CN105838661A - Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用 - Google Patents

Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。通过对klotho基因的编辑来保护异种肾脏免受急性和慢性损伤，维持异种肾脏正常的状态和功能，延长异种肾脏在受体内的存活时间。

Description

Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用
技术领域
本申请涉及异种器官移植领域，涉及对异种器官供体进行抗衰老基因编辑。
背景技术
器官移植是器官衰竭疾病末期最有效的治疗手段，但是供体器官短缺的现状严重制约了器官移植手术的开展。我国供体器官短缺状况极为严重，每年仅肾脏移植患者就多达100万，而全国可以开展的肾脏移植手术不超过1万例，因此，同种异体器官已经远远不能满足器官移植的需要，亟待寻找新的供体器官来源。
异种器官移植是指将其它物种的器官、组织和细胞移植到人体。异种器官来源丰富，有望成为解决人类供体器官不足的根本途径之一。其中，猪器官的构造、大小、血管分布与人极为相似，因此，猪成为了最为理想的异种器官来源。在过去的十几年间，开展了大量猪到灵长类动物的异种器官移植研究和实验，也取得了显著的进步。
与同种异体器官移植相比，由于不同物种之间的遗传背景差异更大，异种器官移植后产生的免疫反应也会更加强烈。为此，大量的研究专注于克服异种器官移植所伴随的强烈免疫排斥反应。按照发生的先后顺序，异种器官移植的免疫排斥反应分为：超急性免疫排斥反应、急性血管排斥反应、细胞排斥反应以及慢性排斥。超急性排斥反应主要由于在猪的细胞表面存在α-1，3半乳糖基抗原决定簇，而人体存在相应的天然抗体。当猪的器官植入人体后，体内存在的天然抗体与α-1，3半乳糖基抗原决定簇结合，并激活补体系统，使得植入人体的异种器官在数分钟到数小时内，因免疫排斥而坏死。为了克服超急性免疫排斥反应，在2003年时，Phelps等人获得了敲除了α-1，3半乳糖转移酶基因的克隆猪(GTKO)，在2005年Kuwaki等人将GTKO修饰的猪心脏成功地移植到狒狒体内，该异种心脏在狒狒体内的最长存活时间达6个月。该实验结果表明，对异种器官的基因修饰能够有效地抑制异种移植物在受体内的免疫排斥反应。
除了强烈的免疫排斥反应之外，异种器官移植面临的另一个挑战是异种器官在受体内的凝血功能异常和血栓性微血管病。血管内凝血紊乱主要是由免疫排斥引起血管内皮损伤和不同物种之间凝血调节相关的信号分子和受体存在一些差异，导致内皮细胞的激活；内皮细胞的损伤和活化会导致广泛血栓、出血和组织坏死。为此，Mohiuddin等人在GTKO/hCD46双基因修饰的基础上，将人的凝血调节蛋白基因转入猪的基因组，该三基因修饰的GTKO/hCD46/hTBM猪心脏移植到狒狒体内存活的时间超过了1年。
异种肾脏移植面临的问题更为复杂。将GTKO/hCD46双基因修饰的猪肾脏移植到狒狒体内后，最长存活时间为83天，远短于相同条件下异种心脏的存活时间(236天)。除了存活时间短，肾脏移植后容易出现由慢性肾病导致的移植肾慢性失功。慢性肾病的发生是多因素导致的，包括免疫排斥、免疫抑制剂的肾毒性、微血管病变等。因此，为了延长异种肾脏在人体存活时间和维持异种肾脏在人体正常功能，需要进行新的基因修饰。
发明内容
本发明提供一种新的异种肾脏移植方法。
本发明提供一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。
可以将人Klotho基因转入猪的基因组，将经过修饰的猪肾脏移植到人体。
一种人Klotho基因在制备保护猪血管内皮细胞的试剂中的应用。
随着人Klotho浓度增大，对猪血管内皮细胞的保护作用不断增强。随着klotho处理时间的延长，对猪血管内皮细胞的保护作用逐渐增强。
一种人Klotho基因在制备抑制猪血管内皮细胞NF-κB信号通路的试剂中的应用。
一种Klotho基因在制备保护移植肾脏免受损伤的药物中的应用。
一种Klotho基因在制备提高肾脏抗凋亡能力的药物中的应用。
该药物通过提高Klotho基因的浓度或含量，来有效保护肾脏和延长移植肾脏的存活时间。
Klotho基因可以是人基因或猪基因。
本发明的有益效果是：对klotho基因的编辑来保护异种肾脏免受急性和慢性损伤，维持异种肾脏正常的状态和功能，延长异种肾脏在受体内的存活时间。
附图说明
图1是显示不同浓度人血清对猪血管内皮细胞溶解作用的结果图；
图2是显示不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用的结果图；
图3是显示不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用的结果图；
图4是显示Western blot检测klotho处理对于猪血管内皮细胞NF-κB信号通路的影响的结果图；
图5是慢病毒载体pLVX-klotho的结构示意图；
图6是PCR鉴定稳转细胞株的结果图；
图7是显示人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤能力的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
Klotho(Genbank ID：9365(人)和ID：100519728(猪))基因最初被发现时是一个与抗衰老相关的基因，klotho基因的表达紊乱会导致寿命缩短、高磷血症、动脉粥样硬化和骨质疏松等一系列表型，而这些表型与慢性肾脏病(CKD)的临床表现具有高度的相似性。在CKD早期，患者血清中klotho蛋白质含量呈下降趋势，可作为较早出现的生物学标志物之一，而且随着CKD的发展klotho蛋白质含量的下降愈发明显。
Klotho基因主要在肾脏表达，其产物有膜结合型和分泌型两种蛋白，分别作为膜结合受体和体液调节因子。klotho蛋白能够调节体内的钙磷代谢平衡减轻CKD患者的血管钙化，抑制氧化应激保护肾脏免受缺血和炎症的损伤，抑制Wnt通路激活导致的肾小管上皮细胞凋亡。因此，klotho基因可以作为异种肾脏移植的候选基因，能够保护移植肾脏免受急性和慢性损伤，提高肾脏的抗凋亡能力，维持移植后肾脏正常的状态和功能。
一、实验方法
1.不同浓度人血清对猪的血管内皮细胞溶解试验
将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，培养至第4天细胞基本铺满培养板底部，加入含正常人AB型血清的培养液，终浓度分别为5％，10％，25％、40％，以相应浓度胎牛血清为对照，每组各取3孔。放入37℃孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活率，实验重复3次。
2.不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用
将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含人klotho的培养液，终浓度分别为0.2nmol，0.4nmol，0.6nmol，1.0nmol和1.5nmol，每组取3孔，孵育48h后，加入终浓度为20％的正常人AB型血清，放入37℃孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活率，实验重复3次。
3.不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用
将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含人1.0nmol klotho的培养液，分别培养4h，8h，24h，48h和72h，每组取3孔。分别加入终浓度为20％的正常人AB型血清，放入37℃孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活率，实验重复3次。
4.Klotho处理猪血管内皮细胞对NF-κB信号通路的影响
将猪血管内皮细胞接种于6孔培养板，每孔10000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含人1.0nmol klotho的培养液，培养48h。分别加入终浓度为20％的正常人AB型血清处理4h，2h，40min和20min后，裂解细胞，提取蛋白质，采用anti-IκBα、anti-p65和anti-actin抗体，进行Western Blot检测。
二、实验结果
1.不同浓度人血清对猪的血管内皮细胞溶解
如图1所示，随着人血清浓度的提高，猪的血管内皮细胞的存活率不断降低。
2.不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用
如图2所示，在低浓度条件下，随着klotho浓度增大，对猪血管内皮细胞的保护作用不断增强；在1.0nmol条件下，猪血管内皮细胞的存活率最高。
3.不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用
如图3所示，随着klotho处理时间的延长，对猪血管内皮细胞的保护作用逐渐增强；在48h时候，klotho对猪血管内皮细胞保护作用最为显著。
4.Klotho处理猪血管内皮细胞对NF-κB信号通路的影响
实验证明，A20，HO-1和bcl-2等基因的过表达能显著延长异种器官在受体内的存活时间。进一步研究发现，这些基因保护功能的发挥都是通过抑制NF-κB信号通路来实现。因此，申请人检测klotho处理猪血管内皮细胞后，调控NF-κB信号通路的两个关键蛋白p65和IκBα在细胞内的含量。
如图4所示，随着人血清处理时间的延长，NF-κB信号通路呈现先激活后减弱的变化趋势。使用klotho预处理的猪血管内皮细胞，两个关键调控蛋白p65和IκBα含量都显著低于对照组，该结果表明klotho预处理猪血管内皮细胞后，能减弱NF-κB信号通路的激活，与预期一致。
表达细胞株构建及杀伤实验
1、Klotho过表达稳转猪血管内皮细胞株构建
以人的cDNA文库为模板，设计上下游引物(F：CCCATGGGCTACCACAGGTAAACATT(SEQ ID NO：2)和R：GGAATTCCATGCCCGCCAGCGCCCCG(SEQ ID NO:3)，斜体分别为EcoRI和NotI酶切位点)扩增klotho基因(SEQ ID NO:1)。经酶切后，构建慢病毒载体pLVX-klotho，经酶切、测序鉴定后，转染到293T细胞包装慢病毒，经纯化后，感染猪血管内皮细胞，通过puromycin筛选稳转细胞株，并由PCR(F：CTACCACAGGTAAACATTCAGGT(SEQ ID NO：4)和R：ATGCCCGCCAGCGCCCCGCCGCGCCG(SEQ ID NO：5))鉴定，鉴定结果如图6所示。慢病毒载体pLVX-klotho的结构如图5所示。
2.人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤
将klotho过表达稳转细胞株接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，培养48h后加入终浓度为20％的正常人AB型血清，放入37℃孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活率，实验重复3次。
3.人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤能力
如图7所示，klotho过表达细胞株耐受人血清杀伤的能力有显著的提高。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (5)

1.一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。
2.一种人Klotho基因在制备保护猪血管内皮细胞的试剂中的应用。
3.一种人Klotho基因在制备抑制猪血管内皮细胞NF-κB信号通路的试剂中的应用。
4.一种Klotho基因在制备保护移植肾脏免受损伤的药物中的应用。
5.一种Klotho基因在制备提高肾脏抗凋亡能力的药物中的应用。
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