CN111468204A - 一种可控组分的富血小板血浆制备管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可控组分的富血小板血浆制备管，包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，依次包括分离胶层和抗凝剂层，所述分离胶层的上方空间用于容置样品血液；所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，其比重为1.04～1.09；所述基体树脂为由二元羧酸和二元醇反应制得共聚酯，其比重为1.01～1.08。本发明可以通过改变PRP分离胶的比重，制备不同成分的PRP，从而满足不同的临床需要；同时本发明所述的PRP制备管可以分离得到中性粒细胞和红细胞较少的PRP。

Description

一种可控组分的富血小板血浆制备管及其制备方法
技术领域
本发明涉及血液取样、分离技术领域，尤其涉及一种可控组分的富血小板血浆制备管及其制备方法。
背景技术
PRP的英文全称是platelet rich plasma，其中文意思是富血小板血浆，PRP的经典定义是在相同体积的血浆和全血中，血浆中血小板的数量要多于全血中血小板的数量。在PRP中的血小板富含生长因子和细胞因子，如血小板源性生长因子-AB(PDGF-AB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)等，一旦血小板被激活，这些生长因子和细胞因子便从血小板的α质粒中释放出来，生长因子和细胞因子促进细胞的分化、增殖以及血管的再生，从而在伤口修复中起了相当重要的作用，血小板还会分泌抗菌多肽，从而在伤口的修复过程中有抗感染作用。自从PRP在1980年代末作为一种治疗手段治疗慢性下肢溃疡，PRP在医学领域的应用得到了长足的发展，这些医学领域包括：皮肤医学、眼科学、牙科学、美容医学、神经外科、泌尿外科、心胸外科和运动外科等。
目前市场上有许多制备PRP的套装，大多数产品是基于二步离心法制备PRP，其基本原理如下：使用预装有抗凝剂的医疗器械从病人抽取全血，在采集血液一个小时内进行第一次离心，离心后抗凝全血便分成三层，从上而下分别为：贫血小板血浆层(PPP)、白膜层(BC)和红细胞层(RBCs)，白膜层是富含白细胞和血小板。根据不同的要求第二步离心可以分为两种情况：为了得到纯度较高的PRP，PPP和上层的BC层转移到另一支管内，再在较高的离心力下离心后，丢弃大部分PPP后悬浮，最终产品含有血小板和少量的白细胞，但是这种方法血小板的回收率较低；为了得到血小板较多的PRP，PPP和整个BC层和少量的RBCs转移到另一支管内，在较高的离心力下离心，丢弃大部分PPP后悬浮，最终产品含有血小板和大量的白细胞以及少量的红细胞，这种方式血小板回收率较高，具体如图1所示。
在上述二步离心法中，所述转移的过程中是利用注射器或者移液管来吸取所需要的部分，并且吸取所需的部分完全是靠操作者的目测所决定的，所以在制备的最终产品就会随机得到纯度较高的PRP或者血小板较多的PRP。现在市场上有许多种通过二步离心法制备PRP的套装，不同套装之间要求的抽血量不一样，每一步离心的时间和离心力大小也有差别。即使用一种套装，在相同的条件下，对一个病人制备几次PRP，其PRP中血小板、白细胞和红细胞的浓度差别都很大。这就可以解释为什么在临床使用一些PRP产品后，会得到有冲突性的临床结果。
公认好的PRP是中性粒细胞和红细胞少的PRP。中性粒细胞会释放大量的高活性的抗菌物质和金属蛋白酶以及活性氧，如果这些因子不受控制的释放，将会对组织造成严重的损伤，以及延迟修复速率和增加患者留下伤疤的机会。细胞的新陈代谢会产生含氧的新陈代谢产物，这些含氧的化合物如过氧化合物(O2 -)和过氧化氢(H2O2)，这些含氧的化合物对细胞并不会造成什么影响，有文献报道软骨中的软骨细胞用过氧化氢处理后，并没有增加细胞的透渗性和细胞的死亡率，而红细胞中的血红蛋白含有亚铁血红素，超氧化合物或者过氧化氢可以被亚铁血红素中Fe2+还原成羟基自由基(.OH)，羟基自由基可以攻击或者破坏细胞膜，从而造成细胞死亡。但是市场上很少有可以得到中性粒细胞和红细胞少的PRP的分离管。
发明内容
为了解决上述现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种可控组分的富血小板血浆制备管。
本发明所采用的技术方案如下：
一种可控组分的富血小板血浆(PRP)制备管，包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，依次包括分离胶层和抗凝剂层，所述分离胶层的上方空间用于容置样品血液；所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，其比重为1.04～1.09；所述基体树脂为由二元羧酸和二元醇反应制得共聚酯，其比重为1.01～1.08。
本发明中二元羧酸物质的量在理论上要与二元醇物质的量相等，但是在实际中二元醇的要过量一点，过量的二元醇可以作为反应介质并减少反应物的粘度，当酯化反应完成后过量的二元醇可以通过蒸馏的方式去除掉；一般二元醇过量不超过20％(质量分数)。
进一步地，所述二元羧酸为短链的饱和脂肪族二元羧酸，其碳原子数为4～12。
更进一步地，所述二元羧酸的碳原子数为6～10，所述二元羧酸为戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸和十二烷二酸中的至少一种。
进一步地，所述二元醇是支链脂肪族饱和二元醇或与直链脂肪族饱和二元醇的混合醇，其碳原子数为3～8；所述支链二元醇占总醇质量的50％以上。
更进一步地，所述支链脂肪族饱和二元醇占总醇质量的70％以上；所述支链脂肪族饱和二元醇为2,2-二甲基-1,3-丙二醇、2-甲基-1,3-丙二醇、3-甲基-1,5-戊二醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二酸、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇、1,3-戊二醇或1,4-戊二醇；所述直链脂肪族饱和二元醇为乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇或1,6-己二醇。
进一步地，所述比重调节剂是粒径小于50微米的纳米二氧化硅，所述有机凝胶剂是分子量为500～1000的聚醚。所述聚醚优选为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
在本发明的聚酯中加入纳米二氧化硅，可以使聚酯的比重和粘度增加，主要是因为纳米二氧化硅的比重大约为2.2，要远大于聚酯的比重，把纳米二氧化硅加入到聚酯中，聚酯的比重会增加；同时不论是亲水还是疏水的纳米二氧化硅，其表面都有羟基，羟基可以和聚酯中的酯基形成氢键，从而使聚酯的粘度增加。本发明所述纳米二氧化硅的粒径小于50微米，最优选的粒径范围是5～40微米。
进一步地，所述基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的质量比为：100:1～10:0.01～2。
基于100份聚酯，纳米二氧化硅量的范围是1～10份，最优选是1～5份，当纳米二氧化硅的量低于1份时，不能使PRP胶有足够结构粘度性能，因此得到的分离胶就容易流动；相反如果纳米二氧化硅的量大于10份时，分离胶的比重会过大，并且在离心过程中分离胶的翻转变的困难。
基于100份聚酯，有机凝胶剂的量为0.01～2份，最优选是0.05～1.8份，当有机凝胶剂的量低于0.01份时，就很难使分离胶有足够的触变性能，这样分离胶胶就很容易流动；相反当有机凝胶剂的量大于2份时，分离胶胶的触变性过大，那么在离心过程中分离胶的可翻转性能下降。
进一步地，所述抗凝剂为0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液或柠檬酸葡萄糖溶液。
Ca2+作为一种凝血因子，在其缺失的情况下，凝血酶原无法被激活，导致血液不能凝固；而柠檬酸根离子可与血液中的Ca2+相络合，形成不易离解的可溶性络合物，而使血液中Ca2+浓度降低，从而达到抗凝的效果。
本发明还包括所述可控组分的富血小板血浆制备管的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备共聚酯：按质量比将二元羧酸和二元醇加入到烧瓶中，然后将总反应物质量的0.01％磷酸加入到烧瓶中，使反应温度上升至220℃，并且保持蒸汽温度在100℃～120℃之间；当反应4小时后生成水的速率变低，并且蒸汽温度下降100℃以下时，向烧瓶中加入总反应物质量0.01％～0.5％的酯交换催化剂，同时使反应在真空条件下进行，继续反应6个小时后得到共聚酯。
本步骤中的烧瓶装有搅拌棒、温度计和分馏柱，分馏柱配有冷凝管和温度计。在常温或者真空状态下，冷凝管可使反应生成的水或多余的二醇通过蒸馏的方式除掉。
在此步骤中通过使用酯化反应的催化剂，可以使酯化反应的速率加快。但催化剂不必要在整个酯化反应中存在，在酯化反应的最后阶段加入某些催化剂可以使共聚酯产物有较好的颜色。合适的酯化反就的催化剂有：磷酯、硫酸、甲苯磺酸、甲磺酸、草酸亚锡、二乙酸二丁基锡、钛酸四丁酯、醋酸锌、碳酸钠等等，反应结束时通过过滤或者其它的方式去除催化剂即可。
S2.合成分离胶：按质量比称取和混匀基体树脂、纳米二氧化硅和聚醚，于真空条件下分散调和1～2h得到分离胶；
S3.制备PRP管：向一定尺寸的玻璃管或塑料管中加入2～12g的分离胶，再加入1～3.25ml的抗凝剂，置于水平离心机后中以1500g离心力下离心5min；然后抽真空压塞后便得到PRP管；
在上述制备过程中，所用试剂、管体和管塞均经过灭菌处理。
本发明所述PRP制备管制备PRP的步骤流程如图3所示，把抽好全血的PRP制备管上下缓慢颠倒8-10次，使全血和抗凝剂完全混合后，置于水平离心机中使用一定的离心条件离心，离心完成后，使用注射器抽取一定体积的PPP(贫血小板血浆)，然后颠倒混匀剩余的血浆，即得到一定体积的PRP。
与现有技术比，本发明的优点在于：
1、本发明可以通过改变PRP分离胶的比重，制备不同成分的PRP，从而满足不同的临床需要。
2、本发明所述的PRP制备管可以分离得到中性粒细胞和红细胞少的PRP。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为现有技术通过二步离心法制备PRP的流程示意图。
图2为本发明所述PRP制备管的结构示意图。
图3为采用本发明所述PRP制备管制备PRP的流程示意图。
图中：10、管塞；20、管体；30、抗凝剂层；40、分离胶层。
具体实施方式
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1
请参阅图2，一种可控组分的富血小板血浆(PRP)制备管，包括管塞10和管体20，所述管体20内部从底往上，依次包括抗凝剂层30和分离胶层40，所述分离胶层40的上方空间用于容置样品血液；所述抗凝剂层中的抗凝剂为0.10mol/L的柠檬酸钠溶液；所述分离胶层40中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂纳米二氧化硅和有机凝胶剂聚氧乙烯聚氧丙烯醚制成，其比重为1.058；所述基体树脂为由二元羧酸和二元醇反应制得共聚酯，其比重为1.042。
所述可控组分的富血小板血浆制备管的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备共聚酯：将202g癸二酸(1.0mol)、93.6g新戊二醇(0.9mol)、27g 1,3-丁二醇(理论上应为0.1mol，本实施例实际为0.3mol)放入到三口烧瓶中，三口烧瓶装有搅拌棒、温度计、分馏柱，分馏柱是配有冷凝管、温度计。在常温或者真空状态下，使用冷凝管可反应生成的水份或者多余的二醇可以通过蒸馏的方式除掉。
在开始反应时，将总反应物质量的0.01％磷酸加入到烧瓶中，使反应温度上升至220℃，并且保持蒸汽温度在100℃～120℃之间；当反应4小时后生成水的速率变低，并且蒸汽温度下降100℃以下时，向烧瓶中加入总反应物质量0.05％的催化剂二乙酸二丁基锡，并且使用真空泵抽真空，使反应在真空条件下进行，继续反应6个小时，反应结束。得到共聚酯的比重为1.042。
S2.合成分离胶：按质量比称取和混匀基体树脂、纳米二氧化硅和聚氧乙烯聚氧丙烯醚后，投入行星分散机中，于真空条件下分散调和1-2h得到分离胶；
S3.制备PRP管：向Φ16*125玻璃管中加入2g的分离胶，再加入1ml的0.1M抗凝剂柠檬酸钠溶液，置于水平离心机后以1500g离心力下离心5min；然后抽真空压塞后便得到PRP管，真空设定量为抽血8.5ml；
在以上制备过程中，所用试剂、管体和管塞均经过灭菌处理。
本实施例所述PRP制备管制备PRP的步骤为：把抽好全血的PRP制备管上下缓慢颠倒8-10次，使全血和抗凝剂完全混合后，置于水平离心机中以1500g的条件离心5min，离心完成后，使用注射器抽取一定体积的PPP(贫血小板血浆)，然后颠倒混匀剩余的血浆，即得到2.5ml的PRP。
实施例2
本实施例所述PRP制备管与实施例1类似，区别在于制备管的成分、制备管的制备方法、制备管的尺寸、分离胶的用量、抽取全血体积等。
本实施例中共聚酯的制备是将202g癸二酸(1.0mol)、93.6g新戊二醇(0.9mol)、22.8g1,2-丙二醇(0.3mol)加入到烧瓶中，其它的反应条件和例1一样，得到的共聚酯的比重为1.050。
实施例3
本实施例所述PRP制备管与实施例1类似，区别在于制备管的成分、制备管的制备方法、制备管的尺寸、分离胶的用量、抽取全血体积等。
本实施例中共聚酯的制备是将161.6克癸二酸(0.8mol)、29.2克己二酸(0.2mol)、93.6g新戊二醇(0.9mol)、22.8g1,2-丙二醇(0.3mol)加入到烧瓶中加入到烧瓶中，其它反应条件和例1一样，得到共聚酯的比重为1.058。
实施例1-3所述PRP制备管的制备及制备PRP的相关参数，分别如下表所示：
Figure BDA0002529051810000061
Figure BDA0002529051810000071
效果测试：
实施例1-3分别制备得到PRP后，使用全自动血细胞计数仪器，分析全血和PRP中血小板、中性粒细胞和红细胞的浓度，以及计算血小板、中性粒细胞和红细胞的回收率。
回收率计算公式为＝(PRP体积*PRP中(血小板、中性粒细胞、红细胞)浓度)/(全血体积*全血中(血小板、中性粒细胞、红细胞)浓度)
结果如下：
Figure BDA0002529051810000072
从结果可知，随着PRP分离胶比重增加，血小板的回收率提高，同时红细胞和中性粒细胞的残留率增加。Regenlab的PRP管制备的PRP，其中性粒细胞去除率96％以上，红细胞的去除率在99.7％以上，这样的PRP是中性粒细胞和红细胞少的PRP。从数据上可知：实例1制备的PRP满足上述条件，此类PRP可以用于关节内注射治疗骨关节炎；实例2制备的PRP在上述条件的上限，此类PRP可以用于溃疡创面的修复；实例3制备的PRP其中性粒细胞和红细胞的残留率明显高于上述条件，并且其制备的PRP从外观上看明显的红，主要是因为红细胞残留量过高所致，此类PRP可能会引起病人的疼痛以及使伤口修复效果不佳，在临床不建议使用。本发明可以通过改变PRP分离胶的比重，制备不同成分的PRP，从而满足不同的临床需要。
实施例4
本实施例参照实施例1所述步骤制备得到的PRP制备管(将分离胶用量改为2.5g，其余与实施例1所述步骤完全相同)进行试验，通过制备不同体积的PRP，从而得到不同血小板、中性粒细胞、红细胞的浓度结果，验证血小板、中性粒细胞和红细胞的回收率是否会发生变化。具体实例如下表所示：
Figure BDA0002529051810000081
结果如下所示：
Figure BDA0002529051810000082
从结果可知，随着PRP体积的增加，血小板、中性粒细胞和红细胞的回收率不变，但是血小板、中性粒细胞和红细胞的浓度降低。
本发明可以通过改变PRP分离胶的比重，制备不同成分的PRP，从而满足不同的临床需要。本发明所述的PRP制备管可以分离得到的中性粒细胞和红细胞少的PRP。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (10)

1.一种可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，依次包括分离胶层和抗凝剂层，所述分离胶层的上方空间用于容置样品血液；所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，其比重为1.04～1.09；所述基体树脂为由二元羧酸和二元醇反应制得共聚酯，其比重为1.01～1.08。
2.根据权利要求1所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述二元羧酸为短链的饱和脂肪族二元羧酸，其碳原子数为4～12。
3.根据权利要求2所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述二元羧酸的碳原子数为6～10，所述二元羧酸为戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸和十二烷二酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述二元醇是支链脂肪族饱和二元醇或与直链脂肪族饱和二元醇的混合醇，其碳原子数为3～8；所述支链二元醇占总醇质量的50％以上。
5.根据权利要求4所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述支链脂肪族饱和二元醇占总醇质量的70％以上；所述支链脂肪族饱和二元醇为2,2-二甲基-1,3-丙二醇、2-甲基-1,3-丙二醇、3-甲基-1,5-戊二醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二酸、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇、1,3-戊二醇或1,4-戊二醇；所述直链脂肪族饱和二元醇为乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇或1,6-己二醇。
6.根据权利要求1所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述比重调节剂为粒径小于50微米的纳米二氧化硅，所述有机凝胶剂是分子量为500～1000的聚醚。
7.根据权利要求1所述的可控组分的富血小板血浆制备管浆，其特征在于，所述基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的质量比为：100:1～10:0.01～2。
8.根据权利要求1所述的可控组分的富血小板血浆制备管，其特征在于，所述抗凝剂层中的抗凝剂为0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液或柠檬酸葡萄糖溶液。
9.权利要求1-8所述可控组分的富血小板血浆制备管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备共聚酯：按质量比将二元羧酸和二元醇加入到烧瓶中，然后将总反应物质量0.01％的磷酸加入到烧瓶中，使反应温度上升至220℃，并且保持蒸汽温度在100℃～120℃之间；当反应4小时后生成水的速率变低，并且蒸汽温度下降100℃以下时，向烧瓶中加入总反应物质量0.01％～0.5％的酯交换催化剂，同时使反应在真空条件下进行，继续反应6个小时后得到共聚酯；
S2.合成分离胶：按质量比称取和混匀基体树脂、纳米二氧化硅和聚醚，于真空条件下分散调和1～2h得到分离胶；
S3.制备PRP管：向一定尺寸的玻璃管或塑料管中加入2～12g的分离胶，再加入1～3.25ml的抗凝剂，置于水平离心机后中以1500g离心力下离心5min；然后抽真空压塞后便得到PRP管；
在本制备过程中，所用试剂、管体和管塞均经过灭菌处理。
10.一种胶体，其特征在于：通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，其比重为1.04～1.09；所述基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的质量比为：100:1～10:0.01～2；所述基体树脂为由二元羧酸和二元醇反应制得共聚酯，其比重为1.01～1.08；所述二元羧酸为短链的饱和脂肪族二元羧酸，其碳原子数为4～12；所述二元醇是支链脂肪族饱和二元醇或与直链脂肪族饱和二元醇的混合醇，其碳原子数为3～8，且所述支链二元醇占总醇质量的50％以上。
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