DE2406362A1 - Verfahren und vorrichtung zur feststellung von pathogenen mikroben - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur feststellung von pathogenen mikrobenInfo
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Description
Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung von pathogenen Mikroben
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Feststellung von pathogenen Mikroben und dafür geeignete Vorrichtungen. Insbesondere
betrifft die Erfindung neue Verfahren zur selektiven Extraktion von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe sowie
Verfahren und Vorrichtungen zur Diagnose von Septikämie.
Septikämie, also die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen im Blut, gehört zu den schwersten Infektionskrankheiten.
Trotz einer großen Zahl von Antibiotika und Fungiziden beträgt die Mortalität der Septikämie etwa 25 %. Wenn darüber
hinaus die Septikämie von einem Schock begleitet ist, steigt die Mortalität auf über 60 % an. Patienten mit zehrenden
Krankheiten, oder nach schweren Operationen, oder Patienten, die Immunsuppresiva oder Zytostatika erhalten, sind besonders
anfällig-gegenüber Septikämie.
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Zur Bekämpfung der Septikämie ist die frühzeitige Anwendung
von geeigneten Antibiotika besonders wichtig. Es ist daher für den Arzt unbedingt notwendig, nicht nur so früh wie
möglich zu erfahren, ob Septikämie vorliegt, sondern ebenfalls die Art der auslösenden Mikroorganismen und die
Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber Antibiotika kennenzulernen. Die genaue Diagnose der Septikämie hängt
daher von einer möglichst schnellen und wirksamen quantitativen Analyse des Patientenblutes ab.
Bisher wurden im wesentlichen drei analytische Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen in Körperflüssigkeiten
durchgeführt. Das üblichste Verfahren ist die Kultur im flüssigen Brühmedium. Bei diesem Verfahren werden im allgemeinen
5 bis 10 ml Blut aseptisch in eine Vakuumflasche eingebracht, die ein Nährmedium und eine für anaerobes oder
aerobes Wachstum geeignetes Gasmedium enthält. Die Flaschen werden täglich auf sichtbares Wachstum untersucht. Wenn
Wachtum festgestellt wird, oder am 2. und 10. Tag nach Beginn
des Testes, werden 1 ml der Probe entnommen und auf Agarplatten ausgestrichen. Falls Mikroorganismen vorhanden sind,
bilden diese in etwa 24 Stunden Kolonien auf den Platten.
Ein anderes übliches Verfahren ist die sogenannte Gießplattenmethode,
bei der etwa 0,5 bis I3O ml Blut in 20 ml
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eines Nähragarmediums suspendiert und diese Mischung direkt auf eine Platte ausgegossen wird. Falls Mikroorganismen
vorhanden sind, bilden sie in etwa 21I Stunden auf den
Platten Kolonien.
Ein neuerdings entwickeltes Verfahren ist die sogenannte Filtrationsmethode. Bei diesem Verfahren werden zuerst die
roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum einer Blutprobe durch Fällung oder Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit
entfernt. Das verbleibende Serum wird dann durch einen Filter geschickt, das Teilchen mit der Größe
von Bakterien oder darüber festhält. Diese Filter sind Filter aus einer festen Matrix mit sehr kleinen sich dadurch
erstreckenden Poren. Die Filter werden dann auf eine Nähragarplatte gelegt. Bei Anwesenheit von Mikroorganismen
können diese durch Auswachsen von einzelnen Kolonien in etwa 2k Stunden festgestellt werden.
Darüber hinaus können in Notsituationen, wenn ein Patient eine schnell verlaufende akute Septikämie aufweist, Blutproben
direkt mikroskopisch untersucht werden. Allerdings kann die mikroskopische Untersuchung nur eingesetzt werden,
um verhältnismäßig große Bakterienmengen im Blut festzustellen und nicht, um wesentlich kleinere Mengen an Mikroorganismen
aufzuspüren.
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Eine der zuerst genannten drei analytischen Methoden führt zu einer schnellen Feststellung von Mikroorganismen in
einer Blutprobe. Es wird darauf hingewiesen, daß der Tod bei einer schweren Infektion des Blutes innerhalb von 24
bis *J8 Stunden eintreten kann und in der Tat in manchen
Fällen eintritt, bevor das analytische Verfahren beendet ist. Darüber hinaus ist insbesondere die Flüssigagarmethode
nicht quantitativ.
Ferner kann bei der Flüssigagarmethode ein überwachsen durch
schneller wachsende Mikroorganismen eintreten. Wenn eine Blutprobe zwei oder mehr verschiedene Mikroorganismen enthält
und wenn einer dieser Keime stärker wächst und weniger anfällig ist als die anderen, kann eine wesentlich schnellere
Reproduktion in den angegebenen Medien eintreten, so daß gegebenenfalls vorliegende andere Mikroorganismen überwachsen
v/erden. Es ist aber äußerst wichtig, daß der Arzt weiß, ob mehr als eineKeimsorte im Blut vorliegt, und zwar
nicht nur aus der Sicht, daß ein geeignetes Antibiotikum für alle Mikroorganismen appliziert werden muß, sondern
insbesondere wegen der Tatsache, daß die Anwesenheit von zwei oder mehr Mikroorganismenstämßen gleichzeitig im Blut
anzeigt, daß das Abwehrsystem des Patienten am Zusammenbrechen ist. Darüber hinaus ist es für den Arzt wichtig, die
genaue Anzahl von Keimen im Blutsti'om zu erfahren. Hieraus
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"5" 2A06362
"lassen sich Schlüsse auf die Schwere der Blutinfektion und
die Dosierung der geeigneten Antibiotika ableiten. Die Gießplattenmethode wird im allgemeinen als quantitativ betrachtet.
Ein Nachteil der Gießplattenmethode besteht darin, daß bei diesem Verfahren offen gearbeitet wird, so daß die
Platte von außen kontaminiert werden kann, indem beispielsweise Pathogene durch die Laboratmosphäre oder das Personal
auf die Platte übertragen werden können.
V/eiterhin führen die Plüssigagar- und Gießplattenmethoden nicht zu einer wirksamen Trennung der pathogenen Mikroorganismen
von gegebenenfalls im Blut vorliegenden antimikrobiell wirksamen Paktoren. Insbesondere wird die phagozytische
Aktivität der Granulozyten und Monozyten und die normale antibakerizid wirkende Aktivität der Serumfaktoren
dahin wirksam, daß das Wachstum der zur Kultur isolierten Bakterien verringert wird. In einigen Fällen, wenn die
Patienten vor Abnahme der Blutprobe bereits Antibiotika erhalten haben, können restliche Mengen der Antibiotika in
den Proben zur Durchführung der drei beschriebenen Kulturverfahren vorhanden sein, die dann das Wachstum der Bakterien
inhibieren können.
Zwar ist die Filtrationsmethode im allgemeinen dem Flüssigagar- und dem Gießplattenverfahren in der Bestimmungsmöglich-
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keit für mehr als einen Keimtyp im Blut überlegen und ergibt darüber hinaus eine quantitative Analyse, aber auch diese
Methode hat ihre Nachteile. Erstens besteht wie bei der Gießplattenmethode beim Filtrationsverfahren die Möglichkeit
einer äußeren Kontamination. Es ist für Bakterien verhältnismäßig einfach, aus der Laborluft in die Probe während
des Analysenganges einzudringen. Darüber hinaus kann die anfängliche Fällung oder das Zentrifugieren mit geringer
Geschwindigkeit, die bei diesem Verfahren zur Trennung der roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum angewendet
werden, dazu führen, daß pathogene Mikroben vorzeitig aus dem Serum vor dem Durchlaufen durch das Filter entfernt
werden.
Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren verhältnismäßig aufwendig und teuer. Das Filtrationsverfahren ist wahrscheinlich
das teuerste und die Flüssigagartechnik ist wahrscheinlich die billigste, trotzdem sind alle diese Verfahren verhältnismäßig
teuer, und zwar nicht nur bezüglich der eingesetzten Materialien, sondern insbesondere im Hinblick auf
den Zeitverbrauch der Labortechniker.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Feststellung von Bakterien, das billig, verhältnismäßig
einfach unter Verwendung von Standardlaborausrüstungen
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durchzuführen ist und das trotzdem zu einer schnellen Bestimmung
der genauen Anzahl der Keime in einer Blutprobe, zur Identifizierung der Arten der vorhandenen Keime, zur
Feststellung, ob mehr als ein Keiintyp vorliegt, zur Feststellung der antibakteriellen und antimykotischen Empfindlichkeit
der verschiedenen Arten der isolierten Keime und zur Trennung der Keime von Blut und Plasma führt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur schnellen Bestimmung von pathogenen Mikroben in einer
Flüssigkeitsprobe, ein Verfahren zum Extrahieren und Isolieren von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe
und ein Verfahren zur Bestimmung der genauen Anzahl und der genauen Art von einem oder mehreren Keimen in einer Probe
einer Körperflüssigkeit zu entwickeln.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe mit derartigen
pathogenen Mikroben und antipathogenen Faktoren vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) in
einer umschlossenen Zone die Flüssigkeitsprobe auf ein Flüssigfiltermedium aufgebracht wird, wobei dieses.Flüssigfiltermedium
eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und dadurch die Flüssigkeitsprobe trägt, gegenüber
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pathogenen Keimen nicht toxisch, aber zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Flüssigkeitsprobe befähigt
ist und daß (b) die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß dabei die Flüssigkeitsprobe gegen das flüssige Filtermedium gedrückt und die pathogenen
Keime zum selektiven übergang in das Filtermedium veranlaßt und die pathogenen Keime dadurch aus der restlichen
Masse der Flüssigkeitsprobe abgetrennt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht
das Verfahren zur schnellen Abtrennung von pathogenen Mikroben von anderen Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe darin,
daß die Flüssigkeitsprobe anfänglich auf ein flüssiges Filtermedium aufgebracht wird, das eine wässrige Lösung
darstellt, die selektiv pathogene Mikroben aufnehmen kann, und daß anschließend die Probe und die wässrige Lösung
zentrifugiert werden, so daß die pathogenen Mikroben selektiv in das flüssige Filtermedium übergehen.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden
pathogene Mikroben in einer Probe einer Körperflüssigkeit wie Blut festgestellt, indem anfangs die Blutprobe, und zwar
vorzugsweise eine einer Lyse unterzogene Blutprobe auf einem flüssigen Filtermedium in einer umschlossenen sterilen
Zone aufgebracht wird, wobei das flüssige Filtermedium eine
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größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und eine sterile wässrige Lösung darstellt, die die pathogenen Mikroben
aus der Blutprobe selektiv aufnimmt. Anschließend wird die umschlossene Zone zentrifugiert, wobei die Flüssigkeitsprobe gegen das Filtermedium gedrückt wird, und dadurch die
pathogenen Mikroben veranlaßt werden«, selektiv in das Filtermedium
überzugehen und sich von der Masse der Flüssigkeitsprobe abzutrennen, so daß der Rest der Flüssigkeitsprobe von dem flüssigen Filtermedium ^trennt werden kann.
Das flüssige Filtermedium mit den darin enthaltenen Keimen wird dann sorgfältig gemischt, so daß eine im wesentlichen
gleichmäßige Verteilung der Keime erhalten wird. Dann werden Anteile des flüssigen Filtermediums mit den darin verteilten
Keimen den üblichen Kulturbedingungen unterzogen«
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein neues Gerät zur Feststellung von pathogenen Mikroben vorgeschlagen,
das eine Vorrichtung mit einem geschlossenen Zentrifugierbehälter aufweist, der fest mit einer zur Injektion
geeigneten Verschlußvorrichtung geschlossen ist und bei dem das Innere des Behälters das oben angegebene flüssige
Filtermedium enthält, wobei der Freiraum bei einem unteratmosphärischen Druck gehalten wird. In einer bevorzugten
Ausführungsform enthält die wässrige Lösung ein thermisch
empfindliches Geliermittel.
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— Λ Π —
Die Erfindung ermöglicht durch das Verfahren und durch die Vorrichtung eine einfache und schnelle Bestimmung der genauen
Anzahl von Mikroorganismen in einer Blutprobe; darüber hinaus läßt sich feststellen, ob mehr als eine Keimart vorliegt.
Weiterhin wird die Trennung der Mikroorganismen von Blutkörperchen und anderen flüssigen Bestandteilen des Blutes
und auch die Trennung der Mikroorganismen von antimikrobiell wirksamen Paktoren des Blutes und allen gegebenenfalls beim
Abnehmen der Blutprobe im Blut vorhandenen Antibiotika ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen
Körperflüssigkeiten angewendet werden, wie bei Blut, Knochenmark-, Spinal- und Pleural-Flüssigkeiten, Urin und ähnlichem.
Darüber hinaus kann das Verfahren aber auch bei jeder flüssigen Probe mit einem Gehalt an Mikroorganismen durchgeführt
werden, um die Mikroorganismen von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen antimikrobiell wirksamen Faktoren wie beispielsweise
Nahrungsmitteln wie Milch oder ähnlichem abzutrennen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.
In den Figuren 1 bis 10 sind die verschiedenen Verfahrensschritte bei den bevorzugten Analysenmethoden gemäß Erfindung
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch dargestellt.
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Das bevorzugte Verfahren wird in Einzelheiten bei der quantitativen
Bestimmung von Bakterien in einer Blutprobe beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, daß es in allen Fällen des
Verdachtes auf Septikämie außerordentlich wichtig ist, daß
der Arzt eine sehr schnelle Analyse der Blutprobe erhält. Die Analyse muß schnell anzeigen, welche Arten von pathogenen
Mikroben und welche Mengen derartiger Pathogene im Blut vorliegen.
In den Zeichnungen ist die Analysensequenz anhand einer bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt.
In Fig. 1 weist die bei dem bevorzugten Verfahren eingesetzte Vorrichtung 20 ein reagenzglasartiges Glasgefäß
21 mit einer öffnung 22 am oberen Ende auf, wobei diese öffnung mit einer Durchstichkappe 23 verschlossen ist. Die
selbst schließende Gummidurchstichkappe 23 ist im Schnitt dargestellt, um den in einer Einziehung befindlichen durchstechbaren
Bereich 2^a zu zeigen. Die Innenseite der Kappe
23 weist vorzugsweise eine kegelstumpfförmige Einziehung 2*ib
auf. Der sterile Inhalt der Vorrichtung 20 besteht aus einer wässrigen Lösung (flüssiges Filtermedium) 25 und einem evakuierten
Raum 26 (vollständiges oder teilweises Vakuum). Der Freiraum 26 wird bei unteratmosphärischem Druck, und zwar
bei einem vorherbestimmten Wert gehalten, so daß eine bestimmte Menge Flüssigkeit (durch Injektion durch die Kappe 23)
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aufgenommen werden kann, ohne daß sich innerhalb der Vorrichtung 20 ein zu starker Druck bildet, der dann die Kappe
23 aus der öffnung 22 herauspressen könnte. Evakuierte Behälter dieser Art sind an sich bekannt und werden mit verschiedenen
Unterdrucken hergestellt, um vorherbestimmte
Flüssigkeitsmengen durch die Durchstechkappe aufzunehmen. Geeignete evakuierte Behälter sind beispielsweise in der
US-PS 2 460 641 beschrieben. Die Vorrichtung 20 kann beispielsweise ein evakuiertes Proberöhrchen sein, wie die unter
der Handelsmarke "Vacutainer" von der Becton Dickinson Company
vertriebenen Röhrchen, die zusätzlich noch eine wässrige Lösung 25 enthalten. Die wässrige Lösung 25 bildet das
flüssige Filtermedium.
Das flüssige Filtermedium kann eine wässrige Lösung einer beliebig
gelösten darstellen, vorausgesetzt, daß sie gegenüber den darin suspendierten Keimen nicht toxisch ist und eine
ausreichende Dichte aufweist, um rote und weiße Blutkörperchen oder Zellreste zu suspendieren. Das flüssige Filtermedium hat also eine größere Dichte als Blut wie zum Beispiel
über 1,06 g/cnr und suspendiert damit Blutzellen oder Blutzellreste,
kann aber pathogene Mikroben aufnehmen. Ferner enthält das flüssige Filtermedium vorzugsweise eine geringe
Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels.
Als geeignete in Lösung befindliche Stoffe für das flüssige Filtermedium können Zucker eingesetzt werden wie Saccharose
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Glucose, Maltose, Fructose, Manitol, Sorbitol und ähnliche. Das flüssige Piltermedium enthält mindestens etwa hO Gew.%
Zucker und kann gegebenenfalls den Zucker bis zur Sättigungsgrenze enthalten. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Zucker
etwa 1IO bis 50 Gew.% des flüssigen Filtermediums. Im allgemeinen
werden Zucker und insbesondere Saccharose bevorzugt eingesetzt, da diese Lösungen bei einem physiologischen pH-Wert
wie 6,0 bis 7,0 gehalten werden können.
Als gelöste Stoffe können aber auch alle anderen Verbindungen eingesetzt werden, solange die Lösung eine höhere Dichte als
Blut aufweist und Blutkörperchen und insbesondere rote Blutkörperchen und Überreste roter Blutkörperchen zurückhalten
und suspendieren kann und gegenüber den pathogenen Mikroben nicht toxisch ist. Eine andere geeignete Verbindung ist beispielsweise
"Hypaque"-Natrium C11HgJ-ZNpNaOu(3,5-Diacetamido-2,4,6-trijod-benzoesäure
als Natriumsalz). Diese Verbindung kann in wässriger Lösung in gleichen Konzentrationen wie die
oben angegebenen Zucker verwendet werden.
Andere in Lösung vorliegende und als wässrige Filtermedien geeignete Verbindungen sind makromolekulare Stoffe, die im
wässrigen Medium ein flüssiges Gel aufbauen können, das eine so geringe Porendichte aufweist, daß rote Blutkörperchen
oder deren Reste nicht eindringen können, wobei aber die
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Porengröße groß genug ist, um pathogene Mikroben durchzulassen.
Geeignet zu diesem Zweck als gelöster Makromolekularstoff ist beispielsweise ein wasserlösliches vernetztes Polymeres,
das im löslichen Netzwerk mikroporenartige öffnungen
aufweist. Ein derartiges wasserlösliches Polymer ist beispielsweise das Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin
mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000, einer Intrinsic-Viskosität von etwa 0,17 dl/g und
einer spezifischen Drehung [οό] von +56,5 >
das dialysierbares Material in Mengen unter 1 Gew.% enthält. Eine derartige
Verbindung wird unter der Marke "PICOLL" von der Pharmacia Fine Chemicals Inc., 800 Centennial Avenue,
Piscataway, N.J., auf den Markt gebracht. Andere geeignete Polymere sind Dextrane mit mittleren Molekulargewichten
von etwa 10.000 bis 2.000.000 und vorzugsweise etwa 50.000. Nach dem Auflösen in Wasser wirken diese Polymere als flüssige
Piltermedien für pathogene Mikroben, da sie in dem wasserlöslichen Netzwerk Mikroporenöffnungen mit einer Größe von
etwa 1 bis 7/Um zu haben scheinen.
Die wasserlöslichen Polymere liegen in der wässrigen Lösung in Konzentrationen von etwa 10 bis 40 und vorzugsweise etwa
20 bis 30 Gew./£ vor.
Unter dem Begriff "thermisch empfindliches Geliermittel" wird
jede Verbindung verstanden, die in der wässrigen Lösung 25
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bei einer unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur geliert, aber bei höheren Temperaturen wieder flüssig wird, und zwar
bei solchen, die für die pathogenen Mikroorganismen unschädlich sind, wie beispielsweise unter 50 C und vorzugsweise
nicht über 42 C. Geeignete thermisch empfindliche Geliermittel sind jeweils solche, die gegenüber der Lösung oder
der Analysenprobe keine nachteiligen Wirkungen ausüben. Derartige Verbindungen sind beispielsweise die Gelatinen,
das heißt also aus dem Collagen durch Kochen von Haut, Bändern, Sehnen, Knochen oder ähnlichem in Wasser erhaltenen
Proteine.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach einer bevorzugten
Ausführungsform zur Bestimmung von Bakterien in einer Probe
einer Körperflüssigkeit mit der folgenden Ausrüstung durchgeführt werden:
Mit der oben beschriebenen Vorrichtung 20 mit dem flüssigen Filtermedium, wobei das Röhrchen ein Volumen von etwa 12
bis Ik mm hat und etwa 1 bis 2 ml der wässrigen Flüssigfilterlösung
enthält;
einem weiteren evakuierten 12 bis l4-ml Teströhrchen,
' das ein Material wie Natrium-polyanetholsulfat (beispielsweise
1,6 ml) oder Heparin enthält, das als Anticoagulans wirkt und die phagozytische Aktivität der
Granulozyten und Monozyten und die normale antibakter-ielle
Aktivität des Serums inhibiert;
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zwei sterilen Glasspritzen (mit zurückgezogenem Kolben), die 10 ml sterile Luft enthalten und zwei abnehmbaren
hypodermischen 3,75 cm Nadeln einer Stärke von 5>3/Um;
einer 1 ml-Einmalspritze und eine hypodermische 2,5 cm
Einmalnadel einer Stärke von 5*3/Umj
einer 3 ml-Einmalspritze und einer ebensolchen hypodermischen Einmalnadel;
drei Blutagarplatten;
einer EMB (Eosin-methylenblau)-Platte;
einer Sabouraud-Agarplatte und mit einem Röhrchen mit Thioglycolatmedium.
Es wird darauf hingewiesen, daß mit Ausnahme der Vorrichtung 20 oder einer ähnlichen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens verschiedene Geräte und Kulturmedien angewendet werden können. Insbesondere wird darauf
hingewiesen, daß die oben angegebenen Kulturmedien nur beispielhaft sind, da sie im allgemeinen vorzugsweise zum Nachweis
der am häufigsten vorkommenden pathogenen Mikroben verwendet werden. Die vorgeschlagenen Blutagarplatten sind
die üblicherweise eingesetzten Blutagarplatten, die im wesentlichen aus Schafblut und einem Nährmaterial wie Zucker bestehen,
wobei diese Ausgangsverbindungen durch einen sich
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verfestigenden Agar auf einer Petriplatte zusammengehalten werden. Die Sabouraud-Agarplatte ist speziell zur Kultur
von Pilzen geeignet. Die EMB-Platte wird zur schnellen Identifizierung
bestimmter Keime verwendet, da diese in einer bestimmten Weise darauf Flecken bilden. Das flüssige Thioglykolatmedium
mit zugesetztem.Natrium-polyanetholsulfat (SPS) ist im wesentlichen ein Trägermedium, das als Rückhalt
für das Wachstum von anaeroben und aeroben Bakterien und der meisten Pilze geeignet ist.
Zwar können verschiedenste Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, meist
werden aber die oben bezeichneten Geräte und Materialien in der im folgenden näher beschriebenen Weise eingesetzt.
Die in Pig. I dargestellte Vorrichtung 20 wird anfänglich
wie in Fig. 2 dargestellt, umgedreht, so daß die wässrige Lösung nach unten gegen die Kappe 23 fließen kann. Dann
wird die Vorrichtung in ein geeignetes Kühlaggregat wie in einen Kühlschrank eingesetzt und soweit gekühlt, bis die
Gelatine verfestigt ist. Das Röhrchen kann beispielsweise in der in Fig. 3 dargestellten umgedrehten Stellung auf
h C abgekühlt werden.
Anschließend wird eine vorher bestimmte Menge einer Blutprobe wie beispielsweise 8S3 ml in das evakuierte Teströhr-
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chen mit dem Natrium-anetholsulfonat SPS injiziert. Die roten Blutkörperchen v/erden vorzugsweise mit einem geeigneten für
Mikroorganismen nicht toxischen Mittel wie beispielsweise einem nicht toxischen Saponin lysiert. Es wird aber darauf
hingewiesen, daß die meisten Saponine zumindest gegenüber einigen Mikroorganismen toxisch sind. Es wurde jedoch gefunden,
daß die toxischen Bestandteile aus bisher für toxisch gehaltenen Saponinen entfernt werden können. Im allgemeinen
können derartige toxische Saponinmaterialien nach einem neuen
Verfahren der Anmelderin gereinigt werden, so daß das gereinigte Material im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt
werden kann. Auch einige im Handel erhältliche Saponinzubereitungen sind nicht toxisch, so daß auch diese Verbindungen
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden können. Die 1 ml-Einmalspritze wird zum Injizieren von 0,3 ml des
nicht toxischen Saponine (12 %) in das evakuierte Teströhrehen
mit der Blut-SPS-Mischung verwendet. Gegebenenfalls können die Blutkörperchen aber auch in anderer Weise wie
beispielsweise durch Verdünnung im Verhältnis von 1:1 mit destilliertem Wasser lysiert werden.
Diese vorherige Lyse der Blutprobe verringert die mögliche
Maskierungswirkung der Erythrocyten soweit wie möglich. Eine
Maskierungswirkung kann sich im allgemeinen dadurch ergeben, daß die Erythrocyten auf der Oberfläche des flüssigen Pilter-
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mediums während des Zentrifugierens verkleben und die verklebten
Zellen dabei pathogene Mikroben einschließen., wenn,
diese während des Zentrifugierens nach unten wandern, so daß sie das flüssige Piltermedium nicht erreichen. Als
nächstes wird eine der sterilen Glasspritzen mit einer hypodermischen 3»75 cm Nadel verwendet, um 8 mm der Mischung
aus Blut, SPS und Saponin in dem evakuierten Röhrchen zu entnehmen. Diese Mischung wird dann in der in Pig. 4 schematisch
dargestellten Weise in die Vorrichtung 20 injiziert. Die Nadel stößt durch die Einlage 24a der Gummikappe 23,
passiert durch die gelierte wässrige Filterlösung 25, so daß dann der Kolben niedergedrückt werden kann, um die
Probe 27, wie in Fig. 4 dargest-ellt, auf dem gelierten
wässrigen Filtermedium 25 abzusetzen. Die durch das Einspritzen der Blutprobe im Freiraum 26 ausgelöste Turbulenz
führt zu keiner Störung des wässrigen gelierten Filtermediums 25, so daß dieses als feste Bodenschicht in der
Vorrichtung 20 verbleibt.
Anschließend wird die hypodermische Nadel aus der Gummikappe
23 herausgezogen und die Vorrichtung 20 mit der gelierten wässrigen Filterschicht 25 und der Schicht der Blutprobe
in der umgekehrten Stellung erwärmt, bis die Gelatine weich wird und die wässrige Filterschicht 25 sich verflüssigt.
Die Vorrichtung wird auf eine Temperatur erwärmt, die nicht
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zu einer Zerstörung der gegebenenfalls in der Blutprobe vorhandenen
pathogenen Mikroben führt, aber andererseits ausreichend hoch ist, um die Gelatine zu verflüssigen. Wie
sich aus der schematischen Darstellung in Fig. 5 ergibt, kann das Röhrchen im umgedrehten Zustand durch Eintauchen
in ein Wasserbad auf etwa 37 bis H2 C erwärmt werden. Durch
die Verflüssigung der Gelatine in der wässrigen Lösung bildet sich so eine flüssige wässrige Filterlösung, die nun
als Flüssigfilter für pathogene Mikroben dienen kann.
Die Abtrennung der pathogenen Mikroben aus der Blutprobe er-folgt
durch Einsetzen der Vorrichtung 20 in umgekehrter Stellung in eine geeignete Zentrifuge, in der das Röhrchen
bei einer Temperatur unterhalb i}2°C einer zur Trennung der
pathogenen Mikroben von den anderen Bestandteilen der Blutprobe ausreichenden Zentrifugalkraft unterworfen wird. Geschwindigkeit
und Zentrifugierzeit können je nach Konstruktionsmaterial der Vorrichtung 20 und Art der Zentrifuge in
weitem Umfang variieren. Meist wird eine ausreichende Zentrifugierung
erzielt, wenn der Behälter mit der wässrigen Lösung und der Probe einer 100- bis 6000-fachen und vorzugsweise
etwa jUOO- bis 5000-fachen Schwerkraft unterworfen wird.
Besonders geeignet ist ein Verfahren unter Verwendung einer. Schwingzentrifuge, bei welcher etwa 10 bis 20 Minuten eine
2000- bis JiOOO-fache Schwerkraft auf das System einwirkt.
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Nach der Behandlung des Röhrchens in der Zentrifuge entsprechend der Darstellung in Pig. 6 wird die zweite 10 ml-Glasspritze
mit steriler Luft zum Abziehen des größten Teils der flüssigen Probe 27 vcn der wässrigen Polymerschicht
25 eingesetzt. Wie sich schematisch aus Fig. 7 entnehmen
läßt, können beispielsweise 7,5 ml der restlichen Probe abgezogen werden.
Nach dem Entfernen des Restes der Probe wird die wässrige Filterlösung 25 zunächst sorgfältig gemischt, um sicherzustellen,
daß alle von der Lösung aufgenommenen pathogenen Mikroben gleichmäßig in dieser verteilt werden. Die Lösung
25 kann beispielsweise kräftig geschüttelt werden, indem die Kappe 23 der Vorrichtung 20 im umgekehrten Zustand etwa
1/2 bis 4 Minuten auf einen Vortex-Mischer aufgesetzt wird. Dieser Schritt des Mischens ist schematisch in Fig. 8 dargestellt.
Dann wird die wässrige Filterlösung 25 mit den gegebenenfalls vorhandenen gleichmäßig verteilten pathogenen
Mikroben unter Verwendung der 3 ml-Einmalspritze, wie in
Fig. 9 dargestellt, aus der Vorrichtung 20 abgezogen. In dem Röhrchen sollten etwa 1 1/2 ml Flüssigkeit verbleiben. Diese
Flüssigkeit kann dann auf einem geeigneten Bakteriennährboden verteilt werden; dieser Verfahrensschritt ist schematisch in
Fig. 10 dargestellt. Mit der oben angegebenen Vorrichtung kann das Material wie folgt verteilt werden:
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2406352
Eine Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf;
diese Platte kann dann bei 37°C aerob inkubiert werden. Eine andere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf
und kann in einem Kerzenglas bei 37°C inkubiert werden. Eine weitere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wässrigen Lösung auf
und kann dann bei 37°C in einer anaeroben Umgebung inkubiert werden. Die Sabouraud-Agarplatte kann nach Zugabe von 0,2 ml
des wässrigen Mediums bei 25 C in aerober Umgebung inkubiert
werden. Die EMB-Platte kann nach Zugabe von 0,2 ml der
wässrigen Lösung bei 37 C in einem Kerzenglas inkubiert werden. Das flüssige Thioglycolatmedium kann nach Zugabe
von 0,5 ml der wässrigen Lösung bei 37 C inkubiert werden.
Die Nährböden werden täglich auf Anwesenheit von Kolonien untersucht. Die Anzahl der Mikroben in 1 ml Blut kann durch
Multiplizieren der Anzahl der Kolonien unter Berücksichtigung eines Korrekturfaktors bestimmt werden. Dieser Korrekturfaktor
zieht die Teilungsgeschwindigkeit eines bestimmten Keimes, die eingesetzten Volumina an Blut und Filterflüssigkeit
und die auf die Platte aufgebrachte Menge der endgültigen Mischung ein. In dem oben angegebenen allgemeinen
Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,56.
Es wird nochmals darauf hingewiesen, daß die einzelnen Verfahrensschritte
sowie Vorrichtungen, Ausrüstungen und die eingesetzten Kulturmedien gegebenenfalls variiert werden
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können. So können beispielsweise zum Vermischen der Blutprobe mit dem Antikoagulans und/oder dem eine Lyse auslösenden
Mittel alle bekannten Vorrichtungen eingesetzt werden. Weiter kann zum Beispiel im Verfahrensschritt 7 die Spritze dazu
verwendet werden, um nur die untere flüssige Filterschicht 25 zusammen mit einer sehr geringen Menge der Probe aus der
Schicht 27 aus dem Inneren der Vorrichtung 20 abzuziehen, so daß der Rest der Probeschicht 27 in der Vorrichtung verbleibt.
Gegebenenfalls können auch zahlreiche andere modifizierungen des Verfahrens durchgeführt werden.
Die Erfindung wird im folgenden,anhand der Beispiele näher
erläutert.
Verschiedene jeweils 8 ml umfassende Proben sterilen Blutes von gesunden Blutspendern wurden mit jeweils 0,*l ml von
humanpathogenen Keimen, nämlich Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa, Escherichia CoIi und Candida Albicans
in verschiedenen Konzentrationen inocculiert.
Zu jeder Probe wurden 0,3 ml einer 12 gew.^igen wässrigen
nicht toxischen Saponinlösung zugesetzt. Dann wurde jede Probe unter aseptischen Bedingungen wie in der Beschreibung
angegeben, in einen evakuierten Behälter wie eine Vorrichtung
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20 überführt, die eine vorbestimmte Menge des wässrigen Filtermediums enthielt, und zwar 1,5 ml einer wässrigen
Lösung mit 20 bis 25 % eines Copolymeren aus Epichlorhydrin
und Saccharose mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000, einer Intrinsic-Viskosität von
etwa 0,17 dl/g, einer spezifischen Drehung von [pe] von 56,5° ("FICOLL"-Lösung) sowie 1,5 Gew.? Gelatine (Eastman
Purified Pigskin). Ein anderer Teil der Behälter 20 enthielt
1,5 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 Gew.%
Saccharose und 1,5 Gew.? Gelatine (Eastman Purified Pigskin) mit einem pH-Wert von 6,5· Jede der Vorrichtungen 20 wurde
umgedreht und in umgekehrter Stellung auf *t°C gekühlt, bevor
die Proben in der in Fig. 4 schematisch dargestellten Weise zugegeben wurden. Dann wurden Proben mit dem gleichen humanpathogenen
Bakterien sowohl in den Vorrichtungen 20, die die wässrige "FICOLL"-Lösung enthielten, als auch in den
Vorrichtungen 20, die eine wässrige Saccharoselösung enthielten, (ausnahmsweise wurde für P. aerugenosa nur FICOLL-Lösung
verwendet) eingebracht. Nachdem jede Probe in der Vorrichtung 20 mit der benötigten Menge der Blutproben mit
einem bekannten Gehalt an humanpathogenen Keimen versetzt worden war, wurden diese im umgedrehten Zustand in ein
Wasserbad eingesetzt. Das VJasserbad wurde bei 42°C gehalten,
so daß die Gelatine sich verflüssigen konnte. Jedes Röhrchen wurde dann in umgekehrter Stellung in einer Servall-
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Zentrifuge mit einem HB4-Rotor zentrifugiert. Die Geschwindigkeit der Zentrifuge und die Zentrifugierzeit wurden
entsprechend den Werten in den folgenden Tabellen 1 bis 6 variiert. Jede Probe wurde einer relativen Zentrifugalkraft
von 164 g, 650 g, 1465 g, 2520 g, 4o8O g und 586O g
unterworfen. Weiterhin wurde jede Probe diesen verschiedenen Zentrifugengeschwindigkeiten für 10, 20 und 30 Minuten
unterworfen«
Nach dem Zentrifugieren wurden 8,0 ml der über der wässrigen
Pilterschicht überstehenden Flüssigkeit mit einer 10 ml-Spritze
abgezogen. Der restliche Inhalt wurde etwa 1/2 bis 2 Minuten in einem Vortex-Mischer kräftig gemischt, dann
wurden 0,2 ml Proben dieses Materials zum Auszählen der Kolonien auf Agarmedium aufgebracht. Bei jedem Versuch wurden
Kontrollzählungen der verwendeten Suspension durchgeführt. Die mittlere prozentuale Wiedergewinnung (mit den
angegebenen Standardabweichungen) der pathogenen Keime in den Proben läßt sich aus den folgenden Tabellen 1 bis 6 entnehmen.
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wässrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 10 min
Zentrifugierzeit 10 min
Trennmaterial: Zeit:
"Ficoll" 10 min
%
Wiedergewinnung
RCF
164 g
650 g
1465 g
2520 g
4O8O g
5860 g
CD CO 00 CO
oB. colx
Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der
% s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
aureus 69 ±22, 13 92 ±44, 13 107 ±46, 12 88 ±26, 13 82 ±49, 13 65 ±36, 13
±13, 23 37 ±19, 24 55 ±29, 24 56 ±24, 23 52 ±24, 21 50 ±25, 23
P. aeruginosa 38 ±20, 15 33 ±13, 13 64 ±17, 15 61 ±30, 14 67 ±22, 15 67 ±16, 1*:
C. albicans 81 ±28, 14 103 ±39, 14 99 ±22, 14 70 ±27, 14 67 ±30, 14 74 ±43, 12
s.d. = im folgenden Standardabweichung
wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 10 min
Zentrifugierzeit 10 min
Trennmaterial: Zeit:
Saccharose 10 min
%
Wiedergewinnung
RCP
cd Keim OO
CO
CjO
CO
CjO
164 g
g
1465 g
2520 g 4080 g 5860 g
Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der
% s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben '
°S. aureus cn
E. coli
-47, 8 128 ±33, 6 77 i36,' 8 131 ±44, 8 109 ±54, 8 124 ±41, 8
• 18 ±13, 12 27 ±13, 14 41 ±17, 15 50 ±17, 15 63 ±20, 15 64 ±17, 15
P. aeruginosa
C. albicans 49 ±33, 6 78 ±44, β 80 ±39, β 10β ±41, 5 78 ±38, ' 5 97 ^62, 6
wässrige ttPicoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 20 min
Zentrifugierzeit 20 min
Trennmaterial: Zeit:
"Ficoll" 20 min
%
Wiedergewinnung
RFC
oo Keim
164 g
g
g
g
4o8O g
5860 g
Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr,der ,
s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
. aureus
E. coli
±30, 16 93 ±44, 16 96 ±35, 15 85 ±34, 16 64 ±39, 16 49 ±22, 16
±11, 17 72 ±20, 16 85 ±17, 17 78 ±13, 17 65 ±15, 16 56 ±20, 14
±11, 17 72 ±20, 16 85 ±17, 17 78 ±13, 17 65 ±15, 16 56 ±20, 14
P. aeruginosa 44 ±16, 13 75 ±18, 13 85 ±30, 13 72 ±29, 10 67 ±21, 13 73 ±21, 12
C. albicans 92 ±19, 11 78 ±47, 11 86 ±29, 11 80 ±38, 10 88 ±53, 11 67 ±33, 11
C. albicans 92 ±19, 11 78 ±47, 11 86 ±29, 11 80 ±38, 10 88 ±53, 11 67 ±33, 11
wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter Zentrifugierzeit 20 min
Trennmaterial:
Saccharose 20 min
%
Wiedergewinnung
RCP
°°Keim
o S. aureus
coli
164 g
650 g
1465 g
586O g
2520 g 4o8O g
Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der
s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
■■ ■ ■■-■■■■■■ι ■■■■ ιι-— ■■..--■■■ ι ι. ... ι.
■ ■■■■ ■_■■■■! ■■ ■■-■■■■-■---■■■■.! ι ..■■—■■. .ι. ι ■.■_,.
30 ±28, 9 41 ±21, 8 77 ±36, · 9 78 ±35, 9 78 ±33, 9 75 i29,
29 i15, 13 54 ±20, 12 53 -263 13 64 ±27, 13 73 ±20, 11 71 ±26,
po aeruginosa
C. albicans 77 i32, 6 67 ±43, 6 104 ±23,. 6 94 ±29, 6 109 ±68, 4 105 il8,
wässrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter
Zentrifugierzeit 30 min
Zentrifugierzeit 30 min
Trennmaterial: Zeit:
"Ficoll" 30 min
%
Wiedergewinnung
RFC
°°Keim co
. aureus
E. coli
164 g
65O g
1465 g
2520 g
4O8O g
586O g
Nr.der
Nr.der
Nr.der
Nr.der
Nr.der
Nr.der '
% s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
±33, 14 86 ±18, 14 77 ±27, 14 64 ±29, 14 52 ±36, 14 39 ±37, 14
-20, 13 76 ±22, 12 82 ±18, 12 79 ±20, 13 107 ±59, 13 87 ±32, 12
P. aeruginosa 43 ±20, 14 75 ±18, 14 80 ±29, 14 89 ±30, 13 59 ±22, 13 69 ±30, 14
C. albicans 64 ±24, 12 72 ±24, 12 67 ±20, 12 55 ±18, 12 26 ±20, 12 29 ±25, 11
wässrige Saccharoselösung als Flüssigfilter Zentrifugierzeit 30 min
Trennmaterial: Zeit:
Saccharose 50 min
%
Wiedergewinnung
coKeim
0S. aureus
E. coli
RCF
164 g
65Og
1465 g
2520 g
4o8O g
5860 g
Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der Nr.der
% s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben % s.d. Proben
82 ±45, , 7 105 i5^9 6 170 ±64S 6 148 ±30, 6 155 ±49, 6 169 ±45, 5
44 ±24, 14 65 ±26, 12 83 ±21, 12 89 ±37, 13 105 i32, 12 89 ±35, 14
P. aeruginosa
C. albicans 82 ±41, 6 112 ±47, 6 106 ±43, 6 106 -70, 6 134 ±57, 6 110 ±39, 6
Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu den bisherigen Methoden zur Konzentrierung und Wiedergewinnung von pathogenen Mikroben
als ausgezeichnet anzusehen.
Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Nachweismethode aufzuzeigen, wurden 500 Blutproben von Patienten, die im
Verdacht standen, Infektionen des Blutstromes zu haben, nach zwei oder drei der folgenden Verfahren analysiert:
a) Blutflaschenverfahren: Zwei 5 ml-Proben des Patientenblutes
wurden steril in zwei übliche BBL-Blutflaschen eingebracht. Die eine Flasche wurde anaeroben und die
andere Flaschen aeroben Kulturbedingungen ausgesetzt; beide Flaschen wurden bei 37°C inkubiert. Die Flaschen
wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht. Falls Wachstum festgestellt wurde oder falls
kein Wachstum festgestellt wurde, wurden 1 ml-Proben aus jeder Flasche am zweiten und sechsten Tag nach Zugabe
der Blutprobe entnommen. Die Proben wurden mikroskopisch und durch Ausstreichen auf übliche Bakterien- und Pilznährböden
(Agarplatten) analysiert.
b) Gießplattenverfahren: 0,5 nil Patientenblut wurden aseptisch
in jeweils 12 Petrischalen eingebracht. Dann wurden 20 ml
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Sabouraud~Agarmedium oder Blutagarmedium je Platte eingebracht
und der Inhalt kräftig gemischt. Danach wurden die Platten unter folgenden Bedingungen inkubiert:
drei Platten (Sabourauds Medium), 25°C, aerob
drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, aerob
drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, anaerob
drei Platten (Blutagarmedium), 37°C, Kerzenflasche
Alle Platten wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.
c) Erfindungsgemäßes Dichtezentrifugierverfahren: 8,3 ml
Patientenblut wurden in ein steriles evakuiertes Röhrchen mit 1,7 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an
0,35 Gew.% Natrium-polyanetholsulfonat und 0,85 Gew.% Natriumchlorid überführt. Die roten Blutkörperchen im
Röhrchen wurden mit 0,3 ml einer 12 #igen wässrigen Saponinlösung lysiert, dann wurden 8 ml dieser Mischung
in ein zweites evakuiertes Röhrchen entsprechend Vorrichtung 20 mit 1,7 ml einer wässrigen Lösung mit einem
Gehalt an 20 Gew.% eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose und 1,5 Gew.% Gelatine entsprechend der
in Beispiel 1 beschriebenen Lösung überführt. Jede Vorrichtung 20 wurde dann umgedreht und bei 4°C so lange
gekühlt, bis die wässrige Polymerlösung durch die Gelatine
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verfestigt war. Dann wurden die Blutproben in der in Pig. schematisch dargestellten und in Beispiel 1 beschriebenen
Weise in jede Vorrichtung 20 injiziert. Anschließend wurde die wässrige Polymerlösung in jeder Vorrichtung 20 durch
Eintauchen in ein bei 420C gehaltenes Wasserbad verflüssigt.
Jede Vorrichtung 20 wurde anschließend im umgedrehten Zustand 45 Minuten in einer International U.V.-Zentrifuge
bei 3000 U/min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden 8 ml der über der wässrigen Polymerschicht überstehenden
Flüssigkeit mit Hilfe einer 10 ml-Spritze abgezogen. Der verbleibende Anteil in jeder Vorrichtung
wurde 1 Minute in einem Vortex-Mischer kräftig durchmischt, dann wurden 0,2 ml-Proben entnommen, gleichmäßig
ausgestrichen und auf den folgenden Medien inkubiert:
eine Blutagarplatte, 37°C, aerob zwei Blutagarplatten, 37 C, anaerob
eine Blutagarplatte, 37°C, Kerzenglas eine Sabourauds-Agarplatte, 25 C, aerob
Der Rest der Probe wurde in ein Röhrchen mit flüssigem Thioglycolatmedium überführt und bei 37°C inkubiert. Die
Platten und das Röhrchen wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
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Nachgewiesene I | Blutflaschen- verfahren |
• | 3. | •Tabelle 7 | Anzahl Keime ml/Blut |
Dichtezentrifugier- verfahren |
Anzahl Keime ml/Blut |
1 | I | |
Tag, an dem reines isolier tes Material teime erhalten wurde |
Streptococcen | 0,5 | Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde |
- | 1 | Ul I |
||||
Escherichia coli | 2. | Gießplattenverfahren | - | negativ | - | 1 | ||||
O | Aerogenes | Proteus | negativ | Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde |
50 | negativ | 450 | 1 | ||
CD OO |
ß-hämolytische | aureus | 3. | 3. | - | 1. | 7 | 3 | ||
CjO ^ |
Streptomyces | 1 aureus |
negativ | negativ | - | 2. | 1 Proteus IO Klebsiella 144 |
IQ | ||
O | Klebsiella und | aureus | negativ | 1. | - | 2. | 2. 75 4. Wachstum nur in Thioglykolat |
|||
CO | Staphylococcus | negativ | negativ | - | 2. | KS) -C- |
||||
Staphylococcus | Ί. | nicht"untersucht | - | 2. | 1OS | |||||
Staphylococcus | Streptococcen | 4. | Il | - | 3. . | CB | ||||
ρ Cryptococcus |
Pseudomonas aeruginosa od-hämolytische Streptococcen |
negativ | It | - | 3. | |||||
2 Cryptococcus |
negativ negativ |
tt | - | 5. | ||||||
^-hämolytische | ■ ti | - | ||||||||
ti | ||||||||||
tt | ||||||||||
tt negativ |
||||||||||
Tabelle 7 (Portsetzung)
Blutflaschenverfahren
Gießplattenverfahren
Dichtezentrifugier·
verfahren
Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa
Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde
•2.
CO OO CaJ LO
οί-hämolytische Streptococcen und t·
ß-hämolytische Streptococcen negativ
Tag, an dem
reines isolier- Anzahl
reines isolier- Anzahl
tes Material Keime erhalten wurde ml/Blut
negativ
negativ
Tag, an dem
reines isolier- Anzahl
reines isolier- Anzahl
tes Material Keime erhalten wurde ml/Blut
1. E.coli 10,5
P.aeruginosa 3
1 oi-xx. ß-hämolytische
Strep. 0,4
Pseudomonas Candida |
negativ 6. |
negativ 2. |
0,6 | 1. 2. |
94 0,5 |
I VjJ σ* I |
Staphylococcus aureus | 2. | negativ | - | negativ | - | I |
Enterobacter cloacae | 3. | negativ | - | negativ | - | |
Pseudomonas | 3. | 1. | 10 | 1. | 18 | |
Klebsiella pneumoniae | 2. | 1/2 | 49 | 1/2 | 72 | |
Enterobacter cloacae | 3. | negativ | - | negativ | _ | |
Klebsiella | 2. | 1. | 0,2 | 1/2 | 0,4 | K9 4>. |
Escherichia coli ; | 2. | 1. | 1,2 | 2. | 1,5 | O OD |
Cryptococcus | negativ | negativ | _ | 3. | 1,5 |
Tabelle 7 (Fortsetzung)
nachgewiesene Keime
Blutflaschenverfahren
Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde
ß-hämolyfcische Streptococcen
c^-Iiamolytische Streptococcen
Staphylococcus epidermidis (Mannitolpositiv)
Klebsiella
Pr.&v.domonas §■>■-.'.phylococcus aureus
Sseherichia coli Diplococcus pneumo.niae
Pseudomonas aeruginosa und Eseherichia coli
Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella
Eseherichia coli Escheriehia coli
.1
negativ negativ negativ
2.
2. negativ
2. 2 1/2
6. nur Pseudomonas
3.
negativ 1 1/2 Gießplattenverfahren
Tag, an dem
reines isolier- Anzahl
reines isolier- Anzahl
tes Material Keime
erhalten wurde ml/Blut
erhalten wurde ml/Blut
negativ
negativ
negativ
2.
2,5
negativ | — |
3. | 0,6 |
1. | 0,6 |
2. | 0,5 |
3 1/2 | 0,8 |
3 1/2 nur Pseudomonas |
4 |
0,6 | - |
negativ | |
1/2 | 8 |
Dichtezentrifugierverfahren
Tag, an dem
reines isolier- Anzahl
tes Material Keime
erhalten wurde ml/Blut
2. 1. 2.
1. 2. negativ
1.
1/2 1/2
0,6
2.
1/2
Streptoc. 2,0
1,5 0,9
15 0,3
Pseudomonas 5,1 _ Enterobacter- 0^6
nur Pseudomonas 7,5
0,4 7,5
Tabelle 7 (Portsetzung)
Nachgewiesene Keime | Blutflaschen verfahren |
Gießplattenverfahren | Anzahl Keime ml/Blut |
•M» | Dichtezentrifugier- verfahren |
Anzahl Keime ml/Blut |
I VjJ |
|
Escherichia coli Escherichia coli Propionibacterium |
Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde |
Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde |
26 15 |
1,8 | Tag, an dem reines isolier tes Material erhalten wurde |
19 14 |
CO ! |
|
40983 | Candida albicans | 1 1/2 1 1/2 7 |
1/2 1/2 negativ |
0,4 | >200 | 1/2 1/2 negativ |
- | |
CO | Enterobacter cloacae Escherichia coli |
negativ | .2. | OJ CVJ | 0,6 | negativ | 281 17 |
|
1060 | Staphylococcus aureus | 2. 2. |
1. "2. |
0,4 22 |
1. 1. |
1,2 | ||
Pseudomonas aeruginosa | negativ | negativ | 4 | 3. | 1,5 | |||
Pseudomonas aeruginosa | 3. | 1. | 2. | >200 | 2406: | |||
Pseudomonas aeruginosa | 3. | 2. | 2. | 0,3 | CB N> |
|||
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa |
negativ | 2. | 2. | 20 | ||||
Escherichia coli | negativ 3. |
1. 2. |
■ negativ 2. |
1,5 | ||||
2. | 2. | 1. | ||||||
Tabelle 7 (Portsetzung)
Nachgewiesene Keime Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aerugxnosa
co Escherichia coli ~* Enterobacter cloacae
ο
o Pseudomonas. aerugi'nosa
Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli .
Blutflaschenverfahren
Tag, an dem reines isoliertes Material erhalten wurde
Gießplattenverfahren
Tag, an dem
reines isolier- Anzahl
tes Material Keime
erhalten wurde ml/Blut
Dichtezentrifugierverfahren
Tag, an dem reines isolier- Anzahl
tes Material _ Keime erhalten wurde ml/Blut
10. | 5. | 0,2 | 10. | 0,3 | ι |
2. | 1. | 5 | 1. | β |
VO
I |
2. | 1. | 2,5 | 1. | 3 | |
2. | : ι. | 3,2 | 1. | 3,9 | |
2. | .1. | UM | 1. | 89 | |
3. | 2. | 0,6 | 2. | 0,9 | |
2. | 1. | 200 | 1. | 200 | |
Beim Blutflaschenverfahren wurde Klebsiella durch Proteus überwachsen.
Von einem Patienten getrennt isoliert.
Die Blufflasche zeigte niemals Anzeichen für mikrobielles Wachstum. Cryptococcus wurde in
der Flasche nur nach Subkultur auf Sabouraud-Medium nachgewiesen.
Eine Zusammenfassung der in Tabelle 7 enthaltenen Daten ist in der folgenden Tabelle 8 gegeben:
% positiver | % positiver | Durchschnittszeit | |
Nachweis | Nachweis mit | und bis zur | |
mehreren Keimen | Isolierung von | ||
Methode | 9,6 | reinen Stämmen | |
Zentri | 7,6 | 0,8 | |
fugieren | 6,8 | 0,4 | 1,8 |
Blutflasche | 0,0 | 3,0 | |
Gießplatte | 1,6 | ||
Wie Tabelle 8 zeigt; ist das Zentrifugierverfahren bezüglich
des prozentualen positiven Nachweises gegenüber dem Blutflaschen- und dem Gießplattenverfahren überlegen. Der positive
Nachweis betrifft auch Fälle mit mehr als einem Keim. Das Zentrifugierverfahren ist wesentlich schneller als die
Blutflaschenmethode. Die Ergebnisse in den Tabellen 7 und zeigen darüber hinaus, daß bei einem gegebenen Blutvolumen
die Zentrifugiermethode empfindlicher als die quantitative Gießplattenmethode ist, das heißt also, das ein höherer
Prozentsatz der in der Blutprobe vorhandenen Organismen gewonnen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung können zum Abtrennen von pathogenen Mikroben a.us Flüssigkeitsproben
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wie Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, um die Gegenwart von pathogenen Mikroben in der Körperflüssigkeit nachzuweisen,
wie beispielsweise zur Diagnose von Septikämie. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Untersuchung
von Blut von als gesund angenommenen Blutspendern eingesetzt werden, um infiziertes Blut festzustellen, bevor
es einem Patienten verabreicht wird. Ferner kann das Verfahren zur Untersuchung auf Anwesenheit von pathogenen Mikroben
in Nahrungsmitteln oder anderen Materialien zur Verwendung an Säugetieren eingesetzt werden.
Die dichten Flüssigfilter, die zusammen mit dem Zentrifugieren erfindungsgemäß Anwendung finden, bilden ein neues Verfahren,
um pathogene Mikroben in einer Flüssigkeitsprobe zu konzentrieren und um dann die konzentrierten Mikroben von
antimikrobiell wirksamen Faktoren, wie sie im allgemeinen in Flüssigkeiten wie Blut und anderen Körperflüssigkeiten
vorhanden sind, abzutrennen. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung und Konzentrierung
von pathogenen Mikroben aus Körperflüssigkeitsproben wie Blut, wenn in Notsituationen bei Patienten mit schnell verlaufender
akuter Septikämie eine mikroskopische Untersuchung notwendig ist. Das Flüssigfiltermedium weist im allgemeinen
eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe auf, aus welcher die pathogenen Mikroben extrahiert werden. So hat bei-
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- H2 -
spielsweise das erfindungsgenäß in Konzentrationen von 10 bis 40 Gew.? in wässriger Lösung eingesetzte Copolymere aus
Saccharose und Epichlorhydrin eine Dichte von etwa 1,035 bis 1,16 g/ml. Diese dichten Flüssigfilter führen nicht nur
zu einer selektiven Aufnahme der Keime, sondern suspendieren und schützen die Keime, sobald sie von dem Medium aufgenommen
sind und darin zurückgehalten werden. Die sehr dichten polymeren Medien schützen und konservieren pathogene
Mikroben und zwar insbesondere solche, die teilweise geschädigte Zellwände aufweisen, also Sphäroplasten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis von allen
pathogenen Mikroben eingesetzt werden, wie Bakterien, Pilzen, L-Formen der Bakterien und Kycoplasmen.
Es wird darauf hingewiesen, daß wässrige Zuckerlösungen und insbesondere wässrige Saccharoselösungen wirksam zur Gewinnung
der L-Formen und der Mycoplasmen eingesetzt werden können. Die "konzentrierten Saccharoselösungen sind hypertonisch und schützen die L-Formen und Mycoplasmen vor einer
Lyse. Im allgemeinen enthalten die konzentrierten wässrigen Saccharoselösungen eine kleine Menge Gelatine, wie etwa 1
bis 2 Gew.%; diese Lösungen sind die bevorzugt eingesetzten
Flüssigfilter bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Lösungen sind, wie bereits angegeben, hyper-
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240636
tonisch, sie weisen aber einen ausreichenden Auftrieb auf, um rote und weiße Blutkörperchen und Zellreste während des
Zentrifugierens abzuhalten, während sie gleichzeitig nicht die pathogenen Keime ausschließen so daß sie eine Art
Kissen- oder Schirmwirkung für die pathogenen Keime bilden, und somit die darin suspendierten Keime schützen- Außerdem
sind die Filter wärmestabil. Beispielsweise können die Saccharose-Gelatine-Mischungen während der Vorbereitung
der Vorrichtung 20 autoklaviert werden, ohne daß ein unerwünschter Abbau der Gelatine oder eine Ausfällung auftreten.
Darüber hinaus können diese Lösungen bei einem fast neutralen oder physiologischen pH-Wert gehalten werden.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten Verfahren besteht darin, daß dadurch
pathogene Mikroben als erstes in einem geschlossenen System konzentriert werden können, das nicht einer äußeren Kontamination
mit pathogenen Keimen durch deren Anwesenheit in den Laboratorien oder im Krankenhaus ausgesetzt ist. Weiterhin
werden die konzentrierten pathogenen Keime von antimikrobiell wirksamen Materialien, wie sie normalerweise in
Flüssigkeitsproben vorliegen, abgetrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum wirksamen Nachweis sehr geringer
Konzentrationen der Mikroorganismen wie beispielsweise einem Mikroorganismus je ml Blut eingesetzt werden.
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Claims (1)
- Patentansprüche1. Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe mit derartigen Mikroben und antipathogen wirksamen Faktoren, dadurch gekennzeichnet, daß (a) die Flüssigkeitsprobe in einer umschlossenen Zone auf ein flüssiges Filtermedium aufgebracht wird, wobei das flüssige Filtermedium eine höhere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und dadurch die Flüssigkeitsprobe trägt, gegenüber den pathogenen Keimen nicht toxisch, aber zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Flüssigkeit sprobe befähigt ist und (b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Flüssigkeitsprobe gegen das Flüssigfiltermedium gepreßt und die pathogenen Keime selektiv zum übertreten in das Filtermedium veranlaßt und dadurch von der restlichen Masse der Flüssigkeitsprobe abgetrennt werden.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Lösung eines nichtionischen Zuckers verwendet wird.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als nichtionischer Zucker Saccharose verwendet wird.409833/10604. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plüssigfiltermedium mit einem Gehalt an mindestens etwa 40 % Zucker verwendet wird.5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigfiltermedium eine sterile wässrige Lösung eines makromolekularen Stoffes mit Mikroporenöffnungen durch das gelöste Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine ausreichende Größe zum selektiven Durchtritt von pathogenen Keimen aus der Flüssigkeitsprobe aufweisen, verwendet wird.6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Lösung eines Copolymers aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung fo/] ~ von 56,5 verwendet wird.7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an etwa 10 bis Gew.üi des Copolymers verwendet wird.8. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, daßals mikroporöser Filter eine wässrige Lösung eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.40983-3/1060- H6 -9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung des Dextrans mit einem Gehalt an etwa 10 bis 1JO Gev.% verwendet wird.10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigkeitsprobe eine Körperflüssigkeitsprobe verwendet wird.11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutprobe verwendet wird.12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die restliche Menge der Flüssigkeitsprobe von dem Flüssigfiltermedium entfernt wird.13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Filtermedium mit den pathogenen Mikroben vermischt und diese Mischung quantitativ auf Nährböden für pathogene Mikroben aufgebracht wird.Ik. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Filtermedium auf pathogene Mikroben mikroskopisch analysiert wird.A09833/106015· Verfahren zum Anweis von pathogenen Mikroben in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß(a) eine Probe der Körperflüssigkeit auf einem Flüssigfiltermedium in einer umschlossenen Zone aufgebracht wird, daß dieser Filter gegenüber den Keimen nicht toxisch ist und die Flüssigkeit trägt und selektiv die pathogenen
Keime aufnimmt,(b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Körperflüssigkeitsprobe gegen das Flüssigfiltermedium gepreßt wird und daß so lange zentrifugiert wird, bis die pathogenen Mikroben selektiv in
das Flüssigfiltermedium übertreten und dadurch von der
restlichen Menge der Körperflüssigkeitsprobe getrennt
werden,(c) daß die restliche Menge der Körperflüssigkeitsprobe von dem Flüssigfiltermedium abgetrennt wird,(d) daß das Flüssigfiltermedium mit den pathogenen Keimen sorgfältig durchmischt wird und(e) daß mindestens ein Teil des Flüssigfiltermediums auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht wird.16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine wässrige Zuckerlösung verwendet wird.409833/1060- 1*8 -17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Flüssigfiltermedium mit einem Gehalt an mindestens
1JO Gew.? Zucker verwendet wird.18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Saccharose verwendet wird.19· Verfahren nach Anspruch 15> dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfiltermedium eine sterile wässrige Lösung
eines wasserlöslichen Polymers mit Mxkroporenoffnungen
durch das lösliche Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine Größe von etwa 1 bis 7/Um aufweisen, verwendet wird.20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung[(W ^ von 56,5° verwendet wird.21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an diesem Polymer von etwa 10 bis 1IO Gew.% verwendet wird.22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Dextran mit einem Molekulargewicht von
etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.409833/ 1 06023. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an Dextran von etwa IO bis 40 Gew.% verwendet wird.24. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut, Knochenmark, Spinalflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder Urin verwendet werden.25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe vor Aufbringen auf das Plüssigfiltermedium einer Lyse unterzogen wird.27. Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Mikroben aus einer Plüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß(a) die Plüssigkeitsprobe in einer umschlossenen Zone auf ein Flüssigfiltermedium aufgebracht wird, daß das Plüssigfiltermedium eine höhere Dichte als die Plüssigkeitsprobe aufweist, gegenüber den pathogenen Keimen nicht toxisch und zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Plüssigkeitsprobe befähigt ist,(b) daß die umschlossene Zone Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Flüssigkeitsprobe gegen das Plüssigfiltermedium gepreßt wird und daß die pathogenen Keime409833/1060zum selektiven übertritt in das Medium und zur Trennung aus der übrigen Menge der Plüssigkeitsprobe veranlaßt werden und(c) daß die übrige Menge der Plüssigkeitsprobe von dem Flüssigfilter abgetrennt wird und daß der Flüssigfilter auf pathogene Keime untersucht wird.28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Plüssxgfiltermedium eine wässrige Zuckerlösung verwendet wird.29· Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an mindestens 40 Gew.? Zucker verwendet wird.30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Saccharose verwendet wird.31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigfilter eine wässrige Lösung eines Polymers wie eines Copolymers aus Saccharose und Epichlorhydrin und/oder Dextran verwendet wird.32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem409833/1060Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung[cv^J von 56,5 verwendet wird.33. Verfahren nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, daß ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000
bis 2.000.000 verwendet wird.31I. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an diesen Polymeren von etwa 10 bis 40 Gew.% verwendet wird.35· Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigkeitsprobe eine Körperflüssigkeitsprobe verwendet wird.36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut, Knochenmark, Spinalflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder Urin verwendet wird.37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.38. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse des Plussigfiltermediums durch Vermischen
des Plussigfiltermediums zur gleichmäßigen Verteilung derA 0 9 8 3 3 / 1 060darin enthaltenen pathogenen Mikroben und quantitatives Auftragen dieser Mischung auf Nährböden für pathogene Mikroben durchgeführt wird.39· Verfahren zur Peststellung von pathogenen Mikroben in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß(a) eine wässrige Polymerlösung an der Injektionszone innerhalb eines Zentrifugierrohres bereitgestellt wird, wobei diese wässrige Polymerlösung etwa 10 bis 40 Gew.% eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose oder Dextran und etwa 1 bis 5 Gew.# eines thermisch empfindlichen Geliermittels enthält,(b) daß das Zentrifugierrohr zur Verfestigung der wässrigen Polymerlösung durch das thermisch empfindliche Geliermittel gekühlt wird,(c) daß durch Durchstechen einer hypodermischen Injektionsnadel durch die Injektionszone und durch die verfestigte wässrige Polymerlösung und Injizieren der Körperflüssigkeitsprobe durch die hypodermische Injektionsnadel indas Zentrifugierrohr eine Probe der Körperflüssigkeit auf die verfestigte Polymerlösung aufgebracht wird,(d) daß das Zentrifugierrohr zur Verflüssigung des thermisch empfindlichen Geliermittels und Verflüssigung der wässrigen Polymerlösung erwärmt wird,(e) daß das Zentrifugierrohr Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Kcrperflüssxgkeitsprobe gegen die wässrige Polymerlösung gepreßt wird und daß die pathogenen409833/10602A06362Mikroben zum selektiven übergang in diese Lösung und Abtrennung aus der übrigen Menge der Körperflüssigkeitsprobe veranlaßt werden,(f) daß die übrige Menge der Körperflüssigkeitsprobe von der wässrigen Polymerlösung abgetrennt wird,(g) daß die wässrige Polymerlösung mit den Keimen sorgfältig gemischt wird und daß(h) mindestens Anteile der durchmischten wässrigen Polymerlösung auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht werden.1IO. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung [o^J D von 56,5° verwendet wird.Ml. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 verwendet wird.M2. Verfahren nach Anspruch 39 > dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine verwendet wird.ΔΠ9833/ 1 060kj>. Verfahren zur Peststellung von pathogenen Mikroben in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß(a) eine wässrige PiIterlösung auf eine Injizierzone in einem Zentrifugierrohr bereitgestellt wird, wobei diese wässrige Lösung mindestens etwa 1JO Gew. % eines Zuckers und etwa 1 bis 5 Gew.$S eines thermisch empfindlichen Geliermittels enthält,(b) daß das Zentrifugierrohr zur Verfestigung der wässrigen Filterlösung durch das thermisch empfindliche Geliermittel gekühlt wird,(c) daß durch Durchstechen einer hypodermischen Injektionsnadel durch die Injektionszone und durch die verfestigte wässrige Filterlösung und nachfolgender Injektion einer Probe der Körperflüssigkeit durch die Injektionsnadel in das Zentrifugierrohr eine Probe der Körperflüssigkeit auf die verfestigte wässrige Filterlösung aufgebracht wird,(d) daß das Zentrifugierrohr zur Verflüssigung des thermisch empfindlichen Geliermittels und zur Verflüssigung der wässrigen Filterlösung erwärmt wird,(e) daß das Zentrifugierrohr Zentrifugalkräften ausgesetzt wird, so daß die Probe der Körperflüssigkeit gegen die wässrige Filterlösung gepreßt wird und daß die pathogenen Mikroben zum selektiven übertritt in die Filterlösung und zur Abtrennung aus der restlichen Menge der Körperflüssigkeit sprobe veranlaßt werden,(f) daß die restliche Menge der Körperflüssigkeitsprobe von der wässrigen Filterlösung abgetrennt wird,409833/1060(g) daß die wässrige Filterlösung mit den pathogenen Keimen sorgfältig durchmischt wird, und daß(h) mindestens Anteile der durchmischten wässrigen Polymerlösung auf Nährböden für die pathogenen Mikroben aufgebracht werden.HH. Verfahren nach Anspruch Hj>, dadurch gekennzeichnet, daß als Zucker Saccharose verwendet wird.45. Verfahren nach Anspruch HH9 dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine verwendet wird.H6. Verfahren nach Anspruch H^9 dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit Blut verwendet wird.Hj. Vorrichtung zur Isolierung und Konzentrierung von pathogenen Mikroben aus einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß in einem dicht durch eine mit einer Injektionsnadel durchstechbare Verschlußvorrichtung verschlossenem Zentrifugierbehälter das Innere dieses Behälters einen evakuierten einen unteratmosphärischen Druck aufweisenden Freiraum neben einer sterilen wässrigen Lösung eines Materials mit einer größeren Dichte als der Flüssigkeitsprobe und der Fähigkeit zur selektiven409833/ 1060Aufnahme von pathogenen Mikroben aus der Flüssigkeitsprobe aufweist.k8. Vorrichtung nach Anspruch Uf, dadurch gekennzeichnet, daß in der sterilen wässrigen Lösung eine kleine, aber wirksame Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels
enthalten ist.lJ9. Vorrichtung nach Anspruch *18, dadurch gekennzeichnet, daß in der wässrigen Lösung etwa 1 bis 5 Gew.% des thermisch
empfindlichen Geliermittels enthalten sind.50. Vorrichtung nach Anspruch 1J9s dadurch gekennzeichnet, daß als thermisch empfindliches Geliermittel Gelatine enthalten ist.51. Vorrichtung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Zuckerlösung enthalten ist.52. Vorrichtung nach Anspruch 51» dadurch gekennzeichnet, daß eine Sacchvroselösung enthalten ist.53. Vorrichtung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Behälter eine mindestens kO gew.^ige Saccharoselösung enthalten ist.409833/106051K Vorrichtung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß in den Behälter eine wässrige Lösung eines makromolekularen Stoffes mit Mikroporenöffnungen im löslichen Netzwerk, wobei diese Öffnungen eine ausreichende Größe zum selektiven übertritt von pathogenen Keimen aus der Flüssigkeitsprobe aufweisen, enthalten ist.55. Vorrichtung nach Anspruch 5**> dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung OCj D von 56,6 enthalten ist.56. Vorrichtung nach Anspruch 51J* dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 2.000.000 im Behälter enthalten ist.ue:si:köΛ09833/ 1060stLeerseite
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