CN104558354A - 一种富血小板血浆分离胶及富血小板血浆制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富血小板血浆分离胶及利用该分离胶制备的分离富血小板血浆的真空采血管和分离方法。具体的包括一种富血小板血浆分离胶的树脂，由以下重量比的原料制成：乙酸丁酯120、苯乙烯75-80、丙烯酸丁酯20-25、丙烯酸5-12、偶氮二异丁腈(AIBN)2-2.5、十二烷基硫醇0.5-0.8；且其比重在25℃时为1.068～1.080，且可以根据原料配比精确调节比重。本发明的内容还包括利用所述分离胶树脂制备的分离胶，及制作出的真空采血管。利用所述采血管制备富血小板血浆，流程简便易行、所需时间短，无需多次转管、避免交叉污染，操作简便，制备成本大大降低，大幅提高其实用性和可行性，具有广阔的市场前景。

Description

一种富血小板血浆分离胶及富血小板血浆制备方法

技术领域

本发明属于血液取样、分离领域，具体涉及一种富血小板血浆分离胶及利用该分离胶分离制备富血小板血浆的方法。

背景技术

富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩血浆。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等，这些生长因子主要由血小板活化后分泌，可以从不同方面对组织中细胞和基质的再生起到促进作用，从而促进组织的修复。

现有的PRP制备的方法中，按离心次数，可分为一次、二次及三次离心法，大量研究证明，二次离心法提取的PRP质量最高，其在临床上的应用也最广。制备步骤大致如下：

(1)将若干外周血抽入含抗凝剂的无菌试管中。

(2)进行第1次离心，离心后血液如图1所示分为三层：上层为贫血小板血浆，主要成分是纤维蛋白原等；中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞。

(3)用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞，将其移入另一无菌试管中。

(4)2次离心后血浆分为三层：下层为少许红细胞，上层为贫血小板血浆，两层之间便为富血小板血浆层。

(5)用吸管遗弃大部分的上清液，留取适量的血浆以悬浮浓缩的血小板并混匀，即为富血小板血浆(PRP)。

(6)加入微量凝血酶及氯化钙，激活其中的血小板即获得富血小板血浆凝胶(APG)。

目前PRP的制备方法简单，且设备要求较低。然而，二次离心法之所以未被临床广泛使用主要在于其具有以下缺点：

(1)离心分层后无法形成有效的隔离，由于血小板的比重接近血细胞，故大部分的血小板将停在血浆与血细胞的交界处，吸取过程中容易吸入血细胞，且容易重新混匀导致无法收集PRP；

(2)开放式的制备体系容易受到外界污染；

(3)多个容器间的转移，增加了血小板被污染和激活的机率；

(4)操作人员的个人习惯及拿捏尺度极大地影响了PRP中血小板的浓度，使制备的PRP血小板回收率较低。

故制备得到的富血小板血浆富集系数低，血小板回收不全，回收率偏低，操作繁琐，容易出现人为的误差甚至失误导致获得较少量的PRP甚至是失效的PRP。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述技术问题，提供一种血液分离胶及利用该分离胶分离制备富血小板血浆的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种富血小板血浆分离胶，是通过向基础高分子化合物中加入比重调节剂和触变剂制成，所述基础高分子化合物是由以下重量比的原料制成的：

进一步地，加入所述比重调节剂与基础高分子化合物的重量比和有机触变剂与基础高分子化合物的重量比分别为4-5：100和9-12:1000。

进一步地，所述比重调节剂为粒径为7-20nm的二氧化硅。

进一步地，所述有机触变剂含有N-OH结构。

进一步地，所述有机触变剂为BYK-420触变剂。

本发明的内容还包括所述的富血小板血浆分离胶的制备方法，包括以下步骤：

1)将以下重量份的原料混合：乙酸丁酯120，苯乙烯75-80，丙烯酸丁酯20-25，丙烯酸5-12，偶氮二异丁腈2-2.5，十二烷基硫醇0.5-0.8，置密封的反应釜内，混匀，加热到80-120℃，反应6-8小时，合成基础化合物；

2)使系统真空度低于-0.098Mpa，温度升至190-200℃，保持6-8小时；

3)250目精细过滤并称重；

4)按基础化合物质量4-5％加入二氧化硅，连续搅拌分散1小时；

5)当温度≤25℃时，缓慢搅拌同时加入基础化合物质量0.9-1.2％的有机触变剂；

6)利用行星动力混合机，搅拌混合3-4h；

7)在真空状态下脱去气泡；

8)带负压静置12h后，解压，分装。

本发明的内容还包括一种用于制备富血小板血浆的真空采血管，含有所述富血小板血浆分离胶。

本发明的内容还包括所述的富血小板血浆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照上述的方法制备富血小板血浆分离胶；

2)利用所述分离胶，制备真空采血管；

3)利用所述真空采血管准确采集血液；

4)离心后吸去上层贫血小板血浆；

5)利用注射器，沿管周轻轻吹打与分离胶接触界面，使膜层脱离且混匀在血浆里；

6)更换一次性无菌注射器，吸取激活剂后，缓慢吸取管内PRP，混匀，即得富血小板血浆。

本发明通过添加具有可调节精准密度和良好的触变性能的富血小板血浆分离胶，提高PRP血小板、生长因子等的回收率和富集系数，较其他PRP制备体系有较大程度增幅。同步测试同一志愿者富集前后的血液标本，测试数据显示：未经富集的全血血小板浓度为：182×10⁹/L，经本发明技术4倍富集的富血小板血浆浓度为：685×10⁹/L，回收率达94.1％以上，而其他体系一般为60-70％，具有优越的性能，为自体富血小板凝胶在组织损伤修复再生领域的应用提供了良好的基础。

本发明的富血小板血浆分离胶，可以同时通过调节基础高分子化合物的原料比例，和二氧化硅及有机触变剂的比例精确控制分离胶的比重，以用于不同成分的的PRP分离。通过高温高真空蒸馏的方法对合成产物进行纯化，去除残留单体、溶剂、引发剂分解产物等小分子，可以获得较为纯净的高分子聚合物。选取纳米级气相二氧化硅做为比重调节剂，对其表面进行硅烷偶联剂的键合处理，提高其与有机高分子的相容性和易分散性，可以形成不分离的均相体系。

不同于通常的触变体系是通过二氧化硅的Si-OH与高分子-OH形成氢键，进一步形成立体网状结构从而具有触变性。本品采用BYK-420作为触变剂。加入BYK-420后，所用体系可形成三维网状结构，产生触变流动性，该触变剂加入后应当充分混合。含有N-OH结构的有机触变剂，由于N原子对O原子上电子的吸引远大于Si原子，氢键的强度更高，触变性则更强。

本发明的真空采血管，以无菌密闭的真空采血模式替代传统的开放式的制备模式，以无菌注射器收集PRP备用，以防止外界污染，减少PRP应用风险。

本发明的PRP制备方法，多次离心转变成单次离心，通过对材料和提取工具的量化，标准化操作手法，减少血小板被污染和激活的机率，且减少因操作人员的个人习惯及拿捏尺度对PRP回收率的影响。

本发明特制的富血小板血浆分离胶具有良好的惰性和完整的阻隔性能，能保持血小板原始性状和不被激活，无痕量破坏红细胞(RBC)，以及相适应的无杂质抑制成分，规范的无菌、无热原技术和离心力、离心时间、温度等PRP制备参数，保证临床应用的安全性和有效性。

应用本发明制备富血小板血浆，制备流程简便易行、一次性制备血小板回收率达94.1％以上PRP，制备所需时间短(10min左右)，无需多次转管、避免交叉污染，操作简便，制备成本大大降低，大幅提高其实用性和可行性，以及保证PRP或APG的质量和稳定性、操作的可重复性提供了制备技术基础。

综上所述，本发明一种用于组织工程、组织修复再生富血小板血浆的制备方法，可提升血小板的回收率；保持血小板原始性状和不被激活、保证临床应用的安全性和有效性；保证PRP或APG的质量和稳定性、操作的可重复性，定向和定量调制PRP，满足临床各种不同的需要；填补国内空白，替换进口产品，大幅降低PRP治疗费用，促进PRP疗法在临床是的普及应用。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是血液离心后成分结构示意图。

图2是本发明的富血小板血浆分离胶的制备流程图。

图3是本发明的富血小板血浆真空采血管的制备流程图。

图4是本发明的提取富血小板血浆的流程图。

图5是加入富血小板血浆分离胶后离心分层效果图。

具体实施方式

【实施例1】

如图2，本实施例的富血小板血浆分离胶的制作方法为：

Step1、合成基础聚合物：

按上述配方将原料混合，置密封的反应釜内，混匀，加热到80-120℃，反应6-8小时，合成基础化合物。

Step2、高温高真空蒸馏纯化：使用水喷射-罗茨二级串联真空泵，使系统真空度低于-0.098Mpa，温度升至190-200度，保持6-8小时，获得较为纯净的高分子聚合物，即树脂。

Step3、精滤：250目精细过滤至混合缸，去除杂质，准确称量树脂重量。

Step4、比重剂精确调节比重：经上一步骤，获得基础高分子化合物重量为600kg。选取粒径为7-20nm的纳米级气相二氧化硅24kg做为比重调节剂，缓慢搅拌同时，加入到上述高分子聚合物中。

Step5、添加有机触变剂：缓慢搅拌过程中加入BYK-420有机触变剂5.4kg。

Step6、行星动力混合：利用行星动力混合机，设定公转30r/min，分散子转400r/min，温度控制在40±5℃，真空度设定成-0.09±0.01mpa，持续搅拌混合3-4h。

Step7、真空脱泡：真空度设定成-0.1mpa，抽真空1h，去除多余气泡。

Step8、带负压静置12h后，解压，分装。

按照以上配方制得血浆分离胶，测得比重为1.068，可分离富集血小板，获得高纯富血小板血浆(P-PRP)，且状态完整不被激活，可获得大量血小板衍生生长因子(PDGF)等血小板源性生长因子，用于组织修复再生、烧伤整型、美容抗衰和糖尿病难治性足溃疡等领域。

【实施例2】

本实施例的富血小板血浆分离胶，其基础高分子化合物的产品配方为：

加入的二氧化硅与基础高分子的重量比和BYK-420有机触变剂与基础高分子的重量比分别为4.6:100和1.1:100，其制作方法与实施例1相同，按照以上配方制得的血浆分离胶，测得比重为1.075，可分离富集白细胞与血小板，获得富白细胞血小板血浆(L-PRP)，在组织修复的同时增加抗炎性治疗效果。

【实施例3】

本实施例的富血小板血浆分离胶，其基础高分子化合物的产品配方为：

加入的二氧化硅与基础高分子的重量比和BYK-420有机触变剂与基础高分子的重量比分别为5:100和1.2:100，其制作方法与实施例1相同，按照以上配方制得的血浆分离胶，测得比重为1.080，可分离富集淋巴细胞、单核细胞和血小板，获得富单个核细胞血小板血浆(M-PRP)，用于淋巴细胞免疫功能检测，人类白细胞抗原(HLA)或残留白血病基因检测，及用于单纯动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病下肢缺血等疾病与治疗。

【实施例4】富血小板血浆真空采血管的制备

如图3，本发明的富血小板血浆真空采血管的制备方法为：

Step1、按上述实施例1、2、3的方法制备富血小板血浆分离胶备用。

Step2、利用大管加胶机，向16*100塑料空白管内加胶，每管2.2±0.2g。

Step3、1400±200×g离心力(r＝14mm,3000r/min)，离心10mins，去气泡。

Step4、加注3.2％柠檬酸钠抗凝液，设每管加抗凝液800±50μl。

Step5、压上配套的B16M蓝帽及K16塞。

Step6、抽取真空度，高每管液面高度9.5±0.5ml。

Step7、钴60辐照灭菌。

【实施例5】富血小板血浆提取

如图4，本发明的提取富血小板血浆的具体步骤为：

Step1、按【实施例4】的方法制备富血小板血浆真空采血管备用。

Step2、准确采血8ml。

Step3、2500±200×g离心力(r＝14mm,4000r/min)，离心10mins分层，如图5所示，管内由上至下依次为贫血小板血浆、富血小板血浆、分离胶、血细胞，在富血小板血浆层与分离胶层接触界面形成一层白膜层，为丰富的血小板团聚而成。

Step4、用一次性无菌注射器，抽取上层2ml血浆，即为PPP，弃去。

Step5、更换一次性无菌注射器，沿管周轻轻吹打与分离胶接触界面2-3次，90°角旋转后再吹打2-3次，完成四个角度的吹打，白膜层脱离且混匀在血浆里，吸取分离胶上方的血浆成分，即为PRP。

或Step6、更换一次性无菌注射器，吸取0.2ml1000U/ml凝血酶葡萄糖酸钙激活剂后，缓慢吸取管内PRP，混匀。

Step7、静置10min后，形成APG，即可应用。

利用本实施例的方法，制备富血小板血浆，并同步测试同一志愿者富集前后的血液标本，测试结果显示：未经富集的全血血小板浓度为：182×10⁹/L，经本发明技术4倍富集的富血小板血浆浓度为：685×10⁹/L，回收率达94.1％以上，具有良好的效果。

以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。

Claims (8)

1.一种富血小板血浆分离胶，是通过向基础高分子化合物中加入比重调节剂和触变剂制成，所述基础高分子化合物是由以下重量比的原料制成的：

2.根据权利要求1所述的富血小板血浆分离胶，其特征在于：加入所述比重调节剂与基础高分子化合物的重量比和有机触变剂与基础高分子化合物的重量比分别为4-5：100和9-12:1000。

3.根据权利要求1或2所述的富血小板血浆分离胶，其特征在于：所述比重调节剂为粒径为7-20nm的二氧化硅。

4.根据权利要求1或2所述的富血小板血浆分离胶，其特征在于：所述有机触变剂含有N-OH结构。

5.根据权利要求1或2所述的富血小板血浆分离胶，其特征在于：所述有机触变剂为BYK-420触变剂。

6.权利要求1～4任意一项所述的富血小板血浆分离胶的制备方法，包括以下步骤：

1)将以下重量份的原料混合：乙酸丁酯120，苯乙烯75-80，丙烯酸丁酯20-25，丙烯酸5-12，偶氮二异丁腈2-2.5，十二烷基硫醇0.5-0.8，置密封的反应釜内，混匀，加热到80-120℃，反应6-8小时，合成基础化合物；

2)使系统真空度低于-0.098Mpa，温度升至190-200℃，保持6-8小时；

3)250目精细过滤并称重；

4)按基础化合物质量4-5％加入二氧化硅，连续搅拌分散1小时；

5)当温度≤25℃时，缓慢搅拌同时加入基础化合物质量0.9-1.2％的有机触变剂；

6)利用行星动力混合机，搅拌混合3-4h；

7)在真空状态下脱去气泡；

8)带负压静置12h后，解压，分装。

7.一种用于制备富血小板血浆的真空采血管，含有权利要求1～5任意一项所述富血小板血浆分离胶。

8.一种富血小板血浆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照权利要求6所述的方法制备富血小板血浆分离胶；

2)利用所述分离胶，制备真空采血管；

3)利用所述真空采血管准确采集血液；

4)离心后吸去上层贫血小板血浆；

5)利用注射器，沿管周轻轻吹打与分离胶接触界面，使膜层脱离且混匀在血浆里；

6)更换一次性无菌注射器，吸取激活剂后，缓慢吸取管内PRP，混匀，即得富血小板血浆。