CN116715801B - 一种低细胞毒性的prp分离胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低细胞毒性的PRP分离胶及其制备方法与应用。本发明是以甲基丙烯酸羟乙酯、1‑十二烯和端乙烯基硅油为单体制备得到PRP分离胶。经分析，该PRP分离胶细胞毒性为1级，具备良好的生物学相容性。且本发明制备得到的PRP分离胶可以有效回收全血中的血小板，整体血小板的回收率高达93％以上，可制备得到高质量的富血小板血浆。
Description
技术领域
本发明涉及血液取样分离领域，特别涉及一种低细胞毒性的PRP分离胶及其制备方法与应用。
背景技术
富血小板血浆(简称PRP)，是源于自体血液，成分包含高浓度血小板、白细胞及纤维蛋白。一般而言PRP中的血小板浓度可为正常血液中血小板浓度的3-17倍。由于PRP的应用范围很广，提取高质量、高浓度的PRP至关重要。PRP的传统分离方法是采用两次离心方法，其原理是基于血液中各成分的比重不同，离心时沉降速度不同，第一次离心分离含有血小板的血浆与红细胞，第二次离心将血小板和贫血小板血浆分离，即可得到富含血小板血浆PRP。
但是该分离方法却存在以下缺陷：离心分层后无法形成有效的隔离，由于血小板的比重接近血细胞，故大部分的血小板将停在血浆与血细胞的交界处，吸取过程中容易吸入血细胞，且容易重新混匀导致无法收集PRP；开放式的制备体系容易受到外界污染；多个容器间的转移，增加了血小板被污染和激活的机率；操作人员的个人习惯及拿捏尺度极大地影响了PRP中血小板的浓度，使制备的PRP血小板回收率较低。故制备得到的富血小板血浆富集系数低，血小板回收不全，回收率偏低，操作繁琐，容易出现人为的误差甚至失误导致获得较少
量的PRP甚至是失效的PRP。
为此，相关研发人员在上述分离过程中加入了PRP分离胶以改善上述缺陷，但是目前现有技术中公开的PRP分离胶的富集效果相对较差，并不能得到高质量的PRP，同时，由于分离胶的引入富血小板血浆不可避免地会有残余的分离胶。而现有技术中采用的分离胶成分复杂，且细胞毒性未知，会对富血小板血浆的后期临床施用带来诸多不利因素。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种低细胞毒性的PRP分离胶及其制备方法。
本发明的目的之一在于提供一种低细胞毒性的PRP分离胶，其特征在于，所述PRP分离胶是以甲基丙烯酸羟乙酯、1-十二烯和端乙烯基硅油为单体制备得到。
优选地，所述甲基丙烯酸羟乙酯密度为1.073g/ml，常压沸点189℃。
优选地，所述1-十二烯密度为0.76g/ml，常压沸点213℃。
优选地，所述端乙烯基硅油的粘度为200-1000mpa.s；
进一步优选地，甲基丙烯酸羟乙酯和1-十二烯单体为主合成的聚合物比重为1.02-1.04g/ml。
进一步优选地，在聚合物中引入端乙烯基硅油，使聚合物中增加了硅原子，提高了聚合物与纳米二氧化硅之间的相容性。
本发明的另一目的在于提供一种低细胞毒性的PRP分离胶的制备方法，其特征在于，所述包括如下步骤：
1)将50g 1-十二烯，225g甲基丙烯酸羟乙酯，7.5g端乙烯基硅油加入含有300g溶剂的烧瓶中，并迅速升温至160℃，使其充分混匀；
2)在滴液漏斗中加入225g甲基丙烯酸羟乙酯和13g过氧化苯甲酸叔丁酯，混合均匀；
3)将步骤2)中滴液漏斗缓慢滴入步骤1)中的烧瓶中，滴加时间为4h；
4)滴加结束后，160℃保温1小时，然后迅速升温至220℃开始减压蒸馏，真空度维持在-0.097MPa以上，减压蒸馏时间为1小时，得到比重为1.036，树脂粘度为93pa.s的树脂；
5)将步骤4)的树脂降温至常温，在合成好的树脂中，加入纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
优选地，步骤1)中的溶剂为异构十二烷溶剂。
优选地，步骤5)中是在100g合成好的树脂中，加入2.5g纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
本发明的另一目的在于提供上述低细胞毒性的PRP分离胶在制备PRP分离试剂盒中的应用。
本发明的检测技术原理是基于：PRP为富血小板血浆的英文缩写，是指富含血小板的血浆，一般是通过采集患者血液，通过离心，使血液成分(红细胞、白细胞、血小板、血浆)分层，PRP分离胶是具有特定比重(介于红细胞与血小板之间)的触变性胶体，在离心剪切力作用下，粘度快速降低，变为可流动液体，因其特定比重，会自动切入到红细胞与血小板之间，离心停止，分离胶粘度快速上升，变为不流动状态，从而将红细胞与血小板隔离，以方便获取富含血小板的血浆。
本发明的设计要求是因血小板比重约为1.03g/ml，红细胞比重约为1.07g/ml，本分离胶比重设计为二者之间，即1.05g/ml。本分离胶以纳米气相二氧化硅做触变剂，经实验，获得适宜的触变性，二氧化硅的添加量约为2.5％，以此推算，上述三种单体共聚的聚合物的比重应为1.035g/ml，同时聚合物粘度约为100Pa.S左右，方能保证分离胶可以较好地反转。通过实验确定了三种单体的比例及工艺参数，得到比重和粘度满足要求的聚合物。
本发明同现有技术相比的优点：
1)本发明提供的低细胞毒性的PRP分离胶是以甲基丙烯酸羟乙酯、1-十二烯和端乙烯基硅油为单体制备得到。上述三个单体都具体良好的生物安全性，合成的聚合物也具备良好的生物安全性。以GB/T16886.5-2017标准进行细胞毒性对比测试，结果显示本发明的PRP分离胶细胞毒性为1级，远超过目前市场销售的同类产品。
2)甲基丙烯酸羟乙酯密度为1.073g/ml，1-十二烯密度为0.76g/ml，以这二个单体为主合成的聚合物比重为1.02-1.04g/ml，在聚合物中引入端乙烯基硅油，使聚合物中增加了硅原子，提高了聚合物与纳米二氧化硅之间的相容性。
3)本发明制备得到的PRP分离胶可以有效回收全血中的血小板，整体血小板的回收率高达93％以上，可制备得到高质量的富血小板血浆。且相比于实施例1而言，实施例2的PRP管中均没发现油滴而实施例1的PRP管中有油滴产生。由此可见，在所述单体中引入乙烯基硅油可以抑制油滴产生的技术效果，这也是选择该三个低细胞毒性单体构建PRP分离胶的主要原因之一。
附图说明
图1.实施例1制备的PRP分离胶的胶流变曲线；
图2.实施例2制备的PRP分离胶的胶流变曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种低细胞毒性的PRP分离胶，其是以甲基丙烯酸羟乙酯和1-十二烯为单体制备得到。其制备方法包括如下步骤：
1)将50g 1-十二烯，225g甲基丙烯酸羟乙酯加入含有300g异构十二烷溶剂的烧瓶中，并迅速升温至160℃，使其充分混匀；
2)在滴液漏斗中加入225g甲基丙烯酸羟乙酯和13g过氧化苯甲酸叔丁酯，混合均匀；
3)将步骤2)中滴液漏斗缓慢滴入步骤1)中的烧瓶中，滴加时间为4h；
4)滴加结束后，160℃保温1小时，然后迅速升温至220℃开始减压蒸馏，真空度维持在-0.097MPa以上，减压蒸馏时间为1小时，得到比重为1.035，树脂粘度为90pa.s的树脂；
5)将步骤4)的树脂降温至常温，在100g合成好的树脂中，加入2.5g纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
实施例2
一种低细胞毒性的PRP分离胶，其是以甲基丙烯酸羟乙酯、1-十二烯和端乙烯基硅油为单体制备得到。上述三个单体都具体良好的生物安全性，合成的聚合物也具备良好的生物安全性，甲基丙烯酸羟乙酯密度为1.073，1-十二烯密度为0.76，以这二个单体为主合成的聚合物比重为(1.02-1.04)，在聚合物中引入端乙烯基硅油，使聚合物中增加了硅原子，提高了聚合物与纳米二氧化硅之间的相容性。
上述低细胞毒性的PRP分离胶的制备方法，其包括如下步骤：
1)将50g 1-十二烯，225g甲基丙烯酸羟乙酯，7.5g端乙烯基硅油加入含有300g异构十二烷溶剂的烧瓶中，并迅速升温至160℃，使其充分混匀；
2)在滴液漏斗中加入225g甲基丙烯酸羟乙酯和13g过氧化苯甲酸叔丁酯，混合均匀；
3)将步骤2)中滴液漏斗缓慢滴入步骤1)中的烧瓶中，滴加时间为4h；
4)滴加结束后，160℃保温1小时，然后迅速升温至220℃开始减压蒸馏，真空度维持在-0.097MPa以上，减压蒸馏时间为1小时，得到比重为1.036，树脂粘度为93pa.s的树脂；
5)将步骤4)的树脂降温至常温，在100g合成好的树脂中，加入2.5g纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
对比例
以市面销售的两种PRP产品(国内和国外各一种)内的PRP分离胶作为对比例，其中国内产品是购自于武汉德晟生化科技有限公司，国外产品是购自于Regen Lab。
实施例3
对实施例1和2所获得的分离胶进行理化性能测试，结果显示：实施例1的PRP分离胶的比重为1.050g/ml，其中胶流变曲线如图1所示。实施例2的PRP分离胶的比重为1.051g/ml，其中胶流变曲线如图2所示。
以GB/T 16886.5-2017标准对上述实施例和对比例中的分离胶进行细胞毒性对比测试，结果显示本发明实施例1和2中的PRP分离胶细胞毒性为1级，国内产品分离胶细胞毒性为4级，国外产品分离胶细胞毒性为3级。相比于目前市面销售的PRP产品而言，本发明制备得到的PRP分离胶细胞毒性明显下降，具备良好的生物相容性。
使用该PRP分离胶做成PRP管，往每只Φ16*125(mm)玻璃管中加入3g调和的PRP分离胶后，再加入1ml 0.1mol/L的柠檬酸钠抗凝剂，最后压塞抽真空。
找四位志愿者抽血，抽血完成后，依次置于上述实施例和对比例中的PRP管内，上下颠倒PRP管8次，使抗凝剂与全血混合。然后使用离心机离心，离心条件为1500g*9min。最后抽取一定体积的PPP，上下颠倒PRP管，使分离胶上的白膜完全脱落，并悬浮在剩余的血浆中，得到PRP。实验结果如下表1-3所示：
表1.志愿者全血血常规检验
表2.经PRP分离胶处理后志愿者PRP血常规检验
表3.PRP分离胶回收率分析
由上表1-3的测试结果可知，本发明实施例制备得到的PRP分离胶可以有效回收全血中的血小板，整体血小板的回收率高达93％以上，可制备得到高质量的富血小板血浆。尤其是实施例2制备得到的PRP分离胶血小板的回收率高达94.34％，同时，发明人意外地发现，相比于实施例1而言，实施例2的PRP管中均没发现油滴，而实施例1的PRP管中有油滴产生。由此可见，在所述单体中引入乙烯基硅油可以抑制油滴产生的技术效果，这也是选择该三个低细胞毒性单体构建PRP分离胶的主要原因之一。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种低细胞毒性的PRP分离胶，其特征在于，所述PRP分离胶是以甲基丙烯酸羟乙酯、1-十二烯和端乙烯基硅油为单体制备得到；
其中，所述端乙烯基硅油的粘度为200-1000mpa.s；
甲基丙烯酸羟乙酯和1-十二烯单体为主合成的聚合物比重为1.02-1.04g/ml；
所述低细胞毒性的PRP分离胶的制备方法包括如下步骤：
1）将50g 1-十二烯，225g甲基丙烯酸羟乙酯，7.5g端乙烯基硅油加入含有300g溶剂的烧瓶中，并迅速升温至160℃，使其充分混匀；
2）在滴液漏斗中加入225g甲基丙烯酸羟乙酯和13g过氧化苯甲酸叔丁酯，混合均匀；
3）将步骤2）中滴液漏斗缓慢滴入步骤1）中的烧瓶中，滴加时间为4h；
4）滴加结束后，160℃保温1小时，然后迅速升温至220℃开始减压蒸馏，真空度维持在-0.097MPa以上，减压蒸馏时间为1小时，得到比重为1.036，树脂粘度为93pa.s的树脂；
5）将步骤4）的树脂降温至常温，在合成好的树脂中，加入纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶；
其中，步骤1）中的溶剂为异构十二烷溶剂。
2.如权利要求1所述的PRP分离胶，其特征在于，所述甲基丙烯酸羟乙酯密度为1.073g/ml，常压沸点189℃。
3. 如权利要求1所述的PRP分离胶，其特征在于，所述1-十二烯密度为0.76 g/ml，常压沸点213℃。
4.如权利要求1所述的PRP分离胶，其特征在于，在所述聚合物中引入端乙烯基硅油，使聚合物中增加了硅原子，提高了聚合物与纳米二氧化硅之间的相容性。
5.权利要求1-4任一项所述的低细胞毒性的PRP分离胶的制备方法，其特征在于，所述包括如下步骤：
1）将50g 1-十二烯，225g甲基丙烯酸羟乙酯，7.5g端乙烯基硅油加入含有300g溶剂的烧瓶中，并迅速升温至160℃，使其充分混匀；步骤1）中的溶剂为异构十二烷溶剂；
2）在滴液漏斗中加入225g甲基丙烯酸羟乙酯和13g过氧化苯甲酸叔丁酯，混合均匀；
3）将步骤2）中滴液漏斗缓慢滴入步骤1）中的烧瓶中，滴加时间为4h；
4）滴加结束后，160℃保温1小时，然后迅速升温至220℃开始减压蒸馏，真空度维持在-0.097MPa以上，减压蒸馏时间为1小时，得到比重为1.036，树脂粘度为93pa.s的树脂；
5）将步骤4）的树脂降温至常温，在合成好的树脂中，加入纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5）中是在100g合成好的树脂中，加入2.5g纳米二氧化硅，使用行星分散机，调合成PRP分离胶。
7.权利要求1-6任一项所述的低细胞毒性的PRP分离胶在制备PRP分离试剂盒中的应用。
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