CN105586251B - 一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法，其中，所述的淋巴细胞分离管，包括管体、置于所述管体内的分离胶体和分离液，所述分离液在所述管体底部，所述分离胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方；在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0655‑1.0755g/cm3，所述分离液的密度为1.0765‑1.0785g/cm3，且所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值在0.008‑0.012g/cm3之间；所述分离胶体在1400g‑1800g离心力下能触变成液态凝胶；所述分离胶体的顶面为一斜面，所述斜面与水平面的夹角为20‑70°。用本发明的淋巴细胞分离管来分离淋巴细胞，其细胞得率高，精确度也高。

Description

一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域的细胞分离技术，特别是涉及一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法。
背景技术
在临床医学检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常涉及到细胞的分离技术，从外周血液和各种体液(胸水、腹水、心包积液等)中分离单个核细胞是体外进行淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续实验可靠性的重要环节。
外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是参与机体免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMCs主要包含淋巴细胞和单核细胞，PBMCs中大部分(80％～90％)为淋巴细胞，对不同淋巴细胞的分离、鉴别以及功能的研究对疾病的诊断乃至治疗都有十分重要的临床意义。
目前，普遍采用的是淋巴细胞分离液通过密度梯度法实现细胞分离，在用分离液分离外周血淋巴细胞时，操作者需要非常“小心翼翼”的用微量移液器把血液平铺到分离液上方，技术难度大，操作非常费时费力。不仅需要专业的指导操作，而且复杂的操作会导致分离后获得的细胞数差异很大，结果一致性差。
发明内容
本发明提出一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法，其淋巴细胞得率高且精确度高。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
一种淋巴细胞分离管，包括管体，还包括置于所述管体内的分离胶体和分离液，所述分离液在所述管体底部，所述分离胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方；在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3，所述分离液的密度为1.0765-1.0785g/cm3，且所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值在0.008-0.012g/cm3之间；所述分离胶体在1400g-1800g离心力下能触变成液态凝胶；所述分离胶体的顶面为一斜面，所述斜面与水平面的夹角为20-70°。
优选地：
所述斜面与水平面的夹角为30-60°。
所述分离胶体包括以下重量份数的各组分：双环戊二烯树脂：90-100份；二亚苄基山梨醇(Dibenzylidene sorbitol，DBS)：0.05-1.8份；聚丙烯酸钠:0.03-10份；细颗粒二氧化硅：2-3.5份；聚乙二醇：0.5-0.8份；邻苯二甲酸二酯：5-40份；有机膨润土：3-7份。
所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值为0.01g/cm3。
在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0672g/cm3，所述分离液的密度为1.0772g/cm3。
所述分离液的加入体积为所述淋巴细胞分离管体积的6.7％-10％；所述分离胶的加入质量与所述淋巴细胞的体积的比值为0.1g/mL-0.2g/mL。
一种所述的淋巴细胞分离管的制备方法，包括如下步骤：
(1)在一个分离管中依次加入预定密度的分离液和分离胶体；
(2)将步骤(1)中的分离管放入采用定角转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为3-5min；
(3)离心结束取出分离管后，得到所述的淋巴细胞分离管。
一种用所述的淋巴细胞分离管进行淋巴细胞分离的方法，包括如下步骤：
(1)在所述的淋巴细胞中加入一定量的抗凝全血；
(2)将步骤(1)中的淋巴细胞分离管放入采用水平转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为10-20min；
(3)吸取步骤(2)的淋巴细胞分离管中的呈白膜条带的液体，洗涤后分离得到淋巴细胞。
本发明的有益效果包括：用本发明的淋巴细胞分离管来分离淋巴细胞，其细胞得率高，精确度也高。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中的淋巴细胞分离管的示意图；
图2是采用本发明具体实施方式中的淋巴细胞分离管分离PBMCs细胞的过程示意图；
图3是本发明具体实施方式中细胞得率与夹角的关系曲线图。
具体实施方式
下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
一种淋巴细胞分离管，在具体实施方式中，如图1所示，该淋巴细胞分离管包括管体1，还包括置于所述管体内的分离胶体2和分离液4，分离液4在所述管体1底部，所述分离胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方；在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3，所述分离液的密度为1.0765-1.0785g/cm3，且所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值在0.008-0.012g/cm3之间；所述分离胶体在1400g-1800g离心力下能触变成液态凝胶；所述分离胶体的顶面为一斜面，所述斜面与水平面的夹角a为20-70°，在图1的实施例中，夹角a为45°。
在一些优选的实施例中：
所述斜面与水平面的夹角为30-60°。
所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值为0.01g/cm3。
在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0672g/cm3，所述分离液的密度为1.0772g/cm3。
所述分离液的加入体积为所述淋巴细胞分离管体积的6.7％-10％(较优的是为8％)；所述分离胶体的加入质量与所述淋巴细胞的体积的比值为0.1g/mL-0.2g/mL(较优的是0.13g/mL)。
在上述的具体实施方式中，在分离液的上方加入一个可以固液转变的凝胶层(即分离胶体)，加血操作时可以“倾倒”在分离胶体上，操作非常简单，可以快速掌握使用。加入全血进行细胞分离时，在1400g-1800g离心力下，分离胶体可以触变成液态的凝胶，且密度大的分离液会反转上移到液态凝胶的上方，与淋巴细胞混合在一层。
淋巴细胞的分离液采用公知的分离外周血淋巴细胞的分离液，其将聚蔗糖和泛影酸钠按照一定比例混合，通过常规手段调整密度、渗透压、pH值等，经过除菌过滤后制成密度在1.0765-1.0785g/cm3内的一个定值。为了形成合适的密度梯度，发明人优化了分离胶体和分离液的密度关系，误差精确到万分之2g/cm3，通过大量实证实验表明：在25℃时分离胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3(优选1.0672g/cm3)，呈固体状，在一定的离心力下可以流化触变成液态的凝胶，分离液密度为1.0765-1.0785g/cm3(优选1.0772g/cm3)，且分离液密度大于分离胶体，相对差值在0.008-0.012g/cm3之间(优选0.01g/cm3)。实验发现，若分离液或分离胶体的密度过高，则分离出的淋巴细胞纯度偏低；若分离液或分离胶的密度过低，则分离出的淋巴细胞得率偏低。若分离胶体与分离液密度差值低于0.008g/cm3会导致二者分层效果差，大于0.0012g/cm3，分层效果好，但分离液又不能在离心后反转到分离胶体的上方，这两种情况下细胞得率都降低。实验证明在分离胶体与分离液密度相对差值在0.008-0.012g/cm3之间(优选0.01g/cm3)时，不仅分层效果好，而且细胞得率高。
为此，优选的分离胶体包括以下重量份数的各组分：双环戊二烯树脂：90-100份；二亚苄基山梨醇(DBS)：0.05-1.8份；聚丙烯酸钠:0.03-10份；细颗粒二氧化硅：2-3.5份；聚乙二醇：0.5-0.8份；邻苯二甲酸二酯：5-40份；有机膨润土：3-7份；其中细颗粒二氧化硅的平均粒度为0.05-1μm，邻苯二甲酸二酯优选邻苯二甲酸二戊酯。分离胶体在离心力作用下流化，本发明设定固体的分离胶体的顶面为一斜面，该斜面与水平面保证一定的夹角，夹角在20度-70度。实验发现，若夹角小于20度，在1400g-1800g的离心力下流化效果差，需要更大的离心力才能触变固体的细胞分离胶体变成液态凝胶。而若增大夹角则需要更多的分离胶体来制备分离管，成本上不经济且形态也不合适，分离效果没有改善反而下降，优选夹角在30-60度。因此，制备淋巴细胞分离管的离心机采用特定的定角转头离心机，而在分离淋巴细胞的时候，再转为使用水平转头的离心机，因分离胶体呈斜面，其受到的离心力不一样，容易触发流化。
在另一具体实施方式中，提供一种所述的淋巴细胞分离管的制备方法，包括如下步骤：
(1)在一个分离管中依次加入预定密度的分离液和分离胶体；
(2)将步骤(1)中的分离管放入采用定角转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为3-5min；
(3)离心结束取出分离管后，得到所述的淋巴细胞分离管。
其中，步骤(2)中，定角转头的角度大小与淋巴细胞分离管中分离胶体的顶面与水平面的夹角的大小匹配。
在又一具体实施方式中，还提供一种用所述的淋巴细胞分离管进行淋巴细胞分离的方法，包括如下步骤：
(1)在所述的淋巴细胞中加入一定量的抗凝全血；
(2)将步骤(1)中的淋巴细胞分离管放入采用水平转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为10-20min；
(3)吸取步骤(2)的淋巴细胞分离管中的呈白膜条带的液体，洗涤后分离得到淋巴细胞。
其中，步骤(2)中的离心力和离心时间下，分离胶体与分离液的密度梯度会反转，也即在分离血样本前，密度相对较大的分离液位于密度相对较小的分离胶体下方，在经过步骤(2)的离心后，高密度的红细胞在离心力的作用下穿过分离胶体和分离液，流化的低密度分离胶体在红细胞和离心力作用下，会移动到高密度分离液下方，分离液分开了淋巴细胞与红细胞，分离液移动到分离胶体的上方，与淋巴细胞层混合在一起呈白膜条带状。
在一个优选的实施例中，如图2所示，其中，1表示管体，2表示分离胶体，3表示抗凝全血样品，4表示淋巴细胞的分离液，5表示红细胞，6表示白膜条带(淋巴细胞和分离液的混合物)，7表示血浆。用上述实施例的淋巴细胞分离管分离淋巴细胞时的具体过程如下：
1.取一个15mL的分离管。
2.加入特定密度(密度为1.0772g/cm3)的分离液1.2mL，然后加入特定密度(密度为1.0672g/cm3)的分离胶体2g。
3.采用定角转头离心机，用1400g-1800g离心力(在本例中离心力为1600g)离心3-5min，分离胶体在离心力作用下触变成液态凝胶。
4.离心结束后取出静置，在不受力时，液态凝胶转变为固态的胶体，即为淋巴细胞分离管，如图2的左图所示。分离胶体的顶面(即将与抗凝全血接触的面)和底面(即与分离液接触的面)均为斜面且平行，斜面与水平面的夹角为20-70°，优选30-60°，本例中为45°。
5.加入3-9mL抗凝全血样品到制备好的淋巴细胞分离管中，此时，由于分离胶体的隔离，样品与分离液不会混合，旋紧盖子，如图2的中图所示。
6.采用水平转头离心机，用1400g-1800g(在本例中离心力为1600g)的离心力离心10-20min。在离心力场的作用下，分离胶体触变成液态凝胶，淋巴细胞分离管内的液体分成清晰的四层，从下到上依次是：红细胞5、分离胶体2、白膜条带(淋巴细胞和分离液的混合物)6以及血浆7，如图2的右图所示。
7.取出淋巴细胞分离管，吸去最上层的血浆层，吸取白膜条带(白膜条带为外周血单核细胞层主要含淋巴细胞，与分离液的混合物)。
8.用RPMI(无血清细胞冻存培养基)1640洗涤1-2次(20℃，250g或1000rpm离心，10min)。
9.最后，用0.9％(W/V)生理盐水或合适的培养基重悬分离出来的淋巴细胞，备用。
本发明的具体实施方式中，根据一系列的实验，得到的实验数据如下：
细胞得率：又称细胞回收率，为实际得到量/理论或参照量。同样的血样品，通过不同的分离方法后获得的细胞越多，得率越大。
精确度或变异系数：变异系数即表示一组数据的离散程度，数值越小，说明离散度越低。同样的样品，经过特定方法重复多次，多次测定的结果一致性越高，变异系数越低，精确度就越高。
实验一：制备不同(仅分离胶体的顶面与水平面的夹角不同)的淋巴细胞分离管，取5个样本重复2次测得不同夹角下的细胞得率均值，数据如下表1所示，细胞得率与夹角的关系如图3所示。
表1
夹角(度) 10 20 30 40 50 60 70 80
细胞得率 48.5％ 56.6％ 67.2％ 76.2％ 78.5％ 75.2％ 64.3％ 51.5％
实验二：设计不同的分离胶体密度(25℃时分离胶体密度在1.065-1.075g/cm3之间取值)和分离液密度(25℃时分离液密度在1.076-1.084g/cm3之间取值)，制成淋巴细胞分离管，结果如下表2所示，其中，“分离层”是指含有淋巴细胞的层。
表2
在表2中，细胞得率在低于50％为差，在50-60％为一般，60％-70％为较好，70％以上为好。
实验三：采用现有技术中的细胞分离液直接分离，和具有上表2优选区间内参数的优化后的淋巴细胞分离管分离进行对比，取15个全血样本分离，求得细胞总数均值，每个样本重复4次，求得全部样本的变异系数均值，结果如下表3所示。
表3
因此，本发明的淋巴细胞分离管的显著特点在于独特的分离胶体和分离液特性保证了细胞分离效果稳定、可靠，细胞得率好，且重复操作的结果一致性显著提高。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种淋巴细胞分离管，包括管体，其特征在于：还包括置于所述管体内的分离胶体和分离液，所述分离液在所述管体底部，所述分离胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方；在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3，所述分离液的密度为1.0765-1.0785g/cm3，且所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值在0.008-0.012g/cm3之间；所述分离胶体在1400g-1800g离心力下能触变成液态凝胶；所述分离胶体的顶面为一斜面，所述斜面与水平面的夹角为30-60°。
2.如权利要求1所述的淋巴细胞分离管，其特征在于：所述分离胶体包括以下重量份数的各组分：
双环戊二烯树脂：90-100份；
二亚苄基山梨醇：0.05-1.8份；
聚丙烯酸钠:0.03-10份；细颗粒二氧化硅：2-3.5份；
聚乙二醇：0.5-0.8份；
邻苯二甲酸二酯：5-40份；
有机膨润土：3-7份。
3.如权利要求1所述的淋巴细胞分离管，其特征在于：所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值为0.01g/cm3。
4.如权利要求1所述的淋巴细胞分离管，其特征在于：在25℃时，所述分离胶体的密度为1.0672g/cm3，所述分离液的密度为1.0772g/cm3。
5.如权利要求1所述的淋巴细胞分离管，其特征在于：所述分离液的加入体积为所述淋巴细胞分离管体积的6.7％-10％；所述分离胶体的加入质量与所述淋巴细胞的体积的比值为0.1g/mL-0.2g/mL。
6.一种权利要求1所述的淋巴细胞分离管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在一个分离管中依次加入预定密度的分离液和分离胶体；
(2)将步骤(1)中的分离管放入采用定角转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为3-5min；
(3)离心结束取出分离管后，得到权利要求1所述的淋巴细胞分离管。
7.一种用权利要求1所述的淋巴细胞分离管进行淋巴细胞分离的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在权利要求1所述的淋巴细胞中加入一定量的抗凝全血；
(2)将步骤(1)中的淋巴细胞分离管放入采用水平转头的离心机中，设定离心力为1400g-1800g，离心时间为10-20min；
(3)吸取步骤(2)的淋巴细胞分离管中的呈白膜条带的液体，洗涤后分离得到淋巴细胞。
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