CN105107233A - 去白细胞富血小板血浆的制备方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于血液制品技术领域，公开了一种去白细胞富血小板血浆的制备方法，步骤如下：(i)抽取抗凝剂和血液，混匀，得到待分离的全血；(ii)经第一次离心形成自下而上分为三层的离心液，获取上层血小板和血浆成分；(iii)对获取的上层成分再次离心，形成底部血小板沉积和血浆上清液；抽取部分血浆上清液，用剩余血浆上清液重悬血小板沉积，即制得去白细胞富血小板血浆。该方法同时实现了对白细胞的清除和对血小板的富集，且操作方便、耗时短，制得血浆产品的技术指标均优于现有的同类产品。本发明所提供方法中的两次离心可分别在两个离心管内进行，或者在同一个离心装置中进行，本发明同时提供用于实施该制备方法的离心装置。

Description

去白细胞富血小板血浆的制备方法及装置

技术领域

本发明属于血液制品技术领域，特别涉及一种血浆制品的制备方法以及用于实施该方法的离心装置。

背景技术

富血小板血浆(PRP)是一种富含血小板的血液制品，根据其中是否含有白细胞又可以大致分为富含白细胞的L-PRP和不含白细胞的P-PRP两大类。近年来，大量研究证实PRP中促进骨组织、软骨组织和肌腱组织的修复和再生的有效成分为血小板，而PRP中的白细胞不仅对于组织修复并没有促进作用；相反，白细胞可以通过释放炎症因子引发局部的免疫反应、抑制组织修复，从而降低PRP的临床疗效、提高注射部位疼痛等不良反应的发生率。因此，去白细胞富血小板血浆的制备方法是目前研究的重点和热点。

评价P-PRP的制备方法有三个主要指标：首先是白细胞清除率，清除率越高则白细胞清除越彻底，从而可以提高临床疗效、减少不良反应；其次为血小板回收率，回收率越高则血液利用度越高；再次为血小板富集度，只有PRP的起效剂量为富集度4～6倍，过低的富集度会导致效用下降，从而导致临床疗效不显著。然而，由于白细胞分布区域与血小板分布区域重合较为严重，依照目前的分离技术，要去除越多的白细胞必然导致回收越少的血小板，因此白细胞清除率和血小板回收率看似一对矛盾体。

目前临床上多使用Anitua法制备PRP，也有按照美国Biomet公司富血小板血浆制备套装提供的方法制备PRP，但是制备得到的PRP的各项指标均不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去白细胞富血小板血浆的制备方法，以同时实现富血小板血浆制备过程中的白细胞去除和血小板富集。

本发明的另一目的在于提供一种用于实施上述去白细胞富血小板血浆的制备方法的离心装置，以提高制备效率和减少样本污染。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，包含下述步骤：

(i)样本准备：分别抽取抗凝剂和血液，充分混匀，得到待分离的全血；

(ii)第一次离心：取上述待分离的全血在130g～180g的离心速度下离心10～20分钟，形成自下而上分为三层的离心液，上层离心液的体积占所述全血体积的1/3～2/3，获取所述上层离心液，即为血小板和血浆成分层；

(iii)第二次离心：取上述获取的血小板和血浆成分层在250～400g的离心速度下离心10～20分钟，形成底部血小板沉积和血浆上清液；抽取部分血浆上清液，使用剩余的血浆上清液重悬血小板沉积，所述剩余的血浆上清液的体积占全血体积的1/15～1/5，即制备得到去白细胞富血小板血浆。

在本发明的实施方式所提供的制备方法中，通过两次离心操作分别实现了白细胞的去除和血小板的富集。具体来说，在第一次离心之后，获得了分为三层的离心液，自下而上分别为红色、无色和淡黄色，其中：(1)红色为红细胞层，约占总体积的40～65％，其主要成分为红细胞，此外还含有少量的白细胞和极少量血小板，约占红细胞总数的100％、白细胞总数的10～20％、血小板总数的不足10％；(2)淡黄色层为血小板层和血浆层，约占总体积的35～60％，不含白细胞和红细胞，约占血小板总数的50～90％；(3)无色的为白细胞层，其主要成分为白细胞，该层与上层的血小板层和血浆之间存在重合现象，白细胞层和重合层约占总体积的5％；白细胞层以及与白细胞层重合的血小板层中的白细胞约占80～90％，血小板占总数的10～50％。本发明在第一次离心之后获取上层离心液(即血小板和血浆层)，又对该上层成分进行了第二次离心操作。此次离心操作之后，绝大多数血小板均沉积于离心管底，上清液为含有血小板不超过5％的血浆；抽取并抛弃多余的血浆，使用剩余的少量血浆重悬血小板即制备得到去白细胞富血小板血浆。

上述制备过程中，在对全血进行第一次离心之后，血小板分布区域较宽、白细胞分布区域较窄，且两者重合区域亦较窄，因此在完全去除白细胞后，即可实现对大部分血小板的回收，实现了一对矛盾体的共同发展。第一次离心后获得的血小板和血浆层中，平均血小板浓度约为334.05±103.27×10^9/L，平均血小板富集度约为1.49±0.47倍，平均血小板回收率约为61.74±7.04％，平均白细胞清除率约为98.77±0.94％。然而，第一次离心操作在提升血小板回收率的同时，必然引起血小板分布区域增宽，进而导致单位体积内的血小板浓度降低，即导致血小板富集度降低，从而造成了一对新的矛盾体。为了解决这一矛盾，本发明又进行了第二次离心，将血小板分布区域重新定义至一个较窄的范围内，从而实现血小板富集度的提升。如此，本发明的技术方案通过两次离心，分别实现白细胞的去除和血小板的富集，从而制备得到三大指标均优于现有产品的富血小板血浆。该富血小板血浆中，平均血小板浓度约为1083.25±250.79×10^9/L，平均血小板富集度约为5.22±0.48倍，平均血小板回收率约为58.00±5.32％，平均白细胞浓度约为0.68±0.49×10^9/L，平均白细胞清除率约为98.73±0.91％，各项指标均优于现有技术，且符合现有认识。

值得补充说明的是，本发明所制备的去白细胞富血小板血浆之所以能取得各项较优的技术指标，还在于其对两次离心速度和离心时间的设定。根据本领域专业技术知识：血液的主要成分包括红细胞、白细胞、血小板、血浆以及各种蛋白，其中红细胞、白细胞、血小板的密度各不一致。根据Stoke’s定律，颗粒在液体中的沉降速率与其密度呈正比。因此，血液中的各成分的沉降速率各不一致，离心后分别分布于不同的层面，从而实现对血小板的成分分离。但是，Stoke’s定律还提示，颗粒的沉降速率不仅与其密度相关，还与其所受力的大小呈正比。当红细胞、白细胞、血小板在血浆中移动时所受的力，即离心力，趋向于无限大时，离心力所产生的影响将大大超过其密度对其速率的影响，从而导致各成分之间分布层面较为接近，难以分离。现有技术中GPS法制备的PRP存在的白细胞和血小板无法完全分离的原因即在于此，即由于离心力过大，血小板的沉降速率较快，分布区域较窄，且与白细胞分布区极为接近，难以将两者分离。当离心力趋向于零，即血液在重力的作用下自然沉降时，各成分的分布则主要受其密度的影响。但是在这种情况下，各成分沉降速率均较低，在血小板仍然悬浮于血浆中时，红细胞、白细胞的沉降速率较低会导致其分布区域极为广泛，无法从富含血小板的血浆中分离，从而导致可以获取的所谓“上层液体”体积较少，血小板回收率较低。现有技术中Anitua法制备PRP存在的血小板回收率低的原因即在于此，即由于离心力过小，血小板沉降速率较慢，与血浆无法完全分离，从而悬浮于血浆中，而与此同时，红细胞、白细胞沉降速率也较慢，导致其最终分布范围较大，占据了大量的血小板分布的血浆层，从而导致血小板回收率、血小板富集度均不理想。Anitua为了弥补这一缺点，保留了部分与白细胞层重合的血小板分布层。但是这个补救措施不仅没有能够显著提升该技术的血小板相关技术指标，反而导致其PRP白细胞浓度显著提高，白细胞清除率显著下降。因此，离心速度对于PRP的相关技术参数具有显著的影响。此外，各成分的最终分布层面与沉降距离直接相关，而众所周知，沉降距离是沉降速率与沉降时间的沉积，因此，就PRP的制备而言，离心时间也是影响PRP的相关技术参数的重要因素。本发明所提供的方法中对两次离心速度和离心时间的设定，直接决定了最后制备得到的去白细胞富血小板血浆的技术指标。

具体地，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法中，步骤(i)中的抗凝剂可以为肝素、枸橼酸盐或柠檬酸盐。一般来说，常用的抗凝剂均可用于本发明的实施方式中，但是不应选择EDTA，因为其可能影响血小板的功能；此外，抗凝剂和血液的体积比参照所使用的抗凝剂的药品说明书进行确定，一般来说可以为1/15～1/5。

优选地，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，步骤(ii)中，第一次离心的离心速度为160g，离心时间为10分钟。

值得补充说明的是，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，步骤(ii)中，第一次离心后，自下而上分为三层的离心液的成份如下：下层为混有白细胞和血小板的红细胞层、中间层为白细胞层、上层为血小板和血浆层；且所述中间层与所述上层存在重合区域。

优选地，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，步骤(iii)中的第二次离心的离心速度为250g，离心时间为15分钟。

优选地，本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，步骤(iii)中使用剩余的血浆上清液重悬血小板沉积时，所述剩余的血浆上清液的体积占步骤(i)中全血体积的1/10。对用于重悬血小板的剩余血浆上清液确定该优选体积比例的理由是：如保留过多血浆上清液则血小板富集度和浓度较低，不能满足起效剂量(4～6倍)；如保留过少血浆上清液则PRP体积过少，临床上每次使用PRP的剂量一般每次为4ml左右，体积太小则不足以满足需求。

本发明的实施方式所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法，操作方便、耗时短，且所制备的P-PRP的相关技术指标均优于现有的同类产品，可以有效降低临床使用中的不良反应发生率，提高临床疗效，因而具有较好的临床应用前景。

此外，在具体实施本发明所提供的去白细胞富血小板血浆的制备方法时，第一次离心步骤和第二次离心步骤可以分别在两个离心管内进行，或者在同一个离心装置中进行。

对于两次离心步骤分别在两个离心管内进行的情形(第一次离心之后，抽取上层离心液并转移至一个新的离心管，在新的离心管内对上层成分进行第二次离心)，所使用的离心管为本领域内常规使用的普通离心管，即为结构包含离心管体和管盖的离心管。对于两次离心步骤在同一离心管内进行的情形，则需要使用改进的离心装置。

本发明的实施方式同时提供该种用于实施上述去白细胞富血小板血浆的制备方法的改进的离心装置，该装置包含透明的管体以及盖设于管体上的盖体，盖体上至少设有第一抽吸口和第二抽吸口；在管体的内部设有浮标部件，该浮标部件包含在竖直方向上间隔设置的上浮标和下浮标；此外，第一吸取管固定连接上浮标和下浮标、并延伸至下浮标的下方，第二吸取管的上端连接上浮标、下端位于下浮标的上方；第一抽吸口经第一可伸缩软管连通至第一吸取管，第二抽吸口经第二可伸缩软管连通至第二吸取管。

进一步地，在上述的离心装置中，浮标部件的密度满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第一次离心后，下浮标位于上层离心液和中层离心液的交界处。

进一步地，在上述的离心装置中，上浮标和下浮标之间的距离满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第二次离心后，用于重悬血小板沉积的剩余的血浆上清液即为上浮标与下浮标之间的血浆上清液。

利用本发明的实施方式所提供的该种离心装置进行去白细胞富血小板血浆制作的过程中，在第一次离心之后，下浮标位于上层离心液和中层离心液的交界处；因此可从第一抽吸口处、经由第一可伸缩软管和第一吸取管抽取全部的中层离心液和下层离心液，则在离心装置中剩余上层离心液，从而完成了对上层离心液的获取步骤(即为血浆和血小板成分层)。然后，直接对上层离心液进行第二次离心，形成底部血小板沉积和血浆上清液，从第二抽吸口处、经由第二可伸缩软管和第二吸取管抽取部分血浆上清液，待上清液的液面降低至上浮标处时，停止抽取，在上浮标和下浮标之间即为我们希望用于重悬血小板沉积的剩余的血浆上清液。

由此可知使用本发明所提供的改进的离心装置进行去白细胞富血小板血浆制作具有如下优点：(1)首先，整个制备过程中不发生进行移液操作，两次离心以及重悬血小板的步骤均在同一离心装置中进行；从抽吸口经由可伸缩软管和吸取管进行成分抽取时，也不会发生外部物质接触装置底部血液成分的情况，因而杜绝了对样本引入污染的可能性。(2)在第一次离心后，上层和中层存在较严重的重合情况，分界线不清晰，此时，本发明所提供装置中的下浮标可以作为上层和中层的明确的分界线，有助于准确判断和获取待保留的部分(即上层)、抛弃其他部分(中层及下层)；在获取上层成分的过程中，无需借助背光照射观察液体涌动情况等手段，即可实现高效率和高精确性的分离。(3)在第二次离心之后，上浮标与下浮标直接作为抽取部分血浆上清液的抽取量参照标志，操作人员无需进行其他定量判断步骤，有效提高了去白细胞富血小板血浆的制备效率。

附图说明

图1是本发明实施例4中的离心装置的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1PRP制备实验例(采用两个常规离心管制备)

(1)样本制备：

抽取血液：分别抽取4ml抗凝剂和36ml全血，加入第一离心管内并充分混匀。本实施例中，选用ACD-A为抗凝剂。

(2)第一次离心：

对第一离心管，在130g离心速度下离心10分钟，获得分为三层的液体，自下而上分别红色、无色和淡黄色，其中：

红色为红细胞层，约占总体积的65％，其主要成分为红细胞，此外，还含有少量的白细胞和极少量血小板，约占红细胞总数的100％，白细胞总数的10～20％，血小板总数的不足10％。

淡黄色层为血小板和血浆层，约占总体积的35％，其主要成分为血小板和血浆，不含白细胞和红细胞，约占血小板总数的60～70％。

无色的为白细胞层，其主要成分为白细胞，该层与上层的血小板和血浆层之间存在重合现象，白细胞层和重合层约占总体积的5％，白细胞层以及与白细胞层重合的血小板层中的白细胞约占80～90％，血小板占总数的10～30％。

(3)血小板和血浆层的获取：

使用移液管抽取上层，即血小板和血浆层，并转移至第二离心管内。

抽取时应注意近白细胞层时必须降低抽取速度以避免抽取其与白细胞层重合部分。实现方法为在背光照射下抽取血小板和血浆层，至近白细胞层是降低抽取速度，双眼平视白细胞层，发现白细胞层内无色液体向上涌动至血小板和血浆层(淡黄色)内即提示抽取平面以达白细胞层和血小板层的重合处，立即停止抽取。

(4)第二次离心：

将第二离心管在250g的离心速度下离心10分钟。此时，离心管内绝大多数血小板均沉积于离心管底，上清液为含有血小板不超过5％的血浆。

(5)P-PRP的获取：

抽取并抛弃多余的血浆，使用剩余4ml血浆重悬血小板即获得去白细胞富血小板血浆，该富血小板血浆的各项指标均优于现有技术(详见表1)，且符合现有认识。

实施例2PRP制备实验例(采用两个常规离心管制备)

(1)样本制备：

抽取血液：分别抽取4ml抗凝剂和36ml全血，加入第一离心管内并充分混匀。本实施例中，选用ACD-A为抗凝剂。

(2)第一次离心：

对第一离心管，在180g离心速度下离心20分钟，获得分为三层的液体，自下而上分别红色、无色和淡黄色，其中：

红色为红细胞层，约占总体积的40％，其主要成分为红细胞，此外，还含有少量的白细胞和极少量血小板，约占红细胞总数的100％，白细胞总数的10～20％，血小板总数的不足10％。

淡黄色层为血小板和血浆层，约占总体积的60％，其主要成分为血小板和血浆，不含白细胞和红细胞，约占血小板总数的70～80％。

无色的为白细胞层，其主要成分为白细胞，该层与上层的血小板和血浆层之间存在重合现象，白细胞层和重合层约占总体积的5％，白细胞层以及与白细胞层重合的血小板层中的白细胞约占80～90％，血小板占总数的20～50％。

(3)血小板和血浆层的获取：

使用移液管抽取上层，即血小板和血浆层，并转移至第二离心管内。

抽取时应注意近白细胞层时必须降低抽取速度以避免抽取其与白细胞层重合部分。实现方法为在背光照射下抽取血小板和血浆层，至近白细胞层是降低抽取速度，双眼平视白细胞层，发现白细胞层内无色液体向上涌动至血小板和血浆层(淡黄色)内即提示抽取平面以达白细胞层和血小板层的重合处，立即停止抽取。

(4)第二次离心：

将第二离心管在400g的离心速度下离心20分钟。此时，离心管内绝大多数血小板均沉积于离心管底，上清液为含有血小板不超过5％的血浆。

(5)P-PRP的获取：

抽取并抛弃多余的血浆，使用剩余4ml血浆重悬血小板即获得去白细胞富血小板血浆，该富血小板血浆的各项指标均优于现有技术(详见表1)，且符合现有认识。

实施例3PRP制备实验例(采用两个常规离心管制备)

(1)样本制备：

抽取血液：分别抽取4ml抗凝剂和36ml全血，加入第一离心管内并充分混匀。本实施例中，选用ACD-A为抗凝剂。

(2)第一次离心：

对第一离心管，在160g离心速度下离心10分钟，获得分为三层的液体，自下而上分别红色、无色和淡黄色，其中：

红色为红细胞层，约占总体积的45％，其主要成分为红细胞，此外，还含有少量的白细胞和极少量血小板，约占红细胞总数的100％，白细胞总数的10～20％，血小板总数的不足10％。

淡黄色层为血小板和血浆层，约占总体积的55％，其主要成分为血小板和血浆，不含白细胞和红细胞，约占血小板总数的80～90％。

无色的为白细胞层，其主要成分为白细胞，该层与上层的血小板和血浆层之间存在重合现象，白细胞层和重合层约占总体积的5％，白细胞层以及与白细胞层重合的血小板层中的白细胞约占80～90％，血小板占总数的10～30％。

(3)血小板和血浆层的获取：

使用移液管抽取上层，即血小板和血浆层，并转移至第二离心管内。

抽取时应注意近白细胞层时必须降低抽取速度以避免抽取其与白细胞层重合部分。实现方法为在背光照射下抽取血小板和血浆层，至近白细胞层是降低抽取速度，双眼平视白细胞层，发现白细胞层内无色液体向上涌动至血小板和血浆层(淡黄色)内即提示抽取平面以达白细胞层和血小板层的重合处，立即停止抽取。

(4)第二次离心：

将第二离心管在250g的离心速度下离心15分钟。此时，离心管内绝大多数血小板均沉积于离心管底，上清液为含有血小板不超过5％的血浆。

(5)P-PRP的获取：

抽取并抛弃多余的血浆，使用剩余4ml血浆重悬血小板即获得去白细胞富血小板血浆，该富血小板血浆的各项指标均优于现有技术(详见表1)，且符合现有认识。

实施例4PRP制备实验例(采用本发明的改进的离心装置制备)

本实施例的PRP制作过程所采用的离心装置(其结构示意图如附图1所示)，包含透明的管体1以及盖设于管体1上的盖体2，盖体2上设有第一抽吸口2-1和第二抽吸口2-2；管体1的内部设有浮标部件3，浮标部件3包含在竖直方向上间隔设置的上浮标3-1和下浮标3-2；此外，第一吸取管3-3固定连接上浮标3-1和下浮标3-2、并延伸至下浮标3-2的下方，第二吸取管3-4的上端连接上浮标3-1、下端位于下浮标3-2的上方；第一抽吸口2-1经第一可伸缩软管4-1连通至第一吸取管3-3，第二抽吸口2-2经第二可伸缩软管4-2连通至第二吸取管3-4。

进一步地，在上述离心装置的结构中，浮标部件3的整体密度满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第一次离心后，浮标部件3整体向上浮动，直至下浮标3-2位于上层离心液和中层离心液的交界处；上浮标3-1和下浮标3-2之间的距离满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第二次离心后，用于重悬血小板沉积的剩余的血浆上清液即为上浮标3-1与下浮标3-2之间的血浆上清液。

本实施例的制备步骤具体包含：

(1)样本制备：

抽取血液：分别抽取4ml抗凝剂和36ml全血，加入管体1内，并充分混匀。本实施例中，选用ACD-A为抗凝剂。

(2)第一次离心：

将离心装置放置于离心机内，在160g离心速度下离心10分钟，获得分为三层的液体，自下而上分别红色、无色和淡黄色，其中：红色为红细胞层，约占总体积的45％，其主要成分为红细胞，此外，还含有少量的白细胞和极少量血小板，约占红细胞总数的100％，白细胞总数的10～20％，血小板总数的不足10％。淡黄色层为血小板和血浆层，约占总体积的55％，其主要成分为血小板和血浆，不含白细胞和红细胞，约占血小板总数的80～90％。无色的为白细胞层，其主要成分为白细胞，该层与上层的血小板和血浆层之间存在重合现象，白细胞层和重合层约占总体积的5％，白细胞层以及与白细胞层重合的血小板层中的白细胞约占80～90％，血小板占总数的10～30％。

(3)血小板和血浆层的获取：

第一次离心后，下浮标3-2刚好位于上层离心液和中层离心液的交界处。从第一抽吸口2-1处、经由第一可伸缩软管4-1和第一吸取管3-3，抽取中层离心液和下层离心液并抛弃，则在离心装置中剩余上层离心液，从而完成了对上层离心液的获取步骤(即为血浆和血小板成分层)。

(4)第二次离心：

将离心装置中剩余的下层离心液(即为血浆和血小板成分层)，在250g的离心速度下离心15分钟。此时，离心装置内绝大多数血小板均沉积于离心装置底部，上清液为含有血小板不超过5％的血浆。

(5)P-PRP的获取：

从第二抽吸口2-2处、经由第二可伸缩软管4-2和第二吸取管3-4抽取部分血浆上清液，待上清液的液面降低至上浮标处时，停止抽取，在上浮标和下浮标之间的4ml血浆上清液即为我们希望用于重悬血小板沉积的剩余的血浆上清液。

使用该剩余4ml血浆重悬血小板即获得去白细胞富血小板血浆，该富血小板血浆的各项指标均优于现有技术(详见表1)，且符合现有认识。

实施例5对比实验例

分别使用美国Biomet公司富血小板血浆制备套装、以及常规的Anitua法进行富血小板血浆的制备：

(1)使用套装提供的离心管，60ml全血以3200转/分钟的离心速度离心15分钟，提取离心管指定位置的血液制品即为PRP。

由于白细胞和血小板的沉降系数较为接近，使用GPS法离心后，白细胞和血小板分布区域重合度近似100％，无法区分两者。为了保证对血小板的有效回收，则必须同时回收大量白细胞，导致采用该技术防范制备的PRP中含有较高浓度的白细胞，约为全血的5～8倍。然而研究表明，PRP中白细胞会释放大量的炎症因子，如白介素-1、肿瘤坏死因子α等，而这些炎症因子可以引发局部的免疫反应，抑制组织修复，从而提高副反应发生率，降低PRP的临床疗效，使得GPS法PRP并不适用于治疗肌腱组织和软骨组织损伤或病变、整形去皱等对炎症反应较为敏感的损伤或病变。

(2)使用Anitua法，在160g的离心速度离心6分钟，提取指定位置的血液制品即为PRP。

Anitua法也是使用离心法制备PRP，但是其离心速度和时间明显小于GPS法。与GPS法相比，该技术方案可以显著降低血小板和白细胞的重合度。因此，该技术方案通过提取特定位置的血液制品获得仅含少量白细胞、同时含有高浓度血小板的P-PRP。但是，使用Anitua法离心后，白细胞和血小板分布区域重合度仍然较高，从而导致该技术方案的血小板回收率较低，进而导致其血小板富集度仅为1～3倍，不能达到广泛认同的4～6倍的有效剂量。此外，较高的血小板和白细胞重合度还导致该技术方案的白细胞清除率仅有50～80％，难以完全去除白细胞。虽然可以通过减少回收血小板和白细胞分布重合区域来提高白细胞清除率，但是如此一来势必导致其血小板回收率和富集度的进一步降低，从而影响其临床疗效。

(3)实施例1～4制备的去白细胞富血小板血浆的质量指标与GPS法、Anitua法的对比情况如下表1所示：

表1：制得去白细胞富血小板血浆的质量指标数据

注：表1中各指标含义如下：

1.血小板浓度(×10^9个/L)：血小板体积浓度

2.白细胞浓度(×10^9个/L)：白细胞体积浓度

3.血小板富集度(倍)＝PRP血小板浓度÷全血血小板浓度

4.血小板回收率(％)＝PRP所含血小板总量÷全血所含血小板总量

5.白细胞清除率(％)＝100％-PRP所含白细胞总量÷全血所含白细胞总量

6.白细胞富集度(倍)＝PRP白细胞浓度÷全血白细胞浓度

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，包含下述步骤：

(i)样本准备：分别抽取抗凝剂和血液，混匀，得到待分离的全血；

(ii)第一次离心：取上述待分离的全血在130～180g的离心速度下离心10～20分钟，形成自下而上分为三层的离心液，上层离心液的体积占所述全血体积的1/3～2/3，获取所述上层离心液，即为血小板和血浆成分层；

(iii)第二次离心：取上述获取的血小板和血浆成分层在250～400g的离心速度下离心10～20分钟，形成底部血小板沉积和血浆上清液；抽取部分血浆上清液，使用剩余的血浆上清液重悬血小板沉积，所述剩余的血浆上清液的体积占所述全血体积的1/15～1/5，即制备得到去白细胞富血小板血浆。

2.根据权利要求1所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，第一次离心的离心速度为160g，离心时间为10分钟。

3.根据权利要求1所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，形成自下而上分为三层的离心液的成份如下：下层为混有白细胞和血小板的红细胞层、中间层为白细胞层、上层为血小板和血浆层；且所述中间层与所述上层存在重合区域。

4.根据权利要求1所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述步骤(iii)中的第二次离心的离心速度为250g，离心时间为15分钟。

5.根据权利要求1所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述步骤(iii)中使用剩余的血浆上清液重悬血小板沉积时，所述剩余的血浆上清液的体积占所述全血体积的1/10。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述第一次离心和第二次离心分别在两个离心管内进行，或者在同一个离心装置中进行。

7.根据权利要求6所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法，其特征在于，所述离心管包含离心管体和管盖。

8.一种用于实施权利要求1至5中任一项所述的去白细胞富血小板血浆的制备方法的离心装置，其特征在于，包含透明的管体(1)以及盖设于所述管体(1)上的盖体(2)，所述盖体(2)上至少设有第一抽吸口(2-1)和第二抽吸口(2-2)；

所述管体(1)的内部设有浮标部件(3)，所述浮标部件(3)包含在竖直方向上间隔设置的上浮标(3-1)和下浮标(3-2)；第一吸取管(3-3)固定连接所述上浮标(3-1)和下浮标(3-2)、并延伸至下浮标(3-2)的下方；第二吸取管(3-4)的上端连接所述上浮标(3-1)、下端位于所述下浮标(3-2)的上方；

所述第一抽吸口(2-1)经第一可伸缩软管(4-1)连通至所述第一吸取管(3-3)，所述第二抽吸口(2-2)经第二可伸缩软管(4-2)连通至所述第二吸取管(3-4)。

9.根据权利要求8所述的离心装置，其特征在于，所述浮标部件(3)的密度满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第一次离心后，所述下浮标(3-2)位于上层离心液和中层离心液的交界处。

10.根据权利要求8所述的离心装置，其特征在于，所述上浮标(3-1)和所述下浮标(3-2)之间的距离满足：当使用该装置制备去白细胞富血小板血浆时，在第二次离心后，用于重悬血小板沉积的剩余的血浆上清液即为上浮标(3-1)与下浮标(3-2)之间的血浆上清液。