CN103243075B - 一种乳腺癌干细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种乳腺癌干细胞的分离方法，属于细胞的分离领域。它包括以下步骤：（1）制备胸水单细胞悬液；（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液；（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球。与现有技术相比，本发明的有益效果是该分离方法所获得的细胞表面因不含有抗体和磁珠的干扰；而且可保证乳腺癌细胞的分离效率及其乳腺癌干细胞富集后的纯度；不仅能高效分离数量较少的乳腺癌上皮细胞，而且缩短了分离时间，降低了分离成本，安全有效。

Description

一种乳腺癌干细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离，具体涉及一种乳腺癌干细胞的分离方法。

背景技术

全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。相关资料显示，西方妇女乳腺癌的发病人数高峰期为50～55岁，而且随着年龄的增长，发病率也不断提高。

与发达国家相比，中国虽属乳腺癌的低发区，却是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度递增，近5年增长了3倍，成为城市中死亡率增长最快的癌症之一。其中，近十年来，中国主要城市乳腺癌发病率增长了37%，死亡率增长了38.9%，农村死亡率增长了39.7%。此外，中国女性的乳腺癌发病年龄，要比西方女性小10岁左右，且大城市女性乳腺癌发病率有逐步接近欧美发达国家水平的趋势，发病年龄也呈年轻化发展。

乳腺癌具有侵袭性和难治愈的特点,治疗后仍有可能复发或转移,而其起源、复发与转移的真正原因可能是存在于乳腺癌内极少数具有干细胞的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群，即乳腺癌干细胞，这些细胞具有化疗、放疗及缺氧抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在乳腺癌的发生﹑发展乃至转移﹑复发中起着极其重要作用。然而，放疗和化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞样细胞群疗效甚微，经过治疗后残存的乳腺癌干细胞的增殖足以促使乳腺癌复发和转移。

研究表明，CD44+CD24-是致瘤性乳腺癌干细胞最基本的表型标记，此类细胞亚群在乳腺癌中起着干细胞样作用，与乳腺癌侵袭、归巢和转移密切相关。因此，开发以乳腺癌干细胞为靶点的新一代抗肿瘤生物及免疫药物成为了根治乳腺癌的发展方向之一。然而，由于乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中的比例只有1%左右，因此如何分离获得有效的乳腺癌干细胞，并在体外进行大规模扩增培养，建立乳腺癌干细胞系，成为了乳腺癌干细胞技术发展的瓶颈。

目前，主要采用密度梯度离心法、流式细胞分选法和免疫磁珠分选法来分离乳腺癌干细胞，三者均有利弊。密度梯度离心法分离的乳腺癌干细胞纯度和细胞活性不高；流式细胞分选法所需仪器设备的费用昂贵，操作过程复杂，需要专业技术人员进行操作；免疫磁珠分选法初次分选的乳腺癌干细胞纯度较低，需进一步纯化。

免疫磁珠法分离法是基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单克隆抗体相结合，在外磁场作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面标记抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，因此不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠分离法有阳性分选法和阴性分选法，阳性分选法的磁珠结合的细胞是所要分离获得的细胞，而阴性分离法的磁珠结合的细胞为不需要细胞。免疫磁珠分离法初次获得的靶细胞纯度不高，因此需要对靶细胞进一步富集纯化。

由于肿瘤干细胞既能发生对称性分裂，引起肿瘤干细胞的自我更新，也能发生非对称性分裂产生干细胞与祖细胞，后者可进一步分化成后代细胞。因此如何使分选出来的乳腺癌上皮细胞富集更多的乳腺癌干细胞，并且保证干细胞只发生对称性分裂而不发生或少量发生分化，是研究人员一直致力研究的课题。

发明内容

本发明提出了一种乳腺癌干细胞的分离方法，解决了现有技术中的不足，该分离方法所获得的细胞表面因不含有抗体和磁珠的干扰；而且可保证乳腺癌细胞的分离效率及其乳腺癌干细胞富集后的纯度；不仅能高效分离数量较少的乳腺癌上皮细胞，而且缩短了分离时间，降低了分离成本，安全有效。

本发明的技术方案是这样实现的：一种乳腺癌干细胞的分离方法，采用胸腔穿刺手术收集的胸水进行乳腺癌干细胞的分离，将采集的胸水在2-4小时之内处理，具体步骤如下：

（1）制备胸水单细胞悬液：

在转速为400-600rpm下离心胸腔穿刺手术收集的胸水，以最大程度减少对细胞的损伤，并充分收集目标细胞；用含有1.5-2.5%热灭活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

由于乳腺癌胸水转移大多为血性，含大量红细胞，其红细胞含量往往超过StemSepTM(StemCell Technologies)的纯化能力，因此可用红细胞裂解液（Tris-NH₄Cl）将离心洗涤后的细胞碎片中的红细胞裂解，再用Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片，所得到的乳腺癌组织细胞中不含红细胞，可进一步用于后续乳腺癌干细胞的分选；

（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液：

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5x10⁶-1x10⁹/ml，将生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步骤（1）得到的单细胞悬液中，于0-4℃下孵育25-35分钟后，加入50-70μl免疫磁珠，混匀，于0-4℃下再孵育25-35分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；再用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为乳腺癌上皮细胞液。其中，所述生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步骤（1）得到的单细胞悬液中，加入的每一种抗体比例按20μl抗体相对于5x10⁷细胞/100μl细胞悬液，所述血型糖蛋白A按22-27μg/ml加入到单细胞悬液中；（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球：

将步骤（2）中得到的乳腺癌上皮细胞液在转速为400-600rpm下进行离心，用平衡盐溶液洗涤后，种植在培养板里，用含有bFGF、EGF、胰岛素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培养基进行培养两周，肿瘤细胞呈球状生长，得乳腺癌干细胞球。其中，所述的DMEM/F-12HAM培养基中bFGF的含量为8-12ng/mL，EGF的含量为18-22ng/mL，胰岛素的含量为3-7μg/mL，牛血清白蛋白的含量为0.2-0.6%；所述的采用DMEM/F-12HAM培养基培养时的培养条件为：在温度为37℃，5%CO₂中培养，且每周更换培养基2-3次；所述的使用的培养板为6孔超低粘附培养板或24孔超低粘附培养板。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）由于乳腺癌上皮细胞是异质性细胞，不仅包括乳腺癌干细胞，还包括分化的乳腺癌细胞。因此，本发明选择使用免疫磁珠阴性分选法，去除与特异性单抗-磁珠结合的非乳腺癌细胞，保留不含有特异性单抗-磁珠结合的乳腺癌上皮细胞，所获得的细胞表面因不含有抗体和磁珠的干扰，有利于后续实验。

（2）本发明首次将MACS阴性分选法运用于乳腺癌干细胞的分离中，去除StemSepTM抗体结合的阳性细胞，保留分选纯化后的阴性乳腺癌上皮细胞。由于乳腺癌干细胞是一群CD44+CD24-的异质性细胞群，并且在肿瘤组织中的比例只有约2%-5%，缺乏特异性抗体，因此很难用常规方法进行分离纯化，MACS的磁性微珠可偶联在高度特异性的单克隆抗体上，从而通过抗体对抗原的特异性识别与目标细胞相连，并在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。因此，MACS阴性分选法适用于缺乏特异性抗体的肿瘤细胞筛选，所以将此方法运用于在本发明中，可保证乳腺癌细胞的分离效率及其乳腺癌干细胞富集后的纯度。

（3）本发明提供的方法替代了用流式细胞仪进行分离，不仅能高效分离数量较少的乳腺癌上皮细胞，而且缩短了分离时间，降低了分离成本，安全有效。

（4）本发明提供的非粘附肿瘤细胞微球体法，可使乳腺癌干细胞富集，能使分选出来的乳腺癌上皮细胞富集更多的乳腺癌干细胞，流式细胞仪分析富集后的乳腺癌干细胞纯度可达到70%左右；CD44+CD24-特异性高，不仅显著提高了乳腺癌干细胞的纯度，而且为后续乳腺癌干细胞的扩增培养及乳腺癌干细胞系的建立奠定了良好的基础，并且保证干细胞只发生对称性分裂而不发生或少量发生分化。

具体实施方式

下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实例主要采用加拿大多伦多总医院乳腺癌患者胸腔穿刺手术收集的胸水进行乳腺癌干细胞的分离，将采集的胸水在2-4小时之内处理，具体步骤如下：

（1）制备胸水单细胞悬液：

在转速为500rpm，温度为4℃下离心胸腔穿刺手术收集的胸水20分钟，以最大程度减少对细胞的损伤，并充分收集目标细胞；用含有2.0%热灭活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液：

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁸/ml，然后在100μl的5x10⁷细胞中加入生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A，各抗体的用量均为20ul，血型糖蛋白A的用量为25μg/ml，然后在0℃的冰上孵育30分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于0℃的冰上再孵育30分钟，用100μl MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；再用1ml MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将500μl细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为乳腺癌上皮细胞液；

（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球：

将步骤（2）中得到的乳腺癌上皮细胞液在转速为500rpm下进行离心，用平衡盐溶液洗涤后，种植在培养板里，用含有bFGF、EGF、胰岛素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培养基进行培养两周，肿瘤细胞呈球状生长，得乳腺癌干细胞球。其中，所述的DMEM/F-12HAM培养基中bFGF的含量为10ng/mL，EGF的含量为20ng/mL，胰岛素的含量为5μg/mL，牛血清白蛋白的含量为0.4%；所述的采用DMEM/F-12HAM培养基培养时的培养条件为：在温度为37℃，5%CO₂中培养，且每周更换培养基2次；所述的使用的培养板为6孔超低粘附培养板。

实施例2：

本实例主要采用加拿大多伦多总医院乳腺癌患者胸腔穿刺手术收集的胸水进行乳腺癌干细胞的分离，将采集的胸水在2-4小时之内处理，具体步骤如下：

（1）制备胸水单细胞悬液：

在转速为400rpm，温度为4℃下离心胸腔穿刺手术收集的胸水25分钟，以最大程度减少对细胞的损伤，并充分收集目标细胞；用含有2%热灭活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液：

用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至1×10⁹/ml，然后在100μl的5x10⁷细胞中加入生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A，各抗体的用量均为20ul，血型糖蛋白A的用量为22μg/ml，然后在冰上孵育35分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，在冰上再孵育25分钟，用100μl MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；再用1ml MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将500μl细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为乳腺癌上皮细胞液；

（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球：

将步骤（2）中得到的乳腺癌上皮细胞液在转速为450rpm下进行离心，用平衡盐溶液洗涤后，种植在培养板里，用含有bFGF、EGF、胰岛素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培养基进行培养两周，肿瘤细胞呈球状生长，得乳腺癌干细胞球。其中，所述的DMEM/F-12HAM培养基中bFGF的含量为8ng/mL，EGF的含量为22ng/mL，胰岛素的含量为7μg/mL，牛血清白蛋白的含量为0.2%；所述的采用DMEM/F-12HAM培养基培养时的培养条件为：在温度为37℃，5%CO₂中培养，且每周更换培养基3次；所述的使用的培养板为24孔超低粘附培养板。

实施例3：

本实例主要采用加拿大多伦多总医院乳腺癌患者胸腔穿刺手术收集的胸水进行乳腺癌干细胞的分离，将采集的胸水在2-4小时之内处理，具体步骤如下：

（1）制备胸水单细胞悬液：在转速为600rpm，温度为4℃下离心胸腔穿刺手术收集的胸水20分钟，以最大程度减少对细胞的损伤，并充分收集目标细胞；用含有2%热灭活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

（2）免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞：用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5×10⁶/ml，然后在100μl的5x10⁷细胞中加入生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A，各抗体的用量均为20ul，血型糖蛋白A的用量为27μg/ml，然后于4℃下孵育35分钟后，加入60μl免疫磁珠，混匀，于4℃下再孵育25分钟，用100μl MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；再用1ml MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将500μl细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为乳腺癌上皮细胞液；

（3）采用非粘附培养法将步骤（2）得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球：

将步骤（2）中得到的乳腺癌上皮细胞液在转速为400rpm下进行离心，用平衡盐溶液洗涤后，种植在培养板里，用含有bFGF、EGF、胰岛素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培养基进行培养两周，肿瘤细胞呈球状生长，得乳腺癌干细胞球。其中，所述的DMEM/F-12HAM培养基中bFGF的含量为12ng/mL，EGF的含量为18ng/mL，胰岛素的含量为3μg/mL，牛血清白蛋白的含量为0.6%；所述的采用DMEM/F-12HAM培养基培养时的培养条件为：在温度为37℃，5%CO₂中培养，且每周更换培养基2次；所述的使用的培养板为24孔超低粘附培养板。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种乳腺癌干细胞的分离方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)制备胸水单细胞悬液；

(2)免疫磁珠阴性分选，分离去除非乳腺癌细胞，得乳腺癌上皮细胞液；

(3)采用非粘附培养法将步骤(2)得到的乳腺癌上皮细胞液进行富集纯化，然后得乳腺癌干细胞球；所述步骤(1)为：离心胸腔穿刺手术收集的胸水，充分收集目标细胞；用含有热灭活的胎牛血清和平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

所述离心胸腔穿刺手术收集的胸水的转速为400-600rpm；所述胎牛血清的热灭活含量为1.5-2.5％；所述平衡盐溶液为1.5-2.5mmol/L的Hank平衡盐溶液；所述红细胞裂解液为Tris-NH₄Cl；所述步骤(2)为：用MACS缓冲液重悬细胞，过100μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至5x10⁶-1x10⁹/ml，将生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步骤(1)得到的单细胞悬液中，于0-4℃下孵育25-35分钟后，加入50-70μl免疫磁珠，混匀，于0-4℃下再孵育25-35分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；再用MACS缓冲液预洗磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，该细胞液为乳腺癌上皮细胞液。

2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞的分离方法，其特征在于：所述生物素标记的人造血细胞抗体，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步骤(1)得到的单细胞悬液中，加入的每一种抗体比例按20μl抗体相对于5x107细胞/100μl细胞悬液，所述血型糖蛋白A按22-27μg/ml加入到单细胞悬液中。

3.根据权利要求2所述的一种乳腺癌干细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤(3)中进行富集纯化乳腺癌上皮细胞液的方法为：将步骤(2)中得到的乳腺癌上皮细胞液进行离心，用平衡盐溶液洗涤后，种植在培养板里，用含有bFGF、EGF、胰岛素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培养基进行培养两周，肿瘤细胞呈球状生长，得乳腺癌干细胞球。

4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌干细胞的分离方法，其特征在于：所述离心分离后得到的乳腺癌上皮细胞液的转速为400-600rpm。

5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中的DMEM/F-12HAM培养基中bFGF的含量为8-12ng/mL，EGF的含量为18-22ng/mL，胰岛素的含量为3-7μg/mL，牛血清白蛋白的含量为0.2-0.6％。

6.根据权利要求5所述的一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用DMEM/F-12HAM培养基培养时的培养条件为：在温度为37℃，5％CO₂中培养，且每周更换培养基2-3次；所述步骤(3)中所使用的培养板为6孔超低粘附培养板或24孔超低粘附培养板。