CN110152501B - 一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于白细胞过滤技术领域，具体涉及一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜及其制备方法，所述过滤膜包括疏水性基材以及涂覆在所述疏水性基材表面的亲水性聚合物，所述亲水性聚合物由不同表面形貌的纳米羟基磷灰石粒子按1：（0.01~1）的重量比组成。本发明过滤膜特别适用于从富血小板血浆中去除白细胞，该膜能够保证在高效滤除白细胞的同时显著减少血小板的黏附，具有高的白细胞滤除率（99.99%）和血小板回收率（＞90%），同时，溶血率低（＜5%），与现有技术相比，取得了显著的进步。

Description

一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜及其制备方法

技术领域

本发明属于白细胞过滤技术领域，具体涉及一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜及其制备方法。

背景技术

富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，其含有的血小板比全血中数目高3倍以上，主要用于各种原因所致的血小板减少症和血小板功能缺陷患者出血的预防和治疗。将采集的全血在室温下离心，使红细胞、白细胞基本下沉，较轻的血小板保留在上层，分离上层血浆，即为富血小板血浆。一般由上述方法制得的富血小板血浆中还含有较多的白细胞，血小板制剂中如果剩余白细胞较多，经反复输注可引起受血者白细胞抗原系统同种免疫反应，对再次输注血液及相关制品产生耐受作用，即“输血无效”。如果血小板制剂中残留的白细胞数量小于5×10⁶/L，就能够避免白细胞抗原系统同种免疫反应。

中国专利申请CN102614556A公开了一种高效滤除白细胞的组合滤膜。该组合滤膜包括两层无纺布，以及夹在两层无纺布之间的玻璃纤维膜，所述无纺布外涂覆丙烯酸类共聚物。该过滤器主要针对的是从全血中去除白细胞，其能达到99％以上的滤除率，但是该膜材料在滤除白细胞的同时也吸附了大量的血小板，血小板回收率低。

针对上述问题，在EP329303中，发明人以聚四氟乙烯、PBT或具有羟基或阴离子基团的其他纤维获得了一种过滤器装置，其可以从来源于血液的血小板浓缩物中去除白细胞。该材料具有纤维细、有效孔径小、均匀、各向同性好、价格低廉等优点。美国专利US5783094公开了一种过滤材料，其包括两层基体，即无纺布层和膜层，并且进行了多糖类化合物处理，其血小板回收率大于70％，白细胞去除率达到99.0％以上。但是上述材料的缺点是血小板通过率低(低于90％)，现有的从富血小板血浆中去除白细胞的材料均无法满足血小板通过率超过90％的要求。

除此之外，好的白细胞过滤材料还需要具备良好的血液相容性，具体是指，所述材料具有降低或消除生物材料破坏血液中的红细胞而导致的溶血现象，或因材料本身所致的血小板功能下降、补体被激活等能力。

因此，为了满足市场所需，有必要提供一种白细胞过滤膜，这种膜不仅具有高的白细胞滤除率，还具有高的血小板回收率和良好的血液相容性。

发明内容

本发明旨在提供一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜及其制备方法。该过滤膜具有高的白细胞滤除率，还具有高的血小板回收率，并且其溶血率低。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜，包括疏水性基材以及涂覆在所述疏水性基材表面的亲水性聚合物，所述亲水性聚合物由不同表面形貌的纳米羟基磷灰石粒子按1：(0.01～1)的重量比组成。

本文中所述“表面形貌”是指物体表面所具有的微观几何形状，纳米羟基磷灰石的微观几何形貌特性，在很大程度上影响着它的性能。

进一步地，所述亲水聚合物由类球状的纳米羟基磷灰石粒子a和棒状的纳米羟基磷灰石粒子b按1：(0.01～1)的重量比组成。

进一步地，所述亲水性聚合物由类球状的纳米羟基磷灰石粒子a和棒状的纳米羟基磷灰石粒子b按1：(0.1～1)的重量比组成。

进一步地，所述纳米羟基磷灰石粒子a的粒径为20～100n。

进一步地，所述纳米羟基磷灰石粒子b的平均大小为20×50nm。

进一步地，所述亲水聚合物在所述过滤膜中的质量百分数为0.01～10％，覆盖率为85～95％。

进一步地，所述疏水性基材的平均孔径为1～20μm。

进一步地，所述疏水性基材选自聚对苯二甲酸丁二酯、聚氨酯、聚丙烯、聚乙烯和聚酰胺中的一种或几种。

进一步地，所述疏水性基材为聚对苯二甲酸丁二酯。

相应地，本发明还提供了一种制备上述去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜的方法，包括以下步骤：

A)类球状纳米羟基磷灰石粒子a的制备：在0～8℃下，将硝酸钙的水溶液和(NH₄)₂HPO₄的水溶液混合，保持pH 11～13，搅拌反应8～30h，离心，收集沉淀，洗涤，冷冻干燥处理，煅烧，即得；

B)棒状的纳米羟基磷灰石粒子b的制备：取Ca(NO₃)₂水溶液和(NH₄)₂HPO₄水溶液混合，调节pH 10～12，将该混合溶液置于10℃混合24h，收集沉淀，洗涤，冻干，烧结，研磨，即得；

C)按比例取上述制备得到的两种纳米羟基磷灰石粒子，溶解于丙酮，搅拌，超声波分散5～15min，获得分散均匀的亲水性聚合物溶液；

D)将疏水性基材放入上述亲水性聚合物溶液中，浸润3～6h，取出，60～80℃烘干，即得。

一般认为，当血液与材料接触时，首先是蛋白质迅速吸附在材料表面，而后，细胞才与吸附在材料表面的蛋白分子层相互作用，而不是与材料直接接触，因此有望通过控制材料表面吸附蛋白的数量、类型以及蛋白质的方向、构象和排布方式来控制细胞应答。

若材料表面吸附的是纤维蛋白原时，其能促进白细胞的黏附作用，同时与血小板形成复合体而黏附在材料表面，在材料表面形成血栓；若材料表面主要吸附白蛋白时，其对白细胞的黏附具有一定的抗性作用，但是却极少与血小板形成复合体。因此，有望通过调节两种血浆蛋白在材料表面的吸附比例从而调节血小板和白细胞的黏附率。

单一表面形貌的纳米羟基磷灰石粒子对纤维蛋白原具有吸附作用，作为亲水性聚合物，对白细胞的滤除率可以达到99％以上，但是该材料不能抑制血小板的吸附，甚至起到了促进黏附的作用，无法满足要求。而发明人意外地发现，当采用两种具有不同表面形貌结构的纳米羟基磷灰石粒子按照一定的比例形成亲水性聚合物时，白细胞的滤除率能够达到99.99％以上，同时血小板的回收率有了大幅度地提高(大于90％)，最高能够达到92.3％。对于取得上述效果的机制尚不清楚，发明人认为可能是，两种不同表面形貌的纳米羟基磷灰石粒子的吸附在材料表面形成了更复杂的拓扑结构，而更复杂的拓扑结构更利于白蛋白的吸附，从而起到抑制血小板在材料表面黏附的作用。

而经过大量的试验摸索得出，具有类球状和棒状形貌的纳米羟基磷灰石粒子按1：0.8的重量比组成形成亲水性聚合物时，白细胞的滤除率可达到99.99％，血小板的回收率可达到92.3％。

另一方面，由于纳米羟基磷灰石粒子本身具有的高生物相容性，使用上述材料过滤血样时，能够产生低的溶血率，符合血小板制剂的要求。

本发明具有以下优点：

本发明过滤膜由疏水性基材以及涂覆在基材上的亲水性聚合物组成，其特别适用于从富血小板血浆中去除白细胞，该膜具有高的白细胞滤除率(99.99％)和血小板回收率(＞90％)，同时，溶血率低(＜5％)，与现有技术相比，取得了显著的进步。

附图说明

图1是类球状纳米羟基磷灰石a的TEM图谱；

图2是棒状纳米羟基磷灰石b的TEM图谱。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例1、类球状纳米羟基磷灰石粒子a的制备(HAPN-a)

取硝酸钙溶于400ml超纯水中，配制成0.2mol/L的水溶液，取(NH₄)₂HPO₄溶于200ml的超纯水中，配制成0.2mol/L的水溶液，将上述配制好的水溶液置于冰水浴中，搅拌，将磷酸氢铵溶液与硝酸钙溶液混合，用氨水调节pH保持10～12；在冰水浴中搅拌反应过夜，待反应完全后，对反应液进行离心处理收集制得的粒子，将粒子分别用超纯水、无水乙醇交换清洗3次，冻干，于马弗炉中600℃煅烧1.5h。得到类球状，平均粒径约为50nm的纳米羟基磷灰石粒子，如图1所示。

实施例2、棒状的纳米羟基磷灰石粒子b的制备(HAPN-b)

取硝酸钙用无水乙醇配制得到0.2mol/L的水溶液500ml，用超纯水配制0.2mol/L的(NH₄)₂HPO₄溶液300ml，将两种溶液放入4℃冰箱预冻后混合，用氨水调节pH至10以上，在10℃下混合24h，收集沉淀，用超纯水和乙醇交替洗涤沉淀3次，冻干，与马弗炉中550℃烧结10h，研磨后，获得平均大小约为20×50nm的棒状纳米羟基磷灰石粒子，如图2所示。

本发明实施例3～7以及对比例1～3所述过滤膜

制备方法：

按相应的质量分数取实施例1制备得到的HAPN-a粒子和实施例2制备得到的HAPN-b粒子，分别溶解于丙酮中，搅拌，混合，超声波分散10min，获得均匀的亲水性聚合物溶液；将基材放入上述亲水性聚合物溶液中，浸润5h，取出，70℃烘干，即得。

试验例一、滤除试验

1.1试验对象：本发明实施例3～7以及对比例1～3所述过滤膜。

1.2富含血小板血浆制备：取健康自愿献血者400ml全血，室温保存，4～6h内重离心，分离出白膜层(BC)。将分离的BC于血小板保存箱中(22±2)℃保存，将检验合格的BC通过无菌接管机汇集在二联空袋内，混匀后轻离心去除白细胞和红细胞，得到富含血小板血浆，将上述富含血小板血浆在重力的作用通过各组过滤膜，收集，即得到滤除了白细胞的富含血小板血浆。

1.3血小板回收率测定：分别记录过滤前后血小板容量，利用血细胞分析仪对过滤前后血样做血细胞计数，血小板回收率计算方式如下：

式中，P₀和P₁分别为经过滤膜过滤前后单位体积血样中所含的血小板数；

1.4白细胞滤除率测定：用Nageotte白细胞计数板对过滤前后血样中白细胞进行计数，计算公式如下：

式中L₀和L₁分别为经过过滤膜过滤前后单位体积血样中所含白细胞的数量。

1.5统计学分析：利用SPSS21.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料采用

表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义，结果如表1所示。

表1检测结果

注：与滤前相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

由上表可知，使用本发明实施例3～7所述过滤膜过滤富含血小板血浆，过滤前后白细胞数量具有极显著差异(P＜0.01)，白细胞的滤除率均达到99.9％以上，过滤后血小板较过滤前无明显差异，血小板回收率均大于90％，其中，尤以实施例3效果最佳，其白细胞滤除率为99.99％，血小板回收率达到92.3％。这说明，本发明过滤膜能有效滤除白细胞，同时可获得较高的血小板回收率。

对比例1和2为采用单一的类球状或棒状纳米羟基磷灰石粒子作为亲水性聚合物，两者过滤前后白细胞数据均具有极显著差异(P＜0.01)，具有较好白细胞滤除效果，但是血小板较过滤前后有显著减少，回收率仅为50％左右。这说明，单一形貌的纳米羟基磷灰石粒子无法有效抑制白细胞在材料表面的黏附，而当两种形貌的纳米羟基磷灰石粒子组合在一起时能够显著抑制血小板的黏附行为，血小板回收率可提高44％左右。

试验例二、溶血率测定

2.1试验对象：本发明实施例3～5以及对比例1～3所述过滤膜。

2.2三洗红细胞的制备：按照中国医药行业标准(YY0329-2002)方法，取1d～7d以内血库保存的红细胞悬液10ml，1190g～1200g离心20min，吸出上清液；加入适量0.9v/v％的氯化钠注射液约5ml，轻轻混匀，675～750g离心5min，吸出上清液；重复上述步骤1次，制备成三洗红细胞。取三洗红细胞悬液适量，加0.9v/v％的氯化钠注射液稀释至红细胞比容为0.12～0.13，备用。

2.3测定：取样品组3支试管，每管加入样品检验液10ml(将0.5g过滤膜和约10ml0.9v/v％的氯化钠注射液置于试管中，密封后在37℃水浴中4h，制得样品液)；阴性对照组取3支试管，每管加入0.9v/v％的氯化钠注射液10ml；阳性对照组取3支试管，每管加入蒸馏水10ml。全部试管放入37℃恒温水浴中保温30min后，每支试管加入0.2ml稀释健康人三洗红细胞悬液，轻轻混匀，置37℃水浴中继续保温60min。倒出管内液体，1190g～1200g离心5min，吸取上清液移入比色皿内，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。

2.4统计：样品组和对照组均取3支试管的平均值，阴性对照组的吸光度应不大于0.03；阳性对照组的吸光度应为0.8±0.3，溶血率按下式计算，结果如表2所示：

式中，A＝样品组吸光度；B＝阴性对照组吸光度；C＝阳性对照组吸光度

表2溶血率测定结果

组别	溶血率(％)
		实施例3	2.0
实施例4	2.6
		实施例5	2.3
对比例1	4.8
		对比例2	4.4
对比例3	3.2

由表2可知，经本发明实施例3～5过滤膜过滤后，溶血率低，均小于5％，满足要求，对比例1～3溶血率与实施例3组相比，有少许升高。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜，包括疏水性基材以及涂覆在所述疏水性基材表面的亲水性聚合物，其特征在于，所述亲水性聚合物由类球状的纳米羟基磷灰石粒子a和棒状的纳米羟基磷灰石粒子b按1 : (0.01~1)的重量比组成；所述过滤膜的制备方法包括以下步骤：

A）类球状的纳米羟基磷灰石粒子a的制备：在0~8℃下，将硝酸钙的水溶液和(NH₄)₂HPO₄的水溶液混合，保持pH 11~13，搅拌反应8~30h，离心，收集沉淀，洗涤，冷冻干燥处理，煅烧，即得；

B）棒状的纳米羟基磷灰石粒子b的制备：取Ca(NO₃)₂水溶液和(NH₄)₂HPO₄水溶液混合，调节pH 10~12，将该混合溶液置于10℃混合24h，收集沉淀，洗涤，冻干，烧结，研磨，即得；

C）按比例取上述制备得到的两种纳米羟基磷灰石粒子，溶解于丙酮，搅拌，超声波分散5~15min，获得分散均匀的亲水性聚合物溶液；

D）将疏水性基材放入上述亲水性聚合物溶液中，浸润3~6h，取出，60~80℃烘干，即得。

2.如权利要求1所述的过滤膜，其特征在于，所述亲水性聚合物由类球状的纳米羟基磷灰石粒子a和棒状的纳米羟基磷灰石粒子b按1 :（0.1~1）的重量比组成。

3.如权利要求1或2所述的过滤膜，其特征在于，所述类球状的纳米羟基磷灰石粒子a的粒径为20~100nm。

4.如权利要求1或2所述的过滤膜，其特征在于，所述棒状的纳米羟基磷灰石粒子b的平均大小为20×50nm。

5.如权利要求1所述的过滤膜，其特征在于，所述亲水性聚合物在所述过滤膜中的质量百分数为0.01~10%，覆盖率为85~95%。

6.如权利要求1所述的过滤膜，其特征在于，所述疏水性基材的平均孔径为1~20μm。

7.如权利要求1所述的过滤膜，其特征在于，所述疏水性基材选自聚对苯二甲酸丁二酯、聚氨酯、聚丙烯、聚乙烯和聚酰胺中的一种或几种。

8.如权利要求7所述的过滤膜，其特征在于，所述疏水性基材为聚对苯二甲酸丁二酯。

9.一种制备如权利要求1~8任一所述的去除富含血小板血浆中白细胞的过滤膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）类球状的纳米羟基磷灰石粒子a的制备：在0~8℃下，将硝酸钙的水溶液和(NH₄)₂HPO₄的水溶液混合，保持pH 11~13，搅拌反应8~30h，离心，收集沉淀，洗涤，冷冻干燥处理，煅烧，即得；

B）棒状的纳米羟基磷灰石粒子b的制备：取Ca(NO₃)₂水溶液和(NH₄)₂HPO₄水溶液混合，调节pH 10~12，将该混合溶液置于10℃混合24h，收集沉淀，洗涤，冻干，烧结，研磨，即得；

C）按比例取上述制备得到的两种纳米羟基磷灰石粒子，溶解于丙酮，搅拌，超声波分散5~15min，获得分散均匀的亲水性聚合物溶液；

D）将疏水性基材放入上述亲水性聚合物溶液中，浸润3~6h，取出，60~80℃烘干，即得。

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