JPH0616040B2 - 血液試料の処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は血液試料の処理方法、特
に血液試料中の顆粒球からのリンパ球と単球との分離を
保証するための処理方法に関するものである。

【従来の技術】分離すべき二相の比重の中間比重を有す
チクソトロピックゲル状物質を用いて血液試料中の軽質
相と重質相を分離する方法が、米国特許第 3,852,194号
に概説されている。ゲル状物質と血液試料を一緒に遠心
分離器にかけることにより、ゲル状物質は流動し、分離
すべき相間に膜を形成する。この膜により、通常の実験
技術を用いて上相を除去することができる。該特許には
多種のゲル状物質の使用が示唆されている。即ち、これ
に必要な性質として以下の三基準が掲げられている。 （イ）分離する二相の比重の中間比重 （ロ）分離する二相に対し化学的不活性、および（ハ）
静置状態で本質的に流動しない（半硬直） 米国特許第 3,920,549号には該特許第 3,852,194号の方
法の改良が開示されており、ゲル状物質の比重より大き
い比重を有する固体成分の使用による改良である。「エ
ナジャイザ（energizer ）」と称される固体成分は通常
血液収集管の底に置かれ、遠心分離の間ゲル状物質と密
着しており、ゲル状物質が管壁に沿って上昇するのを容
易にする。従って、血液分画分の分離が促進され、かつ
二相分離が清潔になる。米国特許第 4,190,535号には、
凝固防止血液からのリンパ球、単球および血小板抽出方
法が教示されている。これは下記の基本的三段階方法で
ある。（１）血液成分と化学的に不活性であり、比重が
1.06 〜 1.077ｇ／cc間にある水不溶性、チクソトロピ
ックゲル状物質を凝固防止血液試料に入れ、（２）重い
赤血球と血漿，血小板，リンパ球および単球との間に膜
を形成するに充分な時間、ゲル状物質−血液試料を1200
Ｇ以上の力で遠心分離した後、（３）血漿，血小板，リ
ンパ球および単球を膜上方より採取する。この特許の方
法にはその時広く利用されている分離技術の改良も包含
されている。凝固防止ヒト血液からリンパ球および単球
を分離するこの方法では、スエ−デン国ウプサラのファ
−マシアファインケミカルズ社（Ｐharmacia Ｆine Ｃ
hemicals ＡＢ）が市販している比重 1.077ｇ／ccのニ
ュ−トン流体「フィコ−ル−ペイク（Ｆicoll −Ｐaque
（登録商標）」を用い、約 400〜 500Ｇで約30〜40分間
血球を浮遊力遠心分離しようとするものである。しかし
ながら、フィコ−ル−ペイク流体を使用する方法では下
記の如き問題が生じている。 （イ）最初、血液試料をピペットでフィコ−ル−ペイク
流体上に移す間、白血球の該流体表面より下への展開が
生じ、フィコ−ル−ペイクの比重が減少しリンパ球およ
び単球の分離が不充分となり、（ロ）遠心分離中に血液
中の軽質相がフィコ−ル−ペイク媒質中に移送される
際、 400〜 500Ｇで生じる浮遊力が小さいため媒質を通
過して上昇することができず、（ハ）フィコ−ル−ペイ
ク流体は幾分水溶性であり、かつ遠心速度を増すと血液
中への溶解度が高くなり比重低下が生じるので、 400〜
500Ｇ以上の遠心力を用いることができず、（ニ）遠心
分離終了後、該流体のニュ−トン特性のためにフィコ−
ル−ペイク流体の上からのリンパ球および単球の採取に
は充分な注意を要し、かつ（ホ）この分離技術では完結
のため少なくとも一時間を必要とするので、より消費時
間の少ない方法が切望されている。 1200Ｇ以上の遠心力で膜形成能を有すチクソトロピッ
ク、非ニュ−トン、水不溶性ゲル状物質を用いることに
より、該特許第 4,190,535号に開示された方法はフィコ
−ル−ペイク流体を用いるよりも速く、かつより完全な
分離ができる。ゲル分離管を用いたヒト血液試料からの
単核血球（リンパ球や単球）の分離に関する長期的研究
により、分離性能は血液試料採取時からの経過時間の函
数であることが示されている。従って、新鮮な採取血液
では純度85％以上で単核血球は定量的に回収されてお
り、血液採取後相対的に僅か時間が経過した後は、回収
血球は未分離の全白血球数に近似している。血液採取後
の時間経過とともに、ゲル膜上に沈積した単核血球の顆
粒球による汚染が増加することでこの現象は実証されて
いる。図１において、三種類の異なる血液試料について
の分離性能に対する時間の影響が、1400Ｇで10分間遠心
分離した後のゲル膜上に回収された単核血球の百分率で
示されている。図から判るように、新鮮な採取血液試料
では純粋な単核血球が得られているが、僅か30分経過で
血球純度低下が目立ち、２時間後にはその低下が著し
い。従って、性能の急激な低下は患者にとって重要な問
題である。例えば、白血球、特にリンパ球の正確な測定
は組織適合性決定に非常に大切なものである。免疫抑制
に要す薬物治療の型と程度を決定しなければならない場
合に、リンパ球機能の表示が要求される。図２では高温
になると浮遊力減少が加速されることが示されている。
このように、図２の曲線は同一血液の二試料について温
度を変え、同一ゲルおよび方法を用いて実施した単核血
球量測定結果を示しており、図１で議論したように変化
している。古い血液の純単核血球を採取することができ
ないことは、膜に用いるゲル状物質とは無関係のように
思われ、顆粒球の浮遊力の明白な変化によるものと考え
られる。正常な血液試料から異常なものまで観察するこ
とにより、与えられた血球の型の密度集団内において血
球密度が広く変化していることが判る。血漿を通しての
沈降速度において、理論的条件下に移動する血球試料の
密度を数学的に検討すると、その密度集団上で各血球型
のガラス分布を示す。そのガラス分布は尾引き赤血球に
重なった顆粒球、尾引き顆粒球に重なったリンパ球およ
び尾引きリンパ球に重なった単球によるものである。血
球密度の重なりの増加が予期されるいくつかの方法があ
る。試験管での加令が血球型の重なりを生じさせる一方
法である。典型的な血球密度は多くの単一体の平均値で
あり、正規分布の両端において試料は相当な重なりを示
すことが考えられる。病理学上の試料では血球集団の重
なりが変化することが考えられるが、事実その全集団が
位置を変えている。これらの条件が分離性能の変化に著
しく影響することが考えられる。血球の密度と量の変化
に寄与する機構を広く検討した。細胞膜を通っての移送
に関する三つの基本的考え方を見い出した。即ち、拡
散、促進移送および能動移送である。種々の薬品により
活性化されたり、妨害されたりする各種の独立した通路
があり、この移送は複雑である。Ｎa ⁺ Ｋ⁺ ポンプはか
かる移送システムの一つである。血球環境の浸透圧の変
化は血球内外へのイオンの移送に通じ、その結果水容量
の変化が起こる。この水容量の変化は先ず血球サイズと
密度の変化に影響する。血球体積規制に関し、「バイオ
シミカ エト バイオフィジカ アクタ（Ｂiochimica
Ｅt Ｂiophysica Ａcta ）」， 774（1984）， 159〜 1
68ペ−ジ、エルスビエ− サイエンス パブリッシャ−
ズ社（Ｅlsevier Ｓcience ＰublishersＢv ．）に詳
述されている。アイア−ルエルプレス（ＩＲＬ Ｐres
s）発行の第７章「ヨウ素化密度勾配媒質」（Ｄr ．
Ｄ．Ｒickwood 編集）には、密度勾配液体血球分離技術
と方法についての詳述がある。理論的には、浸透圧が10
％増加すると血球密度が 0.4％増加し、血球半径が 2.2
％減少することが、その文献には示されているＤr ．Ｒ
ickwood によると、ナイコデンズ（Ｎycodenz ：登録商
標）とＮa Ｃｌを用いて分離媒質密度と浸透圧とを独立
して調整できる。ナイコデンズはニュ−ヨ−ク州ウエス
トバリイのアキュレイト ケミカル アンド サイエン
ティフィック コ−ポレ−ション（Ａccurate Ｃhemica
l and ＳcientificＣorporation）が市販している密度
勾配媒質の登録商標であり、その分子量は 821で密度
2.1ｇ／mlである。化合物名はＮ，Ｎ′−ビス（２，３
−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒ
ドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリ
ヨウ素−イソフタルアミドである。リンパ球から単球の
分離にこの媒質を用いること、および浸透圧の増加に伴
ない、単球の純度が変化することが記載されている。沈
降勾配が使用されている。液状勾配媒質を用いる血球分
離において、三つの型の勾配が使用されている。その第
一のものが沈降勾配である。沈降速度の変化のため所定
時間内に分離すべき一群の血球は管底に集まり、残りは
表層液体中に存在する。第二，第三の型のものは浮遊密
度勾配である。このうちの一つは不連続勾配で、試料は
その上に置かれる。沈降後、一群の血球は勾配液体の上
方に集まり、他の群はその下方に集まる。他の一つは連
続勾配と称されるもので、この媒質では遠心分離により
媒質中の巨大分子は底の方へ動くことになり、連続密度
勾配を形成する。この媒質中の血球はその密度により勾
配中に位置する。従って、上述の密度集団の重なりが生
じることが判る。リンパ球は人の免疫システムで重要な
役割を果している。リンパ球は採取され、化学，生理学
における免疫機構の究明研究で重要な役割を果すものと
して使用されている。例えば、ガンや自己免疫症の研究
で重要な役割を演じ、モノクロナ−ル抗体技術の基本的
なものとなっている。多くの場合、顆粒球や赤血球によ
ってリンパ球が汚染されると、化学的架橋反応性のため
にその試料は使用できなくなる。このため、リンパ球分
離方法では定常的に90％以上の純度で製造できなければ
ならない。ゲル分離機構は通常の浮遊密度分離とは基本
的に異なるものである。前者では、密充填時の密度が
1.09 ／ccに近い赤血球の集団で管底のゲルが遠心力に
より置換される。一団の充填血球に成長した時、約 1.0
65〜 1.077ｇ／ccの密度を有すゲルは浮遊力で管を上昇
する。血球懸濁液がゲルの密度に近似する位置でそのゲ
ルは静止する。この位置は、赤血球，白血球および血漿
の混合物の密度がゲルの密度に等しいか、実質的に同じ
であるところである。この平衡位置において、伸長した
ゲル塊は赤血球集団の浮遊力により固定される。ゲル塊
上方の血球懸濁液はゲル塊の密度より小さい。従って、
遠心分離により自重でゲルは圧縮されることになる。こ
の圧縮力でゲルは管の中心方向へ押され、その塊りは水
時計配列のようになると考えられる。ゲル塊は収縮した
り密閉したりする速度やその程度は血球勾配速度に支配
される。ゲル密閉が起る時、血球流はしばしばゲル塊に
捕捉されている希薄な血球流で希釈され、その結果、本
質的に大理石状となる。ゲル下方に血球が密充填される
際、ゲル下方に捕捉されている血漿は泡を形成し、その
泡が充分大きければゲルを通って上部へ移動し、ゲル表
面上で、いわゆる「熱溶岩模様」を形成する。ついでゲ
ルは血漿が残した空間を埋めて沈着する。ゲル密閉が起
る条件は数学的に推定可能である。例ば、血球勾配の浮
遊力がゲルを圧縮する浮遊力以下になる条件である。平
衡状態ではこれらの浮遊力は等しい。もし、このシステ
ムが勾配以上で作用することも無視すると、この概念を
簡略化できる。従って、生産物密度の総計と相の容量パ
−セントは相等しいとすることができる。赤血球の公称
密度は約 1.10 ｇ／cc、白血球の密度は約 1.075、血漿
の密度は約 1.027およびゲルの密度は約 1.065である。
上記数値を用いて二つの境界条件を規定することができ
る。一方の境界条件は全て白血球の場合であり、他方の
境界条件は全て赤血球の場合である。故に、血漿と白血
球だけの場合： 1.075（x ）＋ 1.027（１−x ）＝ 1.065（１） ここでx ＝白血球の％ x ＝（ 1.065− 1.027）÷（ 1.075− 1.027）＝約 0.7
9 ＝約79％ 血漿と赤血球だけの場合： 1.10 （x ）＋ 1.027（１−x ）＝ 1.065（１） ここでx ＝赤血球の％ x ＝（ 1.065− 1.027）÷（ 1.10 − 1.027）＝約 0.5
2 ＝約52％ 従って、密度約 1.065ｇ／ccのゲルを使用すると、懸濁
液の血球混合状態により、血漿中に50〜80％の血球が充
填した血球懸濁液流上にゲルが密着することになる。ゲ
ル密度が変化すると境界条件が変化することが明らかで
ある。粘調液体中において重力で動く球状粒子の末端速
度もまた数学的に式で近似することができる。しかしな
がら、単一粒子群の場合のみ、この式は有効である。そ
の速度は粒子と媒質の密度差、粒子径の二乗に比例し、
媒質粘度に反比例する。それにもかかわらず、この式を
各型の血球に適用すると、実際の相分離の結果と幾分反
対の結論が予測される。このように、実際の分離方法で
は赤血球が最初のように思われる。血球懸濁液が非常に
密なため、塊りと等しい半径の塊りの中で動く多くの赤
血球と共に、血球塊の流れが発生することを観察するこ
とでこの現象は説明される。赤血球が最初かつ最後のよ
うに思われる。即ち、集団化や塊り効果のために最初に
なり、分離中に血球懸濁液が希薄になると最小血球が最
後になるように、上記式に従って個々の血球は移動する
ので最後となるのである。従って、血球懸濁液勾配の先
端はその末端より異なる影響下で移動する。結果的に
は、実質的に赤血球汚染が避けられない。懸濁血球が充
填血球塊に近づくと、小血球より本来的に急激に動く大
血球の動きは、血球懸濁液の密度が増加するので遅くな
る。赤血球濃度約60％で懸濁液密度はリンパ球密度に近
くなる。その流れは充分密でゲルを開放状態に保つ。従
って、ゲル上方に位置したままかつゲル密閉前に、その
密度によって、白血球の動きが遅くなるか、または逆方
向になることが判る。分離のこの段階において下方に移
動している多数の赤血球は白血球上部に沈積することが
考えられ、この作用に反する傾向になる。白血球が順次
赤血球を保持するので、少なくとも部分的にはこの動き
で赤血球汚染を説明することもできる。個々の相の密度
によって血球が層を形成し始めるのが、このことであ
る。従って、濃縮血球懸濁液はそれ自身が密度分離勾配
として作用するのである。ゲルが密閉するのは平衡に到
達する前であるが、実質的に密度分離が起る前ではな
い。ゲル密度が増加すると、管下方にそれは位置し、増
加圧縮力のためにすぐゲル密閉が起る。ゲル密度増加に
より血球収率が高くなることから、この作用は証明され
る。例示すると、ゲル密度が1.055ｇ／ccでは収率は15
〜20％と低いが、 1.08 ｇ／ccでは70〜80％となる。分
離したリンパ球は逆の作用をするので、高純度の相分離
を必要とする場合、この利点が失われる。故に二つの因
子間で最適値を選択する必要がある。上記議論から、殆
どの試料で90％以上の純度を得ようとしてゲルの物理的
性質だけを変えても満足すべきものが得られないことは
明白である。ゲルが一端密閉されると、個々の血球密度
は充分ではなく、ゲルを置換することができない。従っ
て、血球が血漿（密度約 1.027ｇ／cc）から出てゲル
（密度約 1.065）に入るとき、相対的な血球密度は無視
できる。血漿粘度の10万倍であるゲルの粘度は更に血球
速度を遅くする。故に、２〜３分間で血漿中を約５cm
（２インチ）移動する血球はゲル中で血球半径の深さだ
け沈むのに数日を要する。換言すればゲルはドアの役割
を果し、採取のためにゲル上に血球を乗せていることに
なる。かかる血球はリンパ球に富んだ赤血球と白血球の
混合物である。通常の液体密度分離媒質と異なり、ゲル
媒質は浮遊力密度分離において個々の血球上で作用しな
い。しかし、代わりにゲル媒質は懸濁液中で変化する血
球勾配の平均浮遊力密度に基づき管の中で一位置を占
め、本質的に沈降勾配上で閉じるドアとして作用する。
血球種の相対速度および血球自身の浮遊力密度効果のた
め、ゲル上に沈積する血球はリンパ球に富んでいる。赤
血球汚染は溶解（lysing）により除去できる。ゲル分離
活性を補うため精製には化学試薬の添加が必要である。
個々の血球は浮遊力密度平衡に到達しないので、上述の
速度式では速度の二乗が変数でありゲル媒質分離に血球
径は著しく影響する。しかし、血球塊および濃縮血球懸
濁液は動くので、速度効果が浮遊力密度効果で置換され
る時を判断するのは困難である。更に、下降中の赤血球
流に対抗して白血球が上昇するのを防止する赤血球捕捉
効果の評価も易しくない。加令により血球、特に顆粒球
の直径が大きくなること、および血球の大きさを強制的
に小さくすると加令血液試料の分離が著しく改良される
ことが知られている。従って、血球が大きくなると密度
は小さくなるが、加令効果で密度変化の５倍以上直径が
変化する。例えば、直径が2.2％変化すると血球沈降速
度は５％変化する。典型的な血球の直径を見てみると、
顆粒球の範囲はリンパ球の範囲に入り、単球は顆粒球の
最も広い範囲と重なる。赤血球の直径は最小のリンパ球
の直径にほぼ等しい。従って、各血球の直径範囲はかな
り重なりが生じることになる。結果的には、応分に実質
的分離が起るという事実でもって、血球の直径は殆ど同
じであるので、重なりができるだけ少ないところでは血
球密度がゲル分離において非常に重要な働きをしている
ことが示される。故に、分離の後半においては速度が沈
降状態を調節し、かつ分離の主要機構の因子である。血
球濃度勾配が高く、かつゲル密閉位置の上方にある場
合、密度の方が分離機構の支配因子である。血球懸濁液
が主として赤血球で形成されている場合には、それ自身
が分離勾配媒質になる。血球径および密度を変えるため
化学試薬を用いて血漿の浸透圧を変化させることは可能
である。従って、一血球種の血球はその血球種の集団中
心に向って移動し、それにより密度範囲は減少する。そ
の動きは血球集団の重なりの程度を少なくする効果があ
る。例えば、リンパ球沈降状態を先導する大きいリンパ
球はその集団中心に向って引戻される。過度の浸透圧化
学処理剤は小密度血球には効果が少ないので、小さな末
端顆粒球はそれほど影響されない。しかしながら、同時
に、大きな顆粒球は修飾され顆粒球集団の中心に向って
移動する。その他に、浮遊力密度効果は大きな顆粒球を
赤血球塊から出て上方向へ移動させようとする場合に、
この後者の作用は分離方法の結果に重要である。密度／
大きさ調節剤の使用により分離過程でリンパ球は保持さ
れ、顆粒球は管の下方に動くよう助長されることが、全
体の結論である。血球種にはより大きな分離距離が付与
されるので、ゲルはリンパ球集団中に顆粒球をより少な
く捕捉して密閉することができ、純度改良につながる。
上記化学処理は困難な試料の分離を改良すると同様に、
試料加令による不利益を無くすことができる。同様に、
軽度の浸透圧処理も血球拡大に使用することができる。
しかしながら、この方法は、血球の容積調節能によりそ
の効果が短かい。更に、この処理により血球破壊も起
す。

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一目的は
（１）ゲル修飾および（２）分離に先立ち血液試料を処
理する薬品使用によりゲル分離方法の性能を最適化する
ことにある。薬品処理は液体分離技術で使用できるの
で、米国特許第 4,190,535号にその好ましい態様が記載
されている。

【課題を解決するための手段】米国特許第 4,190,535号
記載のゲル密度が 1.065〜 1.077の範囲であることは驚
くべきことでない。各種の血球密度と共に新鮮な採取血
液およびＥＤＴＡ抗凝血剤を用いると、かなり良い結果
が得られる。基本的に競合する液体方法で密度1.077を
使い（この密度は顆粒球とリンパ球集団の間の密度「窓
（Ｗindow ）」に近似する）、かつゲル使用で浮遊力密
度に基づく個々のリンパ球分離可能性を予測できるとす
ると、この密度範囲は当然考慮されるべきものである。
事実、血漿中の赤血球および白血球からなるより低い血
球密度に基づきゲルは早目に密閉する傾向がある。二つ
の型のゲルを用いて実験で最適性能のゲル密度は 1.060
〜1.065の範囲である。リンパ球の最適分離のためのこ
の密度範囲は当業者にとって予期できないものである。
事実、分離機構の本質は未だ明白でない。ゲル密度が
1.055と低いところで許容可能な純度のものが得られ
る。 1.060〜 1.065範囲の密度を選択することで、密閉
領域を顆粒球が通過した後ゲル密閉が起こることにな
る。この密度範囲以上のゲルは単核球収率を向上させる
傾向にあるが、純度が低くなる。典型的に、 1.060〜
1.065範囲のゲルは液体密度勾配媒質より好収率を与
え、僅かに低い密度では収率を多少犠牲にしても純度が
改良されので、これも許容できる。リンパ球収率50％以
下ではある準集団の選択的分離に通じ、準集団中での変
移は誤った診断および／または研究結果の恐れがあるこ
とを、研究者は心配している。従って、血球試料調製に
対しゲル密度の影響を無視できる最小値がある。本発明
の第二の点は血球中の水を浸出させることにより血球密
度を増加させ、大きさを小さくするように、全血球試料
を薬品で処理することからなる。各血球密度集団の軽量
血球はかかる処理で最も影響を受けるので、沈降状態の
前方部では速度減少が起り、各血球種の密度集団の中心
方向に移動する。また、分離過程の後段階で浮遊力密度
が赤血球濃度に影響を与えると大きさが小さくなりかつ
密度が増加した大きな顆粒球はリンパ球集団から離れ管
下方向に移動するので、顆粒球とリンパ球集団の重なり
が減少する。この血球集団の希釈時にゲルが密閉するの
で、リンパ球が多く、顆粒球の少ないものが捕集され
る。最後に、血液試料の分離、特にゲル分離技術を増々
困難にする血液加令をこの処理により防ぐことができ
る。血球膜を通る分子移動を調節するのにいくつかの機
構があるので、密度／容積の調節には数種の異なる薬品
が使用できる。従って、最も簡易な方法では、懸濁液に
高張塩化ナトリウム水溶液のような多浸透薬品を添加す
ると浸透圧が変わり、血球から水が浸出する。かかる現
象が起る移送現象はまだ充分解明されていない。ここで
は、血球は活性化したり密度できる容積規制能を有すと
言うだけで、この目的には充分である。Ｎa ⁺ Ｋ⁺ ポン
プはかかる機構の一つである。何如なる場合にも、実際
に浸透圧を変える化学物質および／または浸透圧が変化
したと血液に考えさせるようなトリックを用いることが
できる。更に、容積変化を阻止する化学物質は、それ自
身が血液加令効果を妨げるのに推薦できる。これらの薬
品の組合せは補助的に作用することができる。密度勾配
媒質と比較して塩の費用は無視できる。従って、ナイコ
デンツのような化学物質媒質との組合せでＮa Ｃｌを使
用すると全体の費用を低減できる。ナイコデンツ密度勾
配媒質に加えて、勾配密度物質として有用な親油基を有
す下記のヨウ素化有機化合物を見出した。分子量 628の
メトリゾイック酸［３−アセトアミド−５−（Ｎ−メチ
ルアセトアミド）−２，４，６−トリ−ヨウ素安息香
酸］で、要望特性を示す一群の化合物の基本となるもの
である。特に有用な二種のメトリゾイック酸誘導体はそ
のナトリウム塩、すなわちメトリゾイック酸ナトリウム
およびメトリズアミド、すなわち２−（３−アセトアミ
ド−５−Ｎ−メチルアセトアミド−２，４，６−トリヨ
ウ素ベンズアミド）−２−デオキシ−Ｄ−グルコ−スで
ある分子量約 789の複合化合物である。これら二種はア
キュレイト ケミカル アンド サイエンティフィック
コ−ポレ−ションが市販している。上記有機分子の等
張性溶液は顆粒球密度回復に有効である。しかしなが
ら、これら化合物の高張性液はもっと急激に作用するこ
とが見出された。従って、本質的に速さのみが要求され
る時には、これら分子の高張性溶液を使用できるが、分
離費用は高くなる。本発明の方法は、顆粒球の浮遊密度
の明白な変化を防ぎ、ゲル分離媒質を使用して凝固防止
ヒト血液試料からのリンパ球と単球の純度または質を保
持することも目的としている。分離管に用いるゲルとし
ては、単球血球分離に予測できる密度範囲より充分以下
で、かつ米国特許第 4,190,535号の密度範囲外の密度の
ゲルを選択するのが望ましい。この予測できない条件は
これまで理解されてなかったゲル位置および密閉の新規
な方法によるものである。血球純度および血球収率が均
衡する好ましいゲル密度範囲は 1.060〜 1.065ｇ／ccで
ある。この着想によるゲル管はかなりの性能を示すが、
常に高純度のものが得られるとは限らない。ＥＤＴＡは
他の抗凝血剤に比して純度を改良する効果がある。ヘパ
リンは多くの場合に好ましい抗凝血剤であるが純度が許
容値以下になることが多い。第二の進歩性が試料の薬品
処理のところで必要となる。広く云えば、本発明の培養
過程では血液試料を本質的に血球と化学的に相溶である
低分子量イオン性物質を含む高張性液、および／又は本
質的に血球と化学的に相溶であって、その構造中に親油
基を有す高分子量有機分子を含む等張性液体または高張
性液体と、顆粒球の浮遊密度をほぼ本来の値に戻すに十
分な時間、たとえば一般的には１分間以上で典型的には
少なくとも10分間、接触させることを企図している。こ
れらの液の少なくとも一つを加えることで、図１および
２で示した浮遊密度の変化を防止できる。次に、顆粒球
からリンパ球と単球とを通常の方法で分離するには勾配
分離媒質、特に好ましくは前述の米国特許 4,190,535号
に記載されているような水不溶性、チクソトロピックゲ
ル状物質を用いることができる。密閉調節は困難である
ので、分離過程中に望ましい浮遊密度にするため低分子
量のイオン性物質を含む高張性液体および／または高分
子量有機分子の等張液体または高張性液体を必要量分離
媒質に添加することができる。従って、好ましくは上記
培養または予備処理段階を使用し、分離方法は下記４要
素からなる。 （イ）新鮮なまたは加令した凝固防止血液試料を低分子
量の有機および／または無機イオン性物質を含む高張性
液体および／または親油基を有す分子を持つ高分子量物
質を含む等張性液体または高張性液体と混合し、血液と
液体の接触時間を１分間以上保持し、（ロ）該血液試料
および該液体の成分と化学的に不活性な水不溶性、チク
ソトロピックゲル状物質を凝固防止血液−液体混合物に
加え、（ハ）リンパ球および単球とより重い血球との間
に膜を形成するのに充分ゲル状物質が流れるように、あ
る力で十分な時間（典型的には少なくとも約10分間）血
液−液体−ゲル混合物を遠心分離し、ついで（ニ）リン
パ球と単球を膜上方より採取する。 最も好ましくは、密度分離媒質として用いるチクソトロ
ピックゲル状物質は米国特許第 3,852,194号および第
4,190,535号に示されたような組成と約 1.055〜1.07 ｇ
／cm³ の間の比重を有し、遠心分離は少なくとも 1,200
Ｇの力で行う。また、米国特許第 4,190,535号で説明し
たように、血小板を含む血液の血漿画分もまた膜上方に
沈積浮遊するのも望ましい。血小板を含む血漿画分から
のリンパ球と単球の分離については米国特許第 4,190,5
35号に記載されており、同じ方法をここで用いることが
できる。従って、先行技術に記載されているより重い血
球からリンパ球と単球を分離する一般的方法と同様に、
血小板を含む血液の血漿画分からリンパ球と探求を分離
することについては本発明の主題ではない。参考文献 イクスペリメンタル セル リサ−チ（Ｅxperimental
Ｃell Ｒesarch）３，245〜 251（1978）の「アイソペ
イク（Ｉsopaque ）による血球密度の変化」の中でテ
ィ．エイ．ダヴリュ．スプリンタ−（Ｔ．Ａ．Ｗ．Ｓpl
inter ）、エム．ベンデカ−（Ｍ．Ｂendeker ）および
エイ．ヴァンビ−ク（Ａ．ven Ｂeek ）は、分離相とし
てのフィコ−ル−アイソペイク（Ｆicoll −Ｉsopaque
）法により予め血液試料からの分離した単核白血球を
培養基中37℃で培養したところ、この白血球の比重が減
少したことを観察している。培養を０℃で行うか、培養
基にフィコ−ル−アイソペイクを添加することで血球密
度の減少が妨げることを著者は発見している。培養基中
37℃での培養で減少した単核血球密度がフィコ−ル−ア
イソペイクと接触させることで回復することも発見され
た。更に研究を行ない、アイソペイクは血球密度を元の
比重に戻す機能を有す薬品であることが判明し、このこ
とから著者は密度勾配の成分としてアイソペイクのよう
な小さな分子量物質を使用すると単核白血球の比重を元
に変えることが出来る、という結論に到達した。しかし
ながら、著者は未分離血液の一般的加令現象を開示して
いないし、顆粒球についての効果も何ら記載していな
い。血液試料から予め分離したリンパ球の浮遊密度変化
についての彼らの観察では、顆粒白血球の作用に関して
は予測できるものではない。上記文献のディ．リックウ
ッド博士（Ｄr ．Ｄ．Ｒicwood）は、各種ヨウ化物が密
度を重くする効果があること、およびその変化によりリ
ンパ球からの単球分離効果を促進すること、を指摘し
た。

【実施例】通常の静脈切開術を用いて、５人の供血者か
らの全ヒト血液試料を、エイ・エイ・ルデラ−（Ａ．
Ａ．Ｌuderer）、エイ・ア−ル・ザイン（Ａ．Ｒ．Ｚin
e ）、ディ・エム・ヘス（Ｄ．Ｍ．Ｈess ）、ゼイ・エ
ヌ・ヘンヤン（Ｊ．Ｎ．Ｈenyan ）およびジ−・オドス
トルケル（Ｇ．Ｏdstrchel）、分子免疫学（Ｍoleailar
lmmunology ）、16， 621〜 624（1979）の「密閉系に
おける迅速かつ定量的ヒトリンパ球分離と精製」に記載
された密閉系リンパ球分離管に採取した。この著者が説
明しているように、ジメチルポリシロキサンおよび沈降
メチル化シリカ（メチル化により疎水性付与）で血液成
分に化学的不活性である水不溶性、チクソトロピックゲ
ルを調製した（米国特許第 4,190,535号）。抗凝血剤と
して作用するリチウムヘパリンを十分含有する殺菌した
シリコンガラス試験管の底にゲルを入れることで、分離
管を無菌的に作り、ついでゲル塊の中心に殺菌ポリエス
テルエナジャイザ（米国特許第 3,920,549号）を入れ
た。他の公知の抗凝血剤、例えばＥＤＴＡ、も同様に用
いることができる。ついで、分離管を真空排気した。何
故なら、プラスチックエナジャイザの比重がゲルより大
きく、遠心力でエネルギザ−がゲルを通過し、ゲルが試
験管壁を上昇するからである。これは満足すべき管性能
を保ちつつ、分離とゲル密閉形成を助長する。密閉系分
離器を用いることにより、血液試料取扱時の問題を少な
くする。しかしながら、米国特許第 4,190,535号記載の
如き開放管も用いることができる。例えば、米国特許第
4,101,422号および第 4,310,430号記載の如き血清分離
管調製から修飾したゲルも同じ操作性を示した。直ちに
血液試料を未冷却のテ−ブルトップ遠心分離器に装着
し、ついで1400Ｇで約10分間遠心分離し平衡に到達し
た。血小板に富む血漿、リンパ球および単球はゲル膜塊
上方に、他の重い血液成分は該膜の下方に分画された。
その後、血漿画分を慎重に採取すると、リンパ球および
単球が支配的である血球がゲル膜上に残存する。等張性
塩緩衝液を静かに管に注入し、液をピペットでかきまぜ
ゲル膜上に該血球の懸濁液とする。該血球懸濁液を管か
ら採取し、ついで 400Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシンおよびエオ
シン）染色血球数を計算することにより、膜上に保持さ
れた単核血球の百分率を決定した。これらの値を表１に
示す。他のヒト血液試料を抗凝血剤としてのリチウムヘ
パリンを含む管に入れ、ついで表１に示した希釈剤で希
釈した。単なる便宜上のため、該希釈液は血液３容量対
希釈剤１とした。表１に示した放置時間後、未加令血液
試料について前記した方法で血液試料を分離し、処理し
た。各ゲルの比重もまた表に示した。 表 １ 試料番号 希 釈 剤
放置時間 １ ０
０ １ 生理的食塩水^*
24時間 １ 生理的食塩水^**
24時間 １ メトリズアミド^*
24時間 １ メトリズアミド^**
24時間 ２ ０
０ ２ 生理的食塩水^*
24時間 ２ 生理的食塩水^**
24時間 ２ メトリズアミド^**
24時間 ３ ０
０ ３ 生理的食塩水^*
24時間 ３ 生理的食塩水^**
24時間 ３ 生理的食塩水^***
24時間 ４ ０
０ ４ 生理的食塩水^*
24時間 ４ 生理的食塩水^**
24時間 ４ メトリズアミド^*
24時間 ４ メトリズアミド^**
24時間 ５ ０
０ ５ 生理的食塩水^**
１時間 ５ メトリズアミド^**
１時間 ５ 生理的食塩水^**
２時間 ５ メトリズアミド^**
２時間 ６ ０
０ ６ メトリズアミド^**
２時間 ６ メトリズアミド^**
４時間 ゲル膜上 ゲ
ルの比重 試料番号 単核血球（％） （ｇ
／cm ³ ） １ 83
1.075 １ 63
1.075 １ 83
1.075 １ 63
1.075 １ 94
1.075 ２ 89
1.075 ２ 66
1.075 ２ 83
1.075 ２ 90
1.075 ３ 92
1.060 ３ 73
1.060 ３ 86
1.060 ３ 91
1.060 ４ 99
1.065 ４ 71
1.065 ４ 79
1.065 ４ 71
1.065 ４ 86
1.065 ５ 81
1.063 ５ 51
1.063 ５ 93
1.063 ５ 84
1.063 ５ 98
1.063 ６ 93
1.063 ６ 93
1.063 ６ 91
1.063 表１において、生理的食塩水^* は単一等張性Ｎa Ｃｌ水
溶液である。生理的食塩水^**は等張性液体の２倍のＮa
Ｃｌを含む高張性である単一Ｎa Ｃｌ溶液を意味し、生
理的食塩水^*** は等張性液体の３倍のＮa Ｃｌを含む高
張性液体である。メトリズアミド^* はその等張性水溶液
であり、メトリズアミド^**は等張性液体の２倍の添加剤
を含む高張性液体である。表１を図１および２との関係
で検討すると、次のような結論となる：第一に血液試料
が加令すると顆粒球の比重がリンパ球および単球に比例
して減少し、その減少速度は時間と温度の函数であり、
第二に、低分子量イオン性物質を含む等張性液体に全血
液が入っても血球比重に本質的に影響がなく、かつ第三
に、低分子量イオン性物質を含む高張性液体に全血が入
ると、血球比重減少が防止されるか、または元に戻り、
その程度は高張性液体の浸透圧変によるものである。

【発明の効果】高張性生理的食塩水と比較して、高張性
メトリズアミド溶液の方の効果が幾分大きい理由は充分
説明できていない。従って、三つの可能な機構が推論で
きる。第一は二溶液の浸透圧の違いである。第二は血球
膜の浸透規制要素と二つの溶質との間に生じる相互作用
の違いと仮定する。第三はメトリズアミド分子と血球膜
との相互作用の可能性で、これにより浸透圧考慮と別に
血球比重の増加を引起すかも知れない。更に、メトリズ
アミド、その誘導体および関連化合物中のベンズアミド
環は分子に極度の親油性を付与することが認められてい
る。従って、該分子が血漿膜への実質的溶解性を示し、
血球膜との相互作用が一層容易になると考えることがで
きる。（前記のナイコデンズ密度勾配媒質はベンズアミ
ド環を含まずかつその効果がその構造に親油基を有す有
機分子に見出されていないことに注視すべきである）血
球内［Ｎa ⁺ ］濃度はエネルギ−従属、血漿膜環境Ｎa
⁺ Ｋ⁺ ポンプ法により、血球で規制されていることは確
実である。従って、正常血球における血球内［Ｎa ⁺ ］
濃度は血球外［Ｎa ⁺ ］濃度よりも低く押えられてい
る。故に、高張性生理的食塩水からの［Ｎa ⁺ ］の侵入
は血球により積極的に防止される。本発明による血球分
離法のもう一つの実施例では、血球用培養基は顆粒球の
浮遊密度変化を防止する、および／またはその浮遊密度
損失を回復する薬品を構成する。自然環境の血球は、そ
れが正常に成長する恒常性系で生育する。試験管中の血
球は加令効果を示す傾向にあり、その結果、かかる系の
欠如により死滅する。試験管における血球成長を保持す
るための多種の培地が開発されている。典型的には、血
球は分離され、血球の倍地懸濁液中で成長する。全血液
の血球分離特性は、血球培養基を加えることで保持され
ることを見い出した。血球用血球培養基は肯定的結果を
与えるが、特にロスウェル パ−ク メモリアル イン
スティテュ−ト（Ｒoswell Ｐark Ｍemorial Ｉnstitu
te）培地およびマッコイ（Ｍc Ｃoy）培地は特に効果が
ある。例えば、約20〜50容量％のこれらの培地量で全血
液試料を希釈すると、分離純度は一般的に高張性塩溶液
およびナイコデンズ塩溶液を用いた時よりも良いものが
得られる。このように、純度は約83％から約93％に変化
することが観察された。ジャ−ナル オブ イミュノロ
ジカル メソッド（Ｊournal of Ｉmmunological Ｍet
hods）、73，29〜40（1984）の「新鮮血液および加令血
液についてのＴおよびＢ細胞の比較」で、ジェイ．ケ
イ．エイ．ニコルソンらは（Ｊ．Ｋ．Ａ．Ｎicholson e
t al）、細胞培養基による全血液試料の希釈について記
述し特にマッコイの5a培養基使用に注目している。しか
しながら、顆粒球からのリンパ球分離における培養基添
加の利点についての開示はない。云わば、定常的血液希
釈が単に示されているだけで、本発明の如き態様での培
養基使用可能性、即ち希釈剤としてだけでなく、全血液
の保存剤としての可能性についての認識は当然のこと、
その示唆もない。本発明におけるゲル状物質を用いる血
液試料からのリンパ球および顆粒球分離を改良する際に
培養基を使用することについての記述は見られない。本
発明は特に加令血液試料を目的としているが、新鮮血液
にも適用できることが評価できる。換言すれば採血から
試験までの経過時間が長くても本発明ではリンパ球と単
核球の定量的分離が保証される。このように、両立性か
らして、新鮮血液の培地は次のリンパ球と単核球の分離
操作に悪影響がない。

【図面の簡単な説明】

【図１】定温下、時間に対する血液密度減少を例示した
グラフ

【図２】温度に対する血球密度減少の程度を例示したグ
ラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ワード カーティス スミス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14830 コーニング ウェスト チェマング ス トリート 558 (72)発明者 アンソニー ラルフ ジーン ジュニア アメリカ合衆国 ニューヨーク州 コーニ ング パーシュイング ストリート 25 (56)参考文献 特開 昭54−126718（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−54860（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液試料中の顆粒球の浮遊密度の明白な
   変化を防止し、および／またはその浮遊密度の損失を回
   復することにより血液試料中の顆粒球からのリンパ球と
   単球との分離を保証するための処理方法であって、本質
   的に血球と化学的相容性の低分子量有機または無機イオ
   ン性物質を含有する高張性液体、本質的に血球と化学的
   相容性の高分子量有機物質を含有する等張性または高張
   性液体、および血球用培養基からなる群より選択される
   液体と血液試料を接触させることからなる方法。
2. 【請求項２】 前記血液試料と前記液体との接触を少な
   くとも約１分以上保持する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 低分子量イオン性物質を含有する前記高
   張性液体が生理的食塩水である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記イオン性物質が約1500より低い分子
   量のものである請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記高分子量有機物質がその構造中に親
   油基を有する分子である請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 前記高分子量有機物質がメトリゾイック
   酸および／またはその誘導体である請求項５記載の方
   法。
7. 【請求項７】 前記メトリゾイック酸の誘導体がメトリ
   ゾイック酸ナトリウムおよびメトリズアミドからなる群
   より選択される請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記高分子量有機物質がＮ，Ｎ′−ビス
   （２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，
   ３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，
   ６−トリヨウ素−イソフタルアミドである請求項１記載
   の方法。
9. 【請求項９】 前記血液用培養基がロスウェル パ−ク
   メモリアル インスティテュ−ト培地およびマッコイ
   培地からなる群より選択される請求項１記載の方法。