CH615511A5

CH615511A5 - Device for mixing a dose of sample fluid with a treatment liquid

Info

Publication number: CH615511A5
Application number: CH507077A
Authority: CH
Inventors: Gordon Lee Dorn; Joseph Macglashan Hill
Original assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Priority date: 1977-04-20
Filing date: 1977-04-20
Publication date: 1980-01-31

Abstract

The device is used principally for rapid detection of the presence of microorganisms in the blood and determination of the species and quantity thereof. It comprises a elongated container closed by two closures that can be perforated by the needle (23) of a syringe (42). A first closure (16) is provided with a membrane which can also be perforated and which delimits a secondary chamber (16a) containing a fluid for the treatment of the sample (44,38). The needle (23) has holes that bring the secondary chamber (16a) into communication with the principal chamber containing the mixture (44) of the sample with the treatment liquid. This mixture (44) is brought into contact with a sterile filtering liquid (38) that has a greater density than that of the mixture (44) and is capable of receiving selectively pathogenic microbes from the said mixture. The treatment agent (20) contained in the secondary chamber (16a) is mixed with the sample through the needle (23) of the syringe. <IMAGE>

Description

La presente invenzione si riferisce ad un apparecchio per mescolare una dose di fluido campione con un liquido di trattamento, apparecchio particolarmente atto ad essere usato per test di laboratorio allo scopo di rivelare la presenza di microbi patogeni. The present invention refers to an apparatus for mixing a dose of sample fluid with a treatment liquid, an apparatus particularly suitable for being used for laboratory tests in order to detect the presence of pathogenic microbes.

Uno dei tipi più gravi di infezioni del sangue che si conoscono oggigiorno è la setticemia che è la presenza di microorganismi nel sangue. La percentuale di mortalità dei pazienti affetti da setticemia è circa del 25%. Inoltre quando alla setticemia subentra anche lo shock la mortalità aumenta ad un im-35 pressionante 60%. I pazienti particolarmente suscettibili di contrarre la setticemia sono quelli che soffrono di malattie debilitanti, che hanno subito gravi operazioni o ricevono medicamenti immunosoppressivi o anti-cancro. One of the most serious types of blood infections known today is septicemia which is the presence of microorganisms in the blood. The mortality rate of patients with septicemia is approximately 25%. Furthermore, when the septicemia also takes over the shock, the mortality increases to an imposing 35%. The patients particularly susceptible to contracting septicemia are those who suffer from debilitating diseases, who have undergone serious operations or receive immunosuppressive or anti-cancer medications.

Poiché la setticemia può causare un rapido peggioramento 40 delle condizioni di un paziente è assolutamente necessario effettuare una diagnosi ed iniziare il necessario trattamento al più presto possibile. È importante non solo che il medico venga subito a sapere con certezza che il paziente ha contratto la setticemia ma anche che egli possa identificare facilmente e 45 rapidamente i particolari microorganismi che causano l'infezione. Quindi, un metodo rapido ed efficiente per analizzare quantitativamente il sangue del paziente è il primo requisito per poter trattare la malattia. Since septicemia can cause rapid deterioration of a patient's condition 40 it is absolutely necessary to make a diagnosis and start the necessary treatment as soon as possible. It is important not only that the doctor immediately learns with certainty that the patient has contracted septicemia but also that he can easily and quickly identify the particular microorganisms that cause the infection. Hence, a quick and efficient method of quantitatively analyzing the patient's blood is the first requirement for treating the disease.

Il metodo e l'apparecchio convenzionale utilizzati a tut-50 t'oggi per rivelare la presenza di microorganismi nel sangue presentano uno o più notevoli svantaggi. Tra questi: è necessario parecchio tempo per rilevare la presenza dei microorganismi, sussiste l'impossibilità di distinguere tra i diversi tipi di microbi patogeni nel campione di sangue ed inoltre molti di 55 questi metodi non consentono di ottenere informazioni quantitative. Un ulteriore inconveniente sta nel rischio di contaminazione da parte dell'ambiente o del personale del laboratorio. The conventional method and apparatus used today to detect the presence of microorganisms in the blood have one or more significant disadvantages. Among them: it takes a long time to detect the presence of microorganisms, it is impossible to distinguish between the different types of pathogenic microbes in the blood sample and also many of 55 these methods do not allow to obtain quantitative information. A further drawback lies in the risk of contamination by the environment or laboratory personnel.

Recentemente si è sviluppato un metodo perfezionato per 60 rivelare la presenza di microbi, metodo che è estremamente rapido e quantitativo e minimizza la contaminazione del campione da parte dell'ambiente o del personale di laboratorio. Questo metodo è descritto nel brevetto USA N. 3 928 139 rilasciato il 23 dicembre 1975 e avente come titolo: «Rivelazione «s di microbi patogeni». An improved method has recently been developed to 60 detect the presence of microbes, a method which is extremely rapid and quantitative and minimizes contamination of the sample by the environment or laboratory personnel. This method is described in U.S. Patent No. 3 928 139 issued December 23, 1975 and having as its title: «Revelation« s of pathogenic microbes ».

Secondo questo metodo perfezionato atto a rivelare la presenza di microbi patogeni, un campione di fluido corporeo ad es. di sangue (preferibilmente un campione di sangue Usato) According to this improved method suitable for detecting the presence of pathogenic microbes, a sample of body fluid e.g. blood (preferably a used blood sample)

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viene depositato su di un mezzo filtrante liquido entro la zona sterile delimitata. Il mezzo filtrante liquido presenta una densità maggiore di quella del campione fluido e comprende una soluzione acquosa sterile che è atta ad accogliere microbi patogeni provenienti dal campione fluido. Dopo il ciò la zona sterile delimitata è sottoposta a centrifugazione così da spingere a forza il campione fluido contro il mezzo filtrante liquido e far sì che i microbi patogeni passino entro di esso selettivamente separandosi così dalla massa del campione fluido. Successivamente il mezzo filtrante liquido contenente i microbi patogeni viene separato dal resto del campione fluido e parti del mezzo filtrante liquido vengono messe a cultura. Tipi perfezionati di apparecchi per eseguire questo nuovo metodo sono descritti nel brevetto USA N. 3 875 012 rilasciato il 1 aprile 1975 col titolo: «Apparecchio e metodo per rivelare microbi patogeni» e nella domanda di brevetto dello stesso richiedente portante il N. 535 148, depositata il 20 dicembre 1974 e avente come titolo: «Dispositivo mescolatore e centrifugatore». it is deposited on a liquid filter medium within the delimited sterile area. The liquid filter medium has a density greater than that of the fluid sample and comprises a sterile aqueous solution which is capable of receiving pathogenic microbes from the fluid sample. After this, the delimited sterile area is subjected to centrifugation so as to forcefully push the fluid sample against the liquid filtering medium and cause the pathogenic microbes to pass through it selectively thus separating from the mass of the fluid sample. Subsequently, the liquid filter medium containing the pathogenic microbes is separated from the rest of the fluid sample and parts of the liquid filter medium are cultured. Improved types of apparatus for performing this new method are described in U.S. Patent No. 3,875,012 issued April 1, 1975 with the title: "Apparatus and method for detecting pathogenic microbes" and in the patent application of the same applicant bearing No. 535 148. , filed on 20 December 1974 and entitled: «Mixing and centrifugal device».

L'apparecchio secondo la presente invenzione elimina gli inconvenienti propri degli apparecchi noti sopra elencati e permette una grande rapidità e sicurezza nella determinazione qualitativa e quantitativa dei microorganismi nel sangue. Esso è caratterizzato da: The apparatus according to the present invention eliminates the drawbacks of the known apparatus listed above and allows great speed and safety in the qualitative and quantitative determination of microorganisms in the blood. It is characterized by:

a) un recipiente avente una prima e una seconda estremità, chiuse a tenuta; almeno un'estremità essendo chiusa a tenuta da un primo mezzo perforabile così da delimitare una camera principale atta ad accogliere il campione, la quale camera principale viene mantenuta ad una pressione minore di quella atmosferica e una camera secondaria; detta camera secondaria atta a contenere un fluido di trattamento del campione suddetto, essendo compresa fra detto primo mezzo perforabile ed una membrana perforabile in modo tale che uno stiletto possa passare attraverso detto primo mezzo perforabile e detta membrana sino a raggiungere detta camera principale; a) a container having a first and a second end, closed tightly; at least one end being sealed by a first perforable means so as to delimit a main chamber adapted to receive the sample, which main chamber is maintained at a pressure lower than the atmospheric one and a secondary chamber; said secondary chamber adapted to contain a treatment fluid of the aforementioned sample, being comprised between said first perforable means and a perforable membrane so that a stylet can pass through said first perforable means and said membrane until it reaches said main chamber;

b) uno stiletto di perforazione atto a passare attraverso detto primo mezzo di chiusura perforabile e attraverso detta membrana perforabile e atto a permettere il passaggio del campione in detta camera principale e a mescolare il campione con detto fluido di trattamento mentre detto campione passa attraverso di esso. b) a perforation stylet adapted to pass through said first pierceable closure means and through said perforable membrane and adapted to allow the passage of the sample in said main chamber and to mix the sample with said treatment fluid while said sample passes through it.

Secondo una preferita forma di realizzazione, anche l'altra estremità del recipiente è chiusa da un secondo mezzo perforabile, a superficie interna piana. According to a preferred embodiment, the other end of the container is also closed by a second perforable means, with a flat internal surface.

La presente invenzione potrà essere compresa più facilmente da un esame dei disegni annessi in cui: The present invention can be more easily understood by an examination of the annexed drawings in which:

fig. 1 è una sezione di una forma preferita d'esecuzione di un dispositivo miscelatore secondo la presente invenzione; Fig. 1 is a section of a preferred embodiment of a mixing device according to the present invention;

flgg. 2 a 8 sono illustrazioni schematiche di un procedimento atto a rivelare la presenza di microbi patogeni utilizzando il dispositivo di fig. 1; flgg. 2 to 8 are schematic illustrations of a method suitable for detecting the presence of pathogenic microbes using the device of fig. 1;

figg. 9 e 10 sono due viste del nuovo stiletto utilizzato per iniettare un campione nel dispositivo e fig. 11 è ima vista dello stiletto utilizzato per asportare e separare una parte del mezzo filtrante liquido contenuto nel recipiente. figs. 9 and 10 are two views of the new stylet used to inject a sample into the device and fig. 11 is an view of the stylet used to remove and separate a part of the liquid filtering medium contained in the container.

Il dispositivo mescolatore 10 secondo la presente invenzione è illustrato in sezione in fig. 1 ed è utilizzato in combinazione con un nuovo stiletto del tipo rappresentato in fig. 9. Come illustrato, il dispositivo mescolatore 10 comprende un recipiente di centrifugazione tubolare di forma allungata munito di un primo elemento di chiusura perforabile 16 che chiude a tenuta la parte superiore del recipiente e da un secondo elemento di chiusura perforabile 14 che chiude la parte inferiore di detto recipiente. The mixing device 10 according to the present invention is illustrated in section in fig. 1 and is used in combination with a new stylet of the type shown in fig. 9. As illustrated, the mixing device 10 comprises an elongated tubular centrifugation container equipped with a first perforable closing element 16 which tightly closes the upper part of the container and a second perforable closing element 14 which closes the lower part of said container.

Il recipiente di centrifugazione 12 può essere fatto di vetro o plastica dura ad es. policarbonato o polipropilene. Gli elementi di chiusura perforabili 16 e 14 possono essere costituiti da tappi di gomma ad auto-tenuta. L'elemento di chiusura 14 The centrifugation vessel 12 can be made of glass or hard plastic e.g. polycarbonate or polypropylene. The pierceable closing elements 16 and 14 can consist of self-sealing rubber plugs. The closing element 14

presenta una superficie interna piana 18 essenzialmente ad angolo retto con la parete del recipiente di centrifugazione. Si è visto che questa superficie interna piana serve egregiamente a prevenire la sedimentazione di microbi patogeni, sedimentazione che ha luogo invece sul bordo interno rivolto verso l'alto degli elementi di chiusura di tipo convenzionale. Inoltre, la superficie interna piana consenta di osservare chiaramente la miscela mezzo filtrante-campione durante gli stadi di separazione dell'esperimento o test per microbi patogeni che verrà discusso in quel che segue. it has a flat internal surface 18 essentially at right angles to the wall of the centrifugation vessel. It has been seen that this internal flat surface serves very well to prevent the sedimentation of pathogenic microbes, sedimentation which takes place instead on the internal edge facing upwards of the closing elements of the conventional type. In addition, the internal flat surface allows to clearly observe the filter-sample mixture during the separation stages of the experiment or test for pathogenic microbes which will be discussed in what follows.

La camera 16a del fluido di trattamento è racchiusa entro l'elemento di chiusura perforabile 16 e contiene un fluido di trattamento 20 del campione. La camera del fluido di trattamento è ricavata incollando mediante adesivo in corrispondenza delle regioni 22a un tappo o membrana terminale 22 all'estremità aperta di un elemento di chiusura tubolare cavo. La membrana terminale 22 non si rompe nè si stacca al passaggio attraverso di essa di uno stiletto. Ne consegue che la camera del fluido di trattamento 16a si mantiene strutturalmente intatta dopo detto passaggio. Dunque, la miscelazione del fluido di trattamento col campione non avviene e non capita che ambedue i fluidi penetrino assieme nello spazio vuoto 40. Al contrario, si utilizzerà, come descritto in seguito, un unico stiletto per mescolare intimamente tra di loro i fluidi entro la camera del fluido di trattamento e/o la cannula dello stiletto. The chamber 16a of the treatment fluid is enclosed within the pierceable closure element 16 and contains a treatment fluid 20 of the sample. The treatment fluid chamber is obtained by gluing an end cap or membrane 22 to the open end of a hollow tubular closing element by means of an adhesive at the regions 22a. The terminal membrane 22 does not break or detach when a stylet passes through it. It follows that the treatment fluid chamber 16a remains structurally intact after said passage. Therefore, the mixing of the treatment fluid with the sample does not take place and it does not happen that both fluids enter the empty space 40 together. On the contrary, as described below, a single stylet will be used to intimately mix the fluids together within the treatment fluid chamber and / or stylet cannula.

Come rappresentato, la camera del fluido di trattamento è disposta generalmente in posizione centrale entro l'elemento di chiusura perforabile 16 ed è in genere di forma cilindrica. Tuttavia essa potrà anche essere di qualsiasi forma e volume convenienti a seconda del fluido di trattamento del campione che verrà utilizzato. Inoltre non è obbligatorio che sia disposta nel centro ma potrà trovarsi in qualsiasi altro punto opportuno purché un ago di iniezione possa passare attraverso di essa e comunicare con lo spazio vuoto del ricipiente di centrifugazione. È preferibile che il fluido di trattamento del campione venga iniettato mediante una comune siringa entro la camera di trattamento e precisamente attraverso la superficie laterale dell'elemento di chiusura a pressione 16. Dopo essere stato iniettato in questo modo e dopo che l'elemento di chiusura perforabile 16 sia stato posizionato sull'estremità del recipiente di centrifugazione 12 il fluido di trattamento del campione non potrà fuoriuscire dalla camera di trattamento in quanto il foro praticato dalla siringa risulta coperto dalla parete del recipiente tubolare di vetro. Alternativamente, il fluido di trattamento del campione può essere depositato nella camera di trattamento prima che il tappo (o membrana) terminale 22 sia incollato all'elemento di chiusura perforabile 16 in corrispondenza delle regioni 22a. As shown, the treatment fluid chamber is generally arranged in a central position within the pierceable closure element 16 and is generally cylindrical in shape. However, it may also be of any convenient shape and volume depending on the sample treatment fluid that will be used. Furthermore, it is not mandatory that it be placed in the center but it can be located in any other suitable point as long as an injection needle can pass through it and communicate with the empty space of the centrifugation vessel. It is preferable that the sample treatment fluid is injected by means of a common syringe into the treatment chamber and precisely through the lateral surface of the pressure closure element 16. After being injected in this way and after the closure element pierceable 16 has been positioned on the end of the centrifugation container 12, the sample treatment fluid cannot escape from the treatment chamber since the hole made by the syringe is covered by the wall of the tubular glass container. Alternatively, the sample treatment fluid can be deposited in the treatment chamber before the end cap (or membrane) 22 is glued to the pierceable closure element 16 at the regions 22a.

Figg. 9 e 10 illustrano due viste della forma d'esecuzione preferita dello stiletto 23 dell'apparecchio utilizzato per iniettare il campione nel recipiente di centrifugazione. Questo stiletto preferito comprende almeno due aperture 24 e 26 disposte longitudinalmente sulla sua parete e a distanza tale che, dopo l'iniezione, ambedue dette aperture vengano a trovarsi entro la camera di trattamento 16a. Inoltre si prevede un mezzo di blocco 28 ad es. un restringimento disposto tra dette due aperture 24 e 26 per impedire che nella cannula dello stiletto dette aperture comunichino tra di loro. In questo modo il campione iniettato potrà essere spinto a forza ad uscire dall'apertura 24 e ad entrare nella camera del fluido di trattamento 16a. L'apertura 26 sotto al mezzo di blocco 28 si trova in comunicazione, tramite il foro 30, con lo spazio sotto vuoto 40 del recipiente di centrifugazione tramite la cannula dello stiletto. Ne risulta che al momento in cui si inietta il campione nella camera 16a, quest'ultimo è spinto ad uscire dallo stiletto 23 attraverso l'apertura 24 e ad entrare nella camera del fluido di trattamento 16a. La turbolenza che ne risulta in detta camera provoca e favorisce una intensa miscelazione del campione col liri Figs. 9 and 10 show two views of the preferred embodiment of the stylet 23 of the apparatus used to inject the sample into the centrifugation vessel. This preferred stylet comprises at least two openings 24 and 26 arranged longitudinally on its wall and at such a distance that, after the injection, both said openings are located within the treatment chamber 16a. Furthermore, a blocking means 28 is provided, e.g. a narrowing arranged between said two openings 24 and 26 to prevent said openings from communicating with each other in the cannula of the stylet. In this way, the injected sample can be forced by force to exit from the opening 24 and enter the treatment fluid chamber 16a. The opening 26 under the blocking means 28 is in communication, through the hole 30, with the vacuum space 40 of the centrifugation container through the cannula of the stylet. As a result, when the sample is injected into the chamber 16a, the latter is pushed to exit the stylet 23 through the opening 24 and enter the treatment fluid chamber 16a. The resulting turbulence in said chamber causes and promotes intense mixing of the sample with the liri

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quido di trattamento 20. La miscela fluido di trattamento-campione rientra poi nello stiletto attraverso la seconda apertura 26 che si trova anch'essa entro la camera del fluido di trattamento e, dal vuoto dello spazio 40 del recipiente di centrifugazione viene aspirata, attraverso la parte inferiore della 5 cannula dello stiletto, fuoriuscendo dalle aperture 30 adiacenti all'estremità di detto stiletto e viene infine depositata su un mezzo filtrante 38. treatment liquid 20. The mixture of treatment-sample fluid then enters the stylet through the second opening 26 which is also located within the chamber of the treatment fluid and, from the vacuum of the space 40 of the centrifugation vessel, is sucked through the lower part of the 5 cannula of the stylet, coming out of the openings 30 adjacent to the end of said stylet and is finally deposited on a filtering medium 38.

Si potranno usare una pluralità di aperture sia sopra detto mezzo di blocco 28 che sotto o in ambedue le posizioni. Il 10 mezzo di blocco può essere a forma di tappo previsto entro la cannula dello stiletto oppure, come rappresentato nelle figg. 9 e 10, il blocco tra le aperture nella cannula sarà realizzato mediante restringimento delle pareti dello stiletto in quel punto. La punta dello stiletto può essere una qualsiasi punta di sirin- I5 ga. Tuttavia si preferirà una punta appiattita 32 a forma di spada con due aperture 30 direttamente sopra di essa cosi da contribuire alla distribuzione uniforme della miscela fluido di trattamento-campione entro lo spazio vuoto del recipiente di centrifugazione 12. 20 A plurality of openings can be used both above said blocking means 28 and below or in both positions. The blocking means 10 may be in the form of a cap provided within the cannula of the stylet or, as shown in figs. 9 and 10, the block between the openings in the cannula will be made by narrowing the walls of the stylet at that point. The tip of the stylet can be any syringe tip. However, a flattened sword-shaped tip 32 with two openings 30 directly above it will be preferred so as to contribute to the uniform distribution of the treatment-sample fluid mixture within the empty space of the centrifugation vessel 12. 20

Si è visto che per ottenere una miscelazione intima e completa non è necessariamente richiesto di prevedere due aperture separate da un mezzo di blocco. Potrà bastare un'apertura disposta longitudinalmente lungo la parete dello stiletto cosi che dopo che è avvenuta l'iniezione possa comunicare con la 25 camera del fluido di trattamento. Dopo aver iniettato un campione attraverso l'apertura che si trova nella camera del fluido di trattamento si aspira entro la cannula stiletto detto fluido di trattamento che si mescolerà intimamente con il campione che già si trova in detta cannula. La miscela fluido di trattamento :i0 campione viene poi depositata nello spazio sotto vuoto 40 del recipiente di centrifugazione 12. It has been seen that to obtain an intimate and complete mixing it is not necessarily required to provide two openings separated by a blocking means. An opening arranged longitudinally along the wall of the stylet may suffice so that after the injection has occurred it can communicate with the chamber 25 of the treatment fluid. After injecting a sample through the opening which is located in the chamber of the treatment fluid, the treatment fluid is sucked into the stylet cannula which will mix intimately with the sample which is already in said cannula. The fluid treatment mixture: the sample is then deposited in the vacuum space 40 of the centrifugation vessel 12.

La fig. 11 mostra un nuovo tipo di stiletto 35 che viene utilizzato per asportare un sottile strato di fluido adiacente alla 3-, superficie interna piana 18 del secondo elemento di chiusura perforabile 14. Lo stiletto 35 può presentare una lunghezza qualsiasi purché sufficiente a forare detto secondo elemento di chiusura 14. Le caratteristiche che lo distinguono consistono in ciò che la punta 34 dello stiletto 35 è chiusa e si prevede alme- 40 no un'apertura 36 distanziata longitudinalmente lungo la parete dello stiletto in modo che, dopo aver iniettato lo stiletto completamente attraverso detto secondo elemento di chiusura 14, la o le aperture 36 vengano a trovarsi leggermente al di sopra della superficie interna piana 18 del detto secondo eie- lr, mento di chiusura 14. Nella forma preferita di fig. 11 la punta 34 dello stiletto 35 è stata appiattita per chiuderla a tenuta e le aperture coassiali 36 sono posizionate una di fronte all'altra attraverso la parete dello stiletto 35. Come è ovvio, la distanza longitudinale dalle aperture alla base dello stiletto dovrebbe -0 essere leggermente maggiore dello spessore del secondo elemento di chiusura 14. La lunghezza dello stiletto dalle aperture 36 alla sua punta 34 può essere scelta a piacere secondo la convenienza. Per il fatto che le aperture 36 sono molto vicine alla superficie interna piana del secondo mezzo di chiusura M perforabile, sarà possibile asportare simultaneamente da detta superficie e attraverso dette aperture 36 parti, genericamente uniformi su tutta la sezione di un segmento, del fluido contenuto entro il dispositivo di centrifugazione 10. La possibilità di asportare in modo uniforme fluido dal fondo del recipiente di 6U centrifugazione facilita il necessario procedimento di separazione del mezzo filtrante liquido che contiene i microbi patogeni dalle rimanenti parti della miscela costituita dal mezzo filtrante e del campione. Ciò è vero poiché si è riscontrato che se si usa un ago di tipo convenzionale (ad estremità aperta) 63 l'azione del fluido aspirato entro di esso provocherà un flusso di fluido a forma conica su tutto il gradiente con la conseguenza che passeranno entro di esso quantità indesiderabili del campione fluido. Ne risulta che parti del mezzo filtrante liquido non si asporteranno dal recipiente di centrifugazione 12. Fig. 11 shows a new type of stylet 35 which is used to remove a thin layer of fluid adjacent to the 3- flat internal surface 18 of the second pierceable closure element 14. The stylet 35 can have any length as long as it is sufficient to perforate said second element closure 14. The characteristics that distinguish it consist in that the tip 34 of the stylet 35 is closed and at least 40 an opening 36 is provided longitudinally spaced along the wall of the stylet so that, after having injected the stylet completely through said second closing element 14, the opening (s) 36 are slightly above the flat internal surface 18 of said second closing element 14. In the preferred form of fig. 11 the tip 34 of the stylet 35 has been flattened to seal it tightly and the coaxial openings 36 are positioned opposite each other through the wall of the stylet 35. Obviously, the longitudinal distance from the openings at the base of the stylet should -0 be slightly greater than the thickness of the second closure element 14. The length of the stylet from the openings 36 to its tip 34 can be chosen as desired according to convenience. Due to the fact that the openings 36 are very close to the internal flat surface of the second pierceable closing means M, it will be possible to remove simultaneously from said surface and through said openings 36 parts, generally uniform on the whole section of a segment, of the fluid contained within the centrifugation device 10. The possibility of uniformly removing fluid from the bottom of the 6U centrifugation container facilitates the necessary process of separating the liquid filter medium containing the pathogenic microbes from the remaining parts of the mixture consisting of the filter medium and the sample. This is true since it has been found that if a conventional (open-ended) needle 63 is used, the action of the fluid sucked inside it will cause a flow of cone-shaped fluid over the entire gradient with the consequence that they will pass within it undesirable quantities of the fluid sample. As a result, parts of the liquid filter medium will not be removed from the centrifugation container 12.

Il contenuto sterile del recipiente di centrifugazione 12 comprende un mezzo filtrante liquido 38 es uno spazio 40 sotto vuoto completo o parziale. Lo spazio sotto vuoto 40 è mantenuto ad una pressione inferiore di quella atmosferica e precisamente ad un valore tale che il recipiente di centrifugazione possa accogliere una quantità nota di liquido mediante iniezione attraverso l'elemento di chiusura perforabile 16 senza che nell'interno di esso venga a crearsi una eccessiva pressione ciò che potrebbe provocare uno spostamento degli elementi di chiusura 14 e 16 dalle estremità del recipiente di centrifugazione 12. The sterile contents of the centrifugation vessel 12 comprise a liquid filter medium 38 and a space 40 under complete or partial vacuum. The vacuum space 40 is maintained at a pressure lower than the atmospheric pressure and precisely at a value such that the centrifugation vessel can receive a known quantity of liquid by injection through the pierceable closure element 16 without being inside it excessive pressure is created which could cause the closure elements 14 and 16 to move from the ends of the centrifugation container 12.

Il mezzo filtrante liquido 38 può essere uno qualsiasi dei mezzi filtranti descritti nel brevetto USA N. 3 928 139 atti a rivelare la presenza di microbi patogeni ed in genere comprende una soluzione acquosa di qualsiasi soluto che non sia tossico per gli organismi microbici in sospensione e abbia una densità sufficientemente alta per consentire la sospensione in esso di cellule sanguigne bianche e rosse o di detriti cellulari sanguigni. Il soluto è preferibilmente non ionico. Dunque, il mezzo filtrante liquido presenta una densità superiore a quella del sangue cioè superiore a circa 1,06 gm/cc e terrà in sospensione cellule ematiche o detriti cellulari sanguigni ma sarà anche atta ad accogliere microbi patogeni. Inoltre il mezzo filtrante liquido conterrà preferibilmente una piccola quantità di agente gelificante sensibile alla temperatura. The liquid filtering medium 38 can be any of the filtering means described in U.S. Patent No. 3 928 139 suitable for detecting the presence of pathogenic microbes and generally comprises an aqueous solution of any solute that is not toxic to the suspended microbial organisms and has a density high enough to allow white and red blood cells or blood cell debris to be suspended therein. The solute is preferably nonionic. Therefore, the liquid filtering medium has a density higher than that of the blood, that is higher than about 1.06 gm / cc and will keep blood cells or blood cell debris in suspension, but it will also be able to receive pathogenic microbes. Furthermore, the liquid filter medium will preferably contain a small amount of temperature-sensitive gelling agent.

Opportuni soluti che possono essere utilizzati nel mezzo filtrante liquido 38 comprendono gli zuccheri come saccarosio, glucosio, maltosio, fruttosio, mannitolo, sorbitolo e simili. In genere, il mezzo filtrante liquido 38 dovrebbe ammontare almeno a ca. 40% in peso dello zucchero e può contenere zucchero fino al limite di saturazione. Preferibilmente gli zuccheri sono contenuti nel mezzo filtrante liquido 38 in una quantità che varia da ca. 40 a ca. 50% in peso. In genere gli zuccheri ed in particolare il saccarosio sono soluti preferiti per il mezzo filtrante liquido 38 in quanto quest'ultimo può essere mantenuto ad un pH fisiologico ad es. 6,0-7,0 e, qualora combinato con gelatina, possono essere trattati in autoclave. Suitable solutes which can be used in the liquid filter medium 38 include sugars such as sucrose, glucose, maltose, fructose, mannitol, sorbitol and the like. Generally, the liquid filter medium 38 should amount to at least approx. 40% by weight of sugar and can contain sugar up to the saturation limit. Preferably the sugars are contained in the liquid filtering medium 38 in an amount ranging from ca. 40 to ca. 50% by weight. Generally sugars and in particular sucrose are preferred solutes for the liquid filtering medium 38 since the latter can be maintained at a physiological pH e.g. 6.0-7.0 and, if combined with gelatin, they can be treated in an autoclave.

Si può usare in tale ambito qualsiasi soluto purché la soluzione risultante sia più densa delle cellule ematiche rosse e dei detriti cellulari sanguigni rossi e non sia tossica per i microbi patogeni. Altri simili sostanze opportune comprendono ad es. una sostanza chimica nota genericamente come «Hypaque sodium» CuH8l3N2Na04 (sale sodico dell'acido 3,5 - diacetam-mido-2,4,6 - triiodobenzoico). Questa sostanza può essere utilizzata in soluzione acquosa nella stessa concentrazione indicata più sopra per lo zucchero. Un'altra classe di soluti che possono venire utilizzati per formare un mezzo filtrante liquido acquoso che serve allo scopo prefisso comprende soluti macro-molecolari atti a produrre una struttura gelatinosa liquida in mezzo acquoso avente pori con dimensioni sufficientemente piccole da impedire la penetrazione di cellule rosse o di detriti di cellule rosse ma abbastanza grandi da lasciar passare i microbi patogeni. Any solute can be used in this context as long as the resulting solution is denser than red blood cells and red blood cell debris and is not toxic to pathogenic microbes. Other such suitable substances include e.g. a chemical known generically as "Hypaque sodium" CuH8l3N2Na04 (sodium salt of 3,5 - diacetam-mido-2,4,6 - triiodobenzoic acid). This substance can be used in an aqueous solution in the same concentration indicated above for sugar. Another class of solutes which can be used to form an aqueous liquid filter medium which serves the prefixed purpose comprises macro-molecular solutes capable of producing a liquid gelatinous structure in an aqueous medium having pores with dimensions small enough to prevent the penetration of red cells. or debris of red cells but large enough to allow pathogenic microbes to pass.

Un esempio di un opportuno soluto macromolecolare è un polimero solubile in acqua a legame reticolato aventè micropori distribuiti su tutta la sua rete solubilizzata. Un simile polimero solubile in acqua comprende un copolimero di saccarosio e epicloridrina avente un peso molecolare medio che può variare da ca. 30 000 a ca. 500 000 ed una viscosità intrinseca di ca. 0,17 dl/g, una rotazione specifica (oc)D2o di +56,5° e contiene materiale dializzabile in una quantità minore dell'1% in peso. Un simile polimero atto a questo scopo è venduto sotto il marchio «FICOLL» dalla Pharmacia Fine Chemicals, Inc. 800 Centennial Avenue, Piscastaway, New Jersey. Un altro polìmero di questo tipo che può essere usato anch'esso a questo scopo è il desterano avente un peso molecolare medio che An example of a suitable macromolecular solute is a cross-linked water-soluble polymer with micropores distributed throughout its solubilized network. Such a water soluble polymer comprises a sucrose and epichlorohydrin copolymer having an average molecular weight which can vary from ca. 30 000 to approx. 500 000 and an intrinsic viscosity of approx. 0.17 dl / g, a specific rotation (oc) D2o of + 56.5 ° and contains dialysable material in an amount less than 1% by weight. A similar polymer suitable for this purpose is sold under the "FICOLL" brand name by Pharmacia Fine Chemicals, Inc. 800 Centennial Avenue, Piscastaway, New Jersey. Another polymer of this type which can also be used for this purpose is the diesterane having an average molecular weight which

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può variare da ca. 10 000 a ca. 2 000 000 ed è preferibilmente di ca. SO 000. Questi polimeri, qualora sciolti in acqua come descritto, funzionano come mezzo filtrante liquido per microbi patogeni e apparentemente presentano micropori su tutta la loro rete solubilizzata che variano da ca. 1 micron a ca. 7 mi- 5 cron. can vary from ca. 10,000 to ca. 2 000 000 and is preferably approx. SO 000. These polymers, when dissolved in water as described, function as a liquid filtering medium for pathogenic microbes and apparently have micropores on their entire solubilized network which vary from approx. 1 micron at approx. 7 mi- 5 chron.

Il polimero solubile in acqua o soluto macromoleculare è preferibilmente presente nella soluzione acquosa in una quantità che varia da ca. 10 a ca. 40% in peso e con particolare preferenza da ca. 20 a ca. 30% in peso. 10 The water-soluble polymer or macromolecular solute is preferably present in the aqueous solution in an amount ranging from ca. 10 to ca. 40% by weight and with particular preference from ca. 20 to ca. 30% by weight. 10

Coli'espressione «agente gelificante termo sensibile» si intende qualsiasi agente che gelifìchi la soluzione acquosa del mezzo filtrante 38 ad ima temperatura in genere minore della temperatura ambiente ma che tuttavia può liquefare a temperature superiori che non sono deleterie per i microbi patogeni 15 cioè inferiori a ca. 50°C ed in genere non superiori a ca. 42°C. Agenti gelificanti termosensibili adatti a questo scopo comprendono qualsiasi agente gelificante di questo tipo che non sia deleterio per la soluzione o per il campione in fase di analisi. Esempi di simili materiali sono gelatine cioè le proteine 2o ottenute da collageno mediante bollitura in acqua di pelli, legamenti, tendini ossa e simili. Si piò utilizzare qualsiasi quantità di agente gelificante termosensibile cioè ca. da 0,5 a ca. 5% in peso del mezzo filtrante 38. By the term "thermo sensitive gelling agent" is meant any agent which gels the aqueous solution of the filter medium 38 at a temperature generally lower than the ambient temperature but which however can liquefy at higher temperatures which are not harmful to the pathogenic microbes 15 i.e. lower at ca. 50 ° C and generally not higher than ca. 42 ° C. Thermosensitive gelling agents suitable for this purpose include any gelling agent of this type which is not harmful to the solution or to the sample being analyzed. Examples of such materials are gelatins, i.e. proteins 2o obtained from collagen by boiling in water the skins, ligaments, tendons, bones and the like. Any amount of thermosensitive gelling agent, i.e. ca. 0.5 to approx. 5% by weight of the filter medium 38.

Inoltre, secondo una forma preferita d'esecuzione si preve- 2s de il mezzo filtrante liquido contenga un captatore d'ossigeno (oxygen scavenger) e/o un colorante sensibile all'ossigeno. La presenza del captatore d'ossigeno assicurerà che l'interno del dispositivo mescolatore e centrifugatore 10 sia mantenuto in un ambiente anaerobico. Più specificatamente, dal punto di :i0 vista medico ci si interessa di infezioni batteriche anaerobiche del corpo umano. Se il test per isolare e rivelare microbi patogeni è eseguito in un ambiente aerobico è senz'altro chiaro che non sarà possibile rivelare la presenza di batteri anaerobici. Quindi la presenza di una piccola quantità effettiva di un 35 agente riduttore (un captatore d'ossigeno di tipo convenzionale) è utilizzata entro un mezzo filtrante liquido 38 secondo lo scopo di una forma d'esecuzione preferita. Agenti riducenti utilizzabili per questo scopo comprendono L-cistina, tioglico-lato di sodio, acido ascorbico e simili. La sostanza riducente 40 preferita utilizzata nel mezzo filtrante liquido 38 per gli scopi prefissi è una miscela di L-cistina e tioglicolato di sodio. Inoltre rientra nell'ambito della forma d'esecuzione che detto mezzo filtrante liquido contenga una piccola quantità di colorante sensibile all'ossigeno. Detto colorante può essere utiliz- _lr> zato sia in presenza che in assenza dell'agente riducente menzionato più sopra. Il colorante è preferibilmente incolore in assenza di ossigeno ma cambia colore quando viene a contatto con l'ossigeno. Quindi un cambiamento di colore indica la presenza di ossigeno nell'interno del dispositivo mescolatore e 50 centrifugatore 10 ciò che significa una perdita di vuoto in detto interno. Opportuni coloranti sensibili all'ossigeno che possono essere utilizzati allo scopo sono ad es. resazurina e blù di metilene. Sarà però anche possibile usare qualsiasi altro colorante sensibile all'ossigeno purché non risulti deleterio al mez- 55 zo filtrante liquido 38 e al procedimento di separazione microbica che ha luogo nell'interno del dispositivo mescolatore e centrifugatore 10. Un tipico mezzo filtrante liquido utilizzabile per gli scopi prefissi è il seguente: Furthermore, according to a preferred embodiment, the liquid filter medium is provided to contain an oxygen scavenger and / or an oxygen sensitive dye. The presence of the oxygen sensor will ensure that the interior of the mixing and centrifuging device 10 is maintained in an anaerobic environment. More specifically, from the medical point of view we are concerned with anaerobic bacterial infections of the human body. If the test to isolate and reveal pathogenic microbes is performed in an aerobic environment, it is certainly clear that it will not be possible to reveal the presence of anaerobic bacteria. Hence the presence of a small effective amount of a reducing agent 35 (a conventional oxygen detector) is used within a liquid filter medium 38 according to the purpose of a preferred embodiment. Reducing agents usable for this purpose include L-cystine, sodium thioglic-side, ascorbic acid and the like. The preferred reducing substance 40 used in the liquid filter medium 38 for the intended purposes is a mixture of L-cystine and sodium thioglycolate. It also falls within the scope of the embodiment that said liquid filter medium contains a small amount of oxygen sensitive dye. Said dye can be used both in the presence and absence of the reducing agent mentioned above. The dye is preferably colorless in the absence of oxygen but changes color when it comes in contact with oxygen. Hence a change in color indicates the presence of oxygen in the interior of the mixing device and centrifuge 50 which means a loss of vacuum in said interior. Suitable oxygen sensitive dyes that can be used for the purpose are e.g. resazurine and methylene blue. However, it will also be possible to use any other oxygen-sensitive dye as long as it is not harmful to the liquid filter medium 38 and the microbial separation process that takes place inside the mixer and centrifuge device 10. A typical liquid filter medium usable for the aims are the following:

50% (peso/peso) saccarosio 60 50% (weight / weight) sucrose 60

1,5% (peso/peso) gelatina 1.5% (weight / weight) gelatin

0,05% (peso/volume) L-cistina 0.05% (weight / volume) L-cystine

0,05% (peso/volume) tioglicolato sodico 0.05% (weight / volume) sodium thioglycolate

0,0001-0,0002% (peso/volume) resazurina pH a 6,0. 65 0.0001-0.0002% (weight / volume) resazurine pH at 6.0. 65

In genere, l'agente riducente può comprendere da 0,01 a ca. 0,2% in peso del mezzo filtrante liquido e il colorante sensibile all'ossigeno può includere da 0,001 a ca. 0,0005% in peso del mezzo filtrante liquido. Generally, the reducing agent can comprise from 0.01 to ca. 0.2% by weight of the liquid filter medium and the oxygen sensitive dye can include from 0.001 to approx. 0.0005% by weight of the liquid filter medium.

Il fluido per il trattamento del campione 20 può contenere qualsiasi ingrediente o insieme di ingredienti coi quali si desidera trattare il campione fluido prima di separare da esso i microbi patogeni. Secondo una forma preferita d'esecuzione il fluido 20 per il trattamento del campione comprende una soluzione acquosa di un agente di lisi per il sangue. Si potrà utilizzare nella soluzione acquosa qualsiasi agente di lisi opportuno che non sia tossico per i microorganismi. Un opportuno agente di lisi è una soluzione acquosa non tossica di saponina. Si deve notare che molte saponine sono considerate tossiche per i microbi patogeni. Tuttavia, nel brevetto USA N. The fluid for processing the sample 20 can contain any ingredient or set of ingredients with which it is desired to treat the fluid sample before separating the pathogenic microbes from it. According to a preferred embodiment, the sample treatment fluid 20 comprises an aqueous solution of a blood lysis agent. Any suitable lysis agent which is not toxic to microorganisms can be used in the aqueous solution. A suitable lysis agent is a non-toxic aqueous solution of saponin. It should be noted that many saponins are considered toxic to pathogenic microbes. However, in U.S. Pat.

3 883 425 rilasciato il 13 maggio 1975, avente come titolo: «Detossificazione delle saponine» ed incoiporato per riferimento in questa domanda di brevetto, si descrive un metodo nuovo per togliere gli ingredienti tossici dalle saponine ritenute fino a questo momento tossiche. In generale la saponina tossica può essere detossificata secondo i dettami del brevetto menzionato più sopra ed il materiale purificato così risultante sarà utilizzabile per gli scopi prefissi. Inoltre, la soluzione acquosa può contenere un anticoagulante e/o un captatore d'ossigeno. Un anticoagulante di tipo preferito è il sodiopoli-anetolsulfonato (SPS) o Heparina. Il sodiopolianetolsulfonato è preferibile perché non agisce solo da anticoagulante ma inibisce pure l'attività fagocitica di granulociti e monociti e l'attività antibatteriale normale del siero e di certi antibiotici ad es. streptomicina polimixina. No. 3,883,425 issued May 13, 1975, having the title: "Detoxification of saponins" and referenced in this patent application, describes a new method for removing toxic ingredients from saponins considered hitherto toxic. In general, toxic saponin can be detoxified according to the dictates of the patent mentioned above and the resulting purified material will be usable for the prefixed purposes. Furthermore, the aqueous solution may contain an anticoagulant and / or an oxygen collector. A preferred anticoagulant is sodium-poly-anetholsulfonate (SPS) or Heparin. Sodium polyanetholsulfonate is preferable because it not only acts as an anticoagulant but also inhibits the phagocytic activity of granulocytes and monocytes and the normal antibacterial activity of serum and certain antibiotics e.g. streptomycin polymyxin.

L'apparecchio mescolatore e centrifugatore in oggetto consente un procedimento conveniente ed economico per combinare un campione ad es. sangue con un fluido per il trattamento del campione del tipo descritto più sopra immediatamente prima di depositare detto campione sul mezzo liquido filtrante per l'esecuzione del test. In diversi casi, si è riscontrato che certi fluidi di trattamento ad es. agenti di lisi sono incompatibili col mezzo filtrante liquido. Inoltre anche se gli agenti di trattamento potessero essi mescolati col mezzo filtrante liquido, detti agenti non potrebbero diffondersi facilmente entro il campione. Ad es. se non si desiderano grumi l'anticoagulante deve disperdersi nel campione di sangue entro pochi minuti. Pertanto se l'anticoagulante fosse incorporato nel mezzo filtrante liquido ci vorrebbero ca. 24 ore fino a chè l'anticoagulante si disperda nel campione di sangue. Quindi è indesiderabile pre-mescolare il fluido di trattamento con il mezzo filtrante prima di chiudere a tenuta il mezzo filtrante nell'atmosfera sterile del recipiente di centrifugazione. The mixing and centrifuging apparatus in question allows a convenient and economic method for combining a sample e.g. blood with a sample treatment fluid of the type described above immediately before depositing said sample on the filtering liquid medium for carrying out the test. In several cases, it has been found that certain treatment fluids e.g. lysis agents are incompatible with the liquid filter medium. Furthermore, even if the treatment agents could mix with the liquid filter medium, said agents could not easily spread within the sample. E.g. if no lumps are desired, the anticoagulant must disperse in the blood sample within a few minutes. Therefore, if the anticoagulant were incorporated in the liquid filter medium, it would take approx. 24 hours until the anticoagulant is dispersed in the blood sample. It is therefore undesirable to pre-mix the treatment fluid with the filter medium before sealing the filter medium in the sterile atmosphere of the centrifugation vessel.

È pure indesiderabile pre-mescolare il fluido trattante col provino prima di introdurlo nel recipiente di centrifugazione poiché questa fase extra costituisce un'opportunità di contaminazione del campione da parte delle condizioni ambiente del laboratorio. Si prevedono mezzi per miscelare il campione con il fluido trattante immediatamente prima che venga a contatto col mezzo filtrante liquido così da mantenere minime le possibilità di contaminazione da parte dell'ambiente del laboratorio. Si ottiene ciò alimentando alla camera 16a del fluido di trattamento del primo elemento di chiusura perforabile 16 una quantità appropriata di fluido 20 per il trattamento del provino e precisamente in uno dei modi menzionati più sopra. Dopo aver fatto ciò e dopo che il recipiente di centrifugazione contenente il mezzo filtrante liquido è stato chiuso a tenuta mediante il primo elemento di chiusura perforabile 16 l'apparecchio è pronto per eseguire il test. Naturalmente il mezzo filtrante liquido sarà già depositato nel recipiente di centrifugazione e lo spazio sopra di esso sarà evacuato in modo sterile dopo aver effettuato la chiusura. Il nuovo stiletto 23 rappresentato nelle figg. 9 è 10 per iniettare il provino viene ora inserito attraverso il primo elemento di chiusura perforabile 16 così che le aperture 24 e 26 lungo la sua parete vengano a trovarsi en- It is also undesirable to pre-mix the treating fluid with the specimen before introducing it into the centrifugation vessel since this extra phase constitutes an opportunity for contamination of the sample by the ambient conditions of the laboratory. Means are provided for mixing the sample with the treating fluid immediately before it comes into contact with the liquid filter medium so as to keep the possibility of contamination by the laboratory environment to a minimum. This is achieved by feeding to the chamber 16a of the treatment fluid of the first pierceable closure element 16 an appropriate quantity of fluid 20 for the treatment of the specimen and precisely in one of the ways mentioned above. After doing this and after the centrifugation container containing the liquid filtering medium has been sealed with the first pierceable closing element 16, the apparatus is ready to carry out the test. Naturally, the liquid filtering medium will already be deposited in the centrifugation container and the space above it will be evacuated in a sterile way after closing. The new stylet 23 shown in figs. 9 and 10 to inject the specimen is now inserted through the first pierceable closure element 16 so that the openings 24 and 26 along its wall are located inside

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tro la camera del fluido di trattamento 16a dell'elemento di latore e centrifugatore 10 viene riscaldato ad una temperatura chiusura perforabile 16. Dopo aver iniettato il campione que- che non distrugga i microbi patogeni che dovessero trovarsi st'ultimo viene a contatto e viene mescolato con il fluido di nel campione di sangue ma che sia sufficiente a liquefare la trattamento del campione nel modo descritto in precedenza. Si gelatina. Ad es. mentre si trova nella posizione illustrata in fig. between the chamber of the treatment fluid 16a of the lator and centrifuge element 10 is heated to a pierceable closing temperature 16. After injecting the sample, it does not destroy the pathogenic microbes that may be found, the latter comes into contact and is mixed with the fluid in the blood sample but which is sufficient to liquefy the treatment of the sample in the manner described above. You jelly. E.g. while it is in the position shown in fig.

deposita quindi la miscela fluido di trattamento-campione sul 5, l'apparecchio mescolatore e centrifugatore 10 può essere ri- it then deposits the fluid treatment-sample mixture on 5, the mixing and centrifuging apparatus 10 can be re-

mezzo filtrante liquido. scaldato per immersione in un bagno di acqua fino ad una liquid filter medium. heated by immersion in a water bath up to one

Con riferimento alle figg. 2 a 8 si descriverà ora in quel che temperatura stabilita a ca. 37 a 42°C. Mediante la liquefazione segue l'utilizzazione dell'apparecchio mescolatore e centrifu- della gelatina entro il mezzo filtrante liquido 38 si ottiene una gatore 10 per quel che riguarda un procedimento atto a rive- soluzione liquefatta pronta ad agire da mezzo filtrante per i lare la presenza di microbi patogeni. Il mezzo filtrante liquido 10 microbi patogeni. With reference to figs. 2 to 8 will now be described in what temperature set at ca. 37 to 42 ° C. By liquefaction follows the use of the mixing and centrifuge apparatus of the gelatin within the liquid filtering medium 38 a gator 10 is obtained with regard to a process suitable for liquefied solution ready to act as a filtering medium to detect the presence of pathogenic microbes. The liquid filter medium 10 pathogenic microbes.

38 può comprendere 1,5 millilitri di una soluzione acquosa La separazione dei microbi patogeni dalla parte rimanente contenente 3,0 parti in peso di gelatina; 97,0 parti in peso di del campione di sangue è effettuata mettendo il dispositivo acqua; 100,0 parti in peso di saccarosio; 0,8 parti in peso di mescolatore e centrifugatore 10 in un opportuno apparecchio L-cistina; 0,8 parti in peso di tioglicolato sodico e 0,0003 parti di centrifugazione sottoponendolo ad una forza centrifuga suf-in peso di resazurina, ad esempio.. lf) ficiente a separare i microbi patogeni dai rimanenti elementi Il fluido 20 per il trattamento del campione può contenere che costituiscono il campione di sangue. La velocità ed il tem-qualsiasi opportuno componente ad es. un agente di lisi e/o un po di centrifugazione possono variare grandemente a secondo anticoagulante e, se lo si desidera, un captatore d'ossigeno o della resistenza del materiale di cui è composto il recipiente di agente riducente in qualsiasi concentrazione desiderata. Si può centrifugazione e del tipo di apparecchio di centrifugazione, usare qualsiasi quantità di anticoagulante che sia sufficiente La centrifugazione può essere eseguita convenientemente imper la quantità di campione di sangue e qualsiasi quantità di partendo al dispositivo mescolatore e centrifugatore tra ca. 100 agente di lisi sufficiente per effettuare la lisi del campione di e 6000 unità gravitazionali e preferibilmente da ca. 1400-5000 sangue. Ad es. si può usare come fluido di trattamento 0,3 mil- unità gravitazionali. Un opportuno procedimento comprende lilitri di una soluzione acquosa contenente a ca. 12% in peso di l'uso di un rotore centrifugo a paniere oscillante che imparte al saponina non tossica e ca. 2% in peso di sodiopolianetolsulfo- 25 particolare sistema secondo questa forma d'esecuzione tra nato. Inizialmente si disporrà l'apparecchio mescolatore e cen- 2000 e 4000 unità gravitazionali per 10 a 20 minuti. La fase di trifugatore 10 in posizione eretta come illustrato in fig. 2 per centrifugazione è illustrata schematicamente in fig. 6. consentire che il mezzo filtrante liquido 38 passi verso il basso Dopo la fase di miscelazione e centrifugazione descritta contro l'elemento di chiusura perforabile 14. Successivamente più sopra, si inietta una siringa sterile 46 portante un nuovo il dispositivo mescolatore e centrifugatore 10 è messo in una 30 stiletto di tipo eccellente 35 attraverso il secondo elemento opportuna unità di raffreddamento, ad es. un refrigeratore do- perforabile 14 del dispositivo di centrifugazione come illustra-ve viene rapidamente raffreddato in modo sufficiente a far sì to in fig. 7. Come indicato, lo stiletto può presentare qualsiasi che la gelatina solidifichi il mezzo filtrante liquido 38. Ad es. lunghezza opportuna; tuttavia le aperture 36 nella parete dello l'apparecchio mescolatore e centrifugatore può essere raffred- stiletto vengono a trovare molto vicine alla superficie interna dato rapidamente a 4°C. Questa fase è illustrata in fig. 3. Suc- 35 18 dell'elemento di chiusura perforabile 14 dopo l'iniezione cessivamente si preleva con la siringa 42, avente un ago ipo- dello stiletto rappresentato in fig. 7. Essendo la punta 34 dello dermico di tipo convenzionale, un campione flui'do ad es. san- stiletto 35 chiusa a pinza sarà possibile estrarre lo strato sottile gue (ad es. 8 ml). L'ago ipodermico convenzionale viene poi uniforme del mezzo filtrante liquido che giace adiacente alla sostituito con il nuovo stiletto 23 che viene poi iniettato attra- superficie piana interna dell'elemento di chiusura perforabile verso l'elemento di chiusura perforabile 16 nel modo descritto 40 14. Grazie alla superficie interna piana dell'elemento di chiu-più sopra e il campione fluido viene quindi iniettato nell'inter- sura perforabile 14 è possibile vedere chiaramente attraverso no dell'apparecchio mescolatore e centrifugatore 10 nella ma- la parete del recipiente di centrifugazione 10 così che il tecnico niera schematica illustrata in fig. 4. La turbolenza creata dal addetto a questo lavoro possa osservare facilmente l'operazio-passaggio del sangue nello spazio sotto vuoto 40 non disturbe- ne di estrazione del mezzo filtrante. Se lo si desidera, si può rà il mezzo filtrante 38 che rimarrà sotto forma di strato solido 4- usare ad es. una siringa ed un ago di tipo convenzionale per di fondo come illustrato in fig. 4. estrarre inizialmente la miscela 44 dal recipiente di centrifuga- 38 may comprise 1.5 milliliters of an aqueous solution. The separation of pathogenic microbes from the remaining part containing 3.0 parts by weight of gelatin; 97.0 parts by weight of the blood sample is carried out by placing the device water; 100.0 parts by weight of sucrose; 0.8 parts by weight of mixer and centrifuge 10 in a suitable L-cystine apparatus; 0.8 parts by weight of sodium thioglycolate and 0.0003 parts of centrifugation by subjecting it to a suf-weight centrifugal force of resazurine, for example. Lf) sufficient to separate the pathogenic microbes from the remaining elements The fluid 20 for the treatment of the sample may contain that make up the blood sample. The speed and the time-any suitable component e.g. a lysis agent and / or a little centrifugation can vary greatly depending on the anticoagulant and, if desired, an oxygen picker or the resistance of the material of which the container of reducing agent is composed in any desired concentration. It is possible to centrifuge and of the type of centrifugation apparatus, use any quantity of anticoagulant that is sufficient. Centrifugation can be carried out conveniently for the quantity of blood sample and any quantity of starting to the mixing and centrifuging device between approx. 100 lysis agent sufficient to perform lysis of the sample of e 6000 gravitational units and preferably from ca. 1400-5000 blood. E.g. 0.3 mil- gravitational units can be used as a treatment fluid. A suitable method comprises liters of an aqueous solution containing approx. 12% by weight of the use of an oscillating basket centrifugal rotor which imparts non-toxic saponin and approx. 2% by weight of sodium polypolyetholsulfone - a particular system according to this embodiment. Initially you will place the mixing apparatus and cen- 2000 and 4000 gravitational units for 10 to 20 minutes. The trifugator phase 10 in an upright position as illustrated in fig. 2 by centrifugation is schematically illustrated in fig. 6. allowing the liquid filtering medium 38 to pass downwards After the mixing and centrifugation step described against the pierceable closing element 14. Subsequently above, a sterile syringe 46 is injected carrying a new mixing and centrifuging device 10 is put in a 30 stiletto of excellent type 35 through the second element suitable cooling unit, e.g. a doublable chiller 14 of the centrifugation device as illustrated is rapidly cooled sufficiently to cause fig. 7. As indicated, the stylet may have any gelatin solidifies the liquid filter medium 38. Eg. appropriate length; however the openings 36 in the wall of the mixing and centrifuging apparatus can be cooled very close to the internal surface given quickly at 4 ° C. This phase is illustrated in fig. 3. After 35 of the pierceable closure element 14 after the injection it is withdrawn with the syringe 42, having a hypo-stylet needle represented in fig. 7. Since tip 34 of the dermal is of a conventional type, a fluid sample e.g. small pin 35 closed with forceps it will be possible to extract the thin layer gue (eg 8 ml). The conventional hypodermic needle is then uniformed by the liquid filtering medium lying adjacent to the replaced with the new stylet 23 which is then injected through the internal flat surface of the pierceable closure element towards the pierceable closure element 16 in the manner described 40 14 Thanks to the flat internal surface of the closure element above and the fluid sample is then injected into the perforable slot 14 it is possible to see clearly through the mixer and centrifuge apparatus 10 in the wall of the centrifugation vessel 10 so that the schematic technician shown in fig. 4. The turbulence created by the person in charge of this work can easily observe the operation of the passage of blood in the vacuum space 40 does not disturb the extraction of the filter medium. If desired, the filter medium 38 can be made which will remain in the form of a solid layer 4- use e.g. a syringe and a needle of a conventional type for the bottom as illustrated in fig. 4. initially extract the mixture 44 from the centrifuge container-

La miscelazione del campione di sangue col fluido di trat- zione e quindi mescolare il mezzo filtrante liquido ed aspor- Mixing the blood sample with the treatment fluid and then mixing the liquid filter medium and removing

tamento 20 contenente l'agente di lisi farà sì che le cellule san- tarlo per mezzo di un stiletto 35. 20 containing the lysing agent will cause the cells to fix it by means of a stylet 35.

guigne rosse vengano lisate ciò che minimizzerà il possibile ef- n mezz0 filtrante liquido 38 estratto mediante la siringa 46 red lines are lysed what will minimize the possible ef- n liquid filter medium 38 extracted by the syringe 46

fetto di intrappolamento o intercettazione degli eritrociti. 30 viene quindi preferibilmente agitato ad es. scuotendolo in mo- entrapment or interception of erythrocytes. 30 is then preferably stirred e.g. shaking it in mo-

Questo effetto di intercettazione consisterà in generale in ciò do che i microbi patogeni si mescolino intimamente e si distri- This interception effect will generally consist in what the pathogenic microbes mix intimately and distribute

che gli eritrociti e linfociti si ammucchiano sulla sommità del buiscano entro di esso in modo uniforme. Il mezzo filtrante li- that the erythrocytes and lymphocytes pile up on top of the buisca within it evenly. The filter medium

mezzo filtrante liquido durante la fase di centrifugazione e le quido 38 contenente i microbi patogeni dispersi viene quindi cellule così ammucchiate intercetteranno i microbi patogeni al distribuito su di un opportuno terreno di crescita batteriale loro passaggio verso il basso durante la centrifugazione impe- 5S nella fase di cultura che è rappresentata schematicamente nel- liquid filtering medium during the centrifugation phase and the liquid 38 containing the dispersed pathogenic microbes is then cells so piled up will intercept the pathogenic microbes to the distributed on a suitable bacterial growth medium their passage downwards during the centrifugation impede 5S in the phase of culture which is schematically represented in the

dendo loro così di raggiungere il mezzo filtrante liquido. Inol- la fig. 8 dei disegni. thus giving them to reach the liquid filter medium. In addition, fig. 8 of the drawings.

tre il sodiopolianetolsulfonato contenuto entro il fluido 20 per Ad es., con 1-1/2 millilitri di mezzo filtrante liquido conte- three the sodium polyanetholsulfonate contained within the fluid 20 for e.g., with 1-1 / 2 milliliters of liquid filter medium containing

il trattamento del campione agisce come anticoagulante ed nente microbi patogeni, una piastrina di agar sanguigno può the treatment of the sample acts as an anticoagulant and without pathogenic microbes, a blood agar plate can

inibisce l'attività fagocitica dei granulociti e monociti e la nor- accogliere 0,2 millilitri di terreno di cultura e la piastrina può inhibits the phagocytic activity of the granulocytes and monocytes and the tolerance of 0.2 milliliters of culture medium and the platelet can

male attività antibatterica del siero una volta che è mescolato R0 essere incubata a 37 °C in un'atmosfera aerobica. Un'altra pia- bad antibacterial activity of serum once R0 is mixed being incubated at 37 ° C in an aerobic atmosphere. Another plan-

col campione di sangue. strina di agar sanguigno può accogliere 0,2 millilitri di una so- with the blood sample. blood agar strina can hold 0.2 milliliters of a sol-

Successivamente, si ritira lo stiletto 23 dall'elemento di luzione acquosa e può essere incubata a 37°C in un vaso-chiusura perforabile 16 e l'apparecchio mescolatore e centri- candela. Un'altra piastrina di agar sanguigno può accogliere fugatore 10 contenente il mezzo filtrante liquido 38 allo stato 0,2 millilitri di una soluzione acquosa e può essere incubata a di gelo e il campione di sangue mescolato col fluido 20 di trat- Hr, 37°C in un ambiente anaerobico. Altri 0,2 millilitri della solu-tamento indicati in figg. 4 e 5 come miscela 44 viene riscaldato zione possono essere predisposti su una piastrina agar «sain posizione eretta tanto da fondere la gelatina e a far sì che il bouraud» ed incubati a 25°C in un ambiente aerobico. Altri mezzo filtrante liquido 38 si liquefaccia. L'apparecchio mesco- 0,2 millilitri della soluzione possono essere predisposti su una Subsequently, the stylet 23 is withdrawn from the aqueous lution element and can be incubated at 37 ° C in a pierceable vessel-closure 16 and the mixing and centering apparatus. Another blood agar plate can accommodate a leak 10 containing the liquid filtering medium 38 in the 0.2 milliliter state of an aqueous solution and can be incubated with frost and the blood sample mixed with the fluid 20 of trat- Hr, 37 ° C in an anaerobic environment. Another 0.2 milliliters of the solution indicated in figs. 4 and 5 as mixture 44 is heated can be prepared on an agar plate «in an upright position so as to melt the gelatin and to cause the bouraud» and incubated at 25 ° C in an aerobic environment. Other liquid filter medium 38 liquefies. The appliance can mix 0.2 milliliters of the solution on one

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piastrina EMB (colorante di eosina e blu di metilene) ed incubati a 37°C in un vaso-candela. Altri 0,5 millilitri di soluzione possono essere predisposti in un mezzo di tioglicolato liquido ed incubati a 37°C. Il terreno di crescita può essere verificato giornalmente controllando la presenza di colonie. Si può de- s terminare il numéro di microbi patogeni in 1 millilitro di sangue moltiplicando il numero di colonie per un fattore di correzione. Quest'ultimo tiene in considerazione la velocità di ricupero di un dato organismo, i volumi di sangue e le soluzioni filtranti liquide usate come pure la quantità di miscela finale io messa su piastrine. Nell'esempio generico indicato più sopra il fattore di correzione è di 1,56. EMB plate (eosin and methylene blue dye) and incubated at 37 ° C in a candle jar. Another 0.5 milliliters of solution can be prepared in a liquid thioglycolate medium and incubated at 37 ° C. Growth medium can be checked daily by checking for colonies. The number of pathogenic microbes in 1 milliliter of blood can be determined by multiplying the number of colonies by a correction factor. The latter takes into account the recovery rate of a given organism, the volumes of blood and the liquid filtering solutions used, as well as the quantity of final mixture placed on platelets. In the generic example indicated above, the correction factor is 1.56.

Si noti che mentre i disegni illustrano una forma preferita di questa invenzione atta a permettere l'esecuzione del test descritto più sopra relativo ai microbi patogeni, saranno pure ir> possibili altre forme d'esecuzione leggermente modificate. Ad es. si può sostituire al recipiente di centrifugazione 10 una semplice provetta. In questo caso si possono usare l'elemento di chiusura perforabile 16 e l'eccellente stiletto 23 senza prevedere il secondò elemento di chiusura 14. In realtà lo stiletto e l'elemento di chiusura perforabile 16 che racchiude la camera per il fluido di trattamento possono essere usati in combinazione con qualsiasi recipiente col quale si desidera miscelare completamente un fluido con un altro prima di mettere a contatto la miscela risultante con un terzo fluido contenuto nel recipiente. L'elemento di chiusura perforabile che comprende la camera per il fluido di trattamento può essere di forma qualsiasi purché chiuda a tenuta il recipiente in combinazione col quale viene usato. Dunque, per quanto la presente invenzione sia stata descritta con riferimento a certe sue forme d'esecuzione preferite si intende che potrebbero esserci diverse forme modificate che appariranno senz'altro possibili a chiunque è competente in questo ramo della tecnica leggendo la descrizione data più sopita. It should be noted that while the drawings illustrate a preferred form of this invention suitable for allowing the test described above concerning pathogenic microbes to be carried out, other slightly modified embodiments will also be possible. E.g. a simple test tube can be substituted for the centrifugation vessel 10. In this case, the pierceable closure element 16 and the excellent stylet 23 can be used without providing the second closure element 14. In reality, the stylet and the pierceable closure element 16 which encloses the chamber for the treatment fluid can be used in combination with any vessel with which it is desired to thoroughly mix one fluid with another before contacting the resulting mixture with a third fluid contained in the vessel. The pierceable closure element which comprises the chamber for the treatment fluid can be of any shape provided it closes the container in combination with which it is used. Therefore, although the present invention has been described with reference to some of its preferred embodiments, it is understood that there could be different modified forms which will certainly appear possible to anyone who is competent in this branch of the art by reading the description given above.

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1 foglio disegni 1 sheet of drawings

Claims

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1. Device for mixing a dose of sample fluid with a treatment liquid, characterized by:

a) a container (12) having a first and a second end, closed tightly; at least one end being closed tightly by a first perforable means (16) so as to delimit a main chamber (40) adapted to receive the sample mixed with a treatment fluid (44), which main chamber (40) is maintained at a lower than atmospheric pressure and a secondary chamber (16a); said secondary chamber (16a) adapted to contain a treatment fluid (20) of the aforementioned sample, being comprised between said first perforable means (16) and a membrane (22) perforable so that a stylet (23) can pass through said first perforable means (16) and said membrane until reaching said main chamber (40);

b) a perforation stylet (23) able to pass through said first pierceable closure means (16) through said secondary chamber (16a) and through said pierceable membrane (22) and able to simultaneously mix the sample fluid with the treatment (20) and passing the mixture (44) into said main chamber (40), depositing it on a filtering medium (38).

2. Apparatus according to claim 1, characterized in that the other end of the container is also sealed by a second perforable means (14), with a flat internal surface (18).

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Apparatus according to claims 1 and 2, characterized in that the stylet (23) (figs. 9 and 10) of a syringe comprises:

c) a first opening (24) and a second opening (26) spaced longitudinally along the wall of said stylet in such a way that both the first and the second opening communicate both with the secondary chamber (16a) after the penetration of the stylet into said first pierceable closure means;

d) a means (28) for blocking the flow of the sample fluid through said stylet, a means arranged between the first (24) and the second (26) opening.

Apparatus according to claims 1, 2 and 3, characterized in that the tip (34) of said stylet is closed tightly being the side walls of the stylet flattened at its tip, while the wall of said stylet adjacent to said flattened tip has a through opening (30).

Apparatus according to claims 1 to 4, characterized in that said through opening is formed by two coaxial openings (30) arranged in the wall of the stylet adjacent to said tip (34).

6. Apparatus according to claims 1 to 3, characterized in that said locking means (28) comprises flattened side walls (28) of said stylet between said first opening (24) and said second opening (26).

7. Apparatus according to claims 1 and 2, characterized in that it comprises a further stylet (35) (fig. 11) of a syringe having an opening (36), said opening being longitudinally spaced along the wall of said stylet, in such that after injection of the stylet through said second pierceable closure means (14) (fig. 7), it (36) is adjacent to the internal face (18) of said second pierceable closure means (14).

Apparatus according to claims from 1 to 7, characterized in that said container (12) is made in an elongated shape (10) (fig. 2) and can be fixed to means which allow the sample mixture (44) to be centrifuged with the treatment fluid contained in the main chamber (40).

Use of the apparatus according to claims 1 to 8 for the isolation and concentration of pathogenic microbes from a blood sample, characterized in that the mixture (44) of the sample with the treatment fluid is placed in contact with a sterile filter medium (38), which is not toxic to said pathogenic microbes and has a density greater than 1.06 gm / cc (44) but is capable of selectively receiving pathogenic microbes from said sample; a treatment agent (20) being disposed within said secondary chamber (16a) and said injection stylet (23) being passed through said first pierceable closure means (16), attracting them towards said secondary chamber (16a) containing the agent of treatment (20) and through said perforable membrane (22) to mix said sample with said treatment agent (20) when said sample fluid passes through it, and to inject the mixture (44) into said space below ir, empty (40).

Use according to claim 9, characterized in that said liquid filtering medium (38) is an aqueous solution of a macromolecular solute having microporous openings through its solubilized network, said openings having sufficient dimensions to pass selectively said pathogenic microbes from said sample fluid.