JPH03270701A - 遠心分離管および細胞の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、特定のリンパ球サブクラスまたはその特定の
サブセットを分離、濃縮する遠心分離管およびこれを用
いた細胞の分離方法に関する。

〈従来の技術〉 免疫担当細胞の中心をなすのは、抗原特異的レセプター
を備えて抗原を認識し、体液性、細胞性の特異抗体を産
生ずるエフェクター細胞まで分化する能力を持つリンパ
球であり、免疫適格細胞（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ　ｃｅｌｌ）と呼ばれる細胞である。　しかしなが
ら、生体内での免疫応答をリンパ球のみで行うことは不
可能であり、抗原を処理してリンパ球に提示する免疫反
応の上行脚では、マクロファージ亜群の樹状細胞が必要
である。　また、抗原抗体反応の最終効果である異物処
理や、血管反応を中心とした炎症反応は、免疫応答の平
行脚にあたり、マクロファージ（単球）の他、顆粒球、
肥満細胞等が関与している。

多様な免疫担当細胞は、複雑な免疫反応の要求に対して
、局所への動員と増殖により速やかに対応することが特
徴であり、刺激に対する増殖と分化は、生体の他の細胞
系における機能調節にあたる役割を持っている。

リンパ球には、サブクラスがある。　すなわち、胸腺の
影響を受けて成熟するＴリンパ球と、ファブリキウス嚢
、あるいは哨乳類ではこれに相当する器官（肝、骨髄等
の造血巣）の影響を受けて成熟するＢリンパ球と、ナチ
ュラルキラー（ＮＫ）系やラージグラニュラ−リンパ（
ＬＧＬ）系等のその他のリンパ球とに大別される。

Ｂリンパ球の場合、抗原刺激を受けた後は、抗体産生細
胞への分化増殖と抗体の産生といういわば単一方向への
変化を示すのに対し、Ｔリンパ球のそれは単一ではなく
、１つの抗原刺激によって数種類の種々の機能を持つＴ
リンパ球に変化が起り、あるものはエフェクター細胞へ
、またあるものは制御（分化増殖の促進または抑制）細
胞として機能する。

すなわち、Ｔリンパ球には、その機能面においてサブセ
ットが存在する。　いわゆるヘルパー／インデューサー
Ｔリンパ球（ＴＨ／、）、サプレッサー／サイトドキシ
ツク下リンパ球（Ｔ、／Ｃ）、遅延型アレルギーに関与
するＴリンパ球（Ｔ、、、）等のサブセットである。　
これらサブセットの存在は、これらサブセットのマーカ
ーとなる表面抗原に対する抗体（モノクローナル抗体）
によるＴリンパ球の分類とその機能との相関によって示
されている。

また、Ｂリンパ球においても、その表面に存在する免疫
グロブリンのクラス（Ｉ　ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ）により分類されるサブセットがあると考え
られている。

近年、このように重要な機能を有するリンパ球を分離、
分画し、免疫科学的基礎研究あるいは各種の診断や治療
に利用する試みがなされているが、従来、リンパ球の分
離法としては以下に述べるような種々の方法が知られて
いる。

すなわち、［１］細胞の大きさの差を利用した速度沈降
法等の方法、［２］細胞の比重差を利用した比重遠心法
等の方法、［３］細胞表面電荷量の差を利用した細胞電
気泳動法等の方法、［４］貧食活性を利用したカルバニ
ール鉄による単球の除去、［５］細胞の非特異的付着活
性の差を利用した、ナイロンウール、ガラスウール等を
充填したカラムを用いる、あるいはガラス、プラスチッ
ク等のシャーレを用いる等の方法、［６］細胞の特異的
結合能を利用したアフィニティークロマトグラフィー、
［７］細胞のロゼツト形成を指標とするロゼツト浣降法
、［８］細胞膜表面の特異抗原、免疫グロブリンと標識
抗体との反応を利用したフルオレセインアクチベイテツ
ドセルソータ−（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉ
ｖａｔｉｎｇ　Ｃｅ１１　ＳｏｒｔｉｎｇＦＡＣＳ１法
等である（例えば、矢田純−１藤原道夫編著、新リンパ
球機能探索法、１９８７年、中外医学柱等を参照）。　
また、支持体や固定相を使用しない多段分離の手段とし
て、［９〕フイールドフローフラクシヨネーシヨン（Ｆ
ｉｅｌｄ−Ｆｌｏｗ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、　
ＦＦＦ）法が検討されている。

しかしながら、［１］〜［３］におけるように物理的な
細胞分離法は、Ｔリンパ球とＢリンパ球との間に比重、
密度等の物理的諸物性に際だった差がないため、分離回
収された細胞の収率あるいは純度に高い精度が要求でき
ないものであり、特に、［３］の細胞電気泳動法におい
ては、細胞の成熟度によって移動度が異なること、細胞
機能に与える電場の影響が解明されていないこと、大量
処理が困難であるといった欠点も有するものであった。

また、［６］〜［８コにおけるような細胞膜表面の特異
抗原、レセプター、免疫グロブリン等を指標とする細胞
分離法は、いずれち処理細胞が生物学的に特異性の高い
強固な結合や刺激を受けるため、インタクトな状態で目
的細胞を回収するのが難しく、かつ大量処理に適さない
ものであり、特に、【６］のアフィニティークロマトグ
ラフィーは、高価な抗体を必要とし、また［８］のＦＡ
Ｃ５法は、細胞を標識する等の前処理が煩雑であり、高
価な抗体と装置を必要とするといった欠点を有するもの
であった。

また、［９］のＦＦＦ法は、回転軸を介して溶離液を連
続的に流入、流出する装置的な困難さと共に、ローター
状分離セルと流路の材質が細胞の接着を招くために、細
胞の相互分離を実用化するところまでには至っていない
。

これに対し、［５］の細胞の非特異的付着特性を利用し
た方法は、処理細胞の機能を損傷するおそれが少なく、
また価格、操作性、および大量処理性の面でも適当なも
のであるが、目的細胞に対する選択性および回収率の面
では不十分なものであり、さらに前記したカラム法等に
おいては、分離操作を行う場合の経験的技術的習熟が必
須であるという課題も存在しているものであった。

さらに、上記［１］〜［９］のほとんどに共通する最大
の欠点は、目的細胞を得るのに多段階の分離操作を必要
とすることである。　すなわち、採血した末梢血から特
定のリンパ球サブクラスを分離する場合、まず、比重遠
心法を用いて赤血球および顆粒球を除去した後、数回の
操作を経て、目的とするリンパ球サブクラスの分離を行
う。

例えば、全血（ヒト末梢血）より前記ＮＫ系またはＬＧ
Ｌ系のリンパ球分画を濃縮する場合には、下記の４段階
の操作が必要とされる。

１）比重遠心法により赤血球および顆粒球を分離除去し
、単核球を得る。

２）ポリスチレンシャーレへの付着、あるいはカルボニ
ル鉄の貧食等により、単核球の内がら単球を分離除去し
、リンパ球（リンパ球の全サブクラスを含む）を得る。

３）ナイロンウールカラム法等によりＢリンパ球を除去
する。

４）アフィニティクロマトグラフィー、抗体を用いたパ
ンニング、ロゼツト形成法、密度勾配遠心分離法等によ
りＴリンパ球を除去し、目的とするＮＫ系、ＬＧＬ系の
リンパ球を得る。

このような多段階の分離操作は多大な手間と時間を要す
る。　また、このような操作は熟練を要し、しかも操作
が多段階にわたるため、再現性が劣る。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、細胞機能を損うことなく各種リンパ球
サブクラスまたはそのサブセットを高収率、高純度で分
離、濃縮することができ、しかもこれを１回の操作で簡
便かつ迅速に行うことができる遠心分離管および細胞の
分離方法を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 このような目的は、下記（１）〜（２ｏ）の本発明によ
り達成される。

（１）遠心操作可能なチューブ状の容器本体内に、特定
のリンパ球サブクラスまたはその特定のサブセットを選
択的に捕捉しうる少なくとも１種の吸着剤と、単核球の
比重より高い比重の分離剤とを充填してなる遠心分離管
。

（２）前記容器本体は、前記吸着剤を保持する吸着剤保
持部と、回収する細胞を含む細胞浮遊液を貯溜する細胞
浮遊液貯溜部と、前記分離剤を充填する分離剤充填部と
を有する上記（１）に記載の遠心分離管。

（３）前記容器本体は、密栓可能な上部開口を有し、該
上部開口から底部へ向って、前記吸着剤保持部、前記細
胞浮遊液貯溜部および前記分離剤充填部がこの順に形成
されている上記（２）に記載の遠心分離管。

（４）前記上部開口に、菌不透過性を有する通気性フィ
ルターを備える栓体を装着した上記（３）に記載の遠心
分離管。

（５）前記容器本体は、複数の部材に分割可能なもので
ある上記（１）〜（４）のいずれかに記載の遠心分離管
。

（６）前記容器本体は、前記吸着剤保持部と前記分離剤
充填部とを分割することが可能なものである上記（３）
または（４）に記載の遠心分離管。

（７）前記吸着剤は、細胞は通過するが、吸着剤は通過
できない網目または細孔を有するフィルター部材により
保持されている上記（１）〜（６）のいずれかに記載の
遠心分離管。

（８）前記吸着剤は、特定のリンパ球サブクラスまたは
その特定のサブセットに対し親和性を有する物質を担体
に固定化したものである上記（１）〜（７）のいずれか
に記載の遠心分離管。

（９）前記物質は、Ｂリンパ球またはその特定のサブセ
ットに対し親和性を有する糖質である上記（８）に記載
の遠心分離管。

（１０）前記物質は、Ｔリンパ球またはその特定のサブ
セットに対し親和性を有する脂質である上記（８）に記
載の遠心分離管。

（１１）前記担体は、粒径が０．０１〜１ｍｍの粒状物
である上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の遠心分
離管。

（１２）前記吸着剤保持部に、２種以上の吸着剤を准合
して保持する上記（２）〜（１１）のいずれかに記載の
遠心分離管。

（１３）前記吸着剤保持部に、２種以上の吸着剤を区画
して保持する上記（２）〜（１１）のいずれかに記載の
遠心分離管。

（１４）前記分離剤の比重が１．０７７付近である上記
（１）〜（１３）のいずれかに記載の遠心分離管。

（１５）前記分離剤は、高分子ゲルに比重調整剤を添加
したものである上記（１）〜（１４）のいずれかに記載
の遠心分離管。

（１６）前記比重調整剤は、無機微粉末である上記（１
５）に記載の遠心分離管。

（１７）遠心分離管の内部に滅菌処理がなされている上
記（１）〜（１６）のいずれかに記載の遠心分離管。

（１８）上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の遠心
分離管を用いて被検液中に存在する細胞の分離を行う方
法であって、 前記容器本体内に被検液を注入し、次いで、遠心操作を
施して、被検液中の単核球より比重の高い細胞を前記分
離剤の下層に移行させるとともに、被検液を前記吸着剤
と接触させて被検液中の特定のリンパ球サブクラスまた
はその特定のサブセットを捕捉し、前記分離剤の下層に
移行せずかつ前記吸着剤で捕捉されなかった細胞を回収
することを特徴とする細胞の分離方法。

（１９）上記（５）〜（１７）のいずれかに記載の遠心
分離管を用いて被検液中に存在する細胞の分離を行う方
法であって、 前記容器本体内に被検液を注入し、次いで、遠心操作を
施して、被検液中の単核球より比重の高い細胞を前記分
離剤の下層に移行させるととちに、被検液を前記吸着剤
と接触させて被検液中の特定のリンパ球サブクラスまた
はその特定のサブセットを捕捉し、その後、前記容器本
体を分割して前記分離剤の下層に移行せずかつ前記吸着
剤で捕捉されなかった細胞を回収することを特徴とする
細胞の分離方法。

（２０）前記被検液は、末梢血である上記（１８）また
は（１９）に記載の細胞の分離方法。

〈作用〉 本発明では、遠心分離管内の吸着剤により特定のリンパ
球サブクラス（例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球）
またはその特定のサブセット（例えば、Ｔリンパ球の亜
分画であるヘルパー／インデューサーＴリンパ球または
サプレッサー／サイトドキシツク下リンパ球）を捕捉す
るとともに、比重が１．０７７を超える赤血球および顆
粒球（好中球、好酸球、好塩基球）を分離剤の下層に移
行させて分離し、目的とするリンパ球サブクラスまたは
そのサブセット（以下、目的細胞という）を得る。

このような複数の分画化は、１回の遠心操作で同時に達
成される。　すなわち、遠心分離管内に末梢血（抗凝固
剤添加）を注入し、市販の遠心器を用いて遠心処理を行
うだけで、ワンパッチで効率よく目的細胞を得ることが
できる。

しかも、回収された目的細胞の収率は高く、その生存率
も極めて高い。

〈発明の構成〉 以下、本発明の遠心分離管および細胞の分離方法を添付
図面に示す好適実施例に基づいて詳細に説明する。

第１図は、本発明の遠心分離管の構成例を示す縦断面図
である。　同図に示すように、遠心分離管１は、遠心操
作可能なチューブ状の容器本体２を有し、この容器本体
２は、上部カラム２ａおよび下部カラム２ｂで構成され
ている。

これら両刃ラム２ａおよび２ｂは、連結、分離自在であ
る。　すなわち、上部カラム２ａの下端部と下部カラム
２ｂの上端部とは互いに嵌合する形状とされ、例えば第
１図に示すように、一方に雌ねじ、他方に雄ねじが形成
され、これらが螺合することにより両刃ラム２ａおよび
２ｂが連結される。

なお、両刃ラム２ａおよび２ｂの連結状態において、液
密性を保持するために、両刃ラム２ａ、２ｂの境界部に
弾性材料よりなるシールリング３を設置するのが好まし
い。

なお、両刃ラム２ａおよび２ｂの連結部は、図示のごと
き螺合形状に限定されるものではない。

このような容器本体２内には、被検液を注入する被検液
注入部２１、後述する吸着剤７を保持する吸着剤保持部
２２、内径が他の部分より小さい縮径部２３、回収する
目的細胞を含む細胞浮遊液を貯溜する細胞浮遊液貯溜部
２４および後述する分離剤９を充填する分離剤充填部２
５が、容器本体２の図中上部から下部へ向ってこの順に
形成されている。

図示の構成例では、縮径部２３の途中において容器本体
２が上部カラム２ａと下部カラム２ｂとに分割される構
成となっている。

従って、上部カラム２ａ側に被検液注入部２１および吸
着剤保持部２２が形成され、下部カラム２ｂ側に細胞浮
遊液貯溜部２４および分離剤充填部２５が形成されるこ
ととなる。

この場合、容器本体２を分割した際、細胞浮遊液貯溜部
２４が縮径部２３の一部を介して外部に連通するため、
細胞浮遊液を取り出し易いという利点がある。

なお、容器本体２の分割部位は縮径部の途中に限定され
ず、また２以上の分割部位を有し３以上の部材に分割す
るものでもよい。

また、容器本体２を分割する目的は、主に細胞浮遊液を
回収するためであるが、これに限定されず、例えば吸着
剤７を充填または取り出すために分割してちよい。

この場合には、吸着剤保持部２２の一対のフィルター部
材８．８間に容器本体２の分割部位を形成するのが好ま
しい。

なお、分離操作を行った後、容器本体２を分割すること
等により吸着剤７を取り出し、この吸着剤７に捕捉され
ている特定のリンパ球サブクラスまたはその特定のサブ
セット（以下、特定のリンパ球等という）を吸着拮抗剤
で離脱させ、この特定のリンパ球を回収することちでき
る。

上部カラム２ａ内の下方に位置する吸着剤保持部２２に
は、被検液中の各種細胞は通過するが、吸着剤７は通過
できない網目または細孔を有する一対のフィルター部材
８．８が設置され、両フィルター部８．８間に吸着剤７
が保持されている。

このフィルター部材８としては、例えばメツシュ、不織
布等が好適に使用され、その構成材料は、生理学的に不
活性で強度の高いものであればいかなるちのでもよく、
特にポリエステルやポリアミドで構成されたものが好ま
しい。

なお、吸着剤７の充填量は、特に限定されないが、０．
１〜１００ｇ程度、特に０．５〜５０ｇ程度とするのが
好ましい。

また、吸着剤７の保持方法は、図示のごときフィルター
部材８によるものに限定されない。

下部カラム２ｂの底部に位置する分離剤充填部２５には
、後述する分離剤９が充填されている。

図示の例では、分離剤９表面（界面９０）は平坦である
が、これと異なり、下部カラム２ｂの底部へ向って凹没
するような湾曲面としてもよい。

これにより、後述する赤血球および顆粒球の除去を効率
よく行うことができる。

なお、分離剤９の充填量は特に限定されないが、注入し
た血液のへマドクリットと同程度とするのが好ましい。

また、分離剤９の充填作業は、容器本体２を分割した状
態で行えば便利である。

容器本体２の図中上部（上部カラム２ａの上部）には、
開口４が形成され、この間口４には、弾性材料よりなる
栓体５が嵌入されている。

この栓体５の構成材料としては、例えば、各種天然ゴム
、合成ゴムあるいは高分子エラストマー等が挙げられる
。

また、栓体５には、貫通孔５１が形成され、この貫通孔
５１には、通気性を有するが細菌は透過しない（菌不透
過性）フィルター６が装着されている。

このフィルター６としては、例えば、多孔質ポリプロピ
レン製フィルム、適当なかさ密度で充填された各種繊維
や不織布等を挙げることができる。

このフィルター６においては、後述する遠心分離管１を
滅菌する際に滅菌ガス（水蒸気、エチレンオキサイドガ
ス等）がフィルター６を介して遠心分離管１の内部と流
通し、また滅菌処理がなされた遠心分離管１に対し、そ
の菌不透過性により遠心分離管１内への細菌の侵入が阻
止され、滅菌状態が維持される。

なお、栓体５に貫通孔５１およびフィルター６を設けず
、栓体５により容器本体２内部を気密状態で密封するよ
うな構成としてもよい。

この場合には、容器本体２内を減圧状態としておくこと
もでき、これにより血ン夜等の被検液の注入を容易に行
うことができる。

容器本体２の構成材料としては、成形が容易で、滅菌処
理に耐えつるものが好ましく、例えばポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ
メチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等
の合成樹脂、ガラス、ステンレス、チタン、アルミニウ
ム等の金属、アルミナ、シリカ等の各種セラミックス、
または、これらのうちの任意を組み合わせたもの等が挙
げられるが、そのなかでも、オートクレーブ滅菌に適し
、取り扱い易い材料であるポリプロピレン、ポリカーボ
ネート、ポリエチレンテレフタレート等が特に好ましい
。

また、被検液注入部２１、吸着剤保持部２２、細胞浮遊
液貯溜部２４および分離剤充填部２５における内径は、
市販の遠心機を用いることができる程度のものであるの
がよく、この点で、それぞれ５〜５０ｍｍ程度、特に７
〜３５ｍｍ程度とするのが好ましい。　なお、各部２１
．２２．２４．２５の内径は、同一でも、異なっていて
もよい。

また、縮径部２３の内径は、１〜３５ｍｍ程度、特に３
〜２０ｍｍ程度とするのが好ましい。

容器本体２の全長（遠心分離管軸方向）は、市販の遠心
機を用いることができる程度のものであるのがよく、こ
の点で、前記内径の範囲においては、４５〜１５０＋ｎ
ｍ程度、特に９０〜１３０ｍｍ程度とするのが好ましい
。

被検液注入部２１の長さ（遠心分離管軸方向）は、被検
液を注入するのに十分な容積を確保することができるも
のとし、前記内径の範囲においては、１０〜１００ｍｍ
程度、特に３０〜６０ｍｍ程度とするのが好ましい。

吸着剤保持部２２の長さは、前記内径の範囲においては
、５〜８０ｍｍ程度、特に１０〜４０ｆｆ１ｍ程度とす
るのが好ましい。

なお、吸着剤７による特定のリンパ球の吸着効率を高め
るために、吸着剤保持部２２の内径を小さくシ（例えば
、縮径部２３の内径程度）、かつその長さ、すなわち被
検液の通過経路長を長く（例えば、５０〜８０ｍｍ程度
）することもできる６　このような構成は、特に吸着剤
７の担体である水不溶性物質の粒径が比較的大きく、そ
のために吸着効率が低い場合や、それ自体吸着効率が低
い吸着剤を用いた場合等に適用するのが好ましい。

また、吸着剤保持部７に隔壁等を設け、被検液の実質的
な通過経路長を延長することも可能である。　ただし、
この場合にはチャネリングを生じないような配慮が必要
である。

縮径部２３の長さは、２〜３０１１１ｆｆｌ程度、特に
３〜１５ｍｍ程度とするのが好ましい。

細胞浮遊液貯溜部２４の長さは、細胞浮遊液を貯溜する
のに十分な容積を確保することができるものとし、前記
内径の範囲においては、２〜１００ｍｍ程度、特に３０
〜６０ｍｍ程度とするのが好ましい。

なお、このような構成の遠心分離管１は、その内部（血
液と接触する部分）が、その使用前に温熱滅菌（オート
クレーブ滅菌）、ガス滅菌（例えばＥＯＧ滅菌）または
放射線滅菌（特にγ線滅菌）等の滅菌法により滅菌処理
がなされているのが好ましい。

この場合、図示の遠心分離管１は、温熱滅菌またはガス
滅菌を施すのに好適な構成である。

すなわち、遠心分離管１を滅菌装置に入れて滅菌すると
、高温、高圧の水蒸気またはエチレンオキサイドガスが
フィルター６を介して容器本体２内に導入され、また容
器本体２外へ排出されるので、栓体５の着脱や容器本体
２の分割等を行うことなく容易かつ確実に滅菌処理を行
うことができる。

なお、本発明の遠心分離管は、前記滅菌処理をしても性
能の低下はみられず、安定した目的細胞の分離能を示す
ゆえに、性格な診断、安全な治療を行うことができる。

次に吸着剤７について説明する。

吸着剤７は、特定のリンパ球等を吸着しうるものであり
、好ましくは特定のリンパ球等に対し親和性を有する物
質を担体に固定化したものである。

この特定のリンパ球等に対し親和性を有する物質（以下
、単に物質という）としては、例えば次のようなものが
挙げられる。

■　Ｂリンパ球またはその特定のサブセットに対し親和
性を有する糖質 この糖質としては、多糖類あるいはその誘導体等が挙げ
られる。

多糖類としては、デンプン、デキストリン、グリコーゲ
ン、セルロース、カロニン、ラミナラン、デキストラン
、イヌリン、レバン、ガラクタン、キチン、アルギン酸
等の１種のみの構成単糖からなるホモ多糖類や、ペクチ
ン、アラビアゴム、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
、ヘパリン、グアラン等の２種以上の構成単糖からなる
ヘテロ多糖類が挙げられる。

また、リボース、デオキシリボース、キシロース、アラ
ビノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フ
ルクトース、ウロン酸等の単糖類を用いて高分子化した
物や、デンプン、デキストリン、グリコーゲン、セルロ
ース、デキストラン、イヌリン、ガラクタン、キチン、
アルギンＭ等のホモ多糖類、ペクチン、アラビアゴム、
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のへテ
ロ多糖類を化学修飾した天然糖の誘導体も用いることが
できる。

■　Ｔリンパ球またはその特定のサブセット（ヘルパー
／インデューサーＴリンパ球またはサプレッサー／サイ
トドキシツク下リンパ球）に対し親和性を有する脂質 この脂質としては、単純脂質、複合脂質および誘導脂質
が含まれるが、このうち特に細胞間相互作用において重
要な役割を示す複合脂質が好ましい。　この複合脂質と
しては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホス
ファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール
、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン
等のリン脂質や、セレブロシド、ガングリオシド等の糖
脂質が挙げられる。

■　Ｔリンパ球またはその特定のサブセットに対し親和
性を有する配糖体 配糖体とは、糖と非糖成分であるアグリコンとが結合し
た化合物で、○−グリコシド、Ｓ−グリコシド、Ｃ−グ
リコシドおよびＮ−グリコシドに大別される。　これら
の内、Ｏ−グリコシドは狭義の配糖体で、環状アルドー
スまたはケトースのへミアセタール性水酸基とアグリコ
ンの水酸基との間で縮合し、酸素を介して結合したもの
である。　植物界に多く見い出され、植物の花、葉、種
子、樹皮等に含まれ、結晶性の固体として得られる。

Ｏ−グリコシドには、フェノール配糖体、クマリン配糖
体、フラボノイド配糖体、カルコン配糖体、アントシア
ニジン配糖体、アントラキノン配糖体、インドール配糖
体、青酸配糖体、ステロイド系配糖体、アルカロイド配
糖体等がある。

○−グリコシドの内でも、特にフラボノイド配糖体を用
いるのが好ましい。　このフラボノイド配糖体には、フ
ラボン配糖体、インフラボン配糖体、フラボノール配糖
体、フラバノン配糖体、フラバノノール配糖体、カテキ
ン配糖体、オーロン配糖体、アントシアニジン配糖体、
カルコン配糖体、ジヒドロカルコン配糖体、等が含まれ
るが、そのなかでもフラボノール配糖体またはフラバノ
ン配糖体が好ましく、さらには、これらのうち糖成分が
ルチノースである配糖体、すなわち、ルチン、ヘスベリ
ジン、ナリンギン、エリオシドリン等が特に好適である
。

■　Ｔリンパ球に対し親和性を有するペプチド（特願平
１−１６８５４２号） このペプチドとしては、胸腺ホルモン、胸腺ホルモンの
生物活性部位またはヒト免疫不全症ウィルス（Ｈｕｍａ
ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ。

８ｍ皮膜タンパク（ｇｐ１２０）とエプスタイン−バー
ルウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ＶｉｒｕｓＥ
ＢＶ）遺伝子の相同部分であるペプチドＴが挙げられる
。

■　Ｔリンパ球に対し親和性を有するアルキル鎖を固定
化したもの アルキル鎖としては、種々の鎖長のアルキル鎖を用いる
ことができ、場合によっては分岐状のものであってもよ
いが、好ましくは、メチレンの繰返しが２５以下の直鎖
状のもの、特にメチレンの繰返しが２〜１４程度のもの
がより高い特性が得られ好ましい。　またその原料とし
てち、アルキルアミン類、脂肪酸類、アルコール類やこ
れらを含む単純脂質や複合脂質などの各種の化合物を用
いることができる。

■　親木的な分子構造を含むスペーサーを介して■と同
様のアルキル鎖を固定化したもの（特願平１−１３９１
４２号） ■　免疫グロブリン（Ｂリンパ球）と親和性を有する有
機合成されたリガンド（特開昭６３−２５２２５２号） ■　Ｂリンパ球に対し親和性を有するスルホン基または
カルボキシル基からなる酸性官能基（特公昭５９−１７
３８７号） このような物質の担体への担持量は、物質の。

種類や分子構造に応じてその好適な範囲が異なるが、通
常の目安としては、３〜８００１１ｍｏｊ／ｇ程度が好
ましく、５０〜３００　ｕｍｏＲ／ｇ程度がより好まし
い。

このような物質を固定化する担体としては、水不溶性物
質が好ましく、この水不溶性物質としては、親水性のも
のであっても、あるいは疎水性のものであってもよい。

　具体的には例えば、アガロース系、デキストラン系、
キトサン系、セルロース系等の多糖類、ポリアクリルア
ミド系、ポリビニルアルコール系、ポリビニルピロリド
ン系、ポリアクリロニトリル系、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、ポリスチレン系、アクリル酸エステル
系、メタクリル酸エステル系、ポリエチレン系、ボリブ
ロピレン系、ポリ４−フッ化エチレン系、エチレン−酢
酸ビニル共重合体系、ポリアミド系、ポリカーボネート
系、ポリフッ化ビニリデン系、ポリビニルホルマール系
、ボリアリレート系、ポリエーテルスルフォン系等の有
機合成高分子、ガラス系、チタン系、活性炭系、あるい
はアルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト等の各種セ
ラミックス系等の無機物等が挙げられるが、通常、固定
化酵素法、アフィニティークロマトグラフィー等におい
て用いられる公知の担体は特別の限定なく使用すること
ができる。

このような水不溶性物質の形態としては、特に限定され
ず、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状、あるいは平板状
等の公知のいずれの形状のものち用いることができるが
、被検液の通液性、吸着剤調製時の取り扱い簡便性等の
点から、粒子状のものが好ましい。

この場合、被１？１２液注入部２１の被検液が遠心によ
り比較的速い速度で吸着剤７中を通過するので、十分な
有効面積を確保する必要があり、そのため、粒子状水不
溶性物質の平均粒径は、０．０１〜１　ｍ＋ｎ程度、特
に０．０３〜０．３ｍｍ程度とするのが好ましい。

すなわち、粒径が０．０１ｍｍ未満では通液性が低下し
、また、１ｍｍを超えると十分な有効表面積を確保し難
しくなる６ さらに、粒子形状は細胞に物理的な損傷を与えにくいこ
と、クダケ、カケ等が生じにくいこと、均一な粒子を得
易い等の点から球形のものが好ましい。

また、このような担体は、多孔質あるいは緻密質のいず
れであってもよい。

このような水不溶性物質の表面に前記物質を固定化する
方法としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着、疎
水結合、生化学的特異結合等の担体結合法、あるいは架
橋法、包括法、複合法等あらゆる公知の方法を用いるこ
とができる。

また、前記■のように、必要に応じて、前記物質と水不
溶性物質表面との間に任意の長さのスペーサー分子を導
入して使用することも可能である。　このスペーサー分
子としては、ヘキサメチメンジアミン等のジアミン類、
ヘキサメチレングリコール等のジオール類等が好ましい
ちのとして挙げることができる。

また、本発明において使用可能なその他の吸着剤７とし
ては、ナイロン繊維、テトロン繊維、綿繊維等の繊維類
を挙げることができる。

この場合、繊維径としては、ｌ〜１０００−程度のもの
が十分な有効表面積の確保という点で好ましい。

また、このような繊維類の吸着剤保持部２２への充填密
度は、０．０５〜１、０ｇ／ｃｍ”程度とするのが好ま
しい。

また、吸着剤７として、ガラスピーズや前述したヒドロ
キシアパタイト等のセラミックス粉末そのちのを用いる
こともできる。　この場合の粒径も前記水不溶性物質と
同様である。

本発明においては、前述の吸着剤を１種または２種以上
用いることができる。

例えば、目的細胞がＮＫ系リンパ球である場合、Ｂリン
パ球を選択的に吸着する吸着剤（例えば前記■、■、■
）およびＴリンパ球を選択的に吸着する吸着剤（例えば
前記■、■、■、■、■）の２種を遠心分離管内に充填
すれば、ＮＫ系リンパ球をより高濃度に濃縮することが
できる。

この場合、吸着剤の充填形態としては、２種以上の吸着
剤をｄ合、好ましくは均一に混合し、これを第１図に示
すようにして吸着剤保持部２２に保持することができる
。

また、２種以上の吸着剤のそれぞれを１または２以上の
層状にし、これらを容器本体２の長手方向に積層し、こ
の積層体を一対のフィルター部材８．８で保持すること
もできる。

また、第２図に示す遠心分離管１゛のように、例えば２
種の吸着剤７ａおよび７ｂを一対のフィルター部材８．
８で保持するとともに、それらの境界を同様のフィルタ
ー部材８１で区画した構成とすることもできる。

なお、２種（またはそれ以上）の吸着剤は、それぞれ異
なる特定のリンパ球等を捕捉するものであるのが好まし
いが、同一の特定のリンパ球等を選択的に吸着するもの
でもよい。

なお、本発明における特定のリンパ球等に対する親和性
については、その特異的相互作用力を物理化学的に解析
すると、リンパ球に親和性を有する配糖体と細胞膜表面
とは、ファン・デル・ワールスカ（この力の中身として
、配向効果、誘電効果および分散効果の三つの効果が考
えられている）を基本にして、水素結合、イオン結合（
クーロン力）、イオン−双極手間力、配位結合および疎
水結合の分子間力が組み合わさって相互作用し、さらに
表面分子が形成する空間的構造が鍵と鍵穴のごとく、立
体的に適合しているものと推測されるものである。

次に、分離剤９について説明する。

分離剤９は、単核球の比重より高い比重を有するもので
ある。　これにより、遠心を施した際、該分離剤９は流
動化して、管壁に沿ってせり上がるように変形し、分離
剤９より高い比重の細胞である赤血球および顆粒球の層
と、低い比重の細胞である単核球の層との間に移動し、
これらの各細胞層に分離することができるものである。

分離剤９の比重は、１，０７７付近、特に１．０７０〜
１．０７９程度のものが好ましい。

分離剤９を構成する物質としては、α−オレイン酸とマ
レイン酸ジエステルとの共重合体等の高分子ゲルや、ジ
アドリゾ酸ナトリウムーフィコール混液のような液体が
挙げられるが、界面９０を乱さず、簡便に目的細胞を回
収できるという点で、高分子ゲルを用いるのが好ましい
。

また、分離剤９は、それ自体で所望の比重（例えば、１
．０７７）を有しているもの（例えば、ファルマシア社
製フィコールパック）、前記高分子ゲルや液体に比重調
整剤を添加して所望の比重に調整したもの、あるいは比
重調整が可能な高分子ゲルのいずれでもよい。

この場合、比重調整剤としては、比重調製に有効なもの
であればいかなるものでもよく、例えばシリカ、ベント
ン、珪藻土等の無機微粉末が好適に使用される。

このような分離剤９の具体例としては、α−オレフィン
−マレイン酸ジエステル共重合体（三菱化成■製部品名
：α−マテリアル）にベントンおよびシリカを重量比で
１００：２：１の割合で混合したもの（比重′＝Ｆ１．
０７７）が挙げられる。

なお、本発明における分離剤としては、前述した滅菌処
理が可能であり、この滅菌処理等により変質、特に比重
変化が生じないものが好ましい。

次に、本発明の細胞の分離方法について説明する。

本発明の細胞の分離方法は、前述した遠心分離管を用い
て実施される。　以下、その手順について述べる。

■　まず、内部に滅菌処理がなされた遠心分離管１の細
胞浮遊液貯溜部２４および縮径部２３には、予め平衡塩
溶液を浦たしておく。

この状態で被検液注入部２１に被検？夜を注入する。　
この注入方法は、例えば針管を備えたシリンジに被検液
を採取し、その針管を栓体５に穿刺、貫通し、この針管
を通じてシリンジ内の被検酸を被検液注入部２１に注入
する。

前述した内部を減圧状態とした遠心分離管を用いる場合
には、例えば針管の一端を採血者の血管に穿刺し、他端
を栓体に穿刺、貫通させると、針管を介して血液が減圧
状態の遠心分離管内に吸引される。　この方法では、直
接採血者の血管から遠心分離管内へ血液を導入すること
ができ、また細菌感染も防止されるので好ましい。

被検液としては、全血、特に末梢血が好ましい。　すな
わち、本発明では、末梢血からでも１回の操作で目的細
胞を直接分離、濃縮することができることに特徴を有す
る。

ただし、被検液が、末梢血の希釈物または濃縮物、末梢
血に抗凝固剤等を添加したもの、末梢血から特定の細胞
（例えば、赤血球）を除去したもの、末梢血以外の体液
、その地番種細胞懸濁液等、細胞を含む液体であれば、
いかなるものでもよいことは言うまでもない。

なお、被検液、特に末梢血の被検液注入部２１への注入
量としては、特に限定されないが、０．５〜１０．０ｍ
ｆｆ１程度とするのが好ましい。

■　次に、被検液が注入された遠心分離管１に対し、遠
心器を用いて遠心操作を施す。　これにより、被検液注
入部２１の被検液は容器本体２の底部方向への力を受け
、移動する。

すなわち、第１図に示す遠心分離管１の場合には、被検
液は、まず上段のフィルター部材８を透過し、吸着剤７
中を通過し、下段のフィルター部材８を透過して縮径部
２３に至り、平衡塩溶液と混合される。　被検液が吸着
剤７中を通過する際に、その吸着剤７に応じて被検液中
の特定のリンパ球等が選択的に吸着、除去される。

また、第２図に示す遠心分離管１°の場合には、被検液
は、上段のフィルター部材８、吸着剤７ａ、中段のフィ
ルター部材８１．吸着剤７ｂおよび下段のフィルター部
材８を順次通過し、吸着剤７ａおよび７ｂにそれぞれ応
じた特定のリンパ球等が選択的に吸着、除去される。

なお、これらの場合、目的細胞は、吸着剤７．７ａ、７
ｂに捕捉されずに通過する。

遠心により分離剤９は流動化して、管壁に沿ってせり上
がるよう変形し、目的細胞の層と赤血球および顆粒球の
層との間に移動するために、目的細胞は細胞浮遊液貯溜
部２４にとどまり、かつ分離剤９が赤血球および顆粒球
の層を封止した状態となる。

この状態で、細胞浮遊液貯溜部２４には、目的細胞が濃
縮された細胞浮遊液が得られる。

なお、遠心操作の条件は、被検液の種類、注入量、吸着
剤７等の粒径、充填量、充填密度、分離剤９の比重、充
填量等に応じて適宜決定されるが、通常は２００〜２０
００Ｇで１０〜３０分程度回程度せるのが好ましい。

図示の遠心分離管１．１゛では、被検液中の細胞が分離
剤の下層に移動するのに先立って被検液が吸着剤と接触
するが、遠心処理中は、これらは大部分並行して行われ
る。

本発明では、被検液の吸着剤との接触と細胞の分離剤の
下層への移動は、いずれが先行しても、また同時であっ
てもよく、これらの間にタイムラグがあってもよい。

■　上部カラム２ａと下部カラム２ｂとを相対的に回転
して両刃ラム２ａおよび２ｂを離反し、容器本体２を分
割する。

この分割により、細胞浮遊液貯溜部２４は縮径部２３の
一部を介して外部へ開放し、この部分より目的細胞を含
む細胞浮遊液を他の容器等に回収する。

細胞浮遊液の回収は、下部カラム２ｂを傾けて細胞浮遊
液を直接取り出すか、またはスポイトやシリンジ等を用
いて吸引する等の方法により行うことができる。

なお、容器本体２が分割可能なものでない場合には、例
えば容器本体２の側部に細胞浮遊液貯溜部２４に連通す
る開口およびこの開口を気密的に封止する蓋体（いずれ
も図示せず）を設け、該開口より蓋体を取り外して細胞
浮遊液を回収することもできる。

く実験例〉 （実施例１） Ａ）ガラスピーズへの多糖類の固定 まず、濃硝酸で洗浄された清浄な表面平滑ガラスピーズ
（平均粒径０．０５ｍｍ）を水酸化カリウムでｐＨ９，
０に調製された１、０％γ−グリシドキシプロビルトリ
メトキシシラン（ＧＯＰＴＳ）（東芝シリコーン■製）
溶液に添加し、室温下で２０分間撹拌した。

次に、過剰なＧＯＰＴＳ溶液を除き、１５０℃で４５分
間キユアリングを行った。

この後、充分な蒸留水で処理ビーズを洗浄し、ｐＨ１０
，０，２Ｍ炭酸緩衝液を用いて調製された１％ペクチン
溶液中にビーズを添加した。　これを８０℃で３時間加
熱し、さらに約２０時間撹拌した後、ビーズを蒸留水で
洗浄してＢリンパ球を選択的に捕捉しうる吸着剤である
多糖類固定化ビーズを得た。

Ｂ）遠心分離管の製造 第１図に示す構造の遠心分離管を製造した。

容器本体は、縮径部において螺合可能なアクリル樹脂製
の上、下部カラムより構成されたものである。

容器本体の内径は９ｍｍ、縮径部の内径は５ｍｍ、全長
１２５ｍｍ、上部カラムの長さは６０ｍｍ（被検液注入
部の長さ４５ｍｍ、吸着剤保持部の長さ１５ｎｒｍ）、
下部カラムの長さは６０ｍｍ、縮径部の長さは５ｍｍと
した。

下部カラムの丸底部内には１．５ｍｊの高比重ゲル（比
重”Ｆｌ、０７７、α−マテリアル（三菱化成■社製）
：ベントン：シリカニ１００：２：１）を充填し、分離
剤充填部を形成した。

その長さは２０ｍｍであった。　さらに上部カラムの吸
着剤保持部には、ポリエステル製のメツシュにより、平
均粒径０．０５ｍｍの前述のようにして得た多糖類固定
化ガラスピーズを１．５ｇ保持、充填した。　また、縮
径部および細胞浮遊液貯溜部には二価カチオンフリーの
ハンフス平衡塩溶液を満たした。

この状態で容器本体２上部開口にポリエステル製の通気
性フィルターを有するゴム栓を嵌入し、１２１℃で２０
分間、オートクレーブ滅菌を施した。

かくして得られた遠心分離管の被検液注入部に、正常人
より採血したクエン酸−リン酸−デキストロース（ＣＰ
Ｄ）加血液１．５＋ｎｊを針管付シリンジを用いて注入
し、２５℃下で約７００Ｇ、２０分間遠心を施した。

この後、遠心分離管を上、下カラムに分割し、下部カラ
ム内の細胞浮遊液を回収した。

回収された細胞浮遊液中の細胞数、血球の種類、リンパ
球サブクラス比等を多目的自動血球計数装置Ｓｙｓｍｅ
ｘ　ＮＥ６０００　　（東亜医用電子工業■製）、フロ
ーサイトメーターＣｙｔｏ　ＡＣＥ　１５０　（日本分
光■製）およびＢリンパ球と特異的に反応する抗Ｌｅｕ
　１２抗体（ＣＤ１９相当）を用いたフローサイトメト
リーにより測定し、赤血球および血小板の除去率と、白
血球分画の存在率を求めた。

その結果を下記衣１に示す。

なお、遠心処理前の被検液中の白血球分画の存在率につ
いても併せて表１に示す。

（実施例２） ガラスピーズに固定化される多糖類をアルギン酸に代え
た以外は実施例１と同様にして実験を行った。

その結果を下記衣１に示す。

（実施例３） 分離剤として、高比重ゲルに代え、ジアドリゾ酸ナトリ
ウムーフィコール漬戚（ファルマシア社製、商品名：フ
ィコールパック）を用いた以外は実施例１と同様にして
実験を行った。

その結果を下記衣１に示す。

表１に示すように、本発明の実施例１〜３では、いずれ
も、Ｂリンパ球に対し親和性を有する物質を固定化した
吸着剤と、比重の高い細胞を分離する分離剤とが、それ
ぞれＢリンパ球と、赤血球および顆粒球とを効果的に分
画化し、高精度にＴリンパ球を濃縮していることがわか
る。

（実施例４） 遠心分離管の上部カラムに充填される吸着剤として、担
体である疎水化キトサンビーズに直鎖アルキルを固定化
したものを用いた以外は実施例１と同様にして実験を行
った。

平均粒径０．１＋ｎｍのキトサンビーズ（富士紡＃ｌ■
製）を０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１Ｏ）を用いて調製さ
れた５％１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル
溶液に添加し、これを８０℃で３時間加熱した。

次に、室温下で約２０時間撹拌した後、蒸留水で活性化
されたキトサンを洗浄し、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）を用いて調製された０、１Ｍテトラデシルアミン溶
液中にこの反応物を添加し、６０℃で２０時間振盪、撹
拌した。

蒸留水で過剰のＤＭＦを洗浄後、ジメチルスルホキシド
およびｐＨ７，４リン酸緩衝液を用い、１２１℃で２０
分間オートクレーブ処理し、Ｔリンパ球を選択的に捕捉
しうる吸着剤である直鎖アルキル固定化ビーズを得た。

なお、フローサイトメトリーにおいては、前記抗Ｌｅｕ
　１２抗体に加え、Ｔリンパ球と特異的に反応する抗Ｌ
ｅｕ　４抗体（ＣＤ３相当）を用いて評価を行った。

その結果を下記表１に示す。

なお、遠心処理前の被検液中の白血球分画の存在率につ
いても併せて表１に示す。

表１に示すように、本発明例４では、Ｔリンパ球に対し
親和性を有する物質を固定化した吸着剤と、比重の高い
細胞を分離する分離剤とが、それぞれＴリンパ球と、赤
血球および顆粒球とを効果的に分画化し、高精度にＢリ
ンパ球を濃縮していることがわかる。

（実施例５） 遠心分離管の上部カラムに充填される吸着剤を以下に示
すリン脂質固定化アクリルビーズに代えた以外は実施例
４と同様にして実験を行った。

平均粒径０．１５ｍｍのオキシランアクリルビーズ（フ
ァルマシア社製、商品名：オイバーギットＣ）をジメチ
ルホルムアミドを用いて調製されたＯ、ＬＭテトラデシ
ルアミン溶ン夜に添加し、６０℃で２０時間振盪、撹拌
した。

蒸留水で過剰のＤＭＦを洗浄後、ジメチルスルホキシド
およびｐｉ（７，４リン酸緩衝液を用い、１２１℃で２
０分間オートクレーブ処理し、このビーズをクロロホル
ムを用いて２５ｍｇ／ｉｔに調製されたジパルミトイル
ホスファチジルグリセロール溶液に添加し、室温下で約
１時間撹拌した。

この後、過剰の脂質溶液を除き、減圧乾燥し、約１００
倍量の蒸留水で洗浄後、生理食塩水中に保存してＴリン
パ球を選択的に捕捉しうる吸着剤であるリン脂質固定化
ビーズを得た。

なお、フロサイトメトリーにおいて、抗Ｌｅｕ２ａ抗体
（Ｃ０ｇ相当）および抗Ｌｅｕ　３ａ抗体（ＣＤ４相当
）を用いた評価を追加した。

その結果を下記表２に示す。

なお、遠心処理前の被検液中の白血球分画の存在率につ
いても併せて表２に示す。

（実施例６） 固定化するリン脂質をジパルミトイルホスファチジルコ
リンに代えた以外は実施例５と同様にして実験を行った
。

その結果を下記表２に示す。

（実施例７） 固定化するリン脂質をホスファチジルイノシトールに代
えた以外は実施例５と同様にして実験を行った。

その結果を下記表２に示す。

（実施例８） 固定化する脂質を糖脂質であるガングリオシドに代えた
以外は実施例５と同様にして実験を行った。

その結果を下記表２に示す。

表２に示すように、Ｔリンパ球に対し高い親和性を有す
る脂質を固定化した吸着剤と、比重の高い細胞を分離す
る分離剤とが、それぞれＴリンパ球の主要なサブセット
であるヘルパー／インデューサーＴリンパ球およびサプ
レッサー／サイトドキシツク下リンパ球と、赤血球およ
び顆粒球とを効果的に分画化し、極めて高精度にＮＫ系
リンパ球を濃縮していることがわかる。

なお、特定のリンパ球等に対し親和性を有する物質とし
て、ヘスベリジン（配糖体）、ルチン（配糖体）、サイ
モシンａｌの２３〜２８アミノ酸残基（ペプチド）、サ
イモボエチンエの３２〜３６アミノ酸残基（ペプチド）
、ペプチドＴ、胸腺血清因子の９アミノ酸残基（ペプチ
ド）、スペーサーとしてトリエチレンテトラミンとブタ
ンジオールを介在したメチレンの繰り返しが１２である
アルキル鎖をそれぞれ固定化した吸着剤や、ガラスピー
ズ、ヒドロキシアパタイト粉末、ナイロン繊維、テトロ
ン繊維による吸着剤を用いて、前記各実施例と同様の実
験を行ったところ、やはり同様の結果が得られた。

また、前記各吸着剤のうちからＢリンパ球を選択的に吸
着する吸着剤とＴリンパ球を選択的に吸着する吸着剤と
を適宜選定し、これら２種の吸着剤を第２図に示す構成
の遠心分離管に区画充填した遠心分離管、およびこれら
２種の吸着剤を第１図に示す構成の遠心分離管に混合充
填した遠心分離管を用いて、それぞれ同様の実験を行っ
たところ、いずれも、実施例５〜８に比べ、ＮＫ系リン
パ球の収率（白血球分画の存在率）がより向上した。

〈発明の効果〉 以上述べたように、本発明の遠心分離管およびこれを用
いた細胞の分離方法によれば、細胞の機能を損なうこと
なく目的とするリンパ球のサブクラスまたはそのサブセ
ットを高収率、高純度で分離、濃縮することができ、し
かも、従来側われていた多段階の分離操作を１回の遠心
操作によるワンパッチ処理で行うことができるので、分
離操作が極めて簡便かつ迅速となり、再現性にも優れ、
誤操作も防止される。

特に、分割可能な遠心分離管を用いる場合には、目的細
胞の回収をも簡便に行うことができる。

従って、例えば、免疫機能に関連したリンパ球の機能解
析等の基礎研究、各種臨床検査、免疫疾患の診断や治療
、特に、養子免疫療法（特定の細胞を体外で活性化した
後、体内に戻す療法）に応用した場合、より信頼性の高
い結果、より効果的な治療、あるいはより効率的な処理
操作が期待できるものとなる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれ、本発明の遠心分離管
の構成例を示す縦断面図である。 符号の説明 １．１゛・・・遠心分離管 ２・・・容器本体 ２ａ・・・上部カラム ２ｂ・・・下部カラム ２１・・・被検液注入部 ２２・・・吸着剤保持部 ２３・・・縮径部 ２４・・・細胞浮遊液貯溜部 ２５・・・分離剤充填部 ３・・・シールリング ４・・・開口 ５・・・栓体 ６・・・フィルター ７．７ａ、７ｂ・・・吸着剤 ８．８１・・・フィルター部材 ９・・・分離剤 ９０・・・界面 ＦＩＧ、１ 出　　願　　人 代　　理　　人 同 テルモ株式会社

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）遠心操作可能なチューブ状の容器本体内に、特定
   のリンパ球サブクラスまたはその特定のサブセットを選
   択的に捕捉しうる少なくとも１種の吸着剤と、単核球の
   比重より高い比重の分離剤とを充填してなる遠心分離管
   。
2. （２）前記容器本体は、前記吸着剤を保持する吸着剤保
   持部と、回収する細胞を含む細胞浮遊液を貯溜する細胞
   浮遊液貯溜部と、前記分離剤を充填する分離剤充填部と
   を有する請求項１に記載の遠心分離管。
3. （３）前記容器本体は、密栓可能な上部開口を有し、該
   上部開口から底部へ向って、前記吸着剤保持部、前記細
   胞浮遊液貯溜部および前記分離剤充填部がこの順に形成
   されている請求項２に記載の遠心分離管。
4. （４）前記上部開口に、菌不透過性を有する通気性フィ
   ルターを備える栓体を装着した請求項３に記載の遠心分
   離管。
5. （５）前記容器本体は、複数の部材に分割可能なもので
   ある請求項１〜４のいずれかに記載の遠心分離管。
6. （６）前記容器本体は、前記吸着剤保持部と前記分離剤
   充填部とを分割することが可能なものである請求項３ま
   たは４に記載の遠心分離管。
7. （７）前記吸着剤は、細胞は通過するが、吸着剤は通過
   できない網目または細孔を有するフィルター部材により
   保持されている請求項１〜６のいずれかに記載の遠心分
   離管。
8. （８）前記吸着剤は、特定のリンパ球サブクラスまたは
   その特定のサブセットに対し親和性を有する物質を担体
   に固定化したものである請求項１〜７のいずれかに記載
   の遠心分離管。
9. （９）前記物質は、Ｂリンパ球またはその特定のサブセ
   ットに対し親和性を有する糖質である請求項８に記載の
   遠心分離管。
10. （１０）前記物質は、Ｔリンパ球またはその特定のサブ
    セットに対し親和性を有する脂質である請求項８に記載
    の遠心分離管。
11. （１１）前記担体は、粒径が０．０１〜１ｍｍの粒状物
    である請求項８〜１０のいずれかに記載の遠心分離管。
12. （１２）前記吸着剤保持部に、２種以上の吸着剤を混合
    して保持する請求項２〜１１のいずれかに記載の遠心分
    離管。
13. （１３）前記吸着剤保持部に、２種以上の吸着剤を区画
    して保持する請求項２〜１１のいずれかに記載の遠心分
    離管。
14. （１４）前記分離剤の比重が１．０７７付近である請求
    項１〜１３のいずれかに記載の遠心分離管。
15. （１５）前記分離剤は、高分子ゲルに比重調整剤を添加
    したものである請求項１〜１４のいずれかに記載の遠心
    分離管。
16. （１６）前記比重調整剤は、無機微粉末である請求項１
    ５に記載の遠心分離管。
17. （１７）遠心分離管の内部に滅菌処理がなされている請
    求項１〜１６のいずれかに記載の遠心分離管。
18. （１８）請求項１〜１７のいずれかに記載の遠心分離管
    を用いて被検液中に存在する細胞の分離を行う方法であ
    って、 前記容器本体内に被検液を注入し、次いで、遠心操作を
    施して、被検液中の単核球より比重の高い細胞を前記分
    離剤の下層に移行させるとともに、被検液を前記吸着剤
    と接触させて被検液中の特定のリンパ球サブクラスまた
    はその特定のサブセットを捕捉し、前記分離剤の下層に
    移行せずかつ前記吸着剤で捕捉されなかった細胞を回収
    することを特徴とする細胞の分離方法。
19. （１９）請求項５〜１７のいずれかに記載の遠心分離管
    を用いて被検液中に存在する細胞の分離を行う方法であ
    って、 前記容器本体内に被検液を注入し、次いで、遠心操作を
    施して、被検液中の単核球より比重の高い細胞を前記分
    離剤の下層に移行させるとともに、被検液を前記吸着剤
    と接触させて被検液中の特定のリンパ球サブクラスまた
    はその特定のサブセットを捕捉し、その後、前記容器本
    体を分割して前記分離剤の下層に移行せずかつ前記吸着
    剤で捕捉されなかった細胞を回収することを特徴とする
    細胞の分離方法。
20. （２０）前記被検液は、末梢血である請求項１８または
    １９に記載の細胞の分離方法。