CN108871916A - 一种超纯血小板的分离方法 - Google Patents

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肖剑萍
叶国栋
陈欣欣
陈茂立
许剑雄
韩大雄
郭奇伟
蔡逸民
杨燕燕
李顺杰
董康梅
朱莎莎
张丽芳
宋丹
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Abstract

本发明公开了超纯血小板的分离方法。步骤包括：采集全血样本，第一次离心去除细胞和其它凝聚物沉淀；双免疫磁珠去除白细胞和红细胞；第二次离心，收集血小板沉淀。采用此方法从小于等于10mL全血中获得的超纯血小板白细胞污染率低于0.0001％，远低于现有方法，适用于血小板RNA测序和实时荧光定量PCR等，可应用于重大疾病检测如肿瘤筛查和诊断。

Description

一种超纯血小板的分离方法
技术领域
本发明涉及医学和生物学领域，尤其涉及一种超纯血小板的分离方法。
背景技术
正常机体中血小板主要通过释放和聚集功能发挥促凝血以及促进伤口愈合的作用。而在 重大疾病如急慢性炎症或肿瘤的微环境中，可导致血小板特定的pre-mRNAs发生剪接，进 而影响血小板的基因表达谱。此外，血小板是血液中第二丰富的细胞类型，获取方便，分离 操作简单，可用作新的检测物。因此，对经过驯化的血小板如肿瘤驯化血小板(Tumor Conditioned Platelets)进行RNA测序，检测受检者是否罹患癌症，已成为一种新的液体活检 方法。
超纯血小板的分离是血小板RNA测序的关键，如何最大限度降低白细胞等其它血液细 胞的污染，获得超纯血小板，对血小板RNA测序至关重要。现有的血小板分离方法主要有 两大类，即机器单采法和手工分离法。一般认为，单采血小板在血小板含量、红细胞和白细 胞残留量等方面优于手工分离血小板。根据国家标准GB 18469-2012《全血及成分血质量要 求》，去白细胞单采血小板的质量控制要求为血小板含量≥2.5×1011个/袋，白细胞残留量 ≤2.5×106个/袋，其标准无法满足血小板RNA测序的要求。手工分离法多采用梯度离心法分 离血小板，但分离效果易受全血体积、离心设备、离心力和离心时间等条件影响，目前尚无 统一的离心标准，也未建立有效的质控方法。
中国专利申请201410508458.8公开了一种富集纯化血小板的方法，该方法提供一种血小 板富集纯化的手工制备方法，特别是在离心富集的基础上加入了去血浆和破红细胞的纯化方 法。该方法在操作过程中，不需要刻意避免抽取红细胞，主要利用红细胞裂解液去除红细胞， 能有效提高血小板富集纯度，减少红细胞污染，避免血浆的潜在不良反应。但该方法第一次 离心残留的白细胞，在接下来的多次离心中均未被进一步去除，得到的血小板纯度为99.84％， 白细胞含量为0.13％，仍无法满足血小板RNA测序的要求。
中国专利申请201710075710.4公开了一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法，将抗 凝全血样品进行第一次离心得到上层液，再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细 胞，随后对滤液进行第二次离心，保留沉淀。该方法能有效去除血小板中混有的白细胞，且 能有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。然而，该方法根据白 细胞和血小板大小的不同，利用固定孔径的滤膜截留白细胞，易受个体差异及白细胞大小不 一的影响，固定孔径无法适用于各种不同来源的全血样本，导致总体合格率偏低。此外，过 滤器会残留液体造成血小板的损失，为提高血小板的回收率，申请人尝试利用缓冲液洗涤过 滤器，但该方法会降低白细胞的截留量，甚至造成白细胞裂解，释放RNA酶和RNA，降解 或污染血小板RNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超纯血小板的分离方法，采用此方法从小于等于10mL全血 中获得的超纯血小板白细胞污染率低于0.0001％，远低于现有方法，适用于血小板RNA测 序和实时荧光定量PCR等，可应用于重大疾病检测如肿瘤筛查和诊断。
为实现上述目的，本发明提供一种超纯血小板的分离方法，其特征在于，步骤包括：采 集全血样本，第一次离心去除细胞和其它凝聚物沉淀；双免疫磁珠去除白细胞和红细胞；第 二次离心，收集血小板沉淀。
进一步，所述第一次离心的参数为60～800×g，5～30min。
进一步，所述第一次离心的参数为600×g，10min。
进一步，所述双免疫磁珠为CD45免疫磁珠和CD235a免疫磁珠。
进一步，所述第二次离心的参数为120～2800×g，5～40min。
进一步，所述第二次离心的参数为1000×g，20min。
进一步，所述全血样本的体积为小于等于10mL。
进一步，所述全血样本的体积为1-5mL。
进一步，所述全血样本的体积为1-2mL。
现有技术主要侧重于富血小板血浆分离装置的发明，或针对现有血小板分离机及其耗材 进行改良，目的是满足临床上对机采血小板输注的需求。相比手工分离血小板，机采血小板 虽纯度高、数量多、输注安全，但也面临单次采集量较高(125mL～300mL)，不适用液体 活检(一般采集全血<10mL)的问题。
少数现有技术公开了血小板的手工制备方法，却仍以满足临床上血小板输注的需求为 主，获得的血小板白细胞污染率虽有所降低，但仍无法满足血小板RNA测序的要求。过滤 法存在严重的液体残留问题，当全血低于2mL时，血小板的白细胞污染率和回收率往往难 以兼顾。此外，过滤器的固定孔径适用范围差，不同来源的全血样本难以取得一致的分离效 果，一旦质控发现白细胞数量过多，即使进行第二次过滤，也无法取得令人满意的效果。而 现有免疫磁珠法一般采用美天旎的免疫磁珠，该磁珠需配套使用美天旎的分选柱，操作繁琐、 成本高且血小板回收率低。
本发明的申请人针对10mL以下体系(尤其是1～2mL)反复摸索，创造性地发现，在第一次离心后，引入双免疫磁珠去除白细胞和红细胞的步骤，再进行第二次离心，能保证较低的白细胞污染率(低于0.0001％)和较高的回收率。本发明利用CD45免疫磁珠去除白细胞的同时，利用CD235a免疫磁珠去除红细胞，当红细胞数量较多时肉眼可见红色沉淀，可根据该现象判断是否需要进一步纯化血小板。本发明使用的免疫磁珠不会影响血小板的回收 率，可根据白细胞污染程度调整磁珠比例，进一步去除白细胞，最终大幅度提高合格率。
本发明能从少量全血中分离超纯血小板，适用于液体活检的需求，具有重要的临床意义 和应用价值。获得的超纯血小板白细胞污染率低于0.0001％，远低于现有方法，能有效避免 白细胞污染带来的背景噪音，适用于血小板RNA测序和实时荧光定量PCR等。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为 对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得 的常规产品。
以下实施例的CD45免疫磁珠可购自于Invitrogen(11153D)，CD235a免疫磁珠可购自 于Lifeint(A5005M)，但不限于这些商家。
对比例1：两次离心法分离血小板
采集全血样本：使用BD二钾EDTA采血管采集受试者2mL静脉血，采集后轻轻颠倒采血管数次，使抗凝剂与全血充分混匀，全血采集后应在96h内处理。
第一次离心：将采血管放置到离心机转子中，室温下60×g离心30min，使用移液器吸 取600μL上层富含血小板血浆，转移至新的1.5mL离心管，吸取过程尽可能轻缓，避免搅动中间白膜层，导致白细胞上浮，污染率增加。
第二次离心：将上述富含血小板血浆，室温下120×g离心40min，弃上清，收集血小板沉淀，使用100μL磷酸缓冲液(pH 7.2)重悬，获得血小板悬液。
血小板和白细胞的计数：取2μL上述富含血小板血浆，添加8μL磷酸缓冲液(pH7.2) 配制稀释1；取1μL上述血小板悬液，添加19μL磷酸缓冲液(pH 7.2)配制稀释液2。各取10μL稀释液1和2至XB-K-25血球计数板，在显微镜下观察，对血小板进行人工计数， 同时取20μL稀释液2，对白细胞进行计数，统计结果见表1。
血小板的质控：根据上述计数结果，按下式计算血小板的白细胞污染率和回收率，并制 定质控标准。
白细胞污染率＝白细胞个数/血小板个数×100％。
血小板回收率＝(血小板悬液的计数浓度×悬液的体积)/(富含血小板血浆的计数浓度×所 取血浆的体积)×100％；
重复三次，结果分别记为1-1，1-2，1-3。
操作步骤同上，所不同的是，采集受试者5mL静脉血，第一次离心吸取1500μL上层富含血小板血浆。重复三次，结果分别记为1-4，1-5，1-6。
结果见表1。
对比例2：两次离心结合过滤纯化法分离超纯血小板
采集全血样本：使用BD二钾EDTA采血管采集受试者2mL静脉血，采集后轻轻颠倒采血管数次，使抗凝剂与全血充分混匀，全血采集后应在96h内处理。
第一次离心：将采血管放置到离心机转子中，室温下60×g离心30min，使用移液器吸 取600μL上层富含血小板血浆，转移至新的1.5mL离心管，吸取过程尽可能轻缓，避免搅动中间白膜层，导致白细胞上浮，污染率增加。
去除白细胞：使用移液器将上述富含血小板血浆，转移至血小板过滤器的收集管内，利 用血小板过滤器去除富含血小板血浆中的白细胞，收集300μL左右的滤液获得进一步纯化 的富含血小板血浆。
第二次离心：取上述进一步纯化的富含血小板血浆，转移至新的1.5mL离心管，室温 下120×g离心40min，弃上清，收集血小板沉淀，使用100μL磷酸缓冲液(pH 7.2)重悬，获得血小板悬液。
白细胞污染率和血小板回收率的测定方法与实施例1一致。
重复三次，结果分别记为2-1，2-2，2-3。
操作步骤同上，所不同的是，采集受试者5mL静脉血，第一次离心吸取1500μL上层富含血小板血浆。重复三次，结果分别记为2-4，2-5，2-6。
结果见表1。
实施例1：两次离心结合磁珠纯化法分离超纯血小板
采集全血样本：使用BD二钾EDTA采血管采集受试者2mL静脉血，采集后轻轻颠倒采血管数次，使抗凝剂与全血充分混匀，全血采集后应在96h内处理。
第一次离心：将采血管放置到离心机转子中，室温下60×g离心30min，使用移液器吸 取600μL上层富含血小板血浆，转移至新的1.5mL离心管，吸取过程尽可能轻缓，避免搅动中间白膜层，导致白细胞上浮，污染率增加。
磁珠前处理：CD45免疫磁珠(Invitrogen,11153D)和CD235a免疫磁珠(Lifeint,A5005M) 使用前涡旋振荡确保充分混匀，分别吸取60μL转移至同一管新的1.5mL离心管，并添加1 mL磷酸缓冲液A(0.1％BSA,2mM EDTA,pH 7.4)进行洗涤，将离心管放置在DynaMagTM-2 磁力架上1min，捕获磁珠，取下离心管添加60μL磷酸缓冲液A重悬磁珠。
去除白细胞：在第一次离心获得的富含血小板血浆中添加60μL CD45和CD235a混合 免疫磁珠，抽吸混匀，使免疫磁珠与相应细胞充分结合，将离心管放置在磁力架上2min，捕获磁珠，去除富含血小板血浆中的白细胞和红细胞，上清为进一步纯化的富含血小板血浆。
第二次离心：取上述进一步纯化的富含血小板血浆，转移至新的1.5mL离心管，室温 下120×g离心40min，弃上清，收集血小板沉淀，使用100μL磷酸缓冲液(pH 7.2)重悬，获得血小板悬液。
第二次去除白细胞(可选)：当第二次离心获得的血小板沉淀可见红色沉淀时，说明红 细胞去除不彻底，极可能残留少量白细胞，添加10μL已处理的CD45免疫磁珠至上述血小 板悬液，进行第二次纯化，即可获得超纯血小板，方法与第一次去除白细胞一致。
白细胞污染率和血小板回收率的测定方法与实施例1一致。
重复三次，结果分别记为3-1，3-2，3-3。
操作步骤同上，所不同的是，采集受试者5mL静脉血，第一次离心吸取1500μL上层富含血小板血浆。重复三次，结果分别记为3-4，3-5，3-6。
结果见表1。
实施例2：
采集受试者1mL静脉血，操作步骤同实施例1，结果见表1。
实施例3：
采集受试者9mL静脉血，操作步骤同实施例1，结果见表1。
实施例4：
采集受试者10mL静脉血，操作步骤同实施例1，结果见表1。
实施例5：
操作步骤同实施例1，所不同的是，第一次离心条件为800×g离心5min，结果见表1。
实施例6：
操作步骤同实施例1，所不同的是，第二次离心条件为2800×g离心5min，结果见表1。
实施例7：
操作步骤同实施例1，所不同的是，第一次离心条件为600×g离心10min，第二次离心 条件为1000×g离心20min，结果见表1。
表1.不同方法分离血小板的结果表
注：若每107个血小板中白细胞的个数小于10个则质控合格，若每107个血小板中白细 胞的个数大于或等于10个则质控不合格，质控合格的血小板白细胞污染率低于0.0001％。
如表1所示，按照实施例1的方法，即使全血低至2mL，所得到的血小板白细胞污染率仍低于0.0001％，回收率在80％以上，满足测序的需求。对照1的方法，虽能保证较高的血小板回收率，但白细胞污染率偏高，不符合上述质控标准。对照2的方法，使用过滤器从2mL全血中分离血小板时，由于过滤器截留血小板的问题，导致血小板回收率大幅度降低，不符合上述质控标准。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下 在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种超纯血小板的分离方法，其特征在于，步骤包括：采集全血样本，第一次离心去除细胞和其它凝聚物沉淀；双免疫磁珠去除白细胞和红细胞；第二次离心，收集血小板沉淀。
2.权利要求1或2所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述第一次离心的参数为60～800×g，5～30min。
3.权利要求2所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述第一次离心的参数为600×g，10min。
4.权利要求1所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述双免疫磁珠为CD45免疫磁珠和CD235a免疫磁珠。
5.权利要求1所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述第二次离心的参数为120～2800×g，5～40min。
6.权利要求5所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述第二次离心的参数为1000×g，20min。
7.权利要求1所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述全血样本的体积为小于等于10mL。
8.权利要求7所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述全血样本的体积为1-5mL。
9.权利要求7所述超纯血小板的分离方法，其特征在于，所述全血样本的体积为1-2mL。
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