DE2747496C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und eine Vorrichtung zur selektiven Abtrennung pathogener Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe, insbesondere aus einer Blutprobe nach dem Abbau der Blutzellen, wobei die Blutprobe andere Komponenten, wie antimikrobielle Blutbestandteile und Arzneimittel enthalten kann, ohne die Verwendung spezialisierter fester oder flüssiger Filtermedien. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht eine bessere Abtrennung der pathogenen Mikroorganismen. Gleichzeitig wird eine neuartige Methode zur Diagnostizierung der Blutvergiftung zur Verfügung gestellt.

Vor kurzem wurde eine verbesserte Methode und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe, z. B. Blut, entwickelt. Diese Methode ist in der US- Patentschrift 39 28 139 beschrieben.

Nach dieser verbesserten Methode wird eine rasche und quantitative Feststellung pathogener Mikroorganismen in einer Körperflüssigkeitsprobe durch Verwendung eines flüssigen Filtermediums ermöglicht. Die Flüssigkeitsprobe wird innerhalb einer geschlossenen sterilen Zone auf das flüssige Filtermedium aufgebracht. Das flüssige Filtermedium hat eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe und beteht aus einer sterilen wäßrigen Lösung, die selektiv pathogene Mikroorganismen aus der Flüssigkeitsprobe aufnimmt. Die geschlossene sterile Zone wird darauf zentrifugiert, um die Flüssigkeitsprobe gegen das flüssige Filtermedium zu pressen und damit zu verursachen, daß die pathogenen Mikroorganismen selektiv in das Filtermedium eindringen und sich damit von der übrigen Flüssigkeitsprobe trennen. Dann wird das flüssige, die pathogenen Mikroorganismen enthaltende Filtermedium vom Rest der Flüssigkeitsprobe getrennt, und Teile des flüssigen Filtermediums werden verschiedenen Kultivierungsbedingungen unterworfen.

Das vorstehend beschriebene verbesserte Verfahren ermöglicht die schnelle und wirksame Trennung pathogener Mikroorganismen aus der Flüssigkeitsprobe. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform dieser Methode wird die Blutprobe vor dem Zentrifugieren einer Zellzerstörung unterworfen, wodurch die mikrobischen Erreger selektiv vom flüssigen Filtermedium aufgenommen werden. Andere Vorbehandlungsmittel, wie Anti-Koagulierungsmittel, werden ebenfalls zur Vorbereitung der Blutprobe verwendet. Einige Bestandteile des bevorzugten vorstehend erläuterten flüssigen Filtermediums sind mit einigen der Vorbehandlungs- und/oder die Zellzerstörung bewirkenden Mitteln unverträglich. Hinzu kommt, daß sich diese Mittel mit dem flüssigen Filtermedium vermischen, wenn sie diesem vor dem Aufbringen der Blutprobe auf die geschlossene sterile Zone zugegeben werden. Wenn sich diese Mittel erst einmal mit dem flüssigen Filtermedium vermischt haben, können sie aus diesem nicht schnell genug austreten, um das Blut wirksam zu behandeln. Es müssen daher entweder die Blutproben der Möglichkeit einer Verunreinigung von außen durch Vermischen der Blutprobe mit den Vorbehandlungs- und/oder die Zellzerstörung bewirkenden Mitteln vor der Einführung der Probe in ein geschlossenes steriles System ausgesetzt werden, oder es muß eine Spezialvorrichtung zur Anwendung kommen, wodurch die Behandlungsmittel innerhalb des geschlossenen Systems, aber getrennt vom flüssigen Filtermedium, gehalten werden könne, bis die Vorrichtung in Betrieb genommen wird. Eine Vorrichtung dieser Art ist in den US-Patentschriften 38 75 012 und 39 32 222 beschrieben.

In dem zuvor erläuterten verbesserten Verfahren wird ein flüssiges Filtermedium in einem Zentrifugiergefäß verwendet, das eine durchstoßbare Verschlußvorrichtung am Ende des Gefäßes umfaßt, gegen das die Blutprobe und das flüssige Filtermedium in der Zentrifugationsstufe gepreßt werden. Dabei hat man festgestellt, daß einige der schwereren mikrobischen Erreger, die vom flüssigen Filtermedium aufgenommen werden, unter der Einwirkung der Zentrifugalkraft vollständig durch das flüssige Filtermedium passieren können und nahe dem Boden des verwendeten Zentrifugationsgefäßes bleiben, so daß, falls nicht große Sorgfalt bei der Trennung und Gewinnung des flüssigen Filtermediums aufgewandt wird, diese mikrobischen Erreger ungewonnen zurückbleiben können. Man nimmt an, daß dieser Verlust an mikrobischen Erregern dadurch bedingt wird, daß beim vollständigen Passieren des flüssigen Filtermediums diese Erreger in dem winzigen Raum zwischen der Wandung des Zentrifugationsgefäßes und dem einsetzbaren Verschluß aufgenommen werden.

Ein steriles Verfahren zur Trennung und Konzentrierung mikrobischer Erreger, die wahrscheinlich in einer Blutprobe enthalten sind, ohne die Notwendigkeit des vorherigen Vermischens der Blutprobe in einer potentiell verunreinigenden Umgebung und ohne die Notwendigkeit der Verwendung einer Spezialvorrichtung zur Durchführung der Vorbehandlungsstufe ist daher sehr erwünscht.

Besonders erwünscht ist ferner die verbesserte Gewinnung der selektiv aus einer Flüssigkeitsprobe abgetrennten und konzentrierten mikrobischen Erreger.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe zur Verfügung, in dem eine die Flüssigkeitsprobe enthaltende geschlossene sterile Zone zentrifugiert wird, wobei man die Zentrifugation in Gegenwart eines nicht-toxischen, mit Wasser nicht mischtbaren, flüssigen, Kissen bildenden Mittels mit einer Dichte von etwa 1,2 bis etwa 2,0 g/cm³ und einem Siedepunkt von etwa 90 bis etwa 210°C durchführt.

Dieses Verfahren ist auf alle Arten von Körperflüssigkeiten anwendbar, wie Blut, Knochenmark, spinale und plurale Flüssigkeiten, Urin und dergleichen. Außerdem kann dieses Verfahren auf jede Mikroorganismen enthaltende Probe angewandt werden, um die Mikroorganismen von jeglichen in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen antimikrobiellen Faktoren, wie Nahrungsmitteln, z. B. Milch und dergleichen, abzutrennen und zu konzentrieren. Allgemein gesagt, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren bei seiner Anwendung auf eine Blutprobe die Ablagerung einer einer Zellzerstörung unterworfenen Blutprobe auf eine verhältnismäßig dünne Schicht eines nicht-toxischen, mit Wasser nicht mischbaren, hydrophoben, flüssigen, Kissen bildenden Mittels mit einer Dichte von etwa 1,2 bis 2,0 g/cm³ und einem Siedepunkt von etwa 90 bis 210°C.

Dieses Kissen bildende Mittel ist mit den die Zellzerstörung bewirkenden und anderen Blutbehandlungsmitteln verträglich, und diese Mittel trennen sich rasch von dem Kissen bildenden Mittel, wenn sie mit ihm vermischt sind. Um eine mögliche Verunreinigung zu vermeiden, wird daher vorzugsweise eine Blutprobe in eine sterile geschlossene Zone gespritzt, die sowohl das Kissen bildende Mittel als auch eine wirksame Menge an die Zellzerstörung bewirkenden und/oder anderen Blutbehandlungsmitteln enthält, so daß die Blutprobe in situ behandelt wird. Die behandelte Blutprobe in der geschlossenen sterilen Zone wird dann einer Zentrifugation unterworfen, wodurch die Blutprobe gegen das Kissen bildende Mittel gepreßt wird. Man hat gefunden, daß bei einer solchen Zentrifugation im wesentlichen die gesamten mikrobischen Erreger, die in einer einem Zellabbau unterworfenen Blutprobe enthalten sind, aus der Suspension treten und sich in einer Schicht an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel und der Blutprobe selbst sammeln. Die mikrobischen Erreger durchdringen tatsächlich die Grenzschicht zwischen Kissen bildendem Mittel und Blutprobe und treten in das Kissen bildende Mittel ein oder bleiben an der Oberfläche oder nahe der Oberfläche des Kissen bildenden Mittels, d. h. kein oder im wesentlichen kein Erreger passiert das Kissen bildende Mittel vollständig. Dies steht im Gegensatz zur Verwendung eines flüssigen Filtermediums, das selektiv mikrobische Erreger aufnimmt und das von einigen der Mikroorganismen vollständig passiert wird, die dann zwischen der Wandung des Zentrifugationsgefäßes und der einsetzbaren Verschlußvorrichtung eingeschlossen werden. Die in erfindungsgemäßer Weise gebildete Schicht aus mikrobischen Erregern kann ohne wesentlichen Verlust gewonnen werden, wenn man das Kissen bildende Mittel und einen kleineren Anteil der restlichen Blutprobe an der Grenzfläche des Kissen bildenden Mittels vom Hauptteil der Probe trennt. Die Gegenwart des Kissen bildenden Mittels während der Zentrifugation der Blutprobe ermöglicht damit die Abtrennung der pathogenen Mikroorganismen von der Blutprobe sowie von jeglichem Arzneimittel und anti-pathogenen Faktoren, die in dieser Probe enthalten sind. Nach der Gewinnung können die Erreger sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Kissen bildenden Mittels, entweder allein oder in Verbindung mit einem flüssigen Filtermedium, ermöglicht eine wesentlich bessere Gewinnung der aus einer Blutprobe abgetrennten mikrobischen Erreger. Als Kissen bildende Mittel können generell inerte Flüssigkeiten verwendet werden, die gegenüber den Mikroorganismen nicht-toxisch, mit Wasser nicht mischbar und hydrophob sind, deren Dichte etwa 1,2 bis etwa 2,0 g/cm³ beträgt und die einen Siedepunkt von etwa 90 bis etwa 210°C aufweisen. Erfindungsgemäß handelt es sich um Flüssigkeiten, deren Dichte ausreicht, um bei Anwendung von Zentrifugalkraft von einer Mischung aus einer Blutprobe und einer Behandlungsflüssigkeit für die Blutprobe oder von einer anderen Flüssigkeitsprobe, von der man annimmt, daß sie mikrobische Erreger enthält, nicht getragen zu werden. Vermutlich bewirken diese Mittel aufgrund ihrer hohen Dichte einen Kissen bildenden Effekt auf die mikrobischen Erreger, die beim Zentrifugieren aus der Suspension der Blutprobe herausgepreßt werden. Die pathogenen Mikroorganismen werden an der Grenzfläche zwischen der Blutprobe selbst und dem Kissen bildenden Mittel aufgefangen. Auf diese Weise gehen die Mikroorganismen nicht an vorhandene Zwischenräume verloren.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Gewinnung der pathogenen Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe. Diese Vorrichtung umfaßt einen Zentrifugenbehälter, der mit durchstoßbaren Verschlüssen versehen ist, wobei das Innere dieses Behälters einen auf einen niedrigeren als Atmosphärendruck evakuierten Raum aufweist, der an das erfindungsgemäße Kisen bildende Mittel hoher Dichte angrenzt.

Der Zentrifugenbehälter weist innen eine glatte kontinuierliche Oberfläche auf, so daß beim Zentrifugieren die Flüssigkeitsprobe in im wesentlichen rechten Winkel gegen die Oberfläche gepreßt wird. Die Oberfläche umfaßt das innere Ende eines durchstoßbaren Verschlusses für den Behälter, auf dem das oben beschriebene Kissen bildende Mittel aufgebracht ist. Das Kissen bildende Mittel wird auf der inneren Oberfläche des durchstoßbaren Verschlusses verteilt und füllt die Zwischenräume zwischen der Wandung des Zentrifugenbehälters und dem durchstoßbaren Verschluß, so daß jeder Einschluß schwerer pathogener Mikroorganismen, die während des Zentrifugierens zu dem Kissen bildenden Mittel passieren können, verhindert wird. Wenn eine Schaukelbecherzentrifuge verwendet wird, sollte die innere Oberfläche des durchstoßbaren Verschlusses senkrecht zum Boden des durchstoßbaren Verschlusses stehen. Wenn ferner eine Winkelrotorzentrifuge eingesetzt wird, ist die glatte innere Oberfläche des durchstoßbaren Verschlusses innerhalb des Zentrifugenbehälters in einem Winkel angeordnet, der komplementär zu dem Winkel ist, bei dem die Zentrifugation durchgeführt wird. Diese Anordnung ermöglicht die Verwendung der herkömmlichen Winkelzentrifugen und resultiert in einem kürzeren Weg des Erregers durch die Probenflüssigkeit, bevor er an der Innenfläche des Kissen bildenden Mittels konzentriert wird. Dieser kürzere Weg resultiert in einer auf die pathogenen Mikroorganismen in der Probenflüssigkeit angewandten größeren durchschnittlichen Kraft "g". Die Zentrifugation unter Anwendung dieses Zentrifugenbehälters führt zur Konzentrierung der Erreger an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel und der Probenflüssigkeit und teilweise an der Seitenwandung des Zentrifugenbehälters. Die so konzentrierten pathogenen Mikroorganismen lassen sich leicht sammeln und aus dem Zentrifugenbehälter entfernen. Die Einstellung der Oberfläche im Zentrifugenbehälter in einem solchen Winkel, daß die Blutprobe und das Kissen bildende Mittel während des Zentrifugierens in im wesentlichen senkrechten Winkel gegen die Oberfläche gepreßt werden, gewährleistet, daß sich das Kissen bildende Mittel im wesentlichen gleichmäßig über die Oberfläche verteilt, so daß jegliche Zwischenräume, die Mikroorganismen einschließen könnten, verschlossen werden. Die Anwendung dieser speziell konstruierten Zentrifugenbehälter führt zu einer höheren Zentrifugenleistung insofern, als die Zentrifugation bei niedrigeren "g"- Werten in der gleichen Zeit durchgeführt werden kann wie die herkömmliche Zentrifugation, oder bei den gleichen "g"-Werten in kürzerer Zeit als die herkömmliche Zentrifugation.

Ferner kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Zellauflösung und/oder die Behandlung des Blutes mit anderen Mitteln zur Vorbereitung einer Blutprobe in einer wäßrigen Lösung innerhalb des Zentrifugenbehälters im Kontakt mit dem flüssigen, Kissen bildenden Mittel durchgeführt werden. Ds flüssige, Kissen bildende Mittel hat eine höhere Dichte als die wäßrige Lösung und ist hydrophob und mit Wasser nicht mischbar, so daß es die wäßrige Lösung trägt. Wenn ferner der Zentrifugenbehälter während der Lagerung und des Transports geschüttelt wird, vermischen sich die zellauflösenden oder anderen Blutbehandlungsmittel mit dem Kissen bildenden Mittel. Wenn jedoch der Zentrifugenbehälter zentrifugiert wird, trennt sich das flüssige, Kissen bildende Mittel hoher Dichte leicht ab und ermöglicht somit die Vermischung der Blutbehandlungsmittel mit der Blutprobe im Behälter. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber den oben beschriebenen herkömmlichen Filtermedien dar, die Bestandteile enthalten, die mit einigen der Blutbehandlungsmittel unverträglich sind. Außerdem sind die herkömmlichen flüssigen Filtermedien auf wäßriger Basis aufgebaut, d. h. sie vermischen sich mit den wäßrigen Blutbehandlungsmitteln, wenn sie miteinander in Kontakt sind, und verhindern eine wirksame Trennung voneinander und eine Behandlung der Blutprobe, die in den Behälter eingebracht ist.

Die Erfindung wird anhand der Abbildungen erläutert. In ihnen stellt

Fig. 1 einen Querschnitt durch den bevorzugten Zentrifugenbehälter gemäß der Erfindung dar,

Fig. 2 bis 9 veranschaulichen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen unter Verwendung des Behälters der Fig. 1.

Der Behälter 20 besteht aus einem länglichen rohrförmigen Gefäß 22 mit einem durchstoßbaren Verschluß 24, der das obere Ende verschließt, und einem durchstoßbaren Verschluß 26, der das untere Ende verschließt. Wenn der Behälter gemäß der bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen verwendet werden soll, wird eine wirksame Menge des Kissen bildenden Mittels 28 und der Blutbehandlungsmittel 30 in ihn eingebracht.

Der Behälter 22 kann aus silikonbeschichtetem Glas oder Hartplastik bestehen, z. B. aus Polycarbonat oder Polypropylen. Die durchstoßbaren Verschlußglieder 24 und 26 können aus selbstdichtenden Kautschukstöpseln bestehen. Die Verschlußglieder 24 und 26 tragen jeweils Einkerbungen 24 a und 26 a, um das Durchstoßen mit herkömmlichen medizinischen Injektionsnadeln zu erleichtern. Der evakuierte Raum 32 wird auf einem vorbestimmten niedrigeren als Atmosphärendruck gehalten, so daß in den Behälter eine bekannte Menge Flüssigkeit durch Injektion durch das durchstoßbare Verschlußglied 24 eingebracht werden kann, ohne daß im Inneren des Behälters ein übermäßiger Druck entsteht, der dazu führen könnte, daß die Verschlußglieder 24 und 26 aus ihrer Position in den Öffnungen des Behälters 22 treten.

Zu bemerken ist, daß die innere Oberfläche 34 des durchstoßbaren Verschlußgliedes 26 in einem Winkel zur Wandung des Behälters 22 geneigt ist.

Der Behälter 22 ist besonders für die Verwendung in einer Winkelrotorzentrifuge konstruiert, wobei der Winkel der inneren Oberfläche 34 zum Winkel des Rotors komplementär ist. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in einer herkömmlichen Schaukelbecherzentrifuge verwendet werdem kann. Im letzteren Fall sollte die Oberfläche 34 senkrecht zum Boden des Behälters 20 stehen. Im übrigen ist die Anwendungsweise gleich. Die Oberfläche 34 sollte glatt und im wesentlichen frei von Hohlräumen sein, in denen pathogene Mikroorganismen eingeschlossen werden könnten. Ferner sollte der ringförmige Verschlußbereich um die Oberfläche 34, wo das durchstoßbare Verschlußglied 26 auf die Wandung des Behälters 22 trifft, dichtverschlossen sein, so daß kein großer ringförmiger Zwischenraum vorliegt, in dem pathogene Mikroorganismen eingeschlossen werden könnten.

Der Neigungswinkel der glatten Oberfläche 34 in bezug auf die Wandung des Behälters 22 wird in Übereinstimmung mit der Zentrifugenvorrichtung festgelegt, in der der Behälter 20 verwendet werden soll.

Wie oben schon ausgeführt, ist bei Verwendung einer Schaukelbecherzentrifuge die Oberfläche 34 senkrecht zum Boden des Behälters 20 eingestellt. Wenn jedoch eine Winkelrotorzentrifuge eingesetzt wird, ist die Oberfläche 34 in einem Komplementärwinkel zum Winkel des Rotors angeordnet. Das heißt, wenn die Rotorwinkel im Bereich von 60° bis 10° liegen, beträgt der Winkel der Oberfläche 34 oder der Neigungswinkel 36 im Behälter ensprechend 30° bis 80°. Das heißt, der durch den Bogen 36 amgezeigte Neigungswinkel ist im allgemeinen komplementär zum Winkel, in dem der Behälter 20 während des Zentrifugierens in der Zentrifuge steht. Wenn z. B. der Neigungswinkel 36 in der Fig. 1 etwa 34° beträgt, wird der Behälter 20 in eine Winkelrotorzentrifuge eingebracht, in der die Zentrifugation bei etwa 56° vor sich geht, so daß die Flüssigkeit im Behälter 20 in im wesentlichen rechten Winkel gegen die Oberfläche 34 gepreßt wird.

Wie in Fig. 1 dargestellt ist, besteht das durchstoßbare Verschlußglied 26 aus einem einzigen Stück Kautschuk. Die Oberfläche 34 kann unter Verwendung eines dichtschließenden Pfropfens aus einem beliebigen Material hergestellt werden, das zu einer glatten Oberfläche und einer guten Abdichtung der Wandung des Behälters 22 führt, durchstoßbar und gegenüber den pathogenen Mikroorganismen nicht-toxisch ist, z. B. aus herkömmlichem Kautschuk. Für die Herstellung eines solchen Stopfens in situ kann man ein Material verwenden, das in den Behälter 22 gegossen werden kann, nachdem ein herkömmlicher Kautschukstopfen, z. B. das durchstoßbare Verschlußglied 24, in das untere Ende des Behälters 22 eingesetzt wurde. Das Material sollte ausreichend fließfähig sein und ausreichend lange Härtungszeiten besitzen, um den Behälter 22 in den gewünschten Neigungswinkel zu bringen, so daß das Material in den angestrebten Neigungswinkeln fließt und dann härtet. Nach dem Härten ergibt es eine glatte Oberfläche 34 bei guter Abdichtung der Wandung des Behälters 22. Beispiele für solche Materialien sind herkömmliche Badewannenabdichtungsmittel und Harze auf Silikonbasis, die in fließfähiger, niedrig viskoser Form zur Verfügung stehen und zu einem elastomeren Material härten. Ein Beispiel für ein Material der zuletzt genannten Art ist ein fließfähiges Harz auf Silikonbasis. Wenn ein solches Material verwendet wird, ist es manchmal ratsam, auf die Innenwandung des Behälters 22 eine Grundierung aufzubringen, um eine gute Dichtung zwischen dem gehärteten Material und der Behälterwandung 22 zu gewährleisten. Zum Beispiel kann eine glatte geneigte Fläche 34 als innere Oberfläche eines einheitlichen durchstoßbaren Verschlußgliedes 26, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, durch Grundieren der Innenwandung des Behälters 22 mit einem geeigneten Grundierungsharz auf Silikonbasis, Einsetzen eines üblichen Kautschukstopfens als durchstoßbaren Verschlußglied 24, Eingießen von flüssigem Silikonharz in den Behälter 22, Anordnen des Behälters im gewünschten Neigungswinkel und Härten des Silkonharzes unter entsprechenden Bedingungen hergestellt werden. Badewannendichtungsmittel und ähnliche Materialien können, falls gewünscht, in der gleichen allgemeinen Weise angewandt werden. Der richtige Neigungswinkel kann durch Zentrifugieren des das ungehärtete Material enthaltenden Behälters in der Zentrifuge, in der der Behälter letztlich angewandt werden soll, erreicht werden.

Wenn eine glatte Oberfläche 34 gebildet ist, entweder durch Verwendung eines aus einem Stück bestehenden durchstoßbaren Verschlußgliedes 26 oder durch eine Kombination aus einem Kautschukstopfen und einem oben beschriebenen Material, kann eine wirksame Menge des Kissens bildenden Mittels in den Behälter 20 eingeführt werden. Diese Menge sollte ausreichen, um beim Zentrifugieren die Fläche 34 vollständig zu bedecken, sie sollte aber nicht so groß sein, um die Blutmenge, die der Behälter 20 aufnehmen kann, wesentlich zu beschränken. Die Menge des Kissen bildenden Mittels kann in Abhängigkeit vom Parameter des besonderen ausgewählten Systems, z. B. der Form des Stopfens, dem Volumen des restlichen Bluts und der Flüchtigkeit des verwendeten, Kissen bildenden Mittels, variieren. Eine bevorzugte Menge Kissen bildendes Mittel kann etwa 3,3 bis etwa 30,0 Vol.-% betragen, bezogen auf das Volumen der Mischung aus Kissen bildendem Mittel und restlicher Blutprobe, die aus dem Behälter 20 entfernt und auf die Gegenwart pathogener Mikroorganismen untersucht wird.

Das erfindungsgemäß verwendete, Kissen bildende Mittel besteht aus einer hydrophoben, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, deren Dichte im Bereich von etwa 1,2 g/cm³ bis etwa 2,0 g/cm³ liegt, wobei der bevorzugte Bereich etwa 1,6 g/cm³ bis etwa 2,0 g/cm³ beträgt. Erfindungsgemäß handelt es sich um eine Flüssigkeit, die von der Mischung aus Blut und Blutbehandlungsflüssigkeit oder einer anderen Flüssigkeitsprobe, von der man annimmt, daß sie pathogene Mikroorganismen enthält, bei Anwendung von Zentrifugalkraft nicht getragen wird. Außerdem ist das Kissen bildende Mittel gegenüber den pathogenen Mikroorganismen nicht-toxisch und sollte in bezug auf Butylkautschuk, Silikonkautschuk und andere Elastomere, die bei der Herstellung des durchstoßbaren Verschlußgliedes verwendet werden, verhältnismäßig inert sein.

Im allgemeinen werden fluorierte Kohlenwasserstoffe mit den oben beschriebenen Eigenschaften und Molekulargewichten im Bereich von etwa 300 bis etwa 850 bevorzugt. Weiterhin werden fluorierte Kohlenwasserstoffe mit den obigen Eigenschaften bevorzugt, die mit etwa der gleichen Geschwindigkeit verdampfen wie Wasser, wenn eine das Kissen bildende Mittel enthaltende Probe auf eine herkömmliche Plattenkultur aufgebracht wird. Dementsprechend werden erfindungsgemäß Kissen bildende Mittel mit den oben angegebenen Eigenschaften und Siedepunkten von etwa 90°C bis etwa 210°C und vorzugsweise von 100°C bis etwa 140°C verwendet. Das Kissen bildende Mittel sollte außerdem einen Dampfdruck haben, der während der Verarbeitungsstufen, wie z. B. des Autoklavierens, die durchstoßbaren Verschlüsse nicht aus dem Behälter drängt. Fluorierte Kohlenwasserstoffe erwiesen sich als geeignet.

Obgleich die genaue Wirkungsweise der Kissen bildenden Mittel nicht vollständig bekannt ist, nimmt man an, daß sie die Sammlung der aus einer zentrifugierten Blutprobe ausgetretenen pathogenen Mikroorganismen in mindestens zweierlei Weise verbessern. Einmal verschließt das Kissen bildende Mittel Zwischenräume, Risse und Löcher in der glatten Oberfläche 34 des Behälters 22 und an der Grenzfläche zwischen der Wandung des Behälters 22 und dem durchstoßbaren Verschlußglied 26. Pathogene Mikroorganismen, die sonst in diesen Zwischenräumen eingeschlossen werden könnten und daher nicht gewonnen werden, werden mit dem Kissen bildenden Mittel 28 entfernt, wenn dieses dem Behälter 20 entnommen wird. Zweitens nimmt man an, daß das Kissen bildende Mittel den Zusammenstoß pathogener Mikroorganismen, die während des Zentrifugierens aus der Blutprobe gedrückt werden, abfängt. Dieser Dämpfungseffekt verringert die Gefahr einer Schädigung der pathogenen Mikroorganismen, die durch den Zusammenprall verursacht werden könnte. Während ferner einige der pathogenen Mikroorganismen tatsächlich in das Kissen bildende Mittel eintreten können, passiert im wesentlichen keiner dieses Mittel vollständig, und der überwiegende Teil sammelte sich an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel 28 und der Blutprobe in einer Schicht.

Nachdem das Kissen bildende Mittel 28 in den Behälter 20 eingebracht ist, können auch wasserlösliche Behandlungsmittel 30 für das Blut eingetragen werden. Solche Behandlungsmittel können z. B. die Zellauflösung bewirkende Mittel und/oder Antikoagulantien umfassen. Es kann jedes geeignete zellauflösende Mittel verwendet werden, solange es für die Mikroorganismen nicht toxisch ist. Ein geeignetes, die Zellauflösung bewirkendes Mittel ist eine wäßrige Lösung eines nicht-toxischen Saponins. Es ist bekannt, daß viele Saponine gegenüber pathogenen Mikroorganismen toxisch sind. In der US-Patentschrift 38 83 425 ist jedoch ein Verfahren zur Entfernung der toxischen Bestandteile aus Saponinen beschrieben, die man bisher als toxisch erachtete. Im allgemeinen kann das toxische Saponinmaterial gemäß der Lehre der US-Patentschrift 38 83 425 entgiftet werden. in dieser Weise gereinigtes Material kann im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Die wäßrige Saponinlösung kann außerdem ein Antikoagulationsmittel und/oder Sauerstoffspülmittel enthalten. Ein bevorzugtes Antikoagulationsmittel ist z. B. Natrium-polyanethol-sulfonat (SPS) oder Heparin. Natrium-polyanethol-sulfonat wird bevorzugt, da es nicht nur als Antikoagulationsmittel wirkt, sondern auch die phagozytische Wirkung von Granulocyten und Monocyten sowie die normale antibakterielle Wirksamkeit von Blutserum hemmt. Vorzugsweise macht die wäßrige Lösung des Behandlungsmittels mindestens 1,0 Vol.-% der gesamten Flüssigkeit aus Behandlungslösung, Flüssigkeitsprobe und Kissen bildendem Mittel im Behälter 22 aus. Vorzugsweise beträgt ihre Menge etwa 7,6 bis 17,5 Vol.-%.

Wenn die Behandlungsmittel 30 in den Zentrifugierbehälter 20 eingebracht sind, kann das durchstoßbare Verschlußglied 24 in Stellung gebracht und der Raum 32 auf den gewünschten Druck evakuiert werden, der niedriger ist als Atmosphärendruck.

In den Fig. 2 bis 9 ist schematisch eine Analysenfolge einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dargestellt. Als Beispiel kann ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Blutprobe zweckmäßig unter Verwendung der folgenden Anordnung durchgeführt werden:
Der Zentrifugierbehälter 20 mit dem Kissen bildenden Mittel 28 und den Blutbehandlungsmitteln 30 kann ein Volumen von 12 bis 14 ml haben;
eine sterile Glasspritze und eine entfernbare subkutane Nadel mit einer Länge von 3,81 cm und einem äußeren Durchmesser von 1,7 mm;
eine sterile Glasspritze und eine entfernbare subkutane Nadel mit einer Länge von 2,54 cm und einem äußeren Durchmesser von 0,81 mm;
eine subkutane Nadel mit einer Länge von 1,59 cm und einem äußeren Durchmesser von 0,5 mm mit einem Wattepfropfen als durchlässigen Verschluß in ihrer Mitte;
drei Blutagarplatten;
eine Schokoladeagarplatte;
eine Sabouraudplatte.

Mit Ausnahme des Zentrifugierbehälters 20 oder eines äquivalenten Gegenstandes können verschiedene Arten bekannter Laborvorrichtungen und Kulturmedien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Insbesondere ist festzustellen, daß die obengenannten Kulturmedien nur als Beispiele angeführt sind und im allgemeinen für die Bestimmung der häufigsten bekannten pathogenen Mikroorganismen bevorzugt werden. Bei den Blutagarplatten handelt es sich um herkömmlicherweise verwendete Blutagarplatten auf der Basis von Schafsblut und Nährstoffen, wie Zucker, die mit einem Agar-Verfestigungsmittel auf eine Petrischale aufgebracht werden. Die Schokoladeagarplatte wird zur Züchtung bestimmter heikler pathogener Mikroorganismen, z. B. Hämophilus, verwendet. Die Sabouraudplatte dient speziell zur Züchtung von Fungi.

Obgleich somit verschiedene Vorrichtungen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, ist es zweckmäßig, die oben aufgeführte Anordnung einzusetzen.

Der Zentrifugierbehälter 20 der Fig. 1 wird zu Anfang so angeordnet, daß sich das durchstoßbare Verschlußglied 26 mit der geneigten glatten Oberfläche 34 am unteren Ende befindet, so daß das Kissen bildende Mittel 28 und die Blutbehandlungsflüssigkeit 30 auf der geneigten Oberfläche 34 zu stehen kommen. Zur besseren Illustration sind in Fig. 2 zwei getrennte Flüssigkeitsspiegel, die das Kissen bildende Mittel 28 und die Behandlungsflüssigkeit 30 veranschaulichen, dargestellt. In der Praxis kann aufgrund der Handhabung eine nicht-beständige Emulsion oder Mischung der beiden Flüssigkeiten eintreten, so daß nicht immer zwei getrennte Flüssigkeitsschichten vorhanden sind. Die unbeständige Mischung aus Kissen bildendem Mittel 28 und Blutbehandlungsflüssigkeit 30 beeinträchtigt das erfindungsgemäße Verfahren in keiner Weise, da die Trennung der beiden Flüssigkeiten rasch beim Zentrifugieren eintritt.

Dann wird eine vorbestimmte Menge einer einem Patienten abgezogenen Blutprobe 38, z. B. 7 ml Blut, unter Verwendung einer üblichen Spritze 40 in den evakuierten Raum des Behälters 20 eingespritzt, wie in Fig. 3 dargestellt. Alternativ kann die Probe direkt unter Verwendung einer feststehenden Standard-Doppelnadel mit einer herkömmlichen Vakuumblutabziehvorrichtung in den Behälter 20 aufgezogen werden. Anschließend wird der die Blutprobe 38, die Blutbehandlungsflüssigkeit 30 und das Kissen bildende Mittel 28 enthaltende Behälter 20 einem Mischvorgang unterworfen, um zu gewährleisten, daß die Blutbehandlungsmittel 30 vollständig mit der Blutprobe 38 vermischt werden. Diese Vermischungsstufe ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.

Nachdem die Blutprobe 38 in dieser Weise behandelt wurde, wird der Behälter 20 zentrifugiert, damit die pathogenen Mikroorganismen in der behandelten Blutprobe 42 aus der Suspension austreten und sich an der Grenzfläche zwischen dem Kissen bildenden Mittel 28 mit hoher Dichte und der restlichen Probenflüssigkeit sammeln. Einige pathogene Mikroorganismen werden auf der Seitenwandung des Behälters 22 angrenzend an das höhere Ende der glatten Oberfläche 34 beim Punkt 22 a abgelagert. Die Zentrifugierungsstufe ist schematisch in Fig. 5 dargestellt. Geschwindigkeit und Dauer der Zentrifugierungsstufe können in Abhängigkeit von der Konstruktion des Behälters 20 und der Art der Zentrifugenvorrichtung stark variieren. Die Zentrifugierung kann zweckmäßig in der Weise bewirkt werden, daß man dem die Blutprobe 42 und das Kissen bildende Mittel 28 enthaltenden Behälter 20 zwischen etwa 1500 und 6000 g und vorzugsweise etwa 1500 bis 3000 g verleiht. Wie in Fig. 5 dargestellt ist, wird eine Winkelrotorzentrifuge verwendet, die den Behälter 20 während des Zentrifugierens, z. B. in einem Winkel von 56°, wie durch den Bogen 43 angezeigt ist, einstellt. Wenn daher die glatte Oberfläche 34 einen Winkel von 34° in bezug auf die Innenwandung des Behälters 20 einnimmt, werden die behandelte Blutprobe 42 und das Kissen bildende Mittel 28 während des Zentrifugierens in einem verhältnismäßig rechten Winkel gegen die glatte Oberfläche 34 gepreßt. Bei Verwendung einer Schaukelbecherzentrifuge wird der Behälter 20 bei im wesentlichen 0° in bezug auf die horizontale Fläche zentrifugiert. In diesem Fall macht der Winkel der Oberfläche 34 annähernd 90° aus, und es kann ein Kautschukverschlußglied mit einer ebenen inneren Oberfläche anstelle des Verschlußgliedes 26 verwendet werden.

Nach Beendigung der Zentrifugationsstufe kann der Behälter 20 von der Zentrifuge genommen und der größere Teil der behandelten Blutprobe 42, aus der die pathogenen Mikroorganismen abgetrennt wurden, entfernt werden. Der vorliegend verwendete Ausdruck "restliches behandeltes Blut" oder "restliches Blut" bezeichnet eine Blutprobe, die so zentrifugiert wurde, daß die vorhandenen pathogenen Mikroorganismen am Boden der Probe gesammelt wurden und damit einen "restlichen" Teil der Probe zurücklassen, der von pathogenen Mikroorganismen im wesentlichen frei ist. Diese Stufe ist in Fig. 6 dargestellt. Zur Erleichterung der Entfernung wird z. B. eine Abzugsnadel 44 in Form einer üblichen subkutanen Nadel mit einem Wattestopfen durch das durchstoßbare Verschlußglied 24 gestoßen. Eine zweite subkutane Nadel mit der Spritze 45 kann durch das durchstoßbare Verschlußglied 26 eingeführt werden, um den größeren Teil der restlichen behandelten Blutprobe 42 zu entfernen, aus der die pathogenen Mikroorganismen abgetrennt wurden. Wenn z. B. der Behälter 20 ein Volumen von 12 bis etwa 14 ml hat, kann eine Nadel mit einer Länge von 3,81 cm und einem äußeren Durchmesser von 1,27 mm zur Entfernung der gesamten behandelten Blutprobe 42 bis auf etwa 1,3 bis 1,7 ml verwendet werden. Wie gezeigt, bevorzugt man die Entfernung des größeren Anteils der restlichen Blutprobe aus dem Inneren des Behälters 22 an einer Stelle der Seitenwandung, die der an das ober Ende der glatten Fläche 34 angrenzenden Seitenwandung gegenüberliegt, um eine Störung der Schicht aus pathogenen Mikroorganismen, die sich auf und innerhalb der Grenzfläche der beiden Flüssigkeiten und an der Seitenwandung des Behälters 22 angrenzend an das obere Ende der glatten Fläche 34 gebildet hat, zu vermeiden. Der Hauptteil des restlichen Bluts wird in dieser Stufe entfernt, jedoch sollte ein kleiner Anteil restliches Blut im Behälter 22 verbleiben, so daß von der gesamten verbleibenden Flüssigkeit das Kissen bildende Mittel etwa 4,7 bis etwa 28,6 Vol.-% ausmacht. Vorzugsweise sollte das Kissen bildende Mittel nicht mehr als etwa 20 Vol.-% betragen, da größere Mengen dieses Mittels die Morphologie der pathogenen Mikroorganismenkolonien in den nachfolgenden Kultivierungsstufen beeinträchtigen können.

Wenn der größere Anteil der behandelten restlichen Blutprobe entfernt ist, können beide Nadeln aus den Verschlußgliedern 24 und 26 gezogen werden, und der Behälter 20 kann einer zweiten Vermischung unterworfen werden, wie schematisch in Fig. 7 gezeigt ist. Falls gewünscht, kann jedoch die Abzugsnadel 44 in ihrer Stellung im durchstoßbaren Verschlußglied 24 bleiben, um die Entfernung der pathogenen Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeit in einer späteren Stufe zu erleichtern. Die zweite Vermischungsstufe dient der Re-Suspendierung der pathogenen Mikroorganismen, die sich aus dem größeren Anteil der restlichen behandelten Blutprobe 42 abgetrennt und die oben beschriebene Schicht gebildet haben. Die Re-Suspendierung der so gesammelten pathogenen Mikroorganismen im verbleibenden kleineren Teil der behandelten restlichen Blutprobe 42 gewährleistet eine bessere und gleichmäßigere Gewinnung.

Wenn in der Vermischungsstufe die pathogenen Mikroorganismen im kleineren Anteil der behandelten restlichen Blutprobe 42 re-suspendiert sind, können die Mischung aus pathogenen Mikroorganismen in der behandelten restlichen Blutprobe und das Kissen bildende Mittel hoher Dichte aus dem Behälter 20 entfernt werden. Diese Stufe ist in Fig. 8 wiedergegeben. Wie oben ausgeführt, kann, falls gewünscht, die Abzugsnadel 44 in das durchstoßbare Verschlußglied 24 eingesetzt werden, um die leichtere Entfernung der verbleibenden Bestandteile zu ermöglichen. Die Spritze 46 mit der subkutanen Nadel kann dann durch das Verschlußglied 26 eingeführt werden, um die Mischung 48 aus Kissen bildendem Mittel 28, dem kleineren Anteil an restlicher Blutprobe 42 und pathogenen Mikroorganismen zu entfernen. Zu bemerken ist, daß eine besonders gute Rückgewinnung möglich ist, wenn man die subkutane Nadel zur Entfernung der Bestandteile am unteren Ende der geneigten glatten Fläche 34 einführt. Man nimmt an, daß der Winkel der Fläche 34 zum Teil als Trichter wirkt, in den die restliche Flüssigkeit mit den pathogenen Mikroorganismen fließt. Die Mischung 48 aus Kissen bildendem Mittel 28 hoher Dichte und dem kleineren Anteil an behandelter restlicher Blutprobe 42 sowie gewonnenen pathogenen Mikroorganismen sollte 1½ ml Flüssigkeit ausmachen. Diese Flüssigkeit wird dann auf einem Medium für Bakterienwachstum ausgebreitet. Diese Stufe ist schematisch in Fig. 9 dargestellt. Unter Verwendung der oben erläuterten Anordnung kann das Material wie folgt verteilt werden:

Eine Blutagarplatte kann 0,3 ml der Mischung aufnehmen, und die Platte kann bei 36°C in einer aeroben Atmosphäre bebrütet werden. Zwei Blutagarplatten können 0,3 ml der wäßrigen Lösung aufnehmen und bei 36°C in einer anaeroben Umgebung bebrütet werden. Eine Schokoladeagarplatte kann 0,3 ml der wäßrigen Lösung aufnehmen und in einer Schale bei 36°C bebrütet werden. Die Sabouraudplatte kann 0,3 ml der Mischung aufnehmen und in einer aeroben Umgebung bei 25°C bebrütet werden. Die Wachstumsmedien sollten täglich auf das Vorhandensein von Kolonien geprüft werden. Es können mikroskopische Analysentechniken angewandt werden. Die Anzahl der pathogenen Mikroorganismen in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien mit einem Korrekturfaktor ermittelt werden. Dieser Korrekturfaktor berücksichtigt die Gewinnungsmenge für einen gegebenen Organismus, die verwendeten Volumina Blut und Kissen bildendes Mittel hoher Dichte und die Menge der schließausgestrichenen Mischung. In dem nachstehenden allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,4.

Wie schon ausgeführt, können, falls gewünscht, im erfindungsgemäßen Verfahren die genannten Verfahrensstufen, die Vorrichtungen und ihre Anordnungen und die verwendeten Arten von Kulturmedien variiert werden. Zum Beispiel kann man die Blutprobe und das Antikoagulationsmittel und/oder das zellauflösende Mittel unter Anwendung bekannter beliebiger Mittel vermischen. Ferner kann in einigen Fällen das in Fig. 6 gezeigte Abziehen des größeren Teiles der Blutprobe 42 völlig unterlassen und nur ein kleinerer Teil der Blutprobe 42, der pathogene Mikroorganismen re-suspendiert enthält, vom Boden des Behälters zusammen mit dem Kissen bildenden Mittel hoher Dichte 28 abgezogen werden, wie Fig. 8 zeigt. Auch noch weitere Modifizierungen sind möglich.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel

Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um Vergleichswerte in bezug auf die prozentuale Gewinnung pathogener Mikroorganismen aus Blutproben bei Anwendung eines flüssigen Filtermediums gemäß der US-Patentschrift 39 28 139 und bei erfindungsgemäßer Anwendung eines Kissens bildenden Mittels zu erhalten.

Die angewandte Technik ist in der Tabelle I entweder als "flüssiges Filtermedium" oder "Kissen bildendes Mittel" bezeichnet. Die Angaben (direkt unter der genannten Technik) erläutern das verwendete flüssige Filtermedium, z. B. 50%ige Saccharose in den Versuchen mit flüssigem Filtermedium bzw. das eingesetzte Kissen bildende Mittel, z. B. ein inerter fluorierter Kohlenwasserstoff mit einer spezifischen Dichte von 1,949 cm³ bie 25°C und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 525 in den erfindungsgemäßen Versuchen. Jede untersuchte Probe (1 bis 21, wie in der Tabelle I aufgeführt) wurde mit 7 ml Proben sterilen, einer Zellauflösung unterworfenen Bluts von gesunden Blutspenders hergestellt. Jede Probe wurde mit 0,3 ml verschiedener bekannter Konzentrationen eines menschlichen pathogenen Mikroorganismus (entweder Escherichia coli oder Candida albicans, wie in der Tabelle I angegeben) beimpft.

In jedem Test wurde ein Behälter 20, wie oben beschrieben, eingesetzt, ob nun ein flüssiges Filtermedium oder ein Kissen bildendes Mittel angewandt wurde. Um die Wirkung einer Fläche zu untersuchen, die im wesentlichen im Komplementärwinkel zum Winkel angeordnet ist, bei dem der Behälter 20 zentrifugiert wird, hatten einige der Behälter 20 ebene glatte innere Oberflächen, so daß die innere Oberfläche des Bodenstopfens horizontal zur Standfläche ausgerichtet war, wenn der Behälter 20 aufrecht stand. Diese Bodenstopfen sind in der Tabelle I als "horizontal" bezeichnet. Ferner wurden speziell hergestellte Verschlüsse für den Boden hergestellt, indem man herkömmliche Kautschukstopfen entweder in Verbindung mit einer herkömmlichen Badewannendichtungsmasse oder einem Harz auf Silikonbasis verwendete. Man erhielt auf diese Weise im Behälter 20 eine Grundfläche, die in bezug auf die Wandung des Behälters 20 in einem Winkel geneigt war, der im wesentlichen komplmentär zu dem Winkel war, in dem der Behälter 20 zentrifugiert wurde. Die unter Verwendung von Bodenstopfen mit einer geneigten Fläche untersuchten Proben sind in der Tabelle I bezeichnet. Die Zentrifugation der in Tabelle I aufgeführten Proben unter Verwendung der Stopfen mit geneigter Oberfläche erfolgte in einer Winkelrotorzentrifuge, in der der Zentrifugationswinkel etwa 56° betrug. Dementsprechend ergaben die Behälter mit in einem Winkel von etwa 34° abgeschrägten Bodenstopfen eine Bodengrundfläche, die im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Zentrifugalkraft stand. Die Behälter mit einem horizontalen Bodenstopfen (wie in der Tabelle I angegeben) wurden in einer Schaukelbecherzentrifuge zentrifugiert, die während des Betriebs dazu führt, daß der Behälter 20 in einer Ebene gedreht wird, die im wesentlichen parallel zum Erdboden ist. Dementsprechend wurde eine Zentrifugalkraft von im wesentlichen rechten Winkel zur Oberfläche der horizontalen Bodenstopfen ausgeübt.

Bei Verwendung flüssigen Filtermediums enthielt jeder Behälter 20 1,2 ml einer wäßrigen Lösung mit 1,5 Gew.-% Gelatin und den in der Tabelle I angegebenen Saccharosekonzentrationen. Jeder Behälter 20 wurde umgedreht und in umgedrehter Stellung auf 4°C gekühlt, bevor die beimpfte Blutprobe zugefügt wurde. Nachdem jeder Behälter 20 die erforderliche Menge Blutprobe mit der bekannten Menge menschlicher pathogener Mikroorganismen erhalten hatte, wurde er noch umgedreht in ein Wasserbad gestellt. Das Wasserbad wurde auf 42°C eingestellt, worauf die Gelatine schmolz. Jedes Rohr wurde dann in einem Winkel von etwa 56° 30 Minuten bei Anwendung einer relativen Zentrifugalkraft von 1500 oder 3000 g, wie in der Tabelle I angegeben, in einer Rotorzentrifuge zentrifugiert.

An diesem Punkt des Verfahrens, das bei einigen Proben angewandt wurde und vorliegend als "3"-Einführungsverfahren bezeichnet ist, wurde eine 10-ml-Spritze durch den Bodenstopfen eingeführt, um etwa 6,7 ml restliche Blutprobe zu entfernen. Dann wurde der Behälter 20 in einem Vortex-Mischer etwa ½ bis 2 Minuten gemischt. Nach der Mischstufe wurden 1,5 ml des zugemischten Filtermediums und des Teils der im Behälter 20 verbliebenen Blutprobe mit einer herkömmlichen Spritze mit Nadel entfernt. Bei anderen Proben unterließ man die Entfernung eines größeren Anteils der restlichen Blutprobe nach dem Zentrifugieren. In diesem Fall wurden 1,5 ml des flüssigen Filtermediums und der Blutprobe am Bodenstopfen direkt nach dem Zentrifugieren vom Boden des Behälters 20 abgezogen. Die 1,5 ml, die aus einer Mischung des Filtermediums und restlicher Blutprobe sowie gesammelten pathogenen Mikroorganismen bestanden, wurden nach der Entfernung aus dem Behälter 20 vermischt, um eine verhältnismäßig gleichförmige Verteilung der Komponenten beim Ausstreichen der Probe zu erreichen. Der Unterschied zwischen diesen beiden Verfahren ist in der Tabelle I unter der Bezeichnung "Anzahl der Einführungen" angegeben, die jede Testprobe als solche mit 2 oder 3 Einführungen bezeichnet. Im Falle von 3 Einführungen dient die erste der Einführung der Blutprobe, die zweite der Entfernung des größeren Teils der Blutprobe nach dem Zentrifugieren und vor dem Mischen und die dritte der Entfernung des verbliebenen flüssigen Filtermediums und des verbliebenen Teils der Blutprobe. Bei 2 Einführungen dient die erste der Einführung der Blutprobe in den Behälter 20 und die zweite der Entfernung von etwa 1,5 ml zugemischten flüssigen Filtermediums und Blutprobe vom Boden des Behälters 20.

In beiden Fällen, ob nun ein Verfahren mit 2 oder 3 Einführungen angewandt wurde, wurden 5 Proben von jeweils 0,3 ml der vom Boden des Behälters 20 abgezogenen 1,5 ml auf 5 getrennten Platten ausgestrichen. Nach der Bebrütung wurden diese Proben mit Kontrollplatten verglichen. Diese waren dadurch hergestellt worden, daß man die gleiche bekannte Menge pathogener Mikroorganismen, wie sie der zu untersuchenden Blutprobe zugefügt worden war, zu einer Kochsalzlösung gab und 0,3 ml der Kochsalzlösung auf jeweils 5 Agarplatten aufstrich. Die prozentuale Rückgewinnung, bezogen auf den Vergleich der Probenplatten mit den Kontrollplatten, ist in der Tabelle I aufgeführt.

Das Verfahren unter Verwendung eines Kissen bildenden Mittels zur Untersuchung von Blutproben wurde wie folgt durchgeführt. Ein Zentrifugenbehälter 20 wurde entweder mit einem horizontalen oder einem abgeschrägten Bodenstopfen hergestellt. Jeder in diesem Verfahren verwendete Behälter 20 enthielt 0,3 ml des angegebenen inerten fluorierten Kohlenwasserstoffs. 7 ml einer Zellauflösung unterworfenen Bluts, die mit einer bekannten Anzahl pathogener Mikroorganismen verunreinigt worden waren, wurden dann durch den oberen Stopfen des Behälters 20 eingeführt. Anschließend wurden die Behälter 20 in der gleichen Winkelrotorzentrifuge zentrifugiert, wie die mit dem flüssigen Filtermedium hergestellten Proben. Es wurde 30 Minuten bei einer relativen Zentrifugalkraft von entweder 1500 g oder 3000 g zentrifugiert, wie es in der Tabelle I angegeben ist. Bei Anwendung des Verfahrens mit 3 Einführungen wurden etwa 5,8 ml restliche Blutprobe entfernt, die man mit einer 10-ml-Spritze durch den Bodenstopfen abzog. Bei Anwendung des Verfahrens mit 2 Einführungen wurde diese Maßnahme unterlassen. In jedem Fall wurden 1,5 ml, die etwa 1,2 ml restliche Blutprobe und 0,3 ml des angegebenen inerten fluorierten Kohlenwasserstoffs enthielten, vom Boden des Behälters 20 abgezogen. Dann wurden unter Verwendung von jeweils 0,3 ml aus restlicher Blutprobe und fluoriertem Kohlenwasserstoff 5 Probenplatten hergestellt. Diese Platten wurden bebrütet und nachfolgend mit Kontrollplatten verglichen, die in gleicher Weise hergestellt worden waren, wie die oben in bezug auf das flüssige Filtermedium beschriebenen. Die prozentuale Gewinnung bei Anwendung des Kissen bildenden Mittels wurde anschließend errechnet. Sie ist in der Tabelle I aufgeführt.

Obgleich keine exakte Theorie zur Erklärung der erhaltenen Daten vorliegt, könnte die niedrige Gewinnungsrate bei der Probe Nr. 2 der Tabelle I, für die 50%ige Saccharose als flüssiges Filtermedium und ein horizontaler Bodenstopfen verwendet wurde, die Folge des Einschlusses pathogener Mikroorganismen längs der inneren Begrenzung des horizontalen Bodenstopfens gegenüber der Wandung des Behälters 20 sein. Vergleicht man die Ergebnisse der Probe Nr. 1 mit denen der Probe Nr. 3, für die wiederum flüssiges Filtermedium und ein horizontaler Stopfen verwendet wurde, bei der jedoch 3 Einführungen zur Anwendung kamen, so sieht man, daß die Gewinnungsrate bei der Probe Nr. 3 wesentlich verbessert ist. Dies könnte damit erklärt weden, daß, nachdem weniger realtive Zentrifugalkraft angewandt wurde, die pathogenen Mikroorganismen nicht so fest in dem Raum zwischen dem Bodenstopfen und der Wandung des Behälters 20 eingeschlossen wurden. Außerdem ermöglicht die Anwendung von 3 Einführungen die Gewinnung aller pathogener Mikroorganismen, die im restlichen Teil der Blutprobe re-suspendiert wurden. Bei 2 Einführungen können einige der re-suspendierten pathogenen Mikroorganismen im restlichen Teil der Blutprobe verbleiben.

Ein Vergleich der Probe Nr. 15 mit der Probe Nr. 17 zeigt die bei Verwendung eines Kissen bildenden Mittels gemäß der Erfindung erzielbaren Verbesserungen. Für die Probe Nr. 15 wurde wie für die Probe Nr. 17 ein horizontaler Bodenstopfen verwendet, die Anzahl der Einführungen betrug 3, und die relative Zentrifugalkraft war die gleiche wie bei Probe Nr. 17 (3000). Man nimmt an, daß bei Anwendung eines Kissen bildenden Mittels gemäß der Erfindung erzielten verbesserten Ergebnisse darauf zurückzuführen sind, daß die pathogenen Mikroorganismen nicht durch das Kissen bildende Mittel hindurchtreten und in dem Zwischenraum zwischen der Wandung des Behälters 20 und dem Bodenstopfen verlorengehen können.

Ein Vergleich der Probe Nr. 9 mit der Probe Nr. 11 veranschaulicht die Vorteile, die bei Verwendung eines abgeschrägten Stopfens im Vergleich zu einem horizontalen Bodenstopfen erzielt werden. Da die Bedingungen und angewandten Techniken bei den Proben Nr. 9 und 11 vollständig identisch waren, mit der Abweichung, daß bei der Probe Nr. 11 ein abgeschrägter Stopfen verwendet wurde, kann die bei der Probe Nr. 11 erreichte Verbesserung in der Gewinnungsrate nur der Verwendung des abgeschrägten Bodenstopfens zugeschrieben werden. Die innere Oberfläche dieses Stopfens ist in bezug auf die Wandung des Behälters 20 in einem Winkel geneigt, der komplementär zum Winkel ist, in dem der Behälter 20 zentrifugiert wird. Ein Vergleich der Probe Nr. 10 mit der Probe Nr. 12 veranschaulicht ebenfalls die besseren Ergebnisse, die bei Verwendung eines abgeschrägten Bodenstopfens bei höherer relativer Zentrifugalkraft (3000) erreicht werden.

In Tabelle I war das Kissen bildende Mittel ein inerter fluorierter Kohlenwasserstoff mit einer spezifischen Dichte von 1,94 g/cm³ bei 25°C und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 525 (Proben 7 bis 12 und 17 bis 21).

Tabelle I

Claims (7)

1. Verfahren zur Bestimmung pathogener Mikroorganismen in einer Flüssigkeitsprobe durch Zentrifugieren einer die Flüssigkeitsprobe enthaltenden geschlossenen sterilen Zone in Gegenwart eines für die Mikroorganismen nicht-toxischen flüssigen Mittels mit einer gegenüber der Flüssigkeitsprobe höheren Dichte, wobei im wesentlichen alle pathogenen Mikroorganismen aus der Flüssigkeitsprobe austreten, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-toxisches flüssiges Mittel eine mit Wasser nicht mischbare, hydrophobe Flüssigkeit mit einer Dichte von etwa 1,2 g/cm³ bis etwa 2,0 g/cm³ und einem Siedepunkt von etwa 90 bis etwa 210°C verwendet und die pathogenen Mikroorganismen durch Zentrifugieren in das nicht-toxische Mittel eintreten, aber nicht durch dieses hindurchtreten läßt und auf diese Weise die pathogenen Mikroorganismen in dem nicht-toxischen flüssigen Mittel oder an der Grenzfläche zwischen dem nicht-toxischen flüssigen Mittel und der Flüssigkeitsprobe konzentriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das kissenbildende Mittel in einer Menge von etwa 3,3 bis etwa 30,0 Vol.-% vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige nicht-toxische, mit Wasser nicht mischbare, kissenbildende Mittel hoher Dichte aus einem inerten fluorierten Kohlenwasserstoff mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 850 und einer Dichte von etwa 1,6 g/cm³ bis etwa 2,0 g/cm³ besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Zentrifugierung ein Röhrchen mit einem das Kissen bildende Mittel tragenden und in solcher Weise angeordneten Verschluß verwendet, daß beim Zentrifugieren die Flüssigkeitsprobe in im wesentlichen rechtem Winkel gegen die vom Kissen und Verschluß gebildete Bodenfläche gepreßt wird.

5. Zentrifugenbehälter zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 4, der an beiden Enden mit durchstoßbaren Verschlüssen versehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß der untere ein- oder zweiteilige Verschluß (26) des Zentrifugenbehälters (20) eine glatte, kontinuierliche innere Oberfläche (34) aufweist und daß die Oberfläche (34) in einem solchen Winkel zu der Wandlung (22) des Zentrifugenbehälters (20) angeordnet ist, daß beim Zentrifugieren die Flüssigkeitsprobe (42) und das kissenbildende Mittel (28) im wesentlichen senkrecht gegen die Oberfläche (34) gepreßt werden.

6. Behälter nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel (36) der Oberfläche (34) des durchstoßbaren Verschlußgliedes (26) in bezug auf die Wand (22) des Behälters (20) etwa 30° bis etwa 80° beträgt.

7. Behälter nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel (36) der Oberfläche (34) 34° beträgt.