DE2406362A1

DE2406362A1 - Verfahren und vorrichtung zur feststellung von pathogenen mikroben

Info

Publication number: DE2406362A1
Application number: DE19742406362
Authority: DE
Inventors: Gordon Lee Dorn
Original assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Current assignee: Wadley Res Inst & Blood Bank
Priority date: 1973-02-12
Filing date: 1974-02-11
Publication date: 1974-08-15
Also published as: JPS49110822A; FR2217419A1; GB1458147A; AU6522974A; DE2406362C2; IT1018621B; CA1021238A; JPS5642280B2; US3928139A; FR2217419B1

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen Mikroben

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Feststellung von pathogenen Mikroben und dafür geeignete Vorrichtungen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Verfahren zur selektiven Extraktion von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe sowie Verfahren und Vorrichtungen zur Diagnose von Septikämie.

Septikämie, also die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen im Blut, gehört zu den schwersten Infektionskrankheiten. Trotz einer großen Zahl von Antibiotika und Fungiziden beträgt die Mortalität der Septikämie etwa 25 %. Wenn darüber hinaus die Septikämie von einem Schock begleitet ist, steigt die Mortalität auf über 60 % an. Patienten mit zehrenden Krankheiten, oder nach schweren Operationen, oder Patienten, die Immunsuppresiva oder Zytostatika erhalten, sind besonders anfällig-gegenüber Septikämie.

409833/1060

Zur Bekämpfung der Septikämie ist die frühzeitige Anwendung von geeigneten Antibiotika besonders wichtig. Es ist daher für den Arzt unbedingt notwendig, nicht nur so früh wie möglich zu erfahren, ob Septikämie vorliegt, sondern ebenfalls die Art der auslösenden Mikroorganismen und die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber Antibiotika kennenzulernen. Die genaue Diagnose der Septikämie hängt daher von einer möglichst schnellen und wirksamen quantitativen Analyse des Patientenblutes ab.

Bisher wurden im wesentlichen drei analytische Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen in Körperflüssigkeiten durchgeführt. Das üblichste Verfahren ist die Kultur im flüssigen Brühmedium. Bei diesem Verfahren werden im allgemeinen 5 bis 10 ml Blut aseptisch in eine Vakuumflasche eingebracht, die ein Nährmedium und eine für anaerobes oder aerobes Wachstum geeignetes Gasmedium enthält. Die Flaschen werden täglich auf sichtbares Wachstum untersucht. Wenn Wachtum festgestellt wird, oder am 2. und 10. Tag nach Beginn des Testes, werden 1 ml der Probe entnommen und auf Agarplatten ausgestrichen. Falls Mikroorganismen vorhanden sind, bilden diese in etwa 24 Stunden Kolonien auf den Platten.

Ein anderes übliches Verfahren ist die sogenannte Gießplattenmethode, bei der etwa 0,5 bis I₃O ml Blut in 20 ml

409833/1060

eines Nähragarmediums suspendiert und diese Mischung direkt auf eine Platte ausgegossen wird. Falls Mikroorganismen vorhanden sind, bilden sie in etwa 2¹I Stunden auf den Platten Kolonien.

Ein neuerdings entwickeltes Verfahren ist die sogenannte Filtrationsmethode. Bei diesem Verfahren werden zuerst die roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum einer Blutprobe durch Fällung oder Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit entfernt. Das verbleibende Serum wird dann durch einen Filter geschickt, das Teilchen mit der Größe von Bakterien oder darüber festhält. Diese Filter sind Filter aus einer festen Matrix mit sehr kleinen sich dadurch erstreckenden Poren. Die Filter werden dann auf eine Nähragarplatte gelegt. Bei Anwesenheit von Mikroorganismen können diese durch Auswachsen von einzelnen Kolonien in etwa 2k Stunden festgestellt werden.

Darüber hinaus können in Notsituationen, wenn ein Patient eine schnell verlaufende akute Septikämie aufweist, Blutproben direkt mikroskopisch untersucht werden. Allerdings kann die mikroskopische Untersuchung nur eingesetzt werden, um verhältnismäßig große Bakterienmengen im Blut festzustellen und nicht, um wesentlich kleinere Mengen an Mikroorganismen aufzuspüren.

409833/1060

Eine der zuerst genannten drei analytischen Methoden führt zu einer schnellen Feststellung von Mikroorganismen in einer Blutprobe. Es wird darauf hingewiesen, daß der Tod bei einer schweren Infektion des Blutes innerhalb von 24 bis *J8 Stunden eintreten kann und in der Tat in manchen Fällen eintritt, bevor das analytische Verfahren beendet ist. Darüber hinaus ist insbesondere die Flüssigagarmethode nicht quantitativ.

Ferner kann bei der Flüssigagarmethode ein überwachsen durch schneller wachsende Mikroorganismen eintreten. Wenn eine Blutprobe zwei oder mehr verschiedene Mikroorganismen enthält und wenn einer dieser Keime stärker wächst und weniger anfällig ist als die anderen, kann eine wesentlich schnellere Reproduktion in den angegebenen Medien eintreten, so daß gegebenenfalls vorliegende andere Mikroorganismen überwachsen v/erden. Es ist aber äußerst wichtig, daß der Arzt weiß, ob mehr als eineKeimsorte im Blut vorliegt, und zwar nicht nur aus der Sicht, daß ein geeignetes Antibiotikum für alle Mikroorganismen appliziert werden muß, sondern insbesondere wegen der Tatsache, daß die Anwesenheit von zwei oder mehr Mikroorganismenstämßen gleichzeitig im Blut anzeigt, daß das Abwehrsystem des Patienten am Zusammenbrechen ist. Darüber hinaus ist es für den Arzt wichtig, die genaue Anzahl von Keimen im Blutsti'om zu erfahren. Hieraus

4 09833/1060

"⁵" 2A06362

"lassen sich Schlüsse auf die Schwere der Blutinfektion und die Dosierung der geeigneten Antibiotika ableiten. Die Gießplattenmethode wird im allgemeinen als quantitativ betrachtet. Ein Nachteil der Gießplattenmethode besteht darin, daß bei diesem Verfahren offen gearbeitet wird, so daß die Platte von außen kontaminiert werden kann, indem beispielsweise Pathogene durch die Laboratmosphäre oder das Personal auf die Platte übertragen werden können.

V/eiterhin führen die Plüssigagar- und Gießplattenmethoden nicht zu einer wirksamen Trennung der pathogenen Mikroorganismen von gegebenenfalls im Blut vorliegenden antimikrobiell wirksamen Paktoren. Insbesondere wird die phagozytische Aktivität der Granulozyten und Monozyten und die normale antibakerizid wirkende Aktivität der Serumfaktoren dahin wirksam, daß das Wachstum der zur Kultur isolierten Bakterien verringert wird. In einigen Fällen, wenn die Patienten vor Abnahme der Blutprobe bereits Antibiotika erhalten haben, können restliche Mengen der Antibiotika in den Proben zur Durchführung der drei beschriebenen Kulturverfahren vorhanden sein, die dann das Wachstum der Bakterien inhibieren können.

Zwar ist die Filtrationsmethode im allgemeinen dem Flüssigagar- und dem Gießplattenverfahren in der Bestimmungsmöglich-

409833/1060

keit für mehr als einen Keimtyp im Blut überlegen und ergibt darüber hinaus eine quantitative Analyse, aber auch diese Methode hat ihre Nachteile. Erstens besteht wie bei der Gießplattenmethode beim Filtrationsverfahren die Möglichkeit einer äußeren Kontamination. Es ist für Bakterien verhältnismäßig einfach, aus der Laborluft in die Probe während des Analysenganges einzudringen. Darüber hinaus kann die anfängliche Fällung oder das Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit, die bei diesem Verfahren zur Trennung der roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum angewendet werden, dazu führen, daß pathogene Mikroben vorzeitig aus dem Serum vor dem Durchlaufen durch das Filter entfernt werden.

Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren verhältnismäßig aufwendig und teuer. Das Filtrationsverfahren ist wahrscheinlich das teuerste und die Flüssigagartechnik ist wahrscheinlich die billigste, trotzdem sind alle diese Verfahren verhältnismäßig teuer, und zwar nicht nur bezüglich der eingesetzten Materialien, sondern insbesondere im Hinblick auf den Zeitverbrauch der Labortechniker.

Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Feststellung von Bakterien, das billig, verhältnismäßig einfach unter Verwendung von Standardlaborausrüstungen

409833/1060

durchzuführen ist und das trotzdem zu einer schnellen Bestimmung der genauen Anzahl der Keime in einer Blutprobe, zur Identifizierung der Arten der vorhandenen Keime, zur Feststellung, ob mehr als ein Keiintyp vorliegt, zur Feststellung der antibakteriellen und antimykotischen Empfindlichkeit der verschiedenen Arten der isolierten Keime und zur Trennung der Keime von Blut und Plasma führt.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur schnellen Bestimmung von pathogenen Mikroben in einer Flüssigkeitsprobe, ein Verfahren zum Extrahieren und Isolieren von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe und ein Verfahren zur Bestimmung der genauen Anzahl und der genauen Art von einem oder mehreren Keimen in einer Probe einer Körperflüssigkeit zu entwickeln.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe mit derartigen pathogenen Mikroben und antipathogenen Faktoren vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) in einer umschlossenen Zone die Flüssigkeitsprobe auf ein Flüssigfiltermedium aufgebracht wird, wobei dieses.Flüssigfiltermedium eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und dadurch die Flüssigkeitsprobe trägt, gegenüber

409833/1060

pathogenen Keimen nicht toxisch, aber zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Flüssigkeitsprobe befähigt ist und daß (b) die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß dabei die Flüssigkeitsprobe gegen das flüssige Filtermedium gedrückt und die pathogenen Keime zum selektiven übergang in das Filtermedium veranlaßt und die pathogenen Keime dadurch aus der restlichen Masse der Flüssigkeitsprobe abgetrennt werden.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das Verfahren zur schnellen Abtrennung von pathogenen Mikroben von anderen Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe darin, daß die Flüssigkeitsprobe anfänglich auf ein flüssiges Filtermedium aufgebracht wird, das eine wässrige Lösung darstellt, die selektiv pathogene Mikroben aufnehmen kann, und daß anschließend die Probe und die wässrige Lösung zentrifugiert werden, so daß die pathogenen Mikroben selektiv in das flüssige Filtermedium übergehen.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden pathogene Mikroben in einer Probe einer Körperflüssigkeit wie Blut festgestellt, indem anfangs die Blutprobe, und zwar vorzugsweise eine einer Lyse unterzogene Blutprobe auf einem flüssigen Filtermedium in einer umschlossenen sterilen Zone aufgebracht wird, wobei das flüssige Filtermedium eine

409833/1080

größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und eine sterile wässrige Lösung darstellt, die die pathogenen Mikroben aus der Blutprobe selektiv aufnimmt. Anschließend wird die umschlossene Zone zentrifugiert, wobei die Flüssigkeitsprobe gegen das Filtermedium gedrückt wird, und dadurch die pathogenen Mikroben veranlaßt werden«, selektiv in das Filtermedium überzugehen und sich von der Masse der Flüssigkeitsprobe abzutrennen, so daß der Rest der Flüssigkeitsprobe von dem flüssigen Filtermedium ^trennt werden kann. Das flüssige Filtermedium mit den darin enthaltenen Keimen wird dann sorgfältig gemischt, so daß eine im wesentlichen gleichmäßige Verteilung der Keime erhalten wird. Dann werden Anteile des flüssigen Filtermediums mit den darin verteilten Keimen den üblichen Kulturbedingungen unterzogen«

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein neues Gerät zur Feststellung von pathogenen Mikroben vorgeschlagen, das eine Vorrichtung mit einem geschlossenen Zentrifugierbehälter aufweist, der fest mit einer zur Injektion geeigneten Verschlußvorrichtung geschlossen ist und bei dem das Innere des Behälters das oben angegebene flüssige Filtermedium enthält, wobei der Freiraum bei einem unteratmosphärischen Druck gehalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die wässrige Lösung ein thermisch empfindliches Geliermittel.

409833/1080

— Λ Π —

Die Erfindung ermöglicht durch das Verfahren und durch die Vorrichtung eine einfache und schnelle Bestimmung der genauen Anzahl von Mikroorganismen in einer Blutprobe; darüber hinaus läßt sich feststellen, ob mehr als eine Keimart vorliegt. Weiterhin wird die Trennung der Mikroorganismen von Blutkörperchen und anderen flüssigen Bestandteilen des Blutes und auch die Trennung der Mikroorganismen von antimikrobiell wirksamen Paktoren des Blutes und allen gegebenenfalls beim Abnehmen der Blutprobe im Blut vorhandenen Antibiotika ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen Körperflüssigkeiten angewendet werden, wie bei Blut, Knochenmark-, Spinal- und Pleural-Flüssigkeiten, Urin und ähnlichem. Darüber hinaus kann das Verfahren aber auch bei jeder flüssigen Probe mit einem Gehalt an Mikroorganismen durchgeführt werden, um die Mikroorganismen von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen antimikrobiell wirksamen Faktoren wie beispielsweise Nahrungsmitteln wie Milch oder ähnlichem abzutrennen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.

In den Figuren 1 bis 10 sind die verschiedenen Verfahrensschritte bei den bevorzugten Analysenmethoden gemäß Erfindung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch dargestellt.

409833/1060

Das bevorzugte Verfahren wird in Einzelheiten bei der quantitativen Bestimmung von Bakterien in einer Blutprobe beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, daß es in allen Fällen des Verdachtes auf Septikämie außerordentlich wichtig ist, daß der Arzt eine sehr schnelle Analyse der Blutprobe erhält. Die Analyse muß schnell anzeigen, welche Arten von pathogenen Mikroben und welche Mengen derartiger Pathogene im Blut vorliegen.

In den Zeichnungen ist die Analysensequenz anhand einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt. In Fig. 1 weist die bei dem bevorzugten Verfahren eingesetzte Vorrichtung 20 ein reagenzglasartiges Glasgefäß 21 mit einer öffnung 22 am oberen Ende auf, wobei diese öffnung mit einer Durchstichkappe 23 verschlossen ist. Die selbst schließende Gummidurchstichkappe 23 ist im Schnitt dargestellt, um den in einer Einziehung befindlichen durchstechbaren Bereich 2^a zu zeigen. Die Innenseite der Kappe 23 weist vorzugsweise eine kegelstumpfförmige Einziehung 2*ib auf. Der sterile Inhalt der Vorrichtung 20 besteht aus einer wässrigen Lösung (flüssiges Filtermedium) 25 und einem evakuierten Raum 26 (vollständiges oder teilweises Vakuum). Der Freiraum 26 wird bei unteratmosphärischem Druck, und zwar bei einem vorherbestimmten Wert gehalten, so daß eine bestimmte Menge Flüssigkeit (durch Injektion durch die Kappe 23)

409833/1060

aufgenommen werden kann, ohne daß sich innerhalb der Vorrichtung 20 ein zu starker Druck bildet, der dann die Kappe 23 aus der öffnung 22 herauspressen könnte. Evakuierte Behälter dieser Art sind an sich bekannt und werden mit verschiedenen Unterdrucken hergestellt, um vorherbestimmte Flüssigkeitsmengen durch die Durchstechkappe aufzunehmen. Geeignete evakuierte Behälter sind beispielsweise in der US-PS 2 460 641 beschrieben. Die Vorrichtung 20 kann beispielsweise ein evakuiertes Proberöhrchen sein, wie die unter der Handelsmarke "Vacutainer" von der Becton Dickinson Company vertriebenen Röhrchen, die zusätzlich noch eine wässrige Lösung 25 enthalten. Die wässrige Lösung 25 bildet das flüssige Filtermedium.

Das flüssige Filtermedium kann eine wässrige Lösung einer beliebig gelösten darstellen, vorausgesetzt, daß sie gegenüber den darin suspendierten Keimen nicht toxisch ist und eine ausreichende Dichte aufweist, um rote und weiße Blutkörperchen oder Zellreste zu suspendieren. Das flüssige Filtermedium hat also eine größere Dichte als Blut wie zum Beispiel über 1,06 g/cnr und suspendiert damit Blutzellen oder Blutzellreste, kann aber pathogene Mikroben aufnehmen. Ferner enthält das flüssige Filtermedium vorzugsweise eine geringe Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels.

Als geeignete in Lösung befindliche Stoffe für das flüssige Filtermedium können Zucker eingesetzt werden wie Saccharose

409833/1060

Glucose, Maltose, Fructose, Manitol, Sorbitol und ähnliche. Das flüssige Piltermedium enthält mindestens etwa hO Gew.% Zucker und kann gegebenenfalls den Zucker bis zur Sättigungsgrenze enthalten. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Zucker etwa ¹IO bis 50 Gew.% des flüssigen Filtermediums. Im allgemeinen werden Zucker und insbesondere Saccharose bevorzugt eingesetzt, da diese Lösungen bei einem physiologischen pH-Wert wie 6,0 bis 7,0 gehalten werden können.

Als gelöste Stoffe können aber auch alle anderen Verbindungen eingesetzt werden, solange die Lösung eine höhere Dichte als Blut aufweist und Blutkörperchen und insbesondere rote Blutkörperchen und Überreste roter Blutkörperchen zurückhalten und suspendieren kann und gegenüber den pathogenen Mikroben nicht toxisch ist. Eine andere geeignete Verbindung ist beispielsweise "Hypaque"-Natrium C₁₁HgJ-ZNpNaOu(3,5-Diacetamido-2,4,6-trijod-benzoesäure als Natriumsalz). Diese Verbindung kann in wässriger Lösung in gleichen Konzentrationen wie die oben angegebenen Zucker verwendet werden.

Andere in Lösung vorliegende und als wässrige Filtermedien geeignete Verbindungen sind makromolekulare Stoffe, die im wässrigen Medium ein flüssiges Gel aufbauen können, das eine so geringe Porendichte aufweist, daß rote Blutkörperchen oder deren Reste nicht eindringen können, wobei aber die

03833/108

Porengröße groß genug ist, um pathogene Mikroben durchzulassen. Geeignet zu diesem Zweck als gelöster Makromolekularstoff ist beispielsweise ein wasserlösliches vernetztes Polymeres, das im löslichen Netzwerk mikroporenartige öffnungen aufweist. Ein derartiges wasserlösliches Polymer ist beispielsweise das Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000, einer Intrinsic-Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung [οό] von +56,5 > das dialysierbares Material in Mengen unter 1 Gew.% enthält. Eine derartige Verbindung wird unter der Marke "PICOLL" von der Pharmacia Fine Chemicals Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, N.J., auf den Markt gebracht. Andere geeignete Polymere sind Dextrane mit mittleren Molekulargewichten von etwa 10.000 bis 2.000.000 und vorzugsweise etwa 50.000. Nach dem Auflösen in Wasser wirken diese Polymere als flüssige Piltermedien für pathogene Mikroben, da sie in dem wasserlöslichen Netzwerk Mikroporenöffnungen mit einer Größe von etwa 1 bis 7/Um zu haben scheinen.

Die wasserlöslichen Polymere liegen in der wässrigen Lösung in Konzentrationen von etwa 10 bis 40 und vorzugsweise etwa 20 bis 30 Gew./£ vor.

Unter dem Begriff "thermisch empfindliches Geliermittel" wird jede Verbindung verstanden, die in der wässrigen Lösung 25

409833/1060

bei einer unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur geliert, aber bei höheren Temperaturen wieder flüssig wird, und zwar bei solchen, die für die pathogenen Mikroorganismen unschädlich sind, wie beispielsweise unter 50 C und vorzugsweise nicht über 42 C. Geeignete thermisch empfindliche Geliermittel sind jeweils solche, die gegenüber der Lösung oder der Analysenprobe keine nachteiligen Wirkungen ausüben. Derartige Verbindungen sind beispielsweise die Gelatinen, das heißt also aus dem Collagen durch Kochen von Haut, Bändern, Sehnen, Knochen oder ähnlichem in Wasser erhaltenen Proteine.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach einer bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung von Bakterien in einer Probe einer Körperflüssigkeit mit der folgenden Ausrüstung durchgeführt werden:

Mit der oben beschriebenen Vorrichtung 20 mit dem flüssigen Filtermedium, wobei das Röhrchen ein Volumen von etwa 12 bis Ik mm hat und etwa 1 bis 2 ml der wässrigen Flüssigfilterlösung enthält;

einem weiteren evakuierten 12 bis l4-ml Teströhrchen, ' das ein Material wie Natrium-polyanetholsulfat (beispielsweise 1,6 ml) oder Heparin enthält, das als Anticoagulans wirkt und die phagozytische Aktivität der Granulozyten und Monozyten und die normale antibakter-ielle Aktivität des Serums inhibiert;

409833/1060

zwei sterilen Glasspritzen (mit zurückgezogenem Kolben), die 10 ml sterile Luft enthalten und zwei abnehmbaren hypodermischen 3,75 cm Nadeln einer Stärke von 5>3/Um;

einer 1 ml-Einmalspritze und eine hypodermische 2,5 cm Einmalnadel einer Stärke von 5*3/Umj

einer 3 ml-Einmalspritze und einer ebensolchen hypodermischen Einmalnadel;

drei Blutagarplatten;

einer EMB (Eosin-methylenblau)-Platte; einer Sabouraud-Agarplatte und mit einem Röhrchen mit Thioglycolatmedium.

Es wird darauf hingewiesen, daß mit Ausnahme der Vorrichtung 20 oder einer ähnlichen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene Geräte und Kulturmedien angewendet werden können. Insbesondere wird darauf hingewiesen, daß die oben angegebenen Kulturmedien nur beispielhaft sind, da sie im allgemeinen vorzugsweise zum Nachweis der am häufigsten vorkommenden pathogenen Mikroben verwendet werden. Die vorgeschlagenen Blutagarplatten sind die üblicherweise eingesetzten Blutagarplatten, die im wesentlichen aus Schafblut und einem Nährmaterial wie Zucker bestehen, wobei diese Ausgangsverbindungen durch einen sich

409833/1060

verfestigenden Agar auf einer Petriplatte zusammengehalten werden. Die Sabouraud-Agarplatte ist speziell zur Kultur von Pilzen geeignet. Die EMB-Platte wird zur schnellen Identifizierung bestimmter Keime verwendet, da diese in einer bestimmten Weise darauf Flecken bilden. Das flüssige Thioglykolatmedium mit zugesetztem.Natrium-polyanetholsulfat (SPS) ist im wesentlichen ein Trägermedium, das als Rückhalt für das Wachstum von anaeroben und aeroben Bakterien und der meisten Pilze geeignet ist.

Zwar können verschiedenste Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, meist werden aber die oben bezeichneten Geräte und Materialien in der im folgenden näher beschriebenen Weise eingesetzt.

Die in Pig. I dargestellte Vorrichtung 20 wird anfänglich wie in Fig. 2 dargestellt, umgedreht, so daß die wässrige Lösung nach unten gegen die Kappe 23 fließen kann. Dann wird die Vorrichtung in ein geeignetes Kühlaggregat wie in einen Kühlschrank eingesetzt und soweit gekühlt, bis die Gelatine verfestigt ist. Das Röhrchen kann beispielsweise in der in Fig. 3 dargestellten umgedrehten Stellung auf h C abgekühlt werden.

Anschließend wird eine vorher bestimmte Menge einer Blutprobe wie beispielsweise 8_S3 ml in das evakuierte Teströhr-

409833/1080

chen mit dem Natrium-anetholsulfonat SPS injiziert. Die roten Blutkörperchen v/erden vorzugsweise mit einem geeigneten für Mikroorganismen nicht toxischen Mittel wie beispielsweise einem nicht toxischen Saponin lysiert. Es wird aber darauf hingewiesen, daß die meisten Saponine zumindest gegenüber einigen Mikroorganismen toxisch sind. Es wurde jedoch gefunden, daß die toxischen Bestandteile aus bisher für toxisch gehaltenen Saponinen entfernt werden können. Im allgemeinen können derartige toxische Saponinmaterialien nach einem neuen Verfahren der Anmelderin gereinigt werden, so daß das gereinigte Material im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Auch einige im Handel erhältliche Saponinzubereitungen sind nicht toxisch, so daß auch diese Verbindungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden können. Die 1 ml-Einmalspritze wird zum Injizieren von 0,3 ml des nicht toxischen Saponine (12 %) in das evakuierte Teströhrehen mit der Blut-SPS-Mischung verwendet. Gegebenenfalls können die Blutkörperchen aber auch in anderer Weise wie beispielsweise durch Verdünnung im Verhältnis von 1:1 mit destilliertem Wasser lysiert werden.

Diese vorherige Lyse der Blutprobe verringert die mögliche Maskierungswirkung der Erythrocyten soweit wie möglich. Eine Maskierungswirkung kann sich im allgemeinen dadurch ergeben, daß die Erythrocyten auf der Oberfläche des flüssigen Pilter-

409833/1060

mediums während des Zentrifugierens verkleben und die verklebten Zellen dabei pathogene Mikroben einschließen., wenn, diese während des Zentrifugierens nach unten wandern, so daß sie das flüssige Piltermedium nicht erreichen. Als nächstes wird eine der sterilen Glasspritzen mit einer hypodermischen 3»75 cm Nadel verwendet, um 8 mm der Mischung aus Blut, SPS und Saponin in dem evakuierten Röhrchen zu entnehmen. Diese Mischung wird dann in der in Pig. 4 schematisch dargestellten Weise in die Vorrichtung 20 injiziert. Die Nadel stößt durch die Einlage 24a der Gummikappe 23, passiert durch die gelierte wässrige Filterlösung 25, so daß dann der Kolben niedergedrückt werden kann, um die Probe 27, wie in Fig. 4 dargest-ellt, auf dem gelierten wässrigen Filtermedium 25 abzusetzen. Die durch das Einspritzen der Blutprobe im Freiraum 26 ausgelöste Turbulenz führt zu keiner Störung des wässrigen gelierten Filtermediums 25, so daß dieses als feste Bodenschicht in der Vorrichtung 20 verbleibt.

Anschließend wird die hypodermische Nadel aus der Gummikappe 23 herausgezogen und die Vorrichtung 20 mit der gelierten wässrigen Filterschicht 25 und der Schicht der Blutprobe in der umgekehrten Stellung erwärmt, bis die Gelatine weich wird und die wässrige Filterschicht 25 sich verflüssigt. Die Vorrichtung wird auf eine Temperatur erwärmt, die nicht

409833/1060

zu einer Zerstörung der gegebenenfalls in der Blutprobe vorhandenen pathogenen Mikroben führt, aber andererseits ausreichend hoch ist, um die Gelatine zu verflüssigen. Wie sich aus der schematischen Darstellung in Fig. 5 ergibt, kann das Röhrchen im umgedrehten Zustand durch Eintauchen in ein Wasserbad auf etwa 37 bis H2 C erwärmt werden. Durch die Verflüssigung der Gelatine in der wässrigen Lösung bildet sich so eine flüssige wässrige Filterlösung, die nun als Flüssigfilter für pathogene Mikroben dienen kann.

Die Abtrennung der pathogenen Mikroben aus der Blutprobe er-folgt durch Einsetzen der Vorrichtung 20 in umgekehrter Stellung in eine geeignete Zentrifuge, in der das Röhrchen bei einer Temperatur unterhalb i}2°C einer zur Trennung der pathogenen Mikroben von den anderen Bestandteilen der Blutprobe ausreichenden Zentrifugalkraft unterworfen wird. Geschwindigkeit und Zentrifugierzeit können je nach Konstruktionsmaterial der Vorrichtung 20 und Art der Zentrifuge in weitem Umfang variieren. Meist wird eine ausreichende Zentrifugierung erzielt, wenn der Behälter mit der wässrigen Lösung und der Probe einer 100- bis 6000-fachen und vorzugsweise etwa jUOO- bis 5000-fachen Schwerkraft unterworfen wird. Besonders geeignet ist ein Verfahren unter Verwendung einer. Schwingzentrifuge, bei welcher etwa 10 bis 20 Minuten eine 2000- bis JiOOO-fache Schwerkraft auf das System einwirkt.

409833/1060

Nach der Behandlung des Röhrchens in der Zentrifuge entsprechend der Darstellung in Pig. 6 wird die zweite 10 ml-Glasspritze mit steriler Luft zum Abziehen des größten Teils der flüssigen Probe 27 vcn der wässrigen Polymerschicht 25 eingesetzt. Wie sich schematisch aus Fig. 7 entnehmen läßt, können beispielsweise 7,5 ml der restlichen Probe abgezogen werden.

Nach dem Entfernen des Restes der Probe wird die wässrige Filterlösung 25 zunächst sorgfältig gemischt, um sicherzustellen, daß alle von der Lösung aufgenommenen pathogenen Mikroben gleichmäßig in dieser verteilt werden. Die Lösung 25 kann beispielsweise kräftig geschüttelt werden, indem die Kappe 23 der Vorrichtung 20 im umgekehrten Zustand etwa 1/2 bis 4 Minuten auf einen Vortex-Mischer aufgesetzt wird. Dieser Schritt des Mischens ist schematisch in Fig. 8 dargestellt. Dann wird die wässrige Filterlösung 25 mit den gegebenenfalls vorhandenen gleichmäßig verteilten pathogenen Mikroben unter Verwendung der 3 ml-Einmalspritze, wie in Fig. 9 dargestellt, aus der Vorrichtung 20 abgezogen. In dem Röhrchen sollten etwa 1 1/2 ml Flüssigkeit verbleiben. Diese Flüssigkeit kann dann auf einem geeigneten Bakteriennährboden verteilt werden; dieser Verfahrensschritt ist schematisch in Fig. 10 dargestellt. Mit der oben angegebenen Vorrichtung kann das Material wie folgt verteilt werden:

409833/1060

2406352

Eine Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf; diese Platte kann dann bei 37°C aerob inkubiert werden. Eine andere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf und kann in einem Kerzenglas bei 37°C inkubiert werden. Eine weitere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf und kann dann bei 37°C in einer anaeroben Umgebung inkubiert werden. Die Sabouraud-Agarplatte kann nach Zugabe von 0,2 ml des wässrigen Mediums bei 25 C in aerober Umgebung inkubiert werden. Die EMB-Platte kann nach Zugabe von 0,2 ml der wässrigen Lösung bei 37 C in einem Kerzenglas inkubiert werden. Das flüssige Thioglycolatmedium kann nach Zugabe von 0,5 ml der wässrigen Lösung bei 37 C inkubiert werden. Die Nährböden werden täglich auf Anwesenheit von Kolonien untersucht. Die Anzahl der Mikroben in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien unter Berücksichtigung eines Korrekturfaktors bestimmt werden. Dieser Korrekturfaktor zieht die Teilungsgeschwindigkeit eines bestimmten Keimes, die eingesetzten Volumina an Blut und Filterflüssigkeit und die auf die Platte aufgebrachte Menge der endgültigen Mischung ein. In dem oben angegebenen allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,56.

Es wird nochmals darauf hingewiesen, daß die einzelnen Verfahrensschritte sowie Vorrichtungen, Ausrüstungen und die eingesetzten Kulturmedien gegebenenfalls variiert werden

409833/ 1060

können. So können beispielsweise zum Vermischen der Blutprobe mit dem Antikoagulans und/oder dem eine Lyse auslösenden Mittel alle bekannten Vorrichtungen eingesetzt werden. Weiter kann zum Beispiel im Verfahrensschritt 7 die Spritze dazu verwendet werden, um nur die untere flüssige Filterschicht 25 zusammen mit einer sehr geringen Menge der Probe aus der Schicht 27 aus dem Inneren der Vorrichtung 20 abzuziehen, so daß der Rest der Probeschicht 27 in der Vorrichtung verbleibt. Gegebenenfalls können auch zahlreiche andere modifizierungen des Verfahrens durchgeführt werden.

Die Erfindung wird im folgenden,anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Verschiedene jeweils 8 ml umfassende Proben sterilen Blutes von gesunden Blutspendern wurden mit jeweils 0,*l ml von humanpathogenen Keimen, nämlich Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa, Escherichia CoIi und Candida Albicans in verschiedenen Konzentrationen inocculiert.

Zu jeder Probe wurden 0,3 ml einer 12 gew.^igen wässrigen nicht toxischen Saponinlösung zugesetzt. Dann wurde jede Probe unter aseptischen Bedingungen wie in der Beschreibung angegeben, in einen evakuierten Behälter wie eine Vorrichtung

409 833/1060

20 überführt, die eine vorbestimmte Menge des wässrigen Filtermediums enthielt, und zwar 1,5 ml einer wässrigen Lösung mit 20 bis 25 % eines Copolymeren aus Epichlorhydrin und Saccharose mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000, einer Intrinsic-Viskosität von etwa 0,17 dl/g, einer spezifischen Drehung von [pe] von 56,5° ("FICOLL"-Lösung) sowie 1,5 Gew.? Gelatine (Eastman Purified Pigskin). Ein anderer Teil der Behälter 20 enthielt 1,5 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 Gew.% Saccharose und 1,5 Gew.? Gelatine (Eastman Purified Pigskin) mit einem pH-Wert von 6,5· Jede der Vorrichtungen 20 wurde umgedreht und in umgekehrter Stellung auf *t°C gekühlt, bevor die Proben in der in Fig. 4 schematisch dargestellten Weise zugegeben wurden. Dann wurden Proben mit dem gleichen humanpathogenen Bakterien sowohl in den Vorrichtungen 20, die die wässrige "FICOLL"-Lösung enthielten, als auch in den Vorrichtungen 20, die eine wässrige Saccharoselösung enthielten, (ausnahmsweise wurde für P. aerugenosa nur FICOLL-Lösung verwendet) eingebracht. Nachdem jede Probe in der Vorrichtung 20 mit der benötigten Menge der Blutproben mit einem bekannten Gehalt an humanpathogenen Keimen versetzt worden war, wurden diese im umgedrehten Zustand in ein Wasserbad eingesetzt. Das VJasserbad wurde bei 42°C gehalten, so daß die Gelatine sich verflüssigen konnte. Jedes Röhrchen wurde dann in umgekehrter Stellung in einer Servall-

409833/1060

Zentrifuge mit einem HB4-Rotor zentrifugiert. Die Geschwindigkeit der Zentrifuge und die Zentrifugierzeit wurden entsprechend den Werten in den folgenden Tabellen 1 bis 6 variiert. Jede Probe wurde einer relativen Zentrifugalkraft von 164 g, 650 g, 1465 g, 2520 g, 4o8O g und 586O g unterworfen. Weiterhin wurde jede Probe diesen verschiedenen Zentrifugengeschwindigkeiten für 10, 20 und 30 Minuten unterworfen«

Nach dem Zentrifugieren wurden 8,0 ml der über der wässrigen Pilterschicht überstehenden Flüssigkeit mit einer 10 ml-Spritze abgezogen. Der restliche Inhalt wurde etwa 1/2 bis 2 Minuten in einem Vortex-Mischer kräftig gemischt, dann wurden 0,2 ml Proben dieses Materials zum Auszählen der Kolonien auf Agarmedium aufgebracht. Bei jedem Versuch wurden Kontrollzählungen der verwendeten Suspension durchgeführt. Die mittlere prozentuale Wiedergewinnung (mit den angegebenen Standardabweichungen) der pathogenen Keime in den Proben läßt sich aus den folgenden Tabellen 1 bis 6 entnehmen.

09833/10®

Tabelle 1

wässrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 10 min

Trennmaterial: Zeit:

"Ficoll" 10 min

% Wiedergewinnung

RCF

164 g

650 g

1465 g

2520 g

4O8O g

5860 g

CD CO 00 CO

oB. colx

Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben

aureus 69 ±22, 13 92 ±44, 13 107 ±46, 12 88 ±26, 13 82 ±49, 13 65 ±36, 13

±13, 23 37 ±19, 24 55 ±29, 24 56 ±24, 23 52 ±24, 21 50 ±25, 23

P. aeruginosa 38 ±20, 15 33 ±13, 13 64 ±17, 15 61 ±30, 14 67 ±22, 15 67 ±16, 1*: C. albicans 81 ±28, 14 103 ±39, 14 99 ±22, 14 70 ±27, 14 67 ±30, 14 74 ±43, 12

s.d. = im folgenden Standardabweichung

Tabelle 2

wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 10 min

Trennmaterial: Zeit:

Saccharose 10 min

% Wiedergewinnung

RCP

cd Keim OO
CO
CjO

164 g

g

1465 g

2520 g 4080 g 5860 g

Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben '

°S. aureus cn

E. coli

-47, 8 128 ±33, 6 77 ⁱ36,' 8 131 ±44, 8 109 ±54, 8 124 ±41, 8 • 18 ±13, 12 27 ±13, 14 41 ±17, 15 50 ±17, 15 63 ±20, 15 64 ±17, 15

P. aeruginosa

C. albicans 49 ±33, 6 78 ±44, β 80 ±39, β 10β ±41, 5 78 ±38, ' 5 97 ^62, 6

Tabelle 3

wässrige ^ttPicoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 20 min

Trennmaterial: Zeit:

"Ficoll" 20 min

% Wiedergewinnung

RFC

oo Keim

164 g

g

4o8O g

5860 g

Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr,der ,
s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben

. aureus

E. coli

±30, 16 93 ±44, 16 96 ±35, 15 85 ±34, 16 64 ±39, 16 49 ±22, 16
±11, 17 72 ±20, 16 85 ±17, 17 78 ±13, 17 65 ±15, 16 56 ±20, 14

P. aeruginosa 44 ±16, 13 75 ±18, 13 85 ±30, 13 72 ±29, 10 67 ±21, 13 73 ±21, 12
C. albicans 92 ±19, 11 78 ±47, 11 86 ±29, 11 80 ±38, 10 88 ±53, 11 67 ±33, 11

Tabelle

wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter Zentrifugierzeit 20 min

Trennmaterial:

Saccharose 20 min

% Wiedergewinnung

RCP

°°Keim

o S. aureus

coli

164 g

650 g

1465 g

586O g

2520 g 4o8O g

Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben

■■ ■ ■■-■■■■■■ι ■■■■ ιι-— ■■..--■■■ ι ι. ... ι. ■ ■■■■ ■_■■■■! ■■ ■■-■■■■-■---■■■■.! ι ..■■—■■. .ι. ι ■.■_,.

30 ±28, 9 41 ±21, 8 77 ±36, · 9 78 ±35, 9 78 ±33, 9 75 ⁱ29, 29 ⁱ15, 13 54 ±20, 12 53 -26₃ 13 64 ±27, 13 73 ±20, 11 71 ±26,

p_o aeruginosa

C. albicans 77 ⁱ32, 6 67 ±43, 6 104 ±23,. 6 94 ±29, 6 109 ±68, 4 105 ⁱl8,

Tabelle 5

wässrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 30 min

Trennmaterial: Zeit:

"Ficoll" 30 min

% Wiedergewinnung

RFC

°°Keim co

. aureus

E. coli

164 g

65O g

1465 g

2520 g

4O8O g

586O g

Nr.der

Nr.der '

% s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben

±33, 14 86 ±18, 14 77 ±27, 14 64 ±29, 14 52 ±36, 14 39 ±37, 14 -20, 13 76 ±22, 12 82 ±18, 12 79 ±20, 13 107 ±59, 13 87 ±32, 12

P. aeruginosa 43 ±20, 14 75 ±18, 14 80 ±29, 14 89 ±30, 13 59 ±22, 13 69 ±30, 14 C. albicans 64 ±24, 12 72 ±24, 12 67 ±20, 12 55 ±18, 12 26 ±20, 12 29 ±25, 11

Tabelle 6

wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter Zentrifugierzeit 30 min

Trennmaterial: Zeit:

Saccharose 50 min

% Wiedergewinnung

coKeim

⁰S. aureus

E. coli

RCF

164 g

65Og

1465 g

2520 g

4o8O g

5860 g

82 ±45, , 7 105 ⁱ5^₉ 6 170 ^±64_S 6 148 ±30, 6 155 ^±49, 6 169 ^±45, 5 44 ±24, 14 65 ±26, 12 83 ±21, 12 89 ^±37, 13 105 ⁱ32, 12 89 ±35, 14

P. aeruginosa

C. albicans 82 ±41, 6 112 ±47, 6 106 ±43, 6 106 -70, 6 134 ±57, 6 110 ±39, 6

Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu den bisherigen Methoden zur Konzentrierung und Wiedergewinnung von pathogenen Mikroben als ausgezeichnet anzusehen.

Beispiel 2

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Nachweismethode aufzuzeigen, wurden 500 Blutproben von Patienten, die im Verdacht standen, Infektionen des Blutstromes zu haben, nach zwei oder drei der folgenden Verfahren analysiert:

a) Blutflaschenverfahren: Zwei 5 ml-Proben des Patientenblutes wurden steril in zwei übliche BBL-Blutflaschen eingebracht. Die eine Flasche wurde anaeroben und die andere Flaschen aeroben Kulturbedingungen ausgesetzt; beide Flaschen wurden bei 37°C inkubiert. Die Flaschen wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht. Falls Wachstum festgestellt wurde oder falls kein Wachstum festgestellt wurde, wurden 1 ml-Proben aus jeder Flasche am zweiten und sechsten Tag nach Zugabe der Blutprobe entnommen. Die Proben wurden mikroskopisch und durch Ausstreichen auf übliche Bakterien- und Pilznährböden (Agarplatten) analysiert.

b) Gießplattenverfahren: 0,5 nil Patientenblut wurden aseptisch in jeweils 12 Petrischalen eingebracht. Dann wurden 20 ml

409833/ 1 060

Sabouraud~Agarmedium oder Blutagarmedium je Platte eingebracht und der Inhalt kräftig gemischt. Danach wurden die Platten unter folgenden Bedingungen inkubiert:

drei Platten (Sabourauds Medium), 25°C, aerob

drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, aerob

drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, anaerob

drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, Kerzenflasche

Alle Platten wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.

c) Erfindungsgemäßes Dichtezentrifugierverfahren: 8,3 ml

Patientenblut wurden in ein steriles evakuiertes Röhrchen mit 1,7 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 0,35 Gew.% Natrium-polyanetholsulfonat und 0,85 Gew.% Natriumchlorid überführt. Die roten Blutkörperchen im Röhrchen wurden mit 0,3 ml einer 12 #igen wässrigen Saponinlösung lysiert, dann wurden 8 ml dieser Mischung in ein zweites evakuiertes Röhrchen entsprechend Vorrichtung 20 mit 1,7 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 20 Gew.% eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose und 1,5 Gew.% Gelatine entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Lösung überführt. Jede Vorrichtung 20 wurde dann umgedreht und bei 4°C so lange gekühlt, bis die wässrige Polymerlösung durch die Gelatine

409833/1 060

verfestigt war. Dann wurden die Blutproben in der in Pig. schematisch dargestellten und in Beispiel 1 beschriebenen Weise in jede Vorrichtung 20 injiziert. Anschließend wurde die wässrige Polymerlösung in jeder Vorrichtung 20 durch Eintauchen in ein bei 42⁰C gehaltenes Wasserbad verflüssigt. Jede Vorrichtung 20 wurde anschließend im umgedrehten Zustand 45 Minuten in einer International U.V.-Zentrifuge bei 3000 U/min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden 8 ml der über der wässrigen Polymerschicht überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe einer 10 ml-Spritze abgezogen. Der verbleibende Anteil in jeder Vorrichtung wurde 1 Minute in einem Vortex-Mischer kräftig durchmischt, dann wurden 0,2 ml-Proben entnommen, gleichmäßig ausgestrichen und auf den folgenden Medien inkubiert:

eine Blutagarplatte, 37°C, aerob zwei Blutagarplatten, 37 C, anaerob eine Blutagarplatte, 37°C, Kerzenglas eine Sabourauds-Agarplatte, 25 C, aerob

Der Rest der Probe wurde in ein Röhrchen mit flüssigem Thioglycolatmedium überführt und bei 37°C inkubiert. Die Platten und das Röhrchen wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

409833/1060

	Nachgewiesene I	Blutflaschen- verfahren	•	3.	•Tabelle 7	Anzahl Keime ml/Blut	Dichtezentrifugier- verfahren	Anzahl Keime ml/Blut	1	I
		Tag, an dem reines isolier tes Material teime erhalten wurde	Streptococcen			0,5	Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde	-	1	Ul I
		Escherichia coli		2.	Gießplattenverfahren	-	negativ	-	1
O		Aerogenes	Proteus	negativ	Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde	50	negativ	450	1
CD OO	ß-hämolytische	aureus	3.	3.	-	1.	7	3
CjO ^	Streptomyces	1 aureus	negativ	negativ	-	2.	₁ Proteus IO Klebsiella 144	IQ
O	Klebsiella und	aureus	negativ	1.	-	2.	2. 75 4. Wachstum nur in Thioglykolat
CO	Staphylococcus		negativ	negativ	-	2.		KS) -C-
	Staphylococcus		Ί.	nicht"untersucht	-	2.		¹OS
	Staphylococcus	Streptococcen	4.	Il	-	3. .		CB
	ρ Cryptococcus	Pseudomonas aeruginosa od-hämolytische Streptococcen	negativ	It	-	3.
	2 Cryptococcus	negativ negativ	tt	-	5.
	^-hämolytische	■ ti	-
	ti
	tt
	tt negativ

Tabelle 7 (Portsetzung)

Blutflaschenverfahren

Gießplattenverfahren

Dichtezentrifugier· verfahren

Nachgewiesene Keime

Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa

Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde

•2.

CO OO CaJ LO

οί-hämolytische Streptococcen und _t· ß-hämolytische Streptococcen negativ

Tag, an dem
reines isolier- Anzahl

tes Material Keime erhalten wurde ml/Blut

negativ

Tag, an dem
reines isolier- Anzahl

tes Material Keime erhalten wurde ml/Blut

1. E.coli 10,5

P.aeruginosa 3

₁ oi-xx. ß-hämolytische Strep. 0,4

Pseudomonas Candida	negativ 6.	negativ 2.	0,6	1. 2.	94 0,5	I VjJ σ* I
Staphylococcus aureus	2.	negativ	-	negativ	-	I
Enterobacter cloacae	3.	negativ	-	negativ	-
Pseudomonas	3.	1.	10	1.	18
Klebsiella pneumoniae	2.	1/2	49	1/2	72
Enterobacter cloacae	3.	negativ	-	negativ	_
Klebsiella	2.	1.	0,2	1/2	0,4	K9 4>.
Escherichia coli ;	2.	1.	1,2	2.	1,5	O OD
Cryptococcus	negativ	negativ	_	3.	1,5

Tabelle 7 (Fortsetzung)

nachgewiesene Keime

Blutflaschenverfahren

Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde

ß-hämolyfcische Streptococcen c^-Iiamolytische Streptococcen

Staphylococcus epidermidis (Mannitolpositiv)

Klebsiella

Pr.&v.domonas §■>■-.'.phylococcus aureus Sseherichia coli Diplococcus pneumo.niae

Pseudomonas aeruginosa und Eseherichia coli

Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella

Eseherichia coli Escheriehia coli

.1

negativ negativ negativ

2.

2. negativ

2. 2 1/2

6. nur Pseudomonas

3.

negativ 1 1/2 Gießplattenverfahren

Tag, an dem
reines isolier- Anzahl

tes Material Keime
erhalten wurde ml/Blut

negativ
negativ

2.

2,5

negativ	—
3.	0,6
1.	0,6
2.	0,5
3 1/2	0,8
3 1/2 nur Pseudomonas	4
0,6	-
negativ
1/2	8

Dichtezentrifugierverfahren

Tag, an dem

reines isolier- Anzahl

tes Material Keime

erhalten wurde ml/Blut

2. 1. 2.

1. 2. negativ

1.

1/2 1/2

0,6

2.

1/2

Streptoc. 2,0

1,5 0,9

15 0,3

Pseudomonas 5,1 _ Enterobacter- 0^6

nur Pseudomonas 7,5

0,4 7,5

Tabelle 7 (Portsetzung)

	Nachgewiesene Keime	Blutflaschen verfahren	Gießplattenverfahren	Anzahl Keime ml/Blut	•M»	Dichtezentrifugier- verfahren	Anzahl Keime ml/Blut	I VjJ
	Escherichia coli Escherichia coli Propionibacterium	Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde	Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde	26 15	1,8	Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde	19 14	CO !
40983	Candida albicans	1 1/2 1 1/2 7	1/2 1/2 negativ	0,4	>200	1/2 1/2 negativ	-
CO	Enterobacter cloacae Escherichia coli	negativ	.2.	OJ CVJ	0,6	negativ	281 17
1060	Staphylococcus aureus	2. 2.	1. "2.	0,4 22	1. 1.	1,2
	Pseudomonas aeruginosa	negativ	negativ	4	3.	1,5
	Pseudomonas aeruginosa	3.	1.	2.	>200	2406:
	Pseudomonas aeruginosa	3.	2.	2.	0,3	CB N>
	Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa	negativ	2.	2.	20
	Escherichia coli	negativ 3.	1. 2.	■ negativ 2.	1,5
	2.	2.	1.

Tabelle 7 (Portsetzung)

Nachgewiesene Keime Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aerugxnosa co Escherichia coli ~* Enterobacter cloacae ο

_o Pseudomonas. aerugi'nosa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli .

Blutflaschenverfahren

Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde

Gießplattenverfahren

Tag, an dem

reines isolier- Anzahl

tes Material Keime

erhalten wurde ml/Blut

Dichtezentrifugierverfahren

Tag, an dem reines isolier- Anzahl

tes Material _ Keime erhalten wurde ml/Blut

10.	5.	0,2	10.	0,3	ι
2.	1.	5	1.	β	VO I
2.	1.	2,5	1.	3
2.	: ι.	3,2	1.	3,9
2.	.1.	UM	1.	89
3.	2.	0,6	2.	0,9
2.	1.	200	1.	200

Beim Blutflaschenverfahren wurde Klebsiella durch Proteus überwachsen. Von einem Patienten getrennt isoliert.

Die Blufflasche zeigte niemals Anzeichen für mikrobielles Wachstum. Cryptococcus wurde in der Flasche nur nach Subkultur auf Sabouraud-Medium nachgewiesen.

Eine Zusammenfassung der in Tabelle 7 enthaltenen Daten ist in der folgenden Tabelle 8 gegeben:

Tabelle 8

	% positiver	% positiver	Durchschnittszeit
	Nachweis	Nachweis mit	und bis zur
		mehreren Keimen	Isolierung von
Methode	9,6		reinen Stämmen
Zentri	7,6	0,8
fugieren	6,8	0,4	1,8
Blutflasche		0,0	3,0
Gießplatte	1,6

Wie Tabelle 8 zeigt; ist das Zentrifugierverfahren bezüglich des prozentualen positiven Nachweises gegenüber dem Blutflaschen- und dem Gießplattenverfahren überlegen. Der positive Nachweis betrifft auch Fälle mit mehr als einem Keim. Das Zentrifugierverfahren ist wesentlich schneller als die Blutflaschenmethode. Die Ergebnisse in den Tabellen 7 und zeigen darüber hinaus, daß bei einem gegebenen Blutvolumen die Zentrifugiermethode empfindlicher als die quantitative Gießplattenmethode ist, das heißt also, das ein höherer Prozentsatz der in der Blutprobe vorhandenen Organismen gewonnen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung können zum Abtrennen von pathogenen Mikroben a.us Flüssigkeitsproben

409833/1060

wie Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, um die Gegenwart von pathogenen Mikroben in der Körperflüssigkeit nachzuweisen, wie beispielsweise zur Diagnose von Septikämie. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Untersuchung von Blut von als gesund angenommenen Blutspendern eingesetzt werden, um infiziertes Blut festzustellen, bevor es einem Patienten verabreicht wird. Ferner kann das Verfahren zur Untersuchung auf Anwesenheit von pathogenen Mikroben in Nahrungsmitteln oder anderen Materialien zur Verwendung an Säugetieren eingesetzt werden.

Die dichten Flüssigfilter, die zusammen mit dem Zentrifugieren erfindungsgemäß Anwendung finden, bilden ein neues Verfahren, um pathogene Mikroben in einer Flüssigkeitsprobe zu konzentrieren und um dann die konzentrierten Mikroben von antimikrobiell wirksamen Faktoren, wie sie im allgemeinen in Flüssigkeiten wie Blut und anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind, abzutrennen. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung und Konzentrierung von pathogenen Mikroben aus Körperflüssigkeitsproben wie Blut, wenn in Notsituationen bei Patienten mit schnell verlaufender akuter Septikämie eine mikroskopische Untersuchung notwendig ist. Das Flüssigfiltermedium weist im allgemeinen eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe auf, aus welcher die pathogenen Mikroben extrahiert werden. So hat bei-

409833/1060

- H2 -

spielsweise das erfindungsgenäß in Konzentrationen von 10 bis 40 Gew.? in wässriger Lösung eingesetzte Copolymere aus Saccharose und Epichlorhydrin eine Dichte von etwa 1,035 bis 1,16 g/ml. Diese dichten Flüssigfilter führen nicht nur zu einer selektiven Aufnahme der Keime, sondern suspendieren und schützen die Keime, sobald sie von dem Medium aufgenommen sind und darin zurückgehalten werden. Die sehr dichten polymeren Medien schützen und konservieren pathogene Mikroben und zwar insbesondere solche, die teilweise geschädigte Zellwände aufweisen, also Sphäroplasten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis von allen pathogenen Mikroben eingesetzt werden, wie Bakterien, Pilzen, L-Formen der Bakterien und Kycoplasmen.

Es wird darauf hingewiesen, daß wässrige Zuckerlösungen und insbesondere wässrige Saccharoselösungen wirksam zur Gewinnung der L-Formen und der Mycoplasmen eingesetzt werden können. Die "konzentrierten Saccharoselösungen sind hypertonisch und schützen die L-Formen und Mycoplasmen vor einer Lyse. Im allgemeinen enthalten die konzentrierten wässrigen Saccharoselösungen eine kleine Menge Gelatine, wie etwa 1 bis 2 Gew.%; diese Lösungen sind die bevorzugt eingesetzten Flüssigfilter bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Lösungen sind, wie bereits angegeben, hyper-

409833/1060

240636

tonisch, sie weisen aber einen ausreichenden Auftrieb auf, um rote und weiße Blutkörperchen und Zellreste während des Zentrifugierens abzuhalten, während sie gleichzeitig nicht die pathogenen Keime ausschließen so daß sie eine Art Kissen- oder Schirmwirkung für die pathogenen Keime bilden, und somit die darin suspendierten Keime schützen- Außerdem sind die Filter wärmestabil. Beispielsweise können die Saccharose-Gelatine-Mischungen während der Vorbereitung der Vorrichtung 20 autoklaviert werden, ohne daß ein unerwünschter Abbau der Gelatine oder eine Ausfällung auftreten. Darüber hinaus können diese Lösungen bei einem fast neutralen oder physiologischen pH-Wert gehalten werden.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten Verfahren besteht darin, daß dadurch pathogene Mikroben als erstes in einem geschlossenen System konzentriert werden können, das nicht einer äußeren Kontamination mit pathogenen Keimen durch deren Anwesenheit in den Laboratorien oder im Krankenhaus ausgesetzt ist. Weiterhin werden die konzentrierten pathogenen Keime von antimikrobiell wirksamen Materialien, wie sie normalerweise in Flüssigkeitsproben vorliegen, abgetrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum wirksamen Nachweis sehr geringer Konzentrationen der Mikroorganismen wie beispielsweise einem Mikroorganismus je ml Blut eingesetzt werden.

409833/1060

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe mit derartigen Mikroben und antipathogen wirksamen Faktoren, dadurch gekennzeichnet, daß (a) die Flüssigkeitsprobe in einer umschlossenen Zone auf ein flüssiges Filtermedium aufgebracht wird, wobei das flüssige Filtermedium eine höhere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und dadurch die Flüssigkeitsprobe trägt, gegenüber den pathogenen Keimen nicht toxisch, aber zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Flüssigkeit sprobe befähigt ist und (b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Flüssigkeitsprobe gegen das Flüssigfiltermedium gepreßt und die pathogenen Keime selektiv zum übertreten in das Filtermedium veranlaßt und dadurch von der restlichen Masse der Flüssigkeitsprobe abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Lösung eines nichtionischen Zuckers verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als nichtionischer Zucker Saccharose verwendet wird.

409833/1060

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plüssigfiltermedium mit einem Gehalt an mindestens etwa 40 % Zucker verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigfiltermedium eine sterile wässrige Lösung eines makromolekularen Stoffes mit Mikroporenöffnungen durch das gelöste Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine ausreichende Größe zum selektiven Durchtritt von pathogenen Keimen aus der Flüssigkeitsprobe aufweisen, verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Lösung eines Copolymers aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung fo/] ~ von 56,5 verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an etwa 10 bis Gew.üi des Copolymers verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, daß

als mikroporöser Filter eine wässrige Lösung eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.

40983-3/1060

- H6 -

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung des Dextrans mit einem Gehalt an etwa 10 bis ¹JO Gev.% verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigkeitsprobe eine Körperflüssigkeitsprobe verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutprobe verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die restliche Menge der Flüssigkeitsprobe von dem Flüssigfiltermedium entfernt wird.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Filtermedium mit den pathogenen Mikroben vermischt und diese Mischung quantitativ auf Nährböden für pathogene Mikroben aufgebracht wird.

Ik. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Filtermedium auf pathogene Mikroben mikroskopisch analysiert wird.

A09833/1060

15· Verfahren zum Anweis von pathogenen Mikroben in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) eine Probe der Körperflüssigkeit auf einem Flüssigfiltermedium in einer umschlossenen Zone aufgebracht wird, daß dieser Filter gegenüber den Keimen nicht toxisch ist und die Flüssigkeit trägt und selektiv die pathogenen
Keime aufnimmt,

(b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Körperflüssigkeitsprobe gegen das Flüssigfiltermedium gepreßt wird und daß so lange zentrifugiert wird, bis die pathogenen Mikroben selektiv in
das Flüssigfiltermedium übertreten und dadurch von der
restlichen Menge der Körperflüssigkeitsprobe getrennt
werden,

(c) daß die restliche Menge der Körperflüssigkeitsprobe von dem Flüssigfiltermedium abgetrennt wird,

(d) daß das Flüssigfiltermedium mit den pathogenen Keimen sorgfältig durchmischt wird und

(e) daß mindestens ein Teil des Flüssigfiltermediums auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Zuckerlösung verwendet wird.

409833/1060

- 1*8 -

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Flüssigfiltermedium mit einem Gehalt an mindestens
¹JO Gew.? Zucker verwendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Saccharose verwendet wird.

19· Verfahren nach Anspruch 15> dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine sterile wässrige Lösung
eines wasserlöslichen Polymers mit Mxkroporenoffnungen
durch das lösliche Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine Größe von etwa 1 bis 7/Um aufweisen, verwendet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung[(W ^ von 56,5° verwendet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an diesem Polymer von etwa 10 bis ¹IO Gew.% verwendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Dextran mit einem Molekulargewicht von
etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.

409833/ 1 060

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an Dextran von etwa IO bis 40 Gew.% verwendet wird.

24. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut, Knochenmark, Spinalflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder Urin verwendet werden.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe vor Aufbringen auf das Plüssigfiltermedium einer Lyse unterzogen wird.

27. Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Plüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die Plüssigkeitsprobe in einer umschlossenen Zone auf ein Flüssigfiltermedium aufgebracht wird, daß das Plüssigfiltermedium eine höhere Dichte als die Plüssigkeitsprobe aufweist, gegenüber den pathogenen Keimen nicht toxisch und zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Plüssigkeitsprobe befähigt ist,

(b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Flüssigkeitsprobe gegen das Plüssigfiltermedium gepreßt wird und daß die pathogenen Keime

409833/1060

zum selektiven übertritt in das Medium und zur Trennung aus der übrigen Menge der Plüssigkeitsprobe veranlaßt werden und

(c) daß die übrige Menge der Plüssigkeitsprobe von dem Flüssigfilter abgetrennt wird und daß der Flüssigfilter auf pathogene Keime untersucht wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Plüssxgfiltermedium eine wässrige Zuckerlösung verwendet wird.

29· Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an mindestens 40 Gew.? Zucker verwendet wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Saccharose verwendet wird.

31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfilter eine wässrige Lösung eines Polymers wie eines Copolymers aus Saccharose und Epichlorhydrin und/oder Dextran verwendet wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem

409833/1060

Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung[cv^J von 56,5 verwendet wird.

33. Verfahren nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, daß ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000
bis 2.000.000 verwendet wird.

3¹I. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an diesen Polymeren von etwa 10 bis 40 Gew.% verwendet wird.

35· Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigkeitsprobe eine Körperflüssigkeitsprobe verwendet wird.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut, Knochenmark, Spinalflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder Urin verwendet wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.

38. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse des Plussigfiltermediums durch Vermischen
des Plussigfiltermediums zur gleichmäßigen Verteilung der

A 0 9 8 3 3 / 1 060

darin enthaltenen pathogenen Mikroben und quantitatives Auftragen dieser Mischung auf Nährböden für pathogene Mikroben durchgeführt wird.

39· Verfahren zur Peststellung von pathogenen Mikroben in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) eine wässrige Polymerlösung an der Injektionszone innerhalb eines Zentrifugierrohres bereitgestellt wird, wobei diese wässrige Polymerlösung etwa 10 bis 40 Gew.% eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose oder Dextran und etwa 1 bis 5 Gew.# eines thermisch empfindlichen Geliermittels enthält,

(b) daß das Zentrifugierrohr zur Verfestigung der wässrigen Polymerlösung durch das thermisch empfindliche Geliermittel gekühlt wird,

(c) daß durch Durchstechen einer hypodermischen Injektionsnadel durch die Injektionszone und durch die verfestigte wässrige Polymerlösung und Injizieren der Körperflüssigkeitsprobe durch die hypodermische Injektionsnadel in

das Zentrifugierrohr eine Probe der Körperflüssigkeit auf die verfestigte Polymerlösung aufgebracht wird,

(d) daß das Zentrifugierrohr zur Verflüssigung des thermisch empfindlichen Geliermittels und Verflüssigung der wässrigen Polymerlösung erwärmt wird,

(e) daß das Zentrifugierrohr Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Kcrperflüssxgkeitsprobe gegen die wässrige Polymerlösung gepreßt wird und daß die pathogenen

409833/1060

2A06362

Mikroben zum selektiven übergang in diese Lösung und Abtrennung aus der übrigen Menge der Körperflüssigkeitsprobe veranlaßt werden,

(f) daß die übrige Menge der Körperflüssigkeitsprobe von der wässrigen Polymerlösung abgetrennt wird,

(g) daß die wässrige Polymerlösung mit den Keimen sorgfältig gemischt wird und daß

(h) mindestens Anteile der durchmischten wässrigen Polymerlösung auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht werden.

¹IO. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung [o^J _D von 56,5° verwendet wird.

Ml. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.

M2. Verfahren nach Anspruch 39 > dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine verwendet wird.

ΔΠ9833/ 1 060

kj>. Verfahren zur Peststellung von pathogenen Mikroben in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) eine wässrige PiIterlösung auf eine Injizierzone in einem Zentrifugierrohr bereitgestellt wird, wobei diese wässrige Lösung mindestens etwa ¹JO Gew. % eines Zuckers und etwa 1 bis 5 Gew.$S eines thermisch empfindlichen Geliermittels enthält,

(b) daß das Zentrifugierrohr zur Verfestigung der wässrigen Filterlösung durch das thermisch empfindliche Geliermittel gekühlt wird,

(c) daß durch Durchstechen einer hypodermischen Injektionsnadel durch die Injektionszone und durch die verfestigte wässrige Filterlösung und nachfolgender Injektion einer Probe der Körperflüssigkeit durch die Injektionsnadel in das Zentrifugierrohr eine Probe der Körperflüssigkeit auf die verfestigte wässrige Filterlösung aufgebracht wird,

(d) daß das Zentrifugierrohr zur Verflüssigung des thermisch empfindlichen Geliermittels und zur Verflüssigung der wässrigen Filterlösung erwärmt wird,

(e) daß das Zentrifugierrohr Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Probe der Körperflüssigkeit gegen die wässrige Filterlösung gepreßt wird und daß die pathogenen Mikroben zum selektiven übertritt in die Filterlösung und zur Abtrennung aus der restlichen Menge der Körperflüssigkeit sprobe veranlaßt werden,

(f) daß die restliche Menge der Körperflüssigkeitsprobe von der wässrigen Filterlösung abgetrennt wird,

409833/1060

(g) daß die wässrige Filterlösung mit den pathogenen Keimen sorgfältig durchmischt wird, und daß

(h) mindestens Anteile der durchmischten wässrigen Polymerlösung auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht werden.

HH. Verfahren nach Anspruch Hj>, dadurch gekennzeichnet, daß als Zucker Saccharose verwendet wird.

45. Verfahren nach Anspruch HH₉ dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine verwendet wird.

H6. Verfahren nach Anspruch H^₉ dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.

Hj. Vorrichtung zur Isolierung und Konzentrierung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß in einem dicht durch eine mit einer Injektionsnadel durchstechbare Verschlußvorrichtung verschlossenem Zentrifugierbehälter das Innere dieses Behälters einen evakuierten einen unteratmosphärischen Druck aufweisenden Freiraum neben einer sterilen wässrigen Lösung eines Materials mit einer größeren Dichte als der Flüssigkeitsprobe und der Fähigkeit zur selektiven

409833/ 1060

Aufnahme von pathogenen Mikroben aus der Flüssigkeitsprobe aufweist.

k8. Vorrichtung nach Anspruch Uf, dadurch gekennzeichnet, daß in der sterilen wässrigen Lösung eine kleine, aber wirksame Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels
enthalten ist.

lJ9. Vorrichtung nach Anspruch *18, dadurch gekennzeichnet, daß in der wässrigen Lösung etwa 1 bis 5 Gew.% des thermisch
empfindlichen Geliermittels enthalten sind.

50. Vorrichtung nach Anspruch ¹J9_s dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine enthalten ist.

51. Vorrichtung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Zuckerlösung enthalten ist.

52. Vorrichtung nach Anspruch 51» dadurch gekennzeichnet, daß eine Sacchvroselösung enthalten ist.

53. Vorrichtung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Behälter eine mindestens kO gew.^ige Saccharoselösung enthalten ist.

409833/1060

5¹K Vorrichtung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß in den Behälter eine wässrige Lösung eines makromolekularen Stoffes mit Mikroporenöffnungen im löslichen Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine ausreichende Größe zum selektiven übertritt von pathogenen Keimen aus der Flüssigkeitsprobe aufweisen, enthalten ist.

55. Vorrichtung nach Anspruch 5**> dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung OCj _D von 56,6 enthalten ist.

56. Vorrichtung nach Anspruch 5¹J* dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 im Behälter enthalten ist.

ue:si:kö

Λ09833/ 1060

st

Leerseite