CN105368776A - 阶梯式离心提取血小板的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了阶梯式离心提取血小板的方法。本发明所提供的阶梯式离心提取血小板方法，包括：1)将动物血液在(90-110)×g下进行第一次离心，使血小板进入上清液中，弃下层液体，收集上清液，该上清液称为上清液A1，所述上清液A1即为血小板粗提液；2)将所述血小板粗提液在(200-220)×g下进行第二次离心，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B1，所述上清液B1即为含有血小板的血小板提取液。实验证明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法可以得到更为纯净的血小板，并且血小板的得率高。

Description

阶梯式离心提取血小板的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中阶梯式离心提取血小板的方法。

背景技术

血小板(bloodplatelet，PLT)是血液中的有形成份之一，在人体的出血凝血生理病理过程中发挥重要作用^[1]。血小板是巨核细胞成熟后脱颗粒释放到血液中的血细胞，形状多样不规则，正常血小板直径2～4μm，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中具有较恒定的数量，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用^[2,3]。血小板内含有多种生长因子，富血小板血浆的修复等功能在临床中运用的日益增多，而血小板在血液中是与其他细胞混合存在的，分离纯净的血小板对血小板功能的研究非常必要。

血小板提取纯化的方法主要有磁珠吸附法、流式细胞仪分离法、分离胶分离法和富血小板血浆简易离心分离法(PRP法)^[4]。前两种方法提取存在着过程繁琐、试剂成本高等缺点；后两种方法则分离纯度低，污染率高。传统的富血小板血浆简易离心分离法所用时间短、步骤少，纯度较高^[5]，但制出的血小板数量少，文献报道中得率最高的约51.30％左右，红细胞和白细胞含量高，血小板完整性会被破坏。

白细胞特有基因-人血蛋白基因(hemoglobin，HGB)^[6]在白细胞内稳定表达，而血小板内不含有该基因。外周全血和单纯血小板都含有线粒体^[7]，NDI基因是线粒体基因中最保守的，其表达产物为NADH脱氢酶(复合体I)亚单位1^[8]。因此对提取后血小板的这两个基因定量检测可用于血小板纯度的评价。

参考文献：

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提取血小板，并得到纯净的血小板。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了阶梯式离心提取血小板方法。

本发明所提供的阶梯式离心提取血小板方法，包括1)和2)：

1)将离体的动物血液在(90-110)×g下进行第一次离心，使血小板进入上清液中，分别收集下层液体和上清液，该上清液称为上清液A1，所述上清液A1即为血小板粗提液；

2)将所述血小板粗提液在(200-220)×g下进行第二次离心，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B1，所述上清液B1即为含有血小板的血小板提取液。

上述方法中，所述第一次离心的离心力可为100×g；所述第二次离心的离心力可为210×g。

上述方法中，所述第一次离心的时间可为13-18分钟；所述第二次离心的时间可为2-5分钟。

上述方法中，所述第一次离心的时间可为15分钟；所述第二次离心的时间可为3分钟。

上述方法中，步骤1)还可包括：将所述下层液体在(160-180)×g下进行离心，该离心命名为下层液体离心，使所述下层液体中残留的血小板进入上清液中，将该上清液称为上清液A2；将所述上清液A2与所述上清液A1混合即得到血小板粗提液。

上述方法中，所述下层液体离心的离心力可为170×g；所述下层液体离心的时间为8-12分钟(如10分钟)。

上述方法中，步骤2)还可包括：将所述上清液B1按照所述第二次离心的离心力进行离心，该离心命名为重复离心，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B2，所述上清液B2即为含有血小板的血小板提取液。所述重复离心的时间可为2-5分钟，如3分钟。

上述方法中，所述动物血液可用EDTA抗凝。

上述方法中，所述动物可为哺乳动物。

上述方法中，所述动物可为人。

上述方法中，将动物血液进行第一次离心前还可包括将所述动物血液混匀。

实验证明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法可以得到大量的血小板，并且瑞氏染色结果未显示混杂有其他细胞。本发明的阶梯式离心提取血小板法得到的含有血小板的血小板提取液中的白细胞低于富血小板血浆简易离心分离得到的血小板提取液中的白细胞，差异有统计学意义(P﹤0.05)，阶梯式离心提取血小板法得到的血小板得率(58.286±10.660％)高于富血小板血浆简易离心分离得到的血小板得率(51.297±13.262％)，差异有统计学意义(P﹤0.05)。表明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法可以得到更为纯净的血小板，并且血小板的得率高。

通过扩增血小板和白细胞共有的线粒体NDI基因和白细胞特异的HGB基因进行血小板的纯度鉴定发现：阶梯式离心提取血小板法得到的产物的NDI基因扩增显示扩增曲线平滑完好，溶解曲线具有单一的峰，表明该方法的产物中含有线粒体NDI基因，HGB基因扩增曲线杂乱，在32个循环后出现曲线，表明阶梯式离心提取血小板法得到的血小板的白细胞基因含量极低。阶梯式离心提取血小板法得到的产物HGB基因含量((0.398±0.291)×10³copies/ml)明显低于富血小板血浆简易离心分离产物HGB基因含量((1.583±1.532)×10³copies/ml)，差异有统计学意义(P﹤0.05)。阶梯式离心提取血小板法得到的产物的NDI基因含量((6.077±4.148)×10⁶copies/ml)高于富血小板血浆简易离心分离组得到的产物的NDI基因含量((6.036±3.128)×10⁶copies/ml)。表明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法血小板的得率高。

本发明的方法可有效的去除红细胞和白细胞及白细胞碎片，得到的血小板中白细胞绝对浓度极低、血小板浓度高和得率较高，并且保证了血小板的完整性。本发明的方法使用材料主要为EPPENDORF管和普通移液器吸头，主要仪器设备为离心机和移液器，所用材料简便易得。

附图说明

图1为瑞氏染色涂片显微镜结果。其中，A为富血小板血浆简易离心组(PRP)组；B为含阶梯式离心提取血小板法(S)组。

图2为实时荧光定量PCR扩增曲线。其中a为HGB基因的扩增曲线，b为NDI基因的扩增曲线。

图3为溶解曲线。其中a为HGB基因的溶解曲线，b为NDI基因的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的仪器和试剂为：美国ABISteponeplus荧光PCR扩增仪、德国eppendorf可调定量加液器、美国Beckman水平式电动离心机、日本SysmexXE-5000血液分析仪、日本OlympusBX-43生物显微镜。DNA提取试剂为北京天恩泽基因公司天净沙系列柱式血液DNA提取试剂，荧光PCR反应试剂为大连宝生物公司RR820A荧光PCR反应试剂，血细胞计数试剂为日本Sysmex公司产品，瑞氏染色液为珠海贝索生物公司产品。

实施例1、血液中血小板的提取

随机选取10名健康体检者作为研究对象，其中男性9名，女性1名，年龄50.8±8.7岁。每人清晨空腹抽取静脉血3管，每管2ml，EDTA抗凝，将每人的一管用于原始全血细胞检测，另一管归为富血小板血浆简易离心分离法血小板提取对照组(PRP组)，第三管归为阶梯式离心法血小板提取实验组(S组)。样本的收集和研究工作得到深圳市职业病防治院医学伦理委员会批准。

血小板的提取按照如下阶梯式离心提取血小板法进行：

将S组中的每个血液样品于EDTA抗凝离心管中小心来回轻轻颠倒8次以上混匀，100×g进行第一次离心，离心时间为15分钟，使血小板进入上清液中，弃下层液体，收集上清液，该上清液称为上清液A1；将下层液体以170×g进行下层液体离心10min，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液A2；将上清液A1与上清液A2小心轻轻混匀30s，得到血小板粗提液；将血小板粗提液以210×g进行第二次离心，离心时间为3min，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B1；将上清液B1以210×g进行重复离心，离心时间为3min，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B2，上清液B2即为含有血小板的血小板提取液。

将PRP组各血液样品进行富血小板血浆简易离心分离实验，作为对照：将PRP组血液样品在离心力以100×g离心时间15min，分离得到PRP(PlateletRichPlasma，富含血小板、血浆或富含生长因子的血液)(血小板提取液)。

将含有血小板的血小板提取液与PRP分别涂片并用瑞氏染色液进行瑞氏染色，显微镜检分别观察100个高倍视野。

结果显示，PRP组得到的PRP可见血小板(PLT)、零星白细胞(whitebloodcell，WBC)(图1中A)，S组得到的含有血小板的血小板提取液可见大量PLT，未见其他细胞。

将PRP组得到的PRP、S组得到的含有血小板的血小板提取液和全血细胞组的样品应用SysmexXE-5000血液分析仪进行全血细胞计数，记录血小板含量并计算血小板得率(表1)。血小板获得率＝C2×V2×100％/(C1×V1)；V1指提取前体积；V2指提取后含血小板的液体体积；C1指提取前血小板浓度；C2指提取后血小板浓度。

表1PRP组和S组血细胞计数及血小板得率

注：*表示TTEST检验P﹤0.05，T值表示检定值，P值表示随机变量分布概率(Sig)。

结果显示，阶梯式离心提取血小板法与富血小板血浆简易离心分离均得到了血小板，S组得到的含有血小板的血小板提取液中的白细胞低于PRP组得到的PRP中的白细胞，差异有统计学意义(P﹤0.05)，并且S组得到的含有血小板的血小板提取液中血小板得率高于PRP组得到的PRP中血小板得率，差异有统计学意义(P﹤0.05)。表明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法可以得到更为纯净的血小板提取液，并且血小板的得率高。

按照下述方法通过扩增血小板和白细胞共有的NDI基因和白细胞特异的HGB基因进行血小板的纯度鉴定：

反应体系采用大连宝生物公司RR820A荧光RTPCR反应试剂，总体积20μl。

NDI基因扩增：ExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0μl，NDI基因上游引物0.5μl，NDI基因下游引物0.5μl，ROXReferenceDye(50×)0.4μl，DNA模板3.0μl，dH₂O(灭菌蒸馏水)5.6μl，反应条件(95℃10s；95℃5s，62℃35s，40个循环)。

HGB基因扩增：ExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0μl，HGB基因上游引物0.7μl，HGB基因下游引物0.7μl，ROXReferenceDye(50×)0.4μl，DNA模板3.0μl，dH₂O(灭菌蒸馏水)5.2μl，反应条件(95℃10s；95℃5s，56℃35s，40个循环)。

所用引物采用Primer5.0设计，线粒体基因选择NDI基因区(参考基因序列号：NC_012920.1)，HGB基因(参考基因序列号：NC_018922.2)。NDI基因上游引物：GCTGACGCCATAAAACTCTTCA(5’→3’)，NDI基因下游引物：GGCGGTGATGTAGAGGGTGAT(5’→3’)，HGB基因上游引物：AAAGGTGCCCTTGAGGTTGTC(5’→3’)，HGB基因下游引物：TGAAGGCTCATGGCAAGAAA(5’→3’)。两对引物分别扩增。加入系列浓度外标准品建立标准曲线进行定量。

实时荧光定量PCR扩增曲线如图2所示。PRP组NDI基因扩增显示扩增曲线平滑完好，溶解曲线(图3)具有单一的峰，表明PRP组得到的PRP中含有线粒体NDI基因，HGB基因扩增曲线杂乱，部分样本扩增曲线在30个循环后开始出现，表明PRP组得到的PRP中混有少量人白细胞基因。S组NDI基因扩增显示扩增曲线平滑完好，溶解曲线具有单一的峰，表明S组得到的含有血小板的血小板提取液中含有线粒体NDI基因，HGB基因扩增曲线杂乱，在32个循环后出现曲线，表明S组得到的含有血小板的血小板提取液中的白细胞基因含量极低。

实验数据采用SPSS16.0统计软件处理，两组均数比较采用TTEST分析，以P﹤0.05为差异有统计学意义。实时荧光定量PCR扩增结果如表2所示。S组HGB基因含量((0.398±0.291)×10³copies/ml)低于PRP组((1.583±1.532)×10³copies/ml)，差异有统计学意义(P﹤0.05)。S组NDI基因含量((6.077±4.148)×10⁶copies/ml)高于PRP组((6.036±3.128)×10⁶copies/ml)，差异无统计学意义(P﹥0.05)。表明，利用本发明的阶梯式离心提取血小板法血小板的得率高。

表2实时荧光定量PCR扩增结果

注：*表示TTEST检验P﹤0.05，T值表示检定值，P值表示随机变量分布概率(Sig)。

Claims (10)

1.阶梯式离心提取血小板的方法，包括1)和2)：

1)将离体的动物血液在(90-110)×g下进行第一次离心，使血小板进入上清液中，分别收集下层液体和上清液，该上清液称为上清液A1，所述上清液A1即为血小板粗提液；

2)将所述血小板粗提液在(200-220)×g下进行第二次离心，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B1，所述上清液B1即为含有血小板的血小板提取液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一次离心的离心力为100×g；所述第二次离心的离心力为210×g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述第一次离心的时间为13-18分钟；所述第二次离心的时间为2-5分钟。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一次离心的时间为15分钟；所述第二次离心的时间为3分钟。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)还包括：将所述下层液体在(160-180)×g下进行离心，该离心命名为下层液体离心，使所述下层液体中残留的血小板进入上清液中，将该上清液称为上清液A2；将所述上清液A2与所述上清液A1混合得到血小板粗提液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述下层液体离心的离心力为170×g；所述下层液体离心的时间为8-12分钟。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤2)还包括：将所述上清液B1按照所述第二次离心的离心力进行离心，该离心命名为重复离心，使血小板进入上清液中，收集上清液，该上清液称为上清液B2，所述上清液B2即为含有血小板的血小板提取液。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述动物血液用EDTA抗凝。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述动物为哺乳动物。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述动物为人。