DE69821002T2 - Verbesserte lager- und haltbarkeit von blutprodukten - Google Patents

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Lagerstabilität und die verbesserte Lebensfähigkeit von Blutprodukten, die Thrombozyten enthalten, und dgl. Spezifischerweise wird ein Verfahren zur Ausdehnung der Lebensfähigkeit dieser Produkte wie auch ihre Beständigkeit gegenüber membranschädigenden Mitteln, z. B. Strahlung, bereitgestellt, indem die Produkte in einer Suspension gelagert werden, die eine wirksame Menge an L-Carnitin oder Alkanoyl-L-carnitinen umfaßt.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Wachsende Sorge haben sowohl die nationale wie auch die weltweite Blutvorräte bereitet. Sowohl die Integrität wie auch die Zuverlässigkeit existierender Vorräte und die Fähigkeit, im Laufe der Zeit größere Vorräte aufzubauen, wurde infrage gestellt. Ein Grund dafür ist der relativ kurze Zeitraum der Lagerstabilität von Blutprodukten. Derzeit sind abgepackte RBCs (Erythrozyten-Konzentrate oder RCC) die vorherrschende Form für Blutprodukte für Transfusionen und dgl. und sind auf einen 42-Tage-Lagerungszeitraum begrenzt. Nach dieser Zeit fallen die ATP-Spiegel deutlich ab, verbunden mit einer deutlichen Abnahme des pH, was ein Fehlen der Lebensfähigkeit deutlich anzeigt, oder, wenn sie lebensfähig sind, eine extrem kurze Kreislaufzeit nach Infusion anzeigt. In vivo wird Vollblut nicht für wesentliche Zeiträume gelagert. Für Thrombozyten ist der gängige Lagerungszeitraum noch kürzer, und zwar liegt der Standard bei 5 Tagen bei 22°C. Der Unterschied bei der Lagerungsstabilität von Thrombozyten-Konzentrationen (PC) im Gegensatz zu RBC liegt darin, daß in Thrombozyten metabolische Reaktionen weitergehen, und zwar zum Teil infolge des Vorliegens von Mitochondrien in PC und deren Abwesenheit in RBCs. Während beide Blutprodukte einen Abfall beim ATP, verbunden mit einem Absinken beim pH, im Laufe der Zeit zeigen, was von der Produktion von Milchsäure begleitet ist, so verschlimmert das Vorliegen von Mitochondrien in PC das Problem infolge einer Glycolyse noch.
• Gleichzeitig wurden Bedenken bezüglich der Zuverlässigkeit und Integrität der Blutversorgung laut. Es wurde insbesondere wiederholt eine Kontamination der Blutvorräte mit Bakterien oder anderen mikrobiologischen Agenzien oder Viren nachgewiesen. Eine derartige Situation ist in Ländern mit weniger hochentwickelten Sammel- und Lagerverfahren noch schlimmer. Obgleich Agenzien den gesammelten Produkten zur Verringerung einer Kontamination zugesetzt werden können, so sind diese nicht wünschenswert, da die Produkte zurück in Empfängerpatienten transfusioniert werden. Eine wünschenswerte Alternative ist eine Bestrahlungsbehandlung der Produkte nach dem Verpacken, typischerweise in elastizierten Vinylkunststoffbehältern. Eine solche Bestrahlungsbehandlung würde eine RBC- und PC-Lagerung erschweren, was zu einer verringerten Funktion dieser Zellen führen würde.
• Außerdem ist ein geringer, aber wachsender Teil der blutempfangenden Bevölkerung dem Risiko eines im allgemeinen gefährlichen Krankheitsbildes ausgesetzt, das als Transfusion Associated Graft Versus Host-Krankheit (TAGVHD) bekannt ist und das infolge des Vorliegens lebensfähiger allogener Leukozyten auftritt. Dieses Syndrom tritt typischerweise bei Patienten mit Immunsupression, z. B. bei Krebs- und Knochenmarkstransplantat-Patienten auf, kann aber auch bei immumkompetenten Personen bei Entwicklung von restringiertem Human Leukocyte Locus A (HLA)-Polymorphismus in der Bevölkerung auftreten.
• Sehr große Aufmerksamkeit wurde auf das Auffinden von Verfahren zur Ausdehnung der Lagerstabilität gerichtet. Ein solches Verfahren zur Ausdehnung der Lagerungszeit von PC wird im US-Patent 5 466 573 beschrieben. Dieses Patent richtet sich auf die Bereitstellung von PC-Präparationen mit Acetationenquellen, die sowohl als Substrat für eine oxidative Phosphorylierung als auch als Puffer, um einer pH-Erniedrigung infolge der Milchsäureproduktion entgegenzuwirken, wirken. Ein solches Verfahren wirkt nicht direkt auf das Hämolyseproblem und den Membranzusammenbruch. Ein alternatives Verfahren wird in dem der Allgemeinheit erteilten US-Patent 5 496 821 beschrieben. In diesem Patent wird Gesamtblut in einer Präparation, die L-Carnitin (LC) oder Alkanoyl-Derivate davon enthält, gelagert. Das Patent beschreibt allerdings nicht die Wirkungen auf Blutprodukte wie z. B. PC- oder RBC-Suspensionen und beruht zu gewissem Grad auf dem Einfluß von LC auf die Plasma-Charakteristika.
• Wie oben beschrieben wurde, ist die Kontamination von Blutkonserven mit mikrobiologischen Agenzien oder Viren ein anderes Problem, dem sich die medizinische Gemeinschaft zuwenden muß. Ein Verfahren zur Sterilisierung des Produktes und zur Verbesserung der Zuverlässigkeit bezüglich einer Kontamination besteht darin, das Blutprodukt zu bestrahlen. Im allgemeinen sind gamma-Bestrahlungswerte von etwa 25 Centigray (cG), die das Produkt nach seiner Versiegelung in einem Kunststoff-, Glas- oder anderen Behälter bestrahlen, wünschenswert. Bedauerlicherweise induziert eine Bestrahlung Membranläsionen mit Hämolyse in RBCs. Eine Bestrahlung von Blutprodukten, einschließlich Vollblut, abgepackten RBCs und PCs bringt weitere Probleme mit sich.
• Dementsprechend besteht eine Aufgabe für den Fachmann auf diesem Gebiet weiter, nämlich die Bereitstellung eines Verfahrens, um den Zeitraum der Lebensfähigkeit und die Zirkulationshalbwertszeit für RBCs und PCs nach Transfusion über die derzeitigen Maximalwerte hinaus auszudehnen. Außerdem bleibt es für die Fachleute auf diesem Gebiet ein Ziel, einen Weg zu finden, durch den Blutprodukte, einschließlich Vollblut, abgepackte RBCs und PCs, durch Bestrahlung sterilisiert werden können, und zwar ohne wesentliche Membranschädigung und -läsionen und ohne Hämolyse.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Der Anmelder hat durch ausgedehnte Untersuchungen festgestellt, daß die Membranschädigung, die PCs bei Lagerung oder durch Bestrahlung erfahren, wesentlich verzögert und supprimiert werden kann, indem das Blutprodukt in einer herkömmlichen Konservierungslösung, z. B. AS-3, suspendiert wird, wobei die Konservierungslösung außerdem L-Carnitin oder ein Alkanoyl-Derivat davon in einer Konzentration von 0,25 bis 50 mM oder mehr enthält. Diese Entdeckung des Anmelders liegt in der Erkenntnis, daß der größte Teil der Zersetzung von Blutprodukten, die herkömmlicherweise mit einer Abnahme bei den ATP-Spiegeln und einer Senkung des pHs verbunden ist, tatsächlich eine Membranschädigung und Hämolyse nach sich ziehen kann. Eine Membranerhaltung und -reparatur kann durch eine Lipid-Reacylierung erfolgen, die teilweise durch L-Carnitin durchgeführt wird, dessen irreversible Aufnahme in PC durch erfinderische Untersuchungen entwickelt wurde.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung verwendet L-Carnitin und seine Alkanoyl-Derivate als Mittel, das eine Zellmembranerhaltung und -reparatur und eine Suppression der Hämolyse in Blutprodukten unterstützt. Alkanoyl-L-carnitine umfassen Acetyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl-, Isovaleryl- und insbesondere Propionyl-L-carnitin. Hier wird diese Familie allgemein als LC bezeichnet und eine Exemplifizierung erfolgt als L-Carnitin. Die beschriebenen Alkanoyl-L-carnitine und ihre pharmakologisch annehmbaren Salze können allerdings anstelle von L-Carnitin eingesetzt werden.
• Der Zusatz von LC zu Blutprodukten, einschließlich PCs, erfordert es, daß LC in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, daß eine Membranerhaltung und -reparatur möglich ist. Die durchgeführten Untersuchungen, einschließlich der unten angeführten Beispiele, haben bewiesen, daß der effektive Mindestbereich für die Produkte von meisten Spendern etwa 0,25 mmol bis 0,5 mmol ist. Die Obergrenze ist eher praktisch als physiologisch zu sehen. Eine Konzentration in der Höhe von 50 mmol oder größer wird leicht toleriert. Werte, die toxikologische und osmologische Aspekte berücksichtigen, sind akzeptabel. Bevorzugte Bereiche sind 1 bis 30 mM. Ein Bereich von 1 bis 10 mM oder mehr ist geeignet, wobei Werte zwischen 4 und 6 mM einen deutlichen Unterschied ausmachen. Die erfindungsgemäßen Effekte, einschließlich der Verlängerung der Lebensfähigkeit und der Ausdehnung der Zirkulationshalbwertszeit nach Transfusion, können in hohem Maße vom Spender abhängen. Verallgemeinert ausgedrückt, eine entsprechende wirksame Konzentration an LC ist 0,5 bis 50 mM. Allerdings kann der Arzt auf dem Fachgebiet genötigt sein, diesen Bereich in jeder Richtung auszudehnen, was von den Besonderheiten des Spenders abhängt. Solche Ausdehnungen erfordern keine erfinderischen Anstrengungen.
• LC entspricht herkömmlichen Trägerlösungen (stabilisierenden Lösungen), die typischerweise hergestellt werden, um eine Pufferungswirkung bereitzustellen. Üblicherweise verwendete Lösungen umfassen ACED (Zitronensäure-Natriumcitrat-Dextrose), CPD (Citrat-Phosphat-Dextrose) und Modifikationen davon, einschließlich CPD2/A-3 und verwandte Zusammensetzungen. Typischerweise umfaßt die Zusammensetzung ein Kohlenhydrat, z. B. Glucose oder Mannit, mindestens ein Phosphatsalz, ein Citrat und andere ausgleichende Salze. LC ist herkömmlicherweise löslich und kann diesen Zusammensetzungen innerhalb des erforderlichen Bereichs frei zugesetzt werden.
• Geeignete Lösungen werden im US-Patent 5 496 821 beschrieben. Allerdings können andere Trägerlösungen als die herkömmlicherweise verwendeten eingesetzt werden, einschließlich künstlichem Plasma und anderen physiologisch annehmbaren Lösungen, vorausgesetzt sie umfassen LC in Übereinstimmung mit der Erfindung. Die wichtige Komponente der Trägerlösung ist LC.
• Die Fähigkeit von LC, wenn es in der Suspension von PCs enthalten ist, die lebensfähige Zeit und daher die Lagerdauer auszudehnen und den Zirkulationszeitraum nach Transfusion in das Empfängerindividuum zu verlängern, wird nachfolgend durch in vitro- und in vivo-Untersuchungen beispielhaft erläutert. Die Untersuchungen verwenden LC, es können aber auch andere Alkanoyl-L-carnitine verwendet werden. Von besonderer Bedeutung ist die Demonstration, daß die verbesserte Leistungsfähigkeit durch verbesserte Aufrechterhaltung (einschließlich Reparatur) der Zellmembran und Suppression einer Hämolyse erreicht wird.
• BESTRAHLUNG
• Das Problem einer Kontamination von Blutprodukten, einschließlich PC, mit Bakterien oder anderen mikrobiologischen Agenzien oder Viren kann durch Bestrahlung um eine wesentliche Menge reduziert werden. Bestrahlungslevel, die zur Sterilisation und zu einer im wesentlichen 100%igen Mortalität der vorgenannten kontaminierenden Agenzien notwendig sind, wurden in großem Umfang untersucht.
• Außerdem, was noch wichtiger ist, können Leukozyten durch eine ähnliche Bestrahlung zerstört werden. Es kann eine Vielzahl von Bestrahlungstypen verwendet werden, einschließlich gamma-Strahlung (Cobalt GG, Van de Graf-Beschleunigung), UV-Bestrahlung, Bestrahlung mit Rotlicht, usw. Ein enges Äquivalent zu etwa 20 bis 50 cG gamma-Bestrahlung ist ausreichend.
• Weltweit werden jährlich zwischen 60 und 80 Millionen Einheiten Vollblut gesammelt und bei der Transfusionsunterstützung einer Vielzahl von Patientengruppen verwendet. In den unterentwickelten Ländern sind die Sammlungsraten pro 1000 Bewohner niedriger und die meisten Bluttransfusionen werden bei der Behandlung bei Geburten und in der Kinderheilkunde, insbesondere bei mit Malaria verbundener Anämie, gegeben. In den entwickelten Ländern sind die Sammlungsraten pro 1000 Einwohne 50- bis 10-mal höher und die meisten Transfusionen werden bei einer Operation (50%) oder bei der Behandlung von Patienten mit einer mit Krebs assoziierten Anämie, mit Knochenmarkstransplantation, nicht-bösartiger gastrointestinaler Blutung gegeben (1). Es gibt viele potentielle nachteilige Wirkungen, die mit der Transfusion von allogenem Blut verbunden sind. Eine besondere Komplikation, die in nachteiliger Weise mit Bluttransfusion verbunden ist, ist die seltene und üblicherweise letale Transfusion assiciated graft versus host-Krankheit (TA-GVHD), eine Komplikation, die durch lebensfähige allogene Immunocyten vermittelt wird.
• TA-GVHD-Krankheit ist eine seltene Komplikation bei Bluttransfusion, die potentiell bei zwei Typen von Bluttransfusion erhaltenen Patientengruppen zu sehen ist. TA-GVHD hat eine Mortalität, die fast 100% ist, und die Prävention ist derzeit der einzig wirksame Ansatz. Erstens, bei Patienten mit angegriffenem Immunsystem, z. B. Patienten nach einer Knochenmarkstransplantation oder einer anderen Organtransplantation, mit Hodgkins-Krankheit oder mit erblichen Defizienzien des Immunsystems. Zweitens bei Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem, wenn eine HLA-Ähnlichkeit zwischen Blutspender und Blutempfänger existiert. Dies wird oft bei direkten Spenden von nahen Verwandten oder bei Bevölkerungsgruppen mit beschränkterem HLA-Polymorphismus wie in Japan und Israel beobachtet. In Anbetracht dieser Tatsache ist es allgemeine Praxis, zelluläre Blutprodukte mit gamma-Bestrahlung bis zu einer mittleren Dosis von etwa 25 Centigray (cG) zu bestrahlen, um die Replikationsfähigkeit von lebensfähigen Immunozyten zu zerstören. Es sollte betont werden, daß TA-GVHD mit zellulären Produkten assoziiert sind, die frisch sind, d. h. im allgemeinen weniger als 15 Tage alt. Allerdings ist ein "Altern" von Blut noch keine akzeptierte Praxis bei der Verhinderung dieser Komplikation. Obgleich die Immunozyten Teil der allogenen Leukozytenpopulation sind, wird der Grad an Leukoverarmung, der derzeit mit der dritten Generation von Filtern erreicht wird, nicht zur Verhinderung dieser Komplikation nicht als adäquat angesehen. Somit bleibt gamma-Bestrahlung derzeit die einzige akzeptierte prophylaktische Intervention.
• Was Thrombozyten-Produkte angeht, so wurde von einem gewissen Verlust bei der Lebensfähigkeit berichtet.
• Ein klarer Beweis gibt an, daß gamma-Bestrahlung ihrer Wirkungen durch Erzeugung von aktivierten Sauerstoffspezies, z. B. Singulett-Sauerstoff, Hydroxy, Radikal und Superoxidanion, erzeugt. Diese Spezies induzieren eine intrazelluläre Schädigung an DNA, was eine Zellreplikation verhindert, eine Voraussetzung für TA-GVHD. Allerdings kann dieselbe Sauerstoffspezies die Thrombozyten-Membran oxidieren, was eine Membranläsion induziert, die die Qualität (Wirksamkeit) des zellulären Produkts reduziert.
• L-Carnitin spielt bekannterweise eine Schlüsselrolle beim Transport von langkettigen Fettsäuren durch die Mitochondrien-Membran. Erbliche Krankheiten, bei denen das Carnitinsystem beim Transport langkettiger Fettsäuren versagt, führen zu einer deutlichen Beeinträchtigung bei der Skelettmuskelfunktion.
• L-Carnitin oder die vorher genannten Alkanoyl-L-carnitine können verwendet werden, um durch Bestrahlung induzierte Membranläsionen außer Kraft zu setzen oder zu verhindern.
• Um die PC-Anfälligkeit für Membranläsionen und Hämolyse zu begrenzen, kann das Blutprodukt zuerst in einer Lösung suspendiert werden, die L-Carnitin oder eines der vorgenannten Alkanoyl-L-carnitine in einer Menge von 0,25 mM bis 50 mM enthält. Die Zellmembranerhaltung und die Suppression von Hämolyse wird zu einem ausreichenden Grad erreicht, so daß das versiegelte Produkt zu Zwecken der Sterilisation bestrahlt werden kann und danach eine ausgedehnte Lagerungszeit und Zirkulationshalbwertszeit nach Transfusion hat. Es kann eine Lebensfähigkeit in der Größenordnung üblicher Lebensfähigkeiten erzielt werden, wobei Materialien steriler sind und es unwahrscheinlich ist, daß sie TA-GVHD einführen, und zwar infolge der Bestrahlung nach dem Versiegeln der Blutproduktsuspension. Der Ausdruck Blutprodukt ist in diesem Zusammenhang so zu interpretieren, daß er PC umfaßt.
• Variationen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf diesem Gebiet ohne erfinderische Leistung einfallen. Insbesondere können wechselnde stabilisierende Zusammensetzungen, Blutprodukte, Konservierungsstoffe, Inhibitoren und dgl. ohne erfinderische Leistung des Fachmanns modifiziert werden. Außerdem werden spezifische Niveaus, Lebensfähigkeitszeiträume und Zirkulationshalbwertszeit von Spender zu Spender und von Empfänger zu Empfänger variieren. Solche Variationen liegen innerhalb des Rahmens der Erfindung, wenn sie durch die Angaben der Ansprüche, die unten ausgeführt sind, nicht spezifisch ausgeschlossen sind.

Claims (10)

1. Verfahren zur Verbesserung der Membranerhaltung und der Unterdrückung einer Hämolyse bei einer Lagerung von Thrombozyten-Konzentrat (PC), umfassend Suspendieren des PC in einer Trägerlösung, die ein Carnitin-Produkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Carnitin (LC), Alkanoyl-L-carnitinen und den pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben und Gemischen derselben, in einer Menge umfaßt, die wirksam ist, um die Fähigkeit des PC, die Membran der Thrombozyten zu erhalten und dadurch eine Hämolyse zu unterdrücken, im Vergleich zu einer identischen Trägerlösung, der das L-Carnitin, die Alkanoyl-L-carnitine oder die pharmakologisch annehmbaren Salze derselben und Gemische derselben fehlen, zu verbessern.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das L-Carnitin, die Alkanoyl-L-carnitine und Gemische derselben in einem Bereich von 0,25 bis 50 mM vorliegen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das L-Carnitin, die Alkanoyl-L-carnitine und Gemische derselben in einer Menge von 1 bis 20 mM vorliegen.
4. Versiegelter Behälter mit PC in einer stabilisierenden Lösung, wobei die stabilisierende Lösung L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitin und Gemische derselben in einer Menge von 0,25 bis 50 mM umfaßt.
5. Versiegelter Behälter nach Anspruch 4, wobei der Behälter nach dem Versiegeln bestrahlt wurde, um ihn im wesentlichen zu sterilisieren und Leukozyten darin zu zerstören.
6. Verfahren, um PC im wesentlichen zu sterilisieren, umfassend Suspendieren des PC in einer Trägerlösung, wobei die Lösung LC in einer Menge von 0,25 bis 50 mM umfaßt, und Bestrahlen des Blutproduktes nach Versiegeln des Produktes in dem Behälter, um so das Blutprodukt im wesentlichen zu sterilisieren.
7. Verfahren zur Behandlung von PC, um Leukozyten darin zu unterdrücken, umfassend Bestrahlen des PC in einer Trägerlösung, die LC in einer Menge von 0,25 bis 50 mM umfaßt, um so Leukozyten in der Probe im wesent lichen zu zerstören, während eine Schädigung an Membranen des PC unterdrückt wird.
8. Verfahren zur Verbesserung der Membranerhaltung und der Unterdrückung einer Hämolyse bei Lagerung eines Thrombozyten-Konzentrats (PC) nach Bestrahlung desselben zum Zwecke einer Zerstörung von Immunozyten darin, umfassend Suspendieren des PC in einer Trägerlösung, wobei die Trägerlösung ein Carnitin-Produkt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitinen und Gemischen derselben, in einer Menge umfaßt, die wirksam ist, um die Fähigkeit des PC, die Membran der Thrombozyten zu erhalten und dadurch eine Hämolyse zu unterdrücken, im Vergleich zu einer identischen Trägerlösung, der das L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitin und Gemische derselben fehlen, zu verbessern.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 6, 7 und 8, wobei das Alkanoyl-L-carnitin aus der Gruppe, umfassend Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin, ausgewählt wird.
10. Versiegelter Behälter nach Anspruch 4 und Anspruch 5, wobei das Alkanoyl-L-carnitin aus der Gruppe, umfassend Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl- und Isovaleryl-L-carnitin, ausgewählt wird.