CN110592015A - 一种诱导增强cik细胞的滇重楼多糖组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种中药诱导增强CIK细胞活性的方法，该方法包括向CIK细胞培养液加入重楼与麦冬提取物，所述重楼提取物为滇重楼多糖，所述麦冬提取物为麦冬多糖，该方法能激活CIK细胞增殖活性与杀瘤活性，提高CIK细胞在体外的杀瘤效果，且通过该方法能获得大量CIK细胞，节省细胞培养时间，利用该方法制备得到的增强型CIK细胞能用于肝脏肿瘤的治疗。

Description

一种诱导增强CIK细胞的滇重楼多糖组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种诱导增强CIK细胞的滇重楼多糖组合物及其应用。

背景技术

肝脏具有分泌、排泄、合成、生物转化及免疫等多种生理功能，是重要的人体器官。我国是乙肝大国，中国的慢性乙肝病人中，约25％-40％最终将死于肝硬化或合并肝癌。原发性肝癌发病隐匿,是临床常见的恶性肿瘤，绝大多数患者确诊时已属晚期。目前常规的手术和放化疗等治疗方法均不能彻底清除体内的癌细胞，体内回输免疫活性细胞的过继免疫治疗法可以直接杀伤肝癌细胞，还可调节和增强机体免疫力，从而成为肝癌治疗的重要辅助手段。

我国对原发性肝癌患者进行CIK细胞续灌输入治疗这一治疗方案正在逐渐普及(第三军医大学学报，2015，37(23):2386-2390)。肝癌患者多伴有免疫缺陷，容易致使肿瘤转移、复发。CIK细胞在免疫调节及抗肿瘤免疫治疗中有着重要作用，CIK细胞不仅直接杀伤残余癌细胞，还通过分泌炎症细胞因子如IL-2等改善肝癌患者免疫功能，是恶性肿瘤过继治疗的重要手段之一，其治疗效果与细胞输注剂量、效应细胞比例和对肿瘤细胞毒性有着密切关系。CIK细胞的增殖和杀瘤活性依赖于多种细胞因子及外源因子的刺激，因此CIK细胞在临床上应用受到其在体外增殖活性及体内杀瘤活性的限制，提高其体外的增殖活性和体内杀瘤活性具有重要临床应用价值。

发明内容

本发明人发现中药提取组合物可诱导增强型CIK细胞。为培养出具有更高效杀瘤活性又能大量扩增的CIK细胞，本发明的目的在于提供一种中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，该方法能促进CIK细胞体外高效扩增，同时提高了CIK细胞体外杀伤肝脏肿瘤细胞的效率，将得到的CIK细胞可以应用于肝脏肿瘤疾病的细胞治疗。

在第一方面，本发明提供了一种CIK细胞培养基，所述CIK细胞培养基包括：滇重楼多糖和麦冬多糖。

在一个实施方案中，所述滇重楼多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为50μg/mL～300μg/mL，麦冬多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100μg/mL～300μg/mL。

在一个实施方案中，所述CIK细胞培养基还包括无血清基础培养基和细胞因子。

在一个实施方案中，所述CIK细胞培养基还包括血清。优选地，所述血清在无血清基础培养基中的体积百分含量约为10％。

在第二方面，本发明提供了一种滇重楼多糖与麦冬多糖组合物诱导增强型CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)将外周血单个核细胞(PBMC)诱导培养成CIK细胞；

(2)将所述CIK细胞培养至7-9天时，在含滇重楼多糖和麦冬多糖混的CIK细胞培养基中培养72h以上。

在一个实施方案中，滇重楼多糖的浓度为50ug/mL～300ug/mL和所述麦冬多糖的浓度为200ug/mL。

在第三方面，本发明提供了根据本发明第二方面的方法制备的CIK细胞。

在第四方面，本发明提供了一种滇重楼多糖和麦冬多糖在制备免疫细胞培养基中的应用。

具体实施方式

中药重楼是我国的传统中药，为百合科重楼属植物的泛称，最早载于《神农本草经》，名为蚤休，后《南本草》开始以重楼作为正式药名。具有清热解毒、凉肝定惊、消肿止痛等功效，主要用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症(中国药典.2010:243)。麦冬是百合科沿阶草属植物麦冬的干燥块根，具有养阴生津、润肺清心之功效(中国药典.2015:155-156)。麦冬主要含有多糖、甾体皂苷、高异黄酮等活性成分。麦冬中含有大量的多糖类成分，并由单糖与低聚糖类化合物组成。文献报道，麦冬多糖经水解之后主要由果糖组成，其果糖与葡萄糖的比例为35∶1(中草药，2005，36(5):1488)。现代药理研究表明麦冬多糖具有广泛的药理作用，包括降糖作用、抗心肌缺血和心肌梗塞作用、对肌体免疫系统的作用、抗氧化作用、抗肿瘤作用、外分泌腺保护作用等。将二者结合应用于医疗目的至今没见报道。

本发明提供了一种滇重楼多糖与麦冬多糖组合物诱导增强型CIK细胞的制备方法及其在CIK细胞培养中的应用。本发明采用的技术方案为：先分离单核细胞，通过细胞因子诱导成CIK细胞。在CIK细胞基本成熟后，向CIK细胞培养液中加入滇重楼多糖与麦冬多糖组合物来激活CIK细胞活性与功能，通过相关实验技术检测滇重楼多糖与麦冬多糖组合物对CIK细胞增殖、杀瘤及免疫活性方面的影响，所述的滇重楼与麦冬组合物为滇重楼多糖提取物和麦冬多糖提取物的混合液。

虽然不拘囿于具体理论，发明人认为重楼在杀伤和抑制癌细胞、调节机体免疫功能、阻遏癌症的发生和转移、诱导癌细胞分化、抑制肿瘤血管生成、逆转癌细胞的耐药性等方面都具有良好的活性；重楼皂苷Ⅰ对人肝癌细胞MHCC97-H增殖及细胞周期都具有明显的影响；重楼多糖能显著增强小鼠脾脏免疫功能及抗氧化能力；麦冬多糖有抑制原发性肝癌实体瘤的功效。

在本发明中，所述无血清基础培养基可以包括GT-T551无血清培养基。

在本发明中，所述细胞因子可以包括白细胞介素-2(IL-2)、抗CD3单克隆抗体(CD3mAB)的一种或两种。

在本发明中，所述的细胞因子可以包括培养基中终浓度为500ng/mL的抗CD3单克隆抗体及终浓度为1000U/mL的白介素-2。

本发明使用滇重楼多糖与麦冬多糖由湖南师范大学生命科学学院分离纯化，其他试剂皆为普通市售品。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例1

1)密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)，步骤为：

(1)外周血采集：由专业医务采血人员负责静脉采血方式抽取20mL健康自愿者血液到含有肝素钠抗凝剂的真空采血管中，颠倒采血管几次。

(2)收集血清：将采集的健康自愿者血液移到50mL离心管中，1000g离心10min，离心后形成上层血清和下层细胞两相。将上层血浆移至新的离心管，56度水浴30min灭活后备用。

(3)样品稀释：加入生理盐水稀释剩下的细胞层至体积为30mL，用移液管充分吹打均匀。

(4)梯度离心：取一新的50mL离心管加入15mL人血淋巴细胞分离液，用10mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min。

(5)收集白膜层：离心完成后，离心管内液相分为四层，从下往上分别为血浆(含血小板)、白膜层(即单个核细胞)、淋巴分离液、红细胞和粒细胞层，用10mL移液管或1mL移液器小心收集中间的白膜层至新的50mL离心管。

(6)清洗：在收集了白膜层的离心管中加RPMI-1640至45mL，混匀，22℃，1000g离心10min，弃去上清。

(7)重复步骤(6)一遍，并在离心前取20uL细胞悬液进行台盼蓝细胞计数。

2)将所述PBMC加入CIK细胞培养液诱导培养：按细胞数2×10⁶个/mL加入无血清GT-T551基础培养基重悬打散细胞沉淀，再加入抗CD3单克隆抗体(CD3 mAB)至终浓度500ng/mL、白介素-2(IL-2)终浓度为1000U/mL及体积分数为10％的血清。

3)细胞种瓶：转移细胞悬液至T175瓶中，置于37℃、5％CO2、90％相对湿度的细胞培养箱培养，该天定为第0天(d0)。隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液。每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×10⁶个/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。

4)在CIK细胞培养至第7天时加入滇重楼多糖处理CIK细胞，作用72h：

(1)CIK细胞铺板：将培养7天的CIK细胞数调整至2×10⁵个/mL，于96孔细胞培养板中加入细胞悬液100uL/孔，每孔2×10⁴个细胞。

(2)加入滇重楼多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为6组，每个组4个平行复孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度分别为25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL和400ug/mL滇重楼多糖溶液各100uL/孔，置于细胞培养箱中培养72h。

5)CCK-8法检测细胞活性：培养72h后每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h后，用酶联免疫检测仪检测各孔细胞在450nm处吸光值(吸光值的大小与活细胞的数量呈正比)，记录结果并对数据进行统计学分析。

6)CIK细胞增殖活性结果分析

将实验组中6个不同浓度的滇重楼多糖溶液处理CIK细胞后，CIK细胞增殖效果如表1：

表1：不同浓度滇重楼多糖对CIK细胞增殖效果影响

组别	A 450值	显著性(p)
			对照组	0.242±0.005
实验组1(滇重楼多糖25μg/mL)	0.246±0.01	P>0.05
			实验组2(滇重楼多糖50μg/mL)	0.254±0.011	P<0.05
实验组3(滇重楼多糖100μg/mL)	0.266±0.012	P<0.05
			实验组4(滇重楼多糖200μg/mL)	0.282±0.016	P<0.01
实验组5(滇重楼多糖300μg/mL)	0.294±0.014	P<0.01
			实验组6(滇重楼多糖400μg/mL)	0.273±0.01	P<0.05

相比对照组(生理盐水)，实验1-6组都能提高细胞活性，其中实验组1组无显著变化；2-5组的OD值显著升高，表明这4组的活细胞数量较对照组显著增加；6组相对5组细胞活性下降，说明滇重楼多糖溶液过高反而影响CIK细胞的增殖。实验证明选取50ug/mL-300ug/mL浓度的滇重楼多糖溶液能显著促进CIK细胞的增殖。

实施例2

1)-3)，按照实施例1的的步骤进行PBMC分离及CIK细胞诱导培养。

4)在CIK细胞培养至第7天时加入麦冬多糖处理CIK细胞，作用72h：

(1)CIK细胞铺板：将培养7天的CIK细胞数调整至2×105个/mL，于96孔细胞培养板中加入细胞悬液100uL/孔，每孔2×104个细胞。

(2)加入麦冬多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为3组，每个组4个平行复孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度分别为100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL的麦冬多糖溶液各100uL/孔，置于细胞培养箱中培养72h。

5)CCK-8法检测细胞活性：培养72h后每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h后，用酶联免疫检测仪检测各孔细胞在450nm处吸光值(吸光值的大小与活细胞的数量呈正比)，记录结果并对数据进行统计学分析。

6)CIK细胞增殖活性结果分析

将实验组中3个不同浓度的麦冬多糖溶液处理CIK细胞后，CIK细胞增殖效果如表2：

表2：不同浓度麦冬多糖对CIK细胞增殖效果影响

组别	A450值	显著性(p)
			对照组	0.241±0.006
实验组1(麦冬多糖100μg/mL)	0.254±0.01	P<0.05
			实验组2(麦冬多糖200μg/mL)	0.261±0.011	P<0.05
实验组3(麦冬多糖300μg/mL)	0.26±0.012	P<0.05

相比对照组(生理盐水)，实验1-3组都能提高细胞活性，细胞活性接近，说明麦冬多糖溶液过高反而影响CIK细胞的增殖。实验证明选取100ug/mL浓度的麦冬多糖溶液较为合适。

实施例3

1)-3)，按照实施例1的的步骤进行PBMC分离及CIK细胞诱导培养。

4)在CIK细胞培养至第7天时加入滇重楼多糖和麦冬多糖混合液处理CIK细胞，作用72h：

(1)CIK细胞铺板：将培养7天的CIK细胞数调整至2×10⁵个/mL，于96孔细胞培养板中加入细胞悬液100uL/孔，每孔2×104个细胞。

(2)加入滇重楼多糖和麦冬多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为4组，每个组4个平行复孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度分别为50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL滇重楼多糖和100ug/mL麦冬多糖混合液各100uL/孔，置于细胞培养箱中培养72h。

5)CCK-8法检测细胞活性：培养72h后每孔加入10μLCCK-8溶液，继续培养4h后，用酶联免疫检测仪检测各孔细胞在450nm处吸光值(吸光值的大小与活细胞的数量呈正比)，记录结果并对数据进行统计学分析。

6)CIK细胞增殖活性结果分析

将实验组中4个不同浓度的滇重楼多糖和麦冬多糖混合液处理CIK细胞后，CIK细胞增殖效果如表1：

表1：CIK细胞增殖效果

组别	A450值	显著性(p)
			对照组	0.241±0.006
实验组1(滇重楼多糖50μg/mL，麦冬多糖100ug/mL)	0.295±0.01	P<0.01
			实验组2(滇重楼多糖100μg/mL，麦冬多糖100ug/mL)	0.292±0.013	P<0.01
实验组3(滇重楼多糖200μg/mL，麦冬多糖100ug/mL)	0.299±0.011	P<0.01
			实验组4(滇重楼多糖300μg/mL，麦冬多糖100ug/mL)	0.325±0.015	P<0.01

相比对照组(生理盐水)，实验1-4组均能显著提高细胞活性，表明活细胞数量较对照组显著增加，说明滇重楼多糖和麦冬多糖混合液能显著促进CIK细胞的增殖。

实施例4

按照实施例1的的步骤进行PBMC分离及CIK细胞诱导培养。

1)在CIK细胞培养至第9天时加入滇重楼多糖和麦冬多糖混合液处理CIK细胞，作用72h：

(1)CIK细胞铺板：取培养至9d的CIK细胞数调整至3×10⁶个/mL，于6孔细胞培养板中加入细胞悬液1mL/孔。

(2)加入滇重楼多糖和麦冬多糖：设置对照组与实验组，对照组加入生理盐水，实验组分为4组，每个组2个平行对照孔，在铺好CIK细胞的孔中分别加入CIK细胞培养基含终浓度分别为50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL滇重楼多糖及100ug/mL麦冬多糖混合液各1mL/孔，置于细胞培养箱中培养72h。

(3)接种肝癌细胞株SMMC-7721：在CIK细胞加入滇重楼多糖和麦冬多糖作用48h后(11d)，将培养至对数生长期的SMMC-7721细胞调整细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔板中接种细胞悬液100μL/孔，培养箱中培养24h。

(4)CIK杀伤SMMC-7721细胞：CIK细胞加入滇重楼多糖和麦冬多糖作用72h后(12d)进行CIK杀伤SMMC-7721细胞实验。弃去SMMC-7721旧的培养液，分别按效应细胞/靶细胞为20:1比例调整五组CIK细胞(悬浮细胞)至相应数目，按每孔100μL CIK细胞悬液加入SMMC-7721细胞孔中，每个比例4个复孔，同时每个比例设对应的单独靶细胞和单独效应细胞孔，于细胞培养箱中培养4h。

(5)CCK-8法检测杀伤活性：培养4h后每孔加入10μL CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4h。

2)细胞杀伤活力的检测：培养4h后，用酶联免疫检测仪检测各孔在450nm处吸光值，记录数据并按照以下公式计算杀伤率：

杀伤率(％)＝[1-(实验组的OD值-单独效应细胞组的OD值)/单独靶细胞组的OD值]×l00％

3)细胞杀伤活力结果分析

将对照组(生理盐水)实验组中4个不同浓度的滇重楼多糖及麦冬多糖混合液处理CIK细胞，然后杀伤SMMC-7721细胞，CIK细胞的杀伤率如表4：

表4：CIK：细胞的杀伤率

相比对照组(生理盐水)，实验1-4组均能显著提高杀伤率，说明50μg/mL-300μg/mL浓度的滇重楼多糖及麦冬多糖混合液能明显提高CIK细胞的杀瘤活性。

本发明提供的CIK细胞培养方法在CIK细胞培养过程中添加了滇重楼多糖和麦冬多糖，滇重楼多糖和麦冬多糖能够提高CIK细胞的增殖活性及杀瘤活性。实验结果表明：本发明提供的CIK细胞培养基，在CIK细胞培养至第7天时加入滇重楼多糖和麦冬多糖(浓度固定为100μg/mL)作用72h，在滇重楼多糖浓度为50μg/mL～300μg/mL实验组中，CIK活细胞数显著增加，统计学分析有意义(p<0.05)；在CIK细胞培养至第9天时加入滇重楼多糖和麦冬多糖浓度固定为100μg/mL)作用72h，在滇重楼多糖浓度为50μg/mL～300μg/mL实验组中，CIK细胞杀瘤效果也明显提高，约85.7％-90.6％。根据发明人在显微镜下观察，CIK细胞一般培养到7-9天细胞状态和细胞密度比较合适。

为了减少多糖对CIK细胞的影响，优选滇重楼多糖浓度为50μg/mL～100μg/mL，麦冬多糖在CIK细胞培养液中的浓度为100μg/mL。

Claims (10)

1.一种中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：向CIK细胞培养液中加入重楼与麦冬提取物。

2.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述的CIK细胞培养液包括无血清基础培养基、抗CD3单克隆抗体(CD3 mAB)，白介素-2(IL-2)、重楼与麦冬提取物。

3.根据权利要求2所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于：所述的抗CD3单克隆抗体(CD3 mAB)终浓度为500ng/mL，白介素-2(IL-2)终浓度为1000U/mL。

4.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，还包括血清。

5.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述血清在培养液中的体积百分含量约为10％。

6.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的重楼与麦冬提取物主要为滇重楼多糖和麦冬多糖。

7.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的滇重楼多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为50μg/mL～300μg/mL，优选50μg/mL～100μg/mL，麦冬多糖在CIK细胞培养液中的作用浓度为100μg/mL～300μg/mL，优选100μg/mL。

8.根据权利要求1所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法，其特征在于所述的滇重楼多糖与麦冬多糖提取物是在CIK细胞培养至第7-9天时加入，加入药物的作用时间为72h。

9.一种如权利要求1至8任一所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法制备得到CIK细胞。

10.一种如权利要求1至9任一所述的中药诱导增强型CIK细胞的制备方法制备得到的CIK细胞用于肝脏肿瘤疾病的细胞治疗。