo al trasplante para remover las células neoplásticas activadas con ras contaminantes o espontáneas. Esto incrementa la eficacia del tratamiento del trasplante de la célula madre hematopoyética autóloga/quimioterapia de dosis elevadas. Será de interés particular el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, leucemia mielogenosa aguda, cánceres de las células germinales (testiculares) , tumores del cerebro, y tumores del pecho, puesto que la quimioterapia de dosis elevadas y el trasplante de células madre autólogas ha sido efectuada eficientemente en pacientes con estos tumores. Sin embargo, se contempla que el presente método será útil en otros cánceres así como para remover cualesquiera células neoplásticas mediadas por ras, puesto que la activación de la ruta de ras puede ocurrir en cualquier tipo de célula o tejido. Las células madre progenitoras hematopoyéticas pueden ser removidas de la médula ósea del paciente previo al tratamiento. Alternativamente, en un paciente con cáncer quien ha estado recibiendo la quimioterapia de dosis no elevadas, tradicional, muchas células madre típicamente aparecen en la sangre periférica. Por lo tanto, la célula madre progenitora hematopoyética puede ser removida de la sangre como el . producto de aféresis, el cual puede ser almacenado durante un período de tiempo prolongado antes de ser trasplantado. La presente invención puede ser aplicada a los autoinjertos que contienen las células madre las cuales fueron colectadas de cualquier fuente del tejido, incluyendo la médula ósea y la sangre. Aunque el reovirus normalmente no está asociado con ninguna enfermedad conocida, puede ser más infecciosa para los pacientes con cáncer cuyos sistemas inmunes están debilitados debido a la quimioterapia. En consecuencia, en otra modalidad de esta invención, las composiciones de la célula madre que han sido tratadas con el reovirus son congeladas en una solución que contiene DMSO y descongeladas previo al trasplante. Aunque el DMSO es utilizado rutinariamente para congelar y almacenar las células animales, el mismo desnaturaliza el reovirus, por lo cual remueve el reovirus infeccioso de la preparación de la célula madre. Esto reduce el riesgo de que el reovirus pueda provocar infecciones indeseables cuando el mismo es introducido en el receptor del trasplante por medio del trasplante de las células madre. En otra modalidad, las composiciones celulares tratadas con el reovirus son tratadas con anticuerpos anti- reovirus o una combinación de anticuerpos anti-reovirus y complementos para inactivar o lisar el reovirus. Alternativa o adicionalmente, los anticuerpos anti-reovirus que reconocen una molécula sobre la superficie de la partícula del reovirus pueden ser utilizadas para remover las partículas del reovirus de la composición celular tratada con el reovirus. Así, los anticuerpos son inmovilizados en una columna, perlas o cualquier otro material o dispositivo conocido en el arte, la composición celular es aplicada a los anticuerpos inmovilizados, y la parte de la composición la cual no se aglutina a los anticuerpos es colectada de acuerdo con un procedimiento adecuado para el método particular de inmovilización. Otro método que puede ser utilizado para remover el reovirus de la mezcla tratada con el reovirus es someter la mezcla a un gradiente el cual separa las células del virus, y colectar la capa que contiene solamente las células. En otra modalidad, al receptor del trasplante se le proporcionan tratamientos para estimular el sistema inmune para reducir el riesgo de infección con el reovirus. Este tratamiento puede ser efectuado previo a, al mismo tiempo que, o después del trasplante, pero preferentemente es efectuado previo al trasplante. Como un tratamiento alternativo o en conjunción con el estimulante del sistema inmune, al receptor se le pueden dar anticuerpos anti- reovirus para reducir el riesgo de infección cpn el reovirus. Además de las células madre hematopoyéticas, la presente invención puede ser aplicada ampliamente para remover las células neoplásticas activadas con ras de muchas otras composiciones celulares. Por ejemplo, el reovirus puede ser utilizado como una práctica de rutina para "limpiar" (remover las células neoplásticas activadas con ras de) cualquier tejido o trasplante de órgano. La aplicación de la presente invención no está limitada por el tipo de célula o tejido a causa de que como se describió anteriormente, el receptor para el reovirus es ubicuo, y el mecanismo en las células normales para inhibir la replicación del reovirus, PKR, también es ubicuo. Por lo tanto, cualquier célula puede llegar a ser una célula neoplástica mediada con ras y llega a ser susceptible a la infección con el reovirus. Será de interés particular el uso de los métodos reivindicados para limpiar la sangre entera o cualquier porción de la misma para una transfusión subsiguiente. De manera semejante, el trasplante de un tejido u órgano ha llegado a ser crecientemente común, y será benéfico si el trasplante puede ser tratado para remover las células neoplásticas activadas con ras antes del trasplante. Las células del hígado, riñon, corazón, córnea, injerto de la piel, del islote pancreático, la médula ósea o cualesquiera porciones de las mismas, son sólo algunos ejemplos de los tejidos u órganos a los cuales esta invención puede ser aplicada. El tejido u órgano puede ser autólogo, alogenéico o xenogenéico. El tejido u órgano también puede ser derivado de un animal transgénico, de un tejido/órgano el cual el desarrollado in vitro de las células madre, o puede ser expandido ex vivo. El tejido u órgano que va a ser tratado con el reovirus puede ser de un origen embriónico o de adulto. Por ejemplo, las células neuronales embriónicas pueden ser tratadas antes que sean trasplantadas en un paciente con la enfermedad de Alzheimer. De manera semejante, la invención puede ser utilizada para tratar el semen o los huevos del donador ex vivo. La aplicación de la presente invención no está limitada a los trasplantes'. En lugar de esto, cualesquiera composiciones celulares pueden ser "limpiadas" con el reovirus para cualquier propósito. Por consiguiente, todos los ejemplos descritos anteriormente son aplicables aún si el tejido u órgano no está propuesto para el trasplante. Las líneas celulares también pueden ser tratadas de la manera acostumbrada para protegerlas contra las células neoplásticas mediadas con ras espontáneas o contaminantes . Nuevamente, cualquier línea celular será un buen candidato para este método, excepto, por supuesto, una línea celular transformada por medio de la activación de la ruta de ras. Recientemente, muchos laboratorios han estado intentando establecer seriamente xenoinjertos trasplantables del tejido de cáncer de la próstata humana inoculados en ratones inmuno-comprometidos. Sin embargo, la contaminación con las células del cáncer del ratón frecuentemente ocurre durante el paso en serie de los xenoinjertos y estas células pueden pasar eventualmente a las células humanas del cáncer de la próstata (Gao et al, 1999) . La presente invención será una solución simple a este problema si el cáncer contaminante está mediado por ras y el xenoinjerto no lo está. Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar esta invención y no están propuestos de ninguna manera como limitativos del alcance de la presente invención.

Ejemplos En los ejemplos posteriores, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen sus significados aceptados generalmente . µM = micromolar mM = milimolar M = molar ml = mililitro µl = microlitro mg = miligramo µg = mierogramo PAGE = electrofóresis en gel de poliacrilamida rpm = revoluciones por minuto FBS = suero de bovino fetal DTT = ditiotreitol SDS = dodecil sulfato de sodio PBS = solución salada amortiguada con fosfato DMEM = medio de Eagle modificado de Dulbecco -MEM = medio de Eagle a-modificado ß-ME = ß-mercaptoetanol MOI = multiplicidad de infecciones PFU = unidades formadoras de placa PKR = proteína cinasa activada por el ARN de doble hebra EGF = factor de crecimiento epidérmico PDGF = factor del crecimiento derivado de las plaquetas DMSO = sulfóxido de dimetilo CPE = efecto citopático Ejemplo 1 Oncólisis inducida por el reovirus y apoptosis en las células del cáncer del pecho Para determinar el efecto del reovirus sobre la viabilidad de las células neoplásticas, primero se usaron tres sistemas modelo del cáncer del pecho, MCF7 (ATCC número HTB-22), SKBR3 (ATCC número HTB-30) y MDA MB 468 (ATCC número HTB 132) . Las células de cada línea celular se hicieron crecer a una confluencia de 50-60% y se infectaron con el serotipo 3 del reovirus, cepa Dearing, en una multiplicidad de sitios de infección de 40. El reovirus fue obtenido y mantenido como se describe en la Patente U.S. No. 6,136,307. Las células infectadas y no infectadas del reovirus fueron colectadas a las 0, 24, 48 y 72 horas después de la infección y la viabilidad fue determinada. Los resultados son mostrados en las Figuras 1A-1D.

El conteo de las células viables en las células MCF7 infectadas con el reovirus (Figura 1A) , SKBR3 (Figura IB) .o MDA MB 468 (Figura ÍC) se redujo significativamente después de la infección, mientras que las células infectadas con el virus muerto o sin el virus proliferaron como se esperaba. El tratamiento con el reovirus provocó que la viabilidad de MCF7 (Figura ID) y SKBR3 se redujera desde 93% hasta 16% a las 72 horas después de la infección. En las células MDA MB 468, los números de células intactas tratadas con el virus se redujeron a 12.7%, 8.8% y 3.6% de los conteos de las células originales, respectivamente, a las 24, 48 y 72 horas después de la infección. Así, el reovirus provocó la oncólisis eficientemente en la totalidad de las tres clases de células cancerosas . Las células murieron por apoptosis. Los marcadores apoptóticos típicos tales como CPE, Annexin V y el escalonamiento del ADN pudieron ser observados en un curso del tiempo paralelo a la reducción de la viabilidad. Las Figuras 2A-2G muestran el porcentaje de fragmentación del ADN (2A-2C) , el teñido con Annexin V (2D) o las células AP02.7+ (2E-2G) en varios puntos del tiempo después de la infección con el reovirus. Las células tratadas con el reovirus exhibieron todas las señales de apoptosis a un nivel dramático comparado con los controles del virus muerto o sin virus, demostrando que el reovirus indujo la apoptosis en la totalidad de estas tres líneas celulares. La apoptosis en los controles parece que se incrementa lentamente también con el tiempo, probablemente a causa de que empezaron a morir cuando las mismas han crecido muy densamente.

Ejemplo 2 El reovirus inhibió selectivamente la síntesis de la proteína en las sélulas del cáncer pero no en las sélulas madre CD34+ Para probar adicionalmente la infección viral selectiva de las células del cáncer, se llevó a cabo la etiquetación con 35S/SDS/PAGE de las proteínas virales. La síntesis de las proteínas virales fue evidente después de 1-2 días en las células de MCF7 infectadas con el reovirus, mientras que la síntesis de la proteína celular se redujo al mismo tiempo, indicando que el reovirus ha tomado el mando de la maquinaria celular. A los 4 días después de la infección, ninguna síntesis de la proteína podría ser detectada más, sugiriendo que Aodas las células han sido exterminadas. En los experimentos de control en donde las células fueron infectadas con el reovirus muerto o sin el virus, no existió la síntesis de la proteína viral, mientras que la síntesis de la proteína celular estuvo en el nivel normal. Por el contrario, la etiquetación con 35S de las células madre CD34+ en la presencia o ausencia del reovirus no mostró la síntesis de la proteína viral hasta 72 horas después de la adición del virus. Por lo tanto, el reovirus infecta selectivamente a las células MCF7 pero no a las células madre CD34A Ejemplo 3 El tratamiento son el reovirus no inhibió la proli erasión celular ni alteró la diferensiasión potensial de las sélulas CD34+ De manera consistente con los resultados de la síntesis de proteínas, el conteo de células viables indicó que el tratamiento con el reovirus no redujo el número de células' viables en las células CD34+ (Figura 34) cuando se compara con el control sin el virus. Aunque el número de células CD34+ no fue afectado por la infección del reovirus, subsiste la cuestión de que si el reovirus cambió el potencial de las células madre CD34+ para diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos en la proporción apropiada. Si este fue el caso, las células madre tratadas con el reovirus podrían no ser un buen candidato para la reconstitución del sistema hematopoyético completo. Para investigar esta posibilidad, las células CD34+ fueron incubadas con el reovirus durante 2, 24, 48 o 72 horas, respectivamente. El reovirus fue removido entonces y las células fueron diluidas y cultivadas en un medio fresco durante 14 días para dejar que se formen las colonias. Cada colonia fue examinada para determinar si la misma pertenece a los linajes de granulocitos, eritroides, o magacariocitos del macrófago eritroide del granulocito. Como se muestra en la Figura 3B, las células madre tratadas con el virus vivo (LV) produjeron números semejantes de granuiocitos (G) , eritrocitos (E) o megacariocitos del macrófago eritroide del granulocito (GEMM) como el control sin el virus (NV) . Por lo tanto, el tratamiento con el reovirus no cambió el potencial de diferenciación de las células CD34A Ejemplo 4 El reovirus removió selesti amente las sélulas del sánser de una somposisión selular mezclada Las células neoplásticas fueron mezcladas con el producto de aféresis y se sometieron a la infección con el reovirus para investigar si el reovirus puede remover selectivamente las células neoplásticas de la composición celular mezclada. El producto de aféresis fue preparado de acuerdo con un procedimiento descrito previamente (Stewart et al, 1999; Duggan et al, 2000) . Cuando las mezclas del producto de aféresis (90%) y MCF7 (10%) fueron tratadas con el reovirus y probadas diariamente para el conteo celular y la viabilidad, existió una disminución de 100 veces en los números de las células de MCF7 positivas a la citoqueratina mientras que las células madre CD34+ permanecieron intactas y viables (Figura 4B) . El reovirus fue efectivo de manera semejante en la remoción selectiva de las células MDA MB 468 (Figura 4B) o SKBR3 (Figura 4C) de su mezcla con el producto de aféresis, respectivamente. Estos resultados demuestran que el reovirus puede exterminar selectivamente las células neoplásticas en una mezcla de células y dejar intactas a las células madre. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REGVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para remover las células neoplásticas mediadas por ras de una composición celular sospechosa de contener tales células neoplásticas, tal método está caracterizado porque comprende poner en contacto la composición celular con el reovirus bajo condiciones las cuales conducen a la oncólisis de las células neoplásticas mediadas por ras .
2. 2. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular comprende células madre hematopoyéticas .
3. 3. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque las células madre hematopoyéticas han sido colectadas de la médula ósea.
4. 4. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque las células madre hematopoyéticas han sido colectadas de la sangre.
5. 5. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular comprende un tejido, un órgano o cualquier porción de un tejido o un órgano .
6. 6. El método de la Reivindicación 5, caracterizado porque el tejido u órgano se selecciona del grupo que consiste del hígado, riñon, corazón, córnea, piel, pulmón, células del islote pancreático, y sangre entera.
7. 7. El método de la Reivindicación 5, caracterizado porque el tejido, órgano o porción del tejido u órgano es útil para el trasplante.
8. 8. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque la composición celular comprende células cultivadas, semen o huevos.
9. 9. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus de mamífero.
10. 10. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus de ave.
11. 11. El método de la Reivindicación 9, caracterizado porque el reovirus de mamífero es un reovirus humano .
12. 12. El método de la Reivindicación 9, caracterizado porque el reovirus de mamífero es el virus del serotipo 3.
13. 13. El método de la Reivindicación 12, caracterizado porque el virus del serotipo 3 es de la cepa Dearing.
14. 14. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de congelar y almacenar la composición tratada con el reovirus en una solución que contiene DMSO.
15. 15. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de tratar la composición tratada con el reovirus con anticuerpos y complementos anti-reovirus .
16. 16. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende los pasos de someter las células tratadas a un gradiente el cual separa las células del reovirus y colectar la capa que contiene las células.
17. 17. Un método de preparación de una composición celular para el trasplante hacia un receptor, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) seleccionar una composición celular para el trasplante; y (b) poner en contacto la composición con un reovirus bajo las condiciones que conduzcan a la oncólisis de las células neoplásticas mediadas por ras.
18. 18. El método de la Reivindicación 17, caracterizado porque el trasplante es autólogo.
19. 19. El método de la Reivindicación 17, caracterizado porque además comprende el paso de administrar al receptor del trasplante al menos una substancia seleccionada del grupo que consiste de un anticuerpo anti-reovirus y/o un agente estimulante del sistema inmune.
20. 20. Un método para reducir el riesgo de recurrencia del tumor debido al trasplante de las células madre hematopoyéticas autólogas sospechosas de contener las células neoplásticas mediadas por ras, caracterizado porque comprende colectar de un sujeto que va a recibir el trasplante una composición celular que comprende las células madre hematopoyéticas, poner en contacto la composición celular con un reovirus bajo condiciones las cuales conduzcan a la oncólisis de las células neoplásticas mediadas con ras, e introducir la composición tratada con el reovirus de regreso al sujeto.
21. 21. Una composición celular, caracterizada porque es preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
22. 22. La composición de la Reivindicación 21, caracterizada porque es utilizada en el trasplante.
23. 23. La composición de la Reivindicación 22, caracterizada porque el trasplante es autólogo.
24. 24. La composición de la Reivindicación 23, caracterizada porque la composición comprende células madre hematopoyéticas .