DE2449749C2

DE2449749C2 - Verfahren zur Gewinnung gereinigter Saponine aus an Saponinen reichen Extrakten

Info

Publication number: DE2449749C2
Application number: DE2449749A
Authority: DE
Inventors: Gordon Lee Dallas Tex. Dorn
Original assignee: Jk And Susie L Wadley Research Institute And Blood Bank Dallas Tex Us; JK And Susie L Wadley Research Institute And Blood Bank Dallas Tex
Current assignee: Wadley Technologies Inc Dallas Tex Us
Priority date: 1973-12-10
Filing date: 1974-10-19
Publication date: 1984-02-23
Also published as: JPS50121300A; US3883425A; GB1483783A; IT1029629B; AU7511774A; BR7410278A; JPS6254797B2; CA1029368A; FR2253759A1; FR2253759B1; DE2449749A1

Description

Zum Nachweis mikrobieller Erreger in einer Blutprobe werden aus dieser zunächst die Blutzellen durch herkömmliche Verfahren, wie Zentrifugieren oder 15 Auflösen vom Serum getrennt. Anschließend wird das zurückgebliebene Serum durch ein Mikroporenfilter geführt, das Teilchen mi» einer Größe von Bakterien oder größer zurückhält. Die Filter werden auf eine Agarplatte gelegt und Bedingungen ausgesetzt, die ein 20 Wachstum der Mikroorganismen ermöglichen. Die Anwesenheit von Mikroorganismen wird durch das Auftreten von Mikroorganismenkolonien innerhalb von etwa 24 Stunden angezeigt. Da die handelsüblichen ■ „.„,. .„ Saponinextrakte für mikrobielle Krankheitserreger

-■ Die Erfindung betrifft em Verfahren zur Gewinnung 25 toxisch sind, d. h. diese zerstören, können sie in solchen gereinigter Saponine aus handelsüblichen Saponinex- Verfahren nicht angewendet werden.

Es wurde nun gefunden, daß Saponine für mikrobielle Krankheitserreger und andere Mikroorganismen dann nicht toxisch sind, wenn aus ihnen die Bestandteile, die in wäßriger Lösung eine scheinbare Molmasse von nicht mehr als etwa 600, z. B. eine scheinbare Molmasse zwischen etwa 140 und etwa 600 haben, entfernt wurden. Das so gereinigte Saponin wirkt als starker Hamölyt, ist aber nicht mehr toxisch für Mikroorganismen.

Die Erfindung betrifft somit das im vorstehenden Anspruch 1 aufgezeigte Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Saponinen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfin-

oder anderen Zuckern. Die Hydrolyse des Saponins 40 dung werden handelsübliche Saponinextrakte dadurch führt zum Sapogenin und einem oder mehreren von den toxischen Bestandteilen befreit, daß man eine Zuckern. wäßrige Lösung des Saponinextrakts herstellt und

Die im Handel erhältlicher; Saponine stellen weiße bis anschließend die Lösung durch ein Mikroporenfilter braune amorphe scharfe Pulver mit unangenehmen filtriert, dessen mittlere Porendurchmesser nicht kleiner Geschmack und Geruch dar. Diese Pulver sind sehr gut 45 als etwa 1.1 nm und nicht größer als etwa 2,4 nm sind, in Wasser löslich und schäumen stark beim Schütteln Die für die mikrowellen Erreger toxischen RrstanHteilp

trakten durch Entfernung der für mikrobielle Erreger

toxischen Substanzen aus diesen Extrakten.
_ -1 Saponine sind Glykoside, die verbreitet in Pflanzen

auftreten, wäßrige ölemulsionen bilden und als ,■Schutzkolloide wirken. Jedes Saponinmolekül enthält

.ein Sapogenin als Aglucon und einen Zucker.

Das Sapogenin ist entweder ein Triterpenoid,

gewöhnlich mit pentazyklischer Struktur, wie z. B. ^Quillajasäure, oder eine Verbindung mit Steroidstruk-

. tür, gewöhnlich mit einer Spiroacetatseitenkette, wie im

Diosgenin. Der Zuckeranteil des Saponinglucosids ■ besteht aus einem oder mehreren Zuckern, wie Glucose.

Saccharose, Xylose, einer Pentose oder Methylpentene

mit Wasser.

Die handelsüblichen Saponine werden durch Extraktion von Pflanzen mit Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, und anschließende Ausfällung und Umkristallisation der Saponine hergestellt. Saponine treten insbesondere in den zur Familie der Caryophyllaceae gehörenden Pflanzen auf. Spezielle Beispiele für Saponinquellen sind Seifenrinde. Panamabefinden sich dann im wäßrigem Filtrat. Dieses Ultrafiltrationsverfahren wird vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt, wobei entsprechend der durch den Filter getretenen Lösungsmenge zu der wäßrigen, das Saponin enthaltenden Lösung reines wäßriges Lösungsmittel gegeben wird, bis die Giftstoffe vollständig aus der das Saponin enthaltenden Lösung entfernt sind.

Obgleich zur Abtrennung der toxischen Bestandteile holz, Seifenbeere und Lakritze. Ein unter Verwendung 55 mit einer scheinbaren Molmasse von über etwa 150 und von Alkohol durchgeführtes Extraktionsverfahren zur unter etwa 600 die Ultrafiltration und insbesondere die Gewinnung von handelsüblichem Saponin ist in kontinuierliche Ultrafiltration bevorzugt wird kann für Kinzettes Chemical Encyclopedia. D.H. Hey, 9. die Entfernung dieser Bestandteile jedes andere Ausgabe 1966 beschrieben. Dort wird gepulverte bekannte Trennverfahren, ζ. B. die Gelfiltration οότ Se^:fenrinde (Quillaja-Saponaria) mit heißem Alkohol, 60 Dialyse angewandt werden. Auch engporige Kanalsyferner ein pulvriger, getrockneter wäßriger Extrakt sterne (TCF 10 der Scientific Systems Division of einer solchen Seifenrinde mit siedendem Alkohol Amicon Corp.) sind anwendbar,
extrahiert. Beim Abkühlen des heißen Alkohols Die handelsüblichen Saponine sind im allgemeinen in

kristallisiert das Saponin aus. drei Reinheitsgraden erhältlich, roh, gereinigt und

Bei oraler Einnahme sind die Saponine für den 65 hochrein. Üblich sind auch die Bezeichnungen chemisch Menschen praktisch ungiftig. Bei einer Injektion in die rein, gereinigt und analysenrein. Im allgemeinen stellen Blutbahn wirken sie jedoch als starke Hämolyten, die diese Handelsprodukte, die aus den verschiedensten die roten Blutkörperchen auflösen. Wegen dieser pflanzlichen Quellen hergestellt werden, komplexe

's¹

Gemische dar. die unterschiedliche Mengen an Fremdstoffen, einschließlich der Gitstoffe für Mikroben enthalten, und unterschiedliche hämolytische Eigenschaften besitzen. Die Gitstoffe für die Mikroorganismen haben in wäßriger Lösung eine scheinbare Molrnasse von nicht mehr als etwa 600 und im allgemeinen zwischen etwa 150 und 600. Ferner wurde festgestellt, daß die Saponine, obwohl sie ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 2000 haben, in wäßriger Lösung ein oehr viel größeres scheinbares Molekulargewicht aufweisen, wahrscheinlich aufgrund der Bildung von Mizellen, und sich deshalb leicht in wäßriger Lösung von den Giftstoffen abtrennen lassen.

Das erfindungsgernäße Verfahren wird nachfolgend anhand der schema tischen Darstellung einer kontinuierlich arbeitenden Ultrafiltrationsanlage erläutert.

in der Zeichnung ist der Ultrafiltrationskessen 10

durch eine Mikroporc-n-Filtermembran 14 in einen

oberen Teil 10a zur Aufnahme der wäßrigen Lösung 12

_ des Faponinextrakts und einen unteren TtII lOb zur

""Aufnahme des die Giftstoffe enthaltenden Filtrats ^₁ unterteilt.

, Die Mikroporenfiltermembran 14 kann aus jeder

, herkömmlichen Ultrafiltrationsmembran mit einem ',mittleren Porendurchmesser von nicht unier etwa

1,1 nm und nicht über etwa 2,4 nm bestehen. Geeignete Membranen dieser Art und Standard-Ultrafiltraiionszellen sind im Handel erhältlich.

Die obere Kammer 10a ist mit einem Rührer 16 ausgestattet und besitzt eine Probenzuleitung 18 und über die Leitung 20 einen Lösungsmitteleinlaß. Der Ruhrer 16 kann direkt mit einem Motor oder mit einem im Block 16a befindlichen Rotationsmagneten betrieben werden. Zur Entfernung des giftstoffhaltigen Fiitrats hat die Kammer Wb über die Leitung 22 einen Auslaß.

Die Leitung 20 verbindet die Öffnung 24 in der .Absperrvorrichtung 26 und den Einlaß in die obere Kammer des Ultrafiltrationskessels 10. Die Absperrvorrichtung 26 hat Öffnungen 24,28,30 und 32. In Stellung 1 ist die öffnung 28 mit den Öffnungen 32 und 24 verbunden, in Stellung 2 die Öffnung 28 mit der Öffnung 32 und die öffnung 30 mit der öffnung 24. Die Leitung 34 verbindet den oberen Teil des Lösungsmitteltanks 36 mit der Öffnung 32, die Leitung 38 die öffnung 30 mit idem Inhalt im unteren Teil des Lösungsmitteltanks 36. Die Leitung 40 verbindet eine geeignete Preßgasquelle, z. B. eine Quelle für Preßluft oder komprimierten Stickstoff mit der öffnung 28 der Absperrvorrichtung 26. Die Absperrvorrichtung 26 kann einen Konzenirationsdialyse-Selektor enthalten.

Der Lösungsmitteltank 36 kann aus irgendeinem Druckkessel bestehen. Er hat eine Einlaßvorrichtung 42 zur Aufnahme von größeren Lösungsmittelm^ngen und v/eitere mit den Leitungen 34 und 38 verbundene Eintrittsöffnungen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der schematisch dargestellten Anlage wird zuerst eine wäßrige Lösung eines handelsüblichen Saponinextrakts hergestellt. Die Lösung kann etwa 5 bis 50 und vorzugsweise etwa 20 bis 40% des handelsüblichen Saponinextrakts enthalten. Die Saponinlösung kann z. B. mit destilliertem Wasser oder mit einer normalen Salzlösung hergestellt werden. Diese Lösung wird über die Einlaßleitung 18 in das Innere der Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels gegeben und befindet sich somit über der -Mikroporenfiltermembran 14.

Dann wird das zur Herstellung der wäßrigen Saponinlösung verwendete Lösungsmittel, z. B. destilliertes Wasser oder normale SalzUsun^ Über die Einlaßvorrichtung 42 in den LösungsnrsäEteltank 36 gegeben. Im allgemeinen ist das Vollmers des in den -, Lösungsmitteltank 36 eingefüllten Lösungsmittels mindestens doppelt und vorzugsweise mindest ens 5mal so groß wie das der wäßrigen Saponinlöswing in der Kammer 1Oi/ des Uitrafilirationskesscls 1*0. Anschließend wird die Absperrverrichtung 25 i-s Stellung 2

m gebracht, so daß die öffnung 28 mit der Öffnung 32 und die öffnung 24 mit der öffnung 30 verblinde· 3a ist und der Gasdruck über der Oberfläche des Lösungsmittels 40 im Lösungsmitteltank 36 und der Oberfläche d«er wäßrigen Saponinlösung 12 in der Kammer 10a des Ultrafiltra-

!, tionskessels 10 gleich ist. Der angewandte Gasdruck ist im allgemeinen größer als AtmosphärendruKck und kann in Abhängigkeit von der Porosität dir rvlikroporenfiltermembran 14 schwanken, liegt im allgemeinen aber ^wischen etwa 2 und 10 Atmosphären. J&ei Verwendung

-20,(einer PMIO-Membran (Amicon Corp, of Lexington,

'?Mass.), die entsprechend einem mittleren JRorendurchmesser von 1,8 nm Moleküle bis zu einem K/ÜDlskulargewicht von 10 000 passieren läßt, kann z.B. bei Raumtemperatur ein Druck von 3,52 A. -aimosphären

?.} angewand» werden.

Nachdem sich im Lösungsmitteltank 36 und im Ultrafiltrationskessel 10 erhöhter Drude eingestellt hat und die Absperrvorrichtung 26 in Position Ώ. ist, so daß die Öffnung 28 mit der Öffnung 32 und die Öffnung 30

jo mit der öffnung 24 in Verbindung stersil, wird der Rührmechanismus 16 betrieben, so daß die sin die obere Oberfläche der Mikroporenfiltermembran 14 angrenzende Flüssigkeit dauernd in Bewegungist.
Der Überdruck in der Kammer !Oa des Ultrafiltrationskessels JO bewirkt, daß Lösungsmittel, das niedermolekulare Bestandteile enthält, zu den&ai alle normalerweise im handelsüblichen Saponinextrrakt enthaltenen mikrobielien Giftstoffe gehören, in cEiie Kammer lOb des Ultrafiltrationskessels lö üb&.rgeht. Die Flüssigkeit aus der Kammer iOb wircä in einen Vorratsbehälter übergeführt und über die Leitung 22 verworfen.

Da der D-uck im Lösungsmitteitanli 36 und in der Kammer 10a des Ultrafiltrationskesseis iO gleich groß ist, wird das aus der Kammer Wa austretende Lösungsmittel über die Leitung 38, die \bsjperrvorrichtung 26 und die Leitung 20 durch eine giteich große Lösungsmiitelmenge aus dem Lösunjsmi. tteltank 36 ersetzt. Dieses Verfahren wird so lange dEiirchgetührt, bis die gewünschte Menge Lösungsmittel hüs dem Lösungsmitteltank 36 in die Kammer 10a des Ultrafiltrationskesseis 10 übergeführt ist. Im allgeinaeinen wird mindestens das doppelte Volumen und vorzugsweise mindestens das 5fache Volumen d«r umfänglichen wäßrigen Saponinlösung in der Ksmrr£»er 10a an Lösungsmittel über die Leitung 20 in die Klammer 10a übergeführt. Wenn dies geschehen ist, ist die wäßrige Saponinlösung 12 frei von Giftstoffei un«3 kann zur Auflösung von roten Blutkörperchen in ei ner Serumprobe, die später z. B. einem Bakterienziichtaiingsverfahren unterworfen wird, verwendet werden.

Im allgemeinen kann das Verfallren mit einer Mikroporenfiltermembran durchgeführt ^srerden, die Moleküle mit einem Molekulargewicht vor? etwa600bis 30 000 passieren läßt. Dies ist insofern überraschend, als Saponine an sich nur ein Molekularg«wieSit zwischen 1000 und 2000 haben. Es kann jede- geeignete Mikroporenfiltermembran verwendet werden, die die

Giftstoffe mit einer scheinbaren Molmasse in wäßriger Lösung von etwa 150 bis 600 wirksam abtrennt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können mehr als 99% der Gitstoffe vom Saponin abgetrennt werden. Das so gereinigte Saponin kann zur Hämoiyse in Blutpräparaten für Blutkulturverfahren z. B. das oben beschriebene Mikrofiltrationsverfahren verwendet werden. Es ist auch für die Desaggregierung von Bakterien und Pilzzellen zur genauen Bestimmung der in einer Lösung enthaltenen lebensfähigen Zellen wertvoll. Weiterhin kann es bei der Zellenmembrananalyse •eingesetzt werden, die ein mildes, nichttoxisches Reinigungsmittel erfordert

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

zeit von einer Nacht bei Raumtemperatur wurde die Hämolysefläche bzw. die Ringgröße bestimmt Außerdem wurden alle wäßrigen Saponinlösungen auf ihre bakterielle Toxizität geprüft Diese Prüfung basiert auf der Messung der Rihggröße auf Nährbodenplatten, die mit Staphylococcus aureus beimpft waren. Die Staphylococcus aureus enthaltenden Agarpiatten waren wie folgt hergestellt worden.

20

Es wurden verschiedene handelsübliche Saponinpräparate auf ihre hämoiytische Fähigkeit und auf ihre Toxizität gegenüber Mikroorganismen untersucht. Zu diesem Zweck wurden wäßrige Saponinlösungen hergestellt. Dann wurde die hämoiytische Wirksamkeit unter Zugrundelegung der Ringgröße der Hämoiyse auf Biutagarplatten untersucht. Die Blutagarplatten enthielten 5% Schafblutzellen und Sojaagar mit Trypsinen/ymen. Es wurde jeweils ein halber Milliliter der wäßrigen Saponiniösung auf eine Blutagarplatte gegeben. Beim Diffundieren nach außen hämolysierten die Lösungen die Blutzeilen auf den Platten. Nach einer Inkubations-

(a) Eine 10 ml Agarschicht wurde dadurch hergestellt, daß man 10 g im Handel erhältliche Nährbrühe, 10 g Casarninosäure und 1000 g destilliertes Wasser vermischte und 10 ml dieser Mischung auf eine sterile Platte gab. Die Schicht ließ man härten.

(b) 2 ml einer über Nacht gezüchteten Staphylococcus aureus Kultur wurden mit 100 ml der oben beschriebenen Nährbodenmischung vermischt. Die oben beschriebene Schicht wurde mit 7 ml dieser Mischung überschichtet. Dann wurden kleine Mulden in die Probeplatten geschnitten und mit jeweils 0,1 ml der wäßrigen Saponinlösungen gefüllt. Nach der über Nacht durchgeführten Bebrütung bei 35° C wurden die Ringgrößen gemessen.

Die ermittelte hämolytäsche Wirkung und die bakterielle Toxizität sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle I

Toxizität verschiedener, im Handel erhältlicher Saponine

Probe Nr.	Marke	Reinheit	Charge Nr.	Ringgröße, mm	Wachstums
				Hämoiyse	hemmung
					42,0 mm
1	CaI Bio Chem	analysenrein	200 615	24,15 mm	37,0 mm
2	Nutritional Bio	analysenrein	7 148	24,0 mm
	chemical Corp.				36,0 mm
3	Coulter Diagnostic Corp.	analysenrein	115	26_vy mm	34,0 mm
4	Nutritional Bio	analysenrein	7 123	26,0 mm
	chemical Corp.				20,1 mm
5	Nutritional Bio	chem. rein	6 356	19,0 mm
	chemical Corp.				16,0 mm
6	Baker Chemical Co.	gereinigt	35 395	21,0 mm	9,0 mm
7	Eastman Chem. Co.	chem. rein	7 HA	25,0 mm	9,0 mm
8	Sigma Chem. Co.	analysenrein	g2C-O050	23,0 mm

Aus der Tabelle 1 geht hervor daß die im Handel erhältlichen Saponinpräparate Blut verschieden stark hämolysieren und alle eine gewisse Toxizität gegenüber Mikroben haben. Auffällig ist, daß auch die analysenreinen Präparate einen erheblichen Gehalt an Giftstoffen für Mikroben besitzen. Aufgrund dieser Toxizität können die im Handel erhältlichen Saponine nicht in Blutkulturverfahren verwendet werden.

Beispiel 2

Die in der Tabelle 1 aufgeführten acht wäßrigen Saponinlösungen wurden verschiedenen Gelfiltrationstrennverfahren unterworfen. Die getrennten Bestandteile wurden auf ihre hämoiytischa Wirkung und ihre bakterielle Toxizität untersucht

Zuerst wurden drei Säulen hergestellt Die erste Säule wurde mit Sephadex G-10, einem vernetzten Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), gefüllt Sephadex G-i0 ist durchlässig für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von etwa 700. Die zweite Säule wurde mit Sephadex G-75 gefüllt, einem vernetzten Dextran, das für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von etwa 50 000 durchlässig ist.
Die dritte Säule wurde mit Bio-Gel P2, einem

vernetzten Acrylamid (Firma Βίο-Rad, Inc.) hergestellt. lO°/oige Lösungen verschiedener Eichstoffe für die

Βίο-Gel P2 ist durchlässig für Moleküle mit einem Säulen hergestellt und 0,2 ml dieser Lösungen auf die

Molekujä'rgewichtbis zu etwa 1800. ' Säulen gegeben.- Die Arbeitsbedingungen und die

Das Sephadex* G^lO und das Bio-Gel P2 iieß man 3 verwendeten Standards zur Eichung der Säulen sind in Stunden in 'entionisiertem Wasser quellen, das Sephadex 5 Tabelle II wiedergegeben. G-75 in Ö,9%iger Natriumchjöndiösurig. Es wurden

Tabelle II

Sephadex G-IO

Sephadex G-75

Bio-Gel P-2

Höhe	23,0 cm	27,0 cm	54,0 cm
Durchmesser	1,5 cm	1,5 cm	0,9 cm
Durchsatz	0,8 ml/min	0,3 ml/min	0,5 ml/min
V₀ (Blaues Dextran)	8,5 ml	13,0 ml	9,5 ml
V₁	40,6 ml	48,0 ml	34,0 ml
y,	20,0 ml	33,0 ml	17,8 ml
^CoCIj	19,0 ml	39,0 ml	30,0 ml
V_} 450 (Bacitracin)*)	-	36,0 ml	-
^2 5oo(CytochromC)*)	-	24,0 ml	-
^7 8oo(Myoglobin)*)	-	22,0 ml	-
^5 000 (-Chymotrypsin)*)	-	21,0 ml	-

V₀ = Leervolumen, bestimmt vom Mittelpunkt des Maximums für das blaue Dextran.

V₁ = Säulenvolumen.

V₁ = berechnetes Volumen für einen vollständig aufgenommenen Stoff

Wr = zurückgewonnenes Wasser, d = Dichte.

*) Austretendes Volumen (Volumen der aus der Säule austretenden Lösung, die die Verbindung mit dem im Index angegebenen Molekulargewicht enthält).

AHe acht handelsüblichen Saponinpräparate gemäß 4ΰ .Beispiel 1 ließ man über die drei Säulen laufen. Die Saponinproben bestanden aus ungefähr 0,2 ml einer 40%igcis Lösung des jeweiligen Saponine in dem zum Quellen der Säulenfüllung verwendeten Lösungsmittel. Zum Eluieren wurde ebenfalls das zum Quellen verwendete Lösungsmittel verwendet. Das Eluat wurde in einem LKB-UItrafiltrationssammler aufgefangen ui.d ein 280-MU-Profil wurde automatisch aufgezeichnet. Nach dem Auffangen von V₀ (Leervolumen) aus jeder Säule in jedem Versuch wurden Fraktionen von einem halben Milliliter gesammelt und nach dem Verfahren des Beispiels 1 auf ihre hämolytische Wirksamkeit und ihre Wachstumshemmwirkung gegenüber Bakterien untersucht. Die Tabellen 3 und 4 geben die Ergebnisse wieder.

Tabelle 3

K_d und ungefähre Molekulargewichte der antimikrobiellen Giftstoffe in verschiedenen handelsüblichen Saponinpräparaten.

Molekular- Kf)
gewicht

Probe

Nr.

Säule

Sephadex

165	0,75	2	G-10
190	0,67	2	G-10
180	0,70	4	G-IÖ

Molekulargewicht

Probe

Nr.

Säule

175	0,72	1	G-10
175	0,72	1	G-10
180	0,70	1	G-10
150	0,80	3	G-10**)
580	0,10	6	G-10
145	0,87	4	P-2
162	0,84	3	P-2
155	0,86	1	P-2

g;₀

*) Der Verteilungskoefilzient für einen gelösten Stoff zwischen dem Wasser in den Gelkörnchen und dem umgebenden Wasser, wird mit Kj bezeichnet. Eine Substanz mit einem K₁J = 0 kann nicht in die Gelkörnchen eindringen und eine Substanz mit einem Kj - 1 hat freien Zugang zu dem sich in den Gelkörnchen befindenden Wasser.

V₁

wobei K^dasElutionsvolumen der betreffenden Substanz, V₁ das Wasservolumen innerhalb der Gelkörnchen und Y₀ das Wasservolumen außerhalb der Gelkörnchen ist. **) Mit 0,9%iger Natriumchloridlösung.

9 10

Tabelle 4

Kj und ungefähre Molekulargewichte verschiedener handelsüblicher Saponinpräparate.

Probe Nr.	Sephadex G-IO Molekulargew.	Kä	Sephadex G-75 Molekulargew.	30 000	-	Bio-Gel P-2 Mclekulargew.	K_d
2	>700	0,0	-	>50 000 3 000	0,10	>1800	0,0
4	>700	0,0	> 50 000	0,0 0,6	>1 800	0,0
1	>700	0,0	10 000	0,0	>1 800	0,0
3	>700	0,0	> 50 000	0,2	> 1 SOO	0,0
8	>700	0,0	>50 000	0,0	>1800	0,0
6	>700	0,0	> 50 000	0,0	>1800	0,0
7	>700	0,0		0,0	>1 800	0,0
5	>700	0,0	>1800	0,0

Wenngleich die Gelfiltration keine genaue Bestimmung des Molekulargewichtes ermöglicht, kann die Molekulargröße der Saponine und der mikrobiellen Giftstoffe in vernünftiger Weise durch Vergleich mit den Standards in den Säulen mit bekannten Molekulargewichten abgeschätzt werden. Aus der Tabelle 3 geht hervor, daß die antimikrobiellen Giftstoffe in den meisten Proben ein ungefähres Molekulargewicht zwischen etwa 140 und 200 besitzen. Die Probe 6 enthielt einen Giftstoff mit einem beträchtlich größeren IMolekulargewL-ht, z. B. von etwa 550 bis 600.

Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, verhalten sich die ■ Saponine so, als ob ihr scheinbares Molekulargewicht größer als 700 in der Sephadex G-10-SäuIe und größer als 2000 in der Bio-Gel P-2-Säule ist. In der Sephadex G-75-Säule verhalten sich alle Saponine der Proben 2 bis 7, als ob sie ein Molekulargewicht von über 10 000 hätten. Bei der Probe 1 verhielt sich der Hauptanteil des Saponins (80%) so, als ob er ein Molekulargewicht von über oder gleich 50 000 hätte, und ein geringerer Anteil (20%) so, als ob er ein Molekulargewicht zwischen 2000 und 4000 hätte.

Die obigen Gelfiltrationswerte zeigen, daß der überwiegende Teil der Saponinmoleküle in wäßriger Lösung eine scheinbare Molinasse von über 10 000 hat, und daß die in den handelsüblichen Präparaten enthaltenen antimikrobiellen Giftstoffe ein Molekulargewicht zwischen 140 und 200 haben.

Beispiel 'J

Es wurde eine ähnliche Anlage wie in der Abbildung aufgebaut, in der der Ultrafiltrationskessel 10 eine mit einem Rührer versehene Ultrafiltrationszelle (Modell 52 Amicon) und die Absperrvorrichtung 26 ein Konzentrationsdialyse-Selektor CDS 10 (Amicon) war. Es wurden Lösungen' von 3 im Handel erhältlichen Saponinen hergestellt. Die Konzentration betrug 20%. Die Ultrafiltrationszelle war, mit einem 2 Liter Lösungsmiiteltank 36 verbunden. Es wurde ungefähr 1 Liter normale Salzlösung in den Lösungsmitteltank 36 gegeben. Dann wurden verschiedene Versuche mit 20 ml Proben der oben beschriebenen Lösungen von handelsüblichen Saponinen durchgeführt. Bei jedem Versuch wurde mit Preßluft ein Druck von 3,52 Atmosphären erzeugt und die Anlage wie oben beschrieben, so lange betrieben, bis das 5fache Volumen (100 ml) das System durchströmt und über die Leitung 22 verlassen hatte. Die Versuche wurden mit verschiedenen Mikroporenfiltermembranen 14 durchgeführt. Es wurden speziell die in der Tabelle 5 angegebenen Membranen verwendet.

Tabelle 5

Membrantyp
(Amicon Corp.)

L ngefahrer mittlerer

Porendurchmesser

nm

Durchlässigkeitsgrenze
(Molekulargewicht)

UM05	1.1	500
UM2	1,2	1000
PMlO	!,8	10 000
PM30	2,4	30 000

Sowohl die aus der Leitung 22 austretende Lösung als

so auch die in der Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels i0 zurückbleibende Lösung 12 wurden gemäß Beispiel 1 auf ihre hämolytische Wirksamkeit geprüft. Daraus wurde der Prozentsatz des Saponinverlustes während der Dialyse bestimmt. Die Empfindlichkeit dieser Bestimmung war auf >5% Verlust begrenzt. Die Tabelle 6 gibt die Ergebnisse wieder.

Tabelle 6

% Saponinverlust bei der Dialyse mit verschiedenen Ultrafiltrationsmembranen.

Reinheitsgrad UM05 UM2

PMlO PM30

CaI Bio Chem

Nutritional Biochemical Corp.

Coulter Chemical Co.

analysenrein analysenrein

analysenrein 7,5%

Wie aus der Tabelle 6 hervorgeht, wird die Hauptmenge der Saponinmoleküle von der Membran PMlO nicht durchgelassen, während die Membran PM30 eine geringe Menge durchzulassen scheint. Da die Durchlässigkeitsgrenze für die Membran PMlO ein Molekulargewicht von etwa 10 000 und für die Membran PM30 ein Molekulargewicht von etwa 30 000 ist, ergeben diese Werte, daß Saponine in wäßriger Lösung bei Verwendung dieser Ultrafiltrationsmembranen eine scheinbare Molmasse zwischen 10 000 und pt 50 000 besitzen.

B e i s ρ i e 1 4

Die Versuche gemäß Beispiel 1 wurden mit der

/Abweichung wiederholt, daß nur 10 ml der_; SaponinlÖ-sung in die Ultrafiltrationszelle des KesselsJIO gegeben

wurden: Die "Anlage wurde so lange betrieben; bis das

,. ^:5fache Volumen (50ml) Lösungsmittel die Membran

^passiert hatte. Die Lösung in der Kammer 10a des <;LJltrafiltrationskessels 10 und die ausgetretene Lösung '!wurden dann gemäß' Beispiel 1 auf ihre antibakterielle

Wirksamkeit geprüft. Tabelle
wieder.

Tabelle 7

7 gibt die !^Ergebnisse

% antibakterielle Giftstoffe, die verschiedene Ultrafiltrationsmembranen passierten.

Marke

UM05

UM2

PMlO

PM30

Galbiochem	>99%	>99% >9$
NBC	>99%	>99% >9S
Coulter	>99%	>99% ' >9i
>^αΛ, >99%
y°>i» >99%
»Ääß >99%

Die Ergebnisse zeigen, daß keinesVcler vferwendeten ^Filter die Giftstoffe in fnerk!^:rher (ü.erige. ^li'rückhielt. Da die Durchläsäigkeitsgrenze der _;v». aiKr-n ein ^Molekulargewipht von etwa 500; ist, Sycghcineir die Giftstoffe in wäßriger Lösung eine scheinbsiri: Molmasse von unter 500 zu haben.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

'it / T t Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Saponieii, die für die Hämolyse von roten Blutkörpchen in auf mikrobielle Erreger zu untersuchenden Blutproben geeignet sind, aus an Saponinen reichen Extrakten, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Anwendung an sich bekannter Trennme-

Eigenschaft werden in hämatologischen Laboratorien Saponine zur Entfernung der roten Blutkörperchen verwendet, wenn deren Gegenwart störend ist. z. B. bei Hämoglobinbestimmungen und Auszählungen der weißen Blutkörperchen.

Die handelsüblichen Saponine eignen sich jedoch nicht für die Hämolyse von roten Blutkörperchen in Blut, das zum Nachweis pathogener mikrobieller Erreger einem Blutkulturverfahren unterworfen wird,

thoden aus dem Saponinextrakt die für die ίο weil diese Saponine für die nachzuweisenden mikrobiel-

mikrowellen Erreger toxischen Substanzen mit einer scheinbaren Molmasse in wäßriger Lösung von unter e:wa 600 entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des Saponinextraktes herstellt, die wäßrige Lösung zur Entfernung der Toxine durch eine Filtermembran mit einer mitlieren Porengröße von nicht unter etwa 1,1 nm und nicht über etwa 2,4 nm filtriert und das gereinigte Saponin gewinnt.

len Erreger stark toxisch sind.