CN105779390A - 一种免疫增强型capri细胞制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脐带血单个核细胞参与的免疫增强型CAPRI细胞制备方法，具体包括如下制备步骤：(1)获取与患者同血型的脐带血，分离并纯化脐带血单个核细胞；(2)获取患者外周血，分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(3)脐带血血浆制备血清；(4)患者PBMC和脐带血单个核细胞链式激活；(5)CAPRI细胞扩大增殖；(6)CAPRI细胞分次收获。本发明采用双蛋白包被培养瓶技术及分次收获方法，提高了CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。本发明所提供的CAPRI细胞培养技术解决了现有技术中由于患者自身状况较差或者寻找不到半合子供体等因素导致的CAPRI细胞培养无法采集到患者足够外周血的问题。

Description

一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带血单个核细胞参与的免疫增强型CAPRI细胞制备方法。
背景技术
CAPRI细胞又名链式CIK细胞，是单个核细胞在体外用多种细胞因子，如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CAPRI细胞具有安全有效、杀瘤谱广、副作用小等传统生物治疗的特点外，还具有典型的个体化免疫治疗模式的特点，其实施目的在于在手术、放化疗等传统治疗的基础上，控制病情（肿瘤停止发展、瘤体缩小、甚至消失）、延长生存时间、防止复发和转移、消除微小残余瘤灶和转移灶、提高生活质量（改善食欲、睡眠、恢复体重、免疫功能增强、生理机能提高）等。CAPRI细胞已经成为了新一代肿瘤治疗中的主要效应细胞，广泛应用于临床实践。CAPRI细胞治疗原则上在化疗开始前就应该规划，最好在手术后、化疗或放疗开始前采集患者外周血单个核细胞（PBMC），如条件允许也可在化疗间隙期采集PBMC，由于采集PBMC后骨髓的再造旺盛，不宜马上进行化疗或放疗以免骨髓损伤，在采集PBMC后至少间隔1周才能开始放化疗。收获CAPRI细胞时应尽量避免化疗给药当天，最好能在给药后16-24小时收获细胞。在无法避开化疗给药的情况下，可在化疗给药4小时后收获细胞。
鉴于CAPRI细胞在肿瘤免疫治疗上的显著疗效，从肿瘤患者外周血分离自体PBMC进行链式激活和扩大培养的方法已十分成熟，较为经典的方法是德国申请WO02/087612A中公开的级联引发刺激过程：起始的CD3激活阶段，将PBMC悬浮于培养基中，加入10%的HyClone胎牛血清，并且沉积到固定化的抗CD3单克隆抗体上；IL2辅助阶段，在2-4小时CD3激活之后，加入IL-2，辅助激活并防止凋亡；引发阶段，在2-3小时的IL-2辅助之后，将APC充分活化用于引发初始PBMC；扩充阶段，将经引发的PBMC技术，重新悬浮在具有IL-2的补充培养基中；72小时扩充后收获CAPRI细胞。然而，上述方法中获取PBMC时对患者身体状况具有严格的要求，在①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞的情况下，PBMC的采集无法实现；在本申请人之前的专利申请ZL201410232692.0中公布了一种半合子CAPRI细胞制备方法，其采用获取患者和半合子供体外周血，分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；从半合子供体血浆制备血清；PBMC激活；CAPRI细胞扩增；CAPRI细胞收获；CAPRI细胞冻存的制备方式，通过增加前期细胞处理步骤以及双抗体装载方法，获得了细胞产量高且具有广谱杀瘤作用的CAPRI细胞。该半合子CAPRI细胞制备方法有效解决现有技术中由于患者自身状况较差等因素导致的CAPRI细胞培养无法进行的问题。然而，在上述制备步骤中，如果寻找不到合适的半合子单个核细胞供体，培养CAPRI细胞足量的PBMC无法采集；再者此方法中制备获得的CAPRI细胞需要冻存，而冷冻复苏操作必然存在对CAPRI细胞活性损伤、并相应地增加了仪器设备的投入。
已有研究表明，脐带血单个核细胞来源的CAPRI细胞与自体单个核细胞来源的CAPRI细胞相比，具有更高的体外扩增能力和杀伤活性，而且脐带血细胞具有来源广泛、免疫性低，潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播概率较低的特点。国内学者王小燕等(脐带血CIK细胞表型变化与细胞毒活性相关性研究，肿瘤基础与临床)已经成功的从脐带血分离单个核细胞，经细胞因子抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ诱导，体外培养扩增获得了CIK细胞，其对U251细胞、SiHa细胞和A549细胞均具有较强的杀伤作用。但后续研究发现脐带血单个核细胞来源的CAPRI细胞的杀瘤作用比较持续，而外周血单个核细胞来源的CAPRI细胞则在初始具有较强的杀瘤作用，但后续作用减弱，因而，脐带血单个核细胞来源的CAPRI细胞具有首剂效应不强的弱点。
针对上述问题，本发明提出了一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法，其不仅可以效避免由于①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞所导致的PBMC无法采集的问题、也不存在寻找不到合适的半合子单个核细胞供体的困难，使CAPRI细胞的治疗应用更加灵活；并且采用脐带血单个核细胞和外周血单核细胞共培养方式，不仅可以提高制备所获得CAPRI细胞数目，而且显著增强了获得的CAPRI细胞的杀瘤效力。而且，本发明制备方法首次采用分次逐步收获的方式，在有效保持CAPRI细胞的杀瘤效力的前提下，避免了因细胞冻存而产生的细胞损伤以及冷冻复溶后细胞活性的降低。
发明内容
本发明提供一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法，其采用脐带血单个核细胞与外周血单个核细胞的共培养模式，有效地提高了CAPRI细胞产量，显著增强了CAPRI细胞的杀瘤效力，有效解决了现有技术中存在的问题。
此外，本申请制备方法首次采用分次逐步收获的方式，在有效保持CAPRI细胞的杀瘤效力的前提下，避免了因细胞冻存而产生的细胞损伤以及冷冻复溶后细胞活性的降低。
具体地，本发明所述的免疫增强型CAPRI细胞制备方法，具体步骤包括：(1)获取与受试者同血型的脐带血，分离并纯化脐带血单个核细胞(PBMC)；(2)获取受试者外周血，分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(3)脐带血血清制备；(4)受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养；(5)CAPRI细胞扩大增殖；(6)CAPRI细胞分次收获。
其中脐带血PBMC的分离纯化步骤为：在知情同意条件下选择产前检查无肝胆系统和血液系统疾病及各种传染病，非高危妊娠和各种肝炎抗体阴性的健康产妇，并要求足月产，无产科并发症。当胎儿娩出后立即断脐，消毒封闭式使用一次性使用塑料血袋采集脐带血，至胎盘剥离停止采血，采集脐带血约100ml左右，作血型鉴定及无菌检测。将脐带血分装至两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，收集上清血浆约60ml，并在每支离心管中分别加入20-35ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml密度为1.075±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层富含造血干细胞层，然后继续用生理盐水1800-2000rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得脐带血单个核细胞。
其中，从受试者外周血分离并纯化PBMC的步骤为：抽取受试者外周血50-100ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并将外周血分装至两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，弃上清，并在每支离心管中分别加入10-25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml密度为1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层单个核细胞层，然后继续用生理盐水1600-1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。
其中，从制备脐带血血清的步骤为：将从脐带血分离的血浆分装两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞和血小板，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。
其中，受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养步骤为：将终浓度为1μg/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为12.5ug/ml的RetroNectin(重组人纤粘连蛋白，TAKARA，货号T100B)包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗1次，再用无血清培养基冲洗1次，然后取受试者外周血PBMC，使其重悬于24ml无血清细胞培养液RPMI1640中，混匀分装到2个预先包被抗CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，2.5-3.5h后加入浓度为800-1200U/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)、800-1200U/ml重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)、150-300U/ml重组人白细胞介素-18(rhIL-18)，继续培养2.5-3.5小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养48小时。
特别地，所述共培养步骤终采用RetroNectin，即重组人纤粘连蛋白，以提高CAPRI细胞的扩增效率，具体操作方法为：将含有浓度为1μg/ml抗CD3单克隆抗体和浓度为12.5ug/mlRetroNectin的PBS缓冲液包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理，并在培养PBMC前用PBS缓冲液和无血清培养液依次分别冲洗1次。
其中，CAPRI细胞扩大增殖步骤为：收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，生理盐水洗涤一次，去上清，每支50ml离心管中加入25ml无血清培养液重悬细胞，细胞计数后，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入800-1200U/mlrhIL-2、800-1200U/mlrhIFN-γ、150-300U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为400-600U/mlrhIL-2、800-1200U/mlrhIFN-γ、150-300U/mlrhIL-18。
其中，CAPRI细胞分次收获步骤为：CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养。将收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，1600-1800rpm离心5-10min，生理盐水洗涤两次，弃去上清后加入15-25ml生理盐水，并加入2-3ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液。第六天收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；第七天收获培养悬液的1/2，余1/2继续扩大培养；第八天收获全部培养悬液。
附图说明
图1：分离脐带血干细胞操作图
图2：受试者来源PMBC培养6h后10×20倍镜下图
图3：受试者来源PMBC与脐带血单个核细胞共培养3h后10×20倍镜下图
图4：CAPRI细胞扩增后24h后10×20倍镜下图
图5：CAPRI细胞扩增后48h后10×20倍镜下图
图6：CAPRI细胞扩增后72h后10×20倍镜下图
图7：传统方法制备的CAPRI细胞免疫表型的流式细胞分析图
图8：本发明方法制备的CAPRI细胞免疫表型的流式细胞分析图
具体实施方式
实施例1、采用本发明制备方法获得的CAPRI细胞与传统方法制备的CAPRI细胞比较。传统培养CAPRI细胞步骤：抽取受试者肝素抗凝外周血100ml，加入两支50ml离心管中，以2000rpm离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；向已吸取上清血浆的50ml离心管中每支加30ml生理盐水，小心混匀；取12支15ml离心管，每支加入7ml医用级人淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入分离液液面上，每支离心管加8ml左右混合液；以2500转/分离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：生理盐水层，第二层：为环状乳白色单个核细胞层，第三层：为透明医用级分离液层，第四层：为粒细胞和红细胞层。用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，2000转/分离心5分钟，弃去上清留沉淀重新悬起。重复洗涤2次既得所需外周血单个核细胞。将分离的一半单个核细胞用培养液（加10%自体血清）调整细胞浓度2×106/ml左右，加入到抗CD3单抗包被的培养瓶中。在37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养3小时后，调整IL-2浓度为200单位/ml，继续培养3小时后加入另一半淋巴细胞，混匀后继续培养16小时，然后吸取收集培养的细胞，离心清洗两次后，悬浮培养在培养液中，调整IL-2浓度为200单位/ml，继续培养72小时后收获CAPRI细胞，手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值，CAPRI细胞数量3.53±0.27×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达，如图7所示。
采用本发明技术培养CAPRI细胞步骤：在知情同意条件下选择产前检查无肝胆系统和血液系统疾病及各种传染病，非高危妊娠和各种肝炎抗体阴性的健康产妇，并要求足月产，无产科并发症。采集脐带血约50ml左右，作血型鉴定及无菌检测。将脐带血分装至50ml离心管中，2000rpm离心20min，收集上清血浆约30ml并制备血清，并在每支离心管中分别加入30ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有7ml密度为1.075±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的6支15ml离心管中，2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层富含单个核细胞层，然后继续用生理盐水2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清，即获得脐带血单个核细胞。抽取同一志愿肿瘤患者肝素抗凝外周血50ml，加入一支50ml离心管中，以2000rpm/min离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；每支加入30ml生理盐水，小心混匀得混合液；取6支15ml离心管，每支加入7ml密度为1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入离心管液面上，以2500rpm离心20分钟；用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，以2000rpm离心5分钟，弃去上清留沉淀用生理盐水重新悬起，重复洗涤2次既得所需患者外周血单个核细胞（PBMC）；将分离的患者PBMC用无血清培养液调整细胞浓度2×106左右，加入到CD3抗体(终浓度1ug/ml)和Retronectin-T100B(终浓度为12.5ug/ml)包被的细胞培养瓶中；在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养3小时后，加入浓度为1000U/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)、1000U/ml重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)、200U/ml重组人白细胞介素-18(rhIL-18)，继续培养3小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养16小时。收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，2000rpm离心5min洗涤一次，去上清，每支50ml离心管用25ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入1000U/mlrhIL-2、1000U/mlrhIFN-γ、200U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于175cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为500U/mlrhIL-2、500U/mlrhIFN-γ、100U/mlrhIL-18。CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获为培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养。收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，2000rpm离心5min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清后加入15ml生理盐水，加2ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液。第六天收获为培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；第七天收获为培养悬液的1/2，余1/2继续扩大培养；第八天收获全部培养悬液。四次收获前手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值。采用脐带血单个核细胞参与的CAPRI细胞培养总数为15.16±0.34×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达，如图8所示。
采用本方法制备CAPRI细胞数量为15.16±0.34×108个，传统方法制备CAPRI细胞数量为3.53±0.27×108个，采用本方法制备CAPRI细胞数量是传统方法的4.29倍，具有统计学差异（P＜0.01）。同时，采用流式细胞分析方法分别对本方法制备的CAPRI细胞和传统方法制备的CAPRI细胞的免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达进行比较，从表1可得，本方法制备CAPRI细胞免疫表型略高于传统方法制备的CAPRI细胞，但不存在统计学差异（P＞0.05）。
实施例2、传统方法培养CAPRI细胞、脐带血PBMC来源CAPRI细胞与本发明脐带血和外周血PBMC共培养获得CAPRI细胞体外杀瘤能力比较。
将分别收获的三种CAPRI细胞作为效应细胞，分为如下三组，A：传统方法培养CAPRI细胞、B：脐带血PBMC来源CAPRI细胞、C：脐带血和外周血PBMC共培养获得CAPRI细胞，取对数生长期的人胃癌细胞株MGC-803、人肺腺癌细胞株A549、人红白血病细胞株K562，用0.4%台盼兰染色并计数作为靶细胞，在96孔板中分别加入1×105/100ulMGC-803细胞悬液、A549细胞悬液、K562细胞悬液，将培养板置于37℃、5％浓度CO2培养箱中培养24小时。调整效应细胞至所需浓度，并按效靶比为5：1、20：1向培养板按设计，每孔分别加入100ulA、B、C三组效应细胞，每种浓度设立3个复孔，并设好对照组，于37℃、5％CO2条件下培养46h后，每孔加入20ulCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，因为气泡会影响OD值的读数），将培养板置于培养箱内培养2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光值，并按照：杀伤活性(％)=100-（实验组-效应对照组）/（靶对照组-空白组）×100，计算各组效应细胞的杀伤活性。分组设计如表2所示，其中肿瘤细胞为MGC-803、A549和K562。
用CCK8试剂测定，效应细胞A、B、C三组体外杀伤癌细胞活性，结果见表3所示。
从表3的结果可知A：传统方法培养CAPRI细胞、B：脐带血PBMC来源CAPRI细胞、C：脐带血和外周血PBMC共培养获得CAPRI细胞，三组效应细胞对人胃癌细胞株MGC-803、人肺腺癌细胞株A549、人红白血病细胞株K562具有显著的杀伤活性，但本发明制备方法获得的C：脐带血和外周血PBMC共培养获得CAPRI细胞的杀伤活性明显高于A组和B组(P<0.05)，在5:1～20:1的效靶比范围内，其杀伤作用与效靶比呈正相关，而且本发明获得的免疫加强型细胞具有广谱杀瘤作用。
实施例3、志愿患者，56岁，男性，胃小弯侧溃疡型低分化腺癌，病例分期：Pt4aN0M0Ⅲb期，因多次OXA+S-1化疗导致白细胞数目减少，体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程，又寻找不到合适半合子供体，采用本发明脐带血单个核细胞参与的CAPRI细胞培养技术。以下通过实施例对本发明进行具体说明。
在知情同意条件下,选择产前检查无肝胆系统和血液系统疾病及各种传染病，非高危妊娠和各种肝炎抗体阴性的健康产妇，足月产,无产科并发症的产妇脐带血。采集脐带血约100ml左右，作血型鉴定及无菌检测，血型必须与患者相同。将脐带血分装至两支50ml离心管中，2000rpm离心20min，收集上清血浆约60ml并制备血清，并在每支离心管中分别加入30ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有7ml密度为1.075±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的12支15ml离心管中，2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层富含造血干细胞层，然后继续用生理盐水2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清，即获得脐带血单个核细胞。抽取志愿肿瘤患者肝素抗凝外周血50ml，加入一支50ml离心管中，以2000rpm/min离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；加入30ml生理盐水，小心混匀得混合液；取6支15ml离心管，每支加入7ml密度为1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入离心管液面上，以2500rpm离心20分钟；用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，2000rpm离心5分钟，弃去上清留沉淀用生理盐水重新悬起，重复洗涤2次既得所需患者外周血单个核细胞（PBMC）；将分离的患者PBMC用无血清培养液调整细胞浓度2×106左右，加入到CD3抗体(终浓度1ug/ml)和RetroNectin(终浓度为12.5ug/ml)包被的细胞培养瓶中；在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养3小时后，加入浓度为1000U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、1000U/ml重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）、200U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养16小时。收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，2000rpm离心5min洗涤一次，去上清，每支50ml离心管用25ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入1000U/mlrhIL-2、1000U/mlrhIFN-γ、200U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于175cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为500U/mlrhIL-2、500U/mlrhIFN-γ、100U/mlrhIL-18。CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获为培养悬液的1/3，余2/3继续倍增换液培养。收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，2000rpm离心5min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清后加入15ml生理盐水，加2ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液。第六天收获为培养悬液的1/3，余2/3继续倍增换液培养；第七天收获为培养悬液的1/2，余1/2继续倍增换液培养；第八天收获全部培养悬液。
本发明提供的免疫增强型CAPRI细胞制备方法，既解决了其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞所导致的PBMC无法采集的问题、也不存在寻找不到合适的半合子单个核细胞供体的困难，使CAPRI细胞的治疗应用更加灵活；并且采用脐带血单个核细胞和外周血单核细胞共培养方式，不仅可以提高制备所获得CAPRI细胞数目，而且显著增强了获得的CAPRI细胞的杀瘤效力。而且，本发明制备方法首次采用分次逐步收获的方式，在有效保持CAPRI细胞的杀瘤效力的前提下，避免了因细胞冻存而产生的细胞损伤以及冷冻复溶后细胞活性的降低。本发明充分发挥了脐带血单个核细胞细胞自我繁殖能力、活性强等优势，使受试者来源的单个核细胞细胞与脐带血来源的单个核细胞细胞充分合作，弥补了现有技术中的空白。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

Claims (8)

1.一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法，具体步骤包括：(1)获取与受试者同血型的脐带血，分离并纯化脐带血单个核细胞(PBMC)；(2)获取受试者外周血，分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(3)脐带血血清制备；(4)受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养；(5)CAPRI细胞扩大增殖；(6)CAPRI细胞分次收获。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脐带血PBMC的分离纯化步骤为：采集脐带血约100ml左右，分装至两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，收集上清血浆约60ml，并在每支离心管中分别加入20-35ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml密度为1.075±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层富含造血干细胞层，然后继续用生理盐水1800-2000rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得脐带血单个核细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述从受试者外周血分离并纯化PBMC的步骤为：抽取受试者外周血50-100ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并将外周血分装至两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，弃上清，并在每支离心管中分别加入10-25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml密度为1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层单个核细胞层，然后继续用生理盐水1600-1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述脐带血血清制备步骤为：将从脐带血分离的血浆分装两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞和血小板，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养步骤为：将抗CD3单克隆抗体和RetroNectin包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗1次，再用无血清培养基冲洗1次，然后取受试者外周血PBMC，使其重悬于24ml无血清细胞培养液RPMI1640中，混匀分装到2个预先包被抗CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，2.5-3.5h后加入浓度为800-1200U/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)、800-1200U/ml重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)、150-300U/ml重组人白细胞介素-18(rhIL-18)，继续培养2.5-3.5小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养48小时。
6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于：所述用于包被细胞培养瓶的PBS缓冲液中抗CD3单克隆抗体的浓度为1μg/ml，RetroNectin的浓度为12.5ug/ml。
7.如权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞扩大增殖步骤为：收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，生理盐水洗涤一次，去上清，每支50ml离心管中加入25ml无血清培养液重悬细胞，细胞计数后，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入800-1200U/mlrhIL-2、800-1200U/mlrhIFN-γ、150-300U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为400-600U/mlrhIL-2、800-1200U/mlrhIFN-γ、150-300U/mlrhIL-18。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞分次收获步骤为：CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；将收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，1600-1800rpm离心5-10min，生理盐水洗涤两次，弃去上清后加入15-25ml生理盐水，并加入2-3ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液；第六天收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；第七天收获培养悬液的1/2，余1/2继续扩大培养；第八天收获全部培养悬液。
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