DE69922362T2

DE69922362T2 - Methode zur präparation eines diafiltrierten stabilen blutproduktes

Info

Publication number: DE69922362T2
Application number: DE69922362T
Authority: DE
Inventors: Louis Summaria; Nathan Roth; Aberash Berhe; Mark Even
Original assignee: ZLB Behring LLC
Current assignee: CSL Behring LLC
Priority date: 1998-04-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-02-27
Also published as: DE69922362D1; EP1073443A1; ES2233024T3; KR20010071184A; CA2330389A1; ATE283699T1; US6139878A; KR100609262B1; JP2002512968A; AU2777799A; EP1073443B1; WO1999055346A1; CA2330389C; EP1073443A4; JP5042405B2; AU760292B2; JP2012144556A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Blutprodukte und Methoden zu ihrer Herstellung. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung von stabilen Blutprodukten durch Diafiltration.
Beschreibung des Standes der Technik
Plättchen sind kernlose Zellen, die in ruhender Form im Blut zirkulieren. Sie sind der zelluläre Bestandteil des Blutkoagulationsmechanismus. Bei einer Gefäßverletzung werden die Plättchen stimuliert und lagern sich an der verletzten Gefäßwand an, woraufhin sie eine komplexe Reihe von biochemischen und morphologischen Veränderungen durchlaufen, die zur Sekretion von im Granula gespeicherten Bestandteilen und der Bildung von Plättchenaggregaten führen. Plättchenadhesion und -aggregation führen in Wechselwirkung mit Fibrin zur Bildung eines primären Plättchenpfropfes. Die Plasmakoagulation wird weiterhin beschleunigt durch die vermehrte Freisetzung von Phospholipiden aus der Plättchenmembran, an deren Oberfläche sich Gerinnungsfaktoren konzentrieren, und die an der verletzten hämorrhagischen Stelle gerinnungsfördernde Proteine aktivieren.
Heutzutage werden Plättchen in der klinischen Praxis verwendet, um verschiedene Zustände zu behandeln, darunter auch hämorrhagischer Schock und Thrombozytopenie. Thrombozytopenie bezeichnet eine abnormal kleine Anzahl von Plättchen im Blutkreislauf. Dieser Zustand kann bei Patienten durch die Verwendung von Heparin, Infektionen, Auto-Antikörpern, Malaria, Lymphome, Hepatitis, Strahlungen und chemotherapeutische Wirkstoffe herbeigeführt werden.
Ferner kann die Verabreichung eines Plättchenpräparates dazu dienen, bestimmte genetische Störungen zu behandeln, die zu einer Beeinträchtigung der Plättchenfunktion führen. Außerdem können diafiltrierte stabile Blutproduktpräparate bei der chirurgischen Behebung von Traumata mit erheblichem Blutverlust verwendet werden, zum Beispiel bei der Behandlung von Patienten mit Schussverletzungen oder Opfern einer Messerstecherei.
Die gängige Therapie der therapeutischen Blutprodukttransfusion wird in der klinischen Praxis durch die kurze Haltbarkeit (fünf Tage) flüssiger Plättchenoder flüssiger Blutzellprodukte (Lagerung bei 22° C) erschwert, wodurch es oft zu lokalen Engpässen bei Lieferungen kommt. Ferner fördern die derzeitigen Lagerungspraktiken das Wachstum von Bakterien und führen zu einem häufigeren Auftreten bakterieller Sepsis bei Plättchen- oder Blutkörperchentransfusionen. Weitere Probleme, die mit der Plättchentransfusionstherapie in Zusammenhang stehen, sind unter anderem Fieberreaktionen und HLA-Alloimmunisierung (Human Leukocyte Antigen Alloimmunization) aufgrund von Leukozytenkontamination (WBC Contamination). Des Weiteren besteht bei der Therapie der Transfusion frischer Plättchen oder Blutkörperchen das Risiko einer Virenübertragung, da keine Maßnahmen zur Vireninaktivierung oder -entfernung getroffen werden.
Die Herstellung eines Plättchen- oder Blutzellproduktes, das einen größeren Schutz gegen Bakterien und Viren bietet und eine längere Haltbarkeit hat, wäre demnach von Vorteil. Das ultimative Ziel ist die Herstellung eines stabilen Blutplättchen- oder Blutzellproduktes, das virensicher, leukozytenfrei, steril, stabil und hämostatisch wirksam ist. Ein stabiles, diafiltriertes Blutprodukt, das bei Raumtemperatur gelagert werden kann, ein niedriges Gewicht hat, beständig, leicht zu transportieren und von der US-Zulassungsbehörde für Lebensmittel und Medikamente (FDA) genehmigt ist sowie eine Haltbarkeit von zwei bis fünf Jahren hat, wäre ein erheblicher Fortschritt in der Handhabung von Blutplättchen- und Blutzellressourcen. Ein derartiges Produkt würde vorzugsweise gemäß den Richtlinien für die Herstellung und die Sicherung der Qualität von Arzneimitteln (Good Manufacturing Practice) hergestellt werden, unter Verwendung einer großangelegten Methode, die die vorstehend genannten Probleme beseitigen kann, und es wäre schonend genug, um übermäßige Aktivierung und Aggregation der Plättchen zu verhindern.
Man kennt lyophilisierte oder gefriergetrocknete Plättchenprodukte, die mit Hilfe von Zentrifugierungstechniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel das US- amerikanische Patent Nr. 5,213,814 von Goodrich, Jr. et al. sowie das US-amerikanische Patent Nr. 5,651,966 von Read et al. Siehe außerdem Chao et al., Infusible platelet membrane microvesicles: a potential transfusion substitute for platelets, Transfusion 1996, das ein Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Plättchenmembranproduktes lehrt. Ferner wird auf die anhängigen US-amerikanischen Patentanmeldungen mit der Seriennummer 891,277, eingereicht am 29. Mai 1992, und der Seriennummer 08/424,895, eingereicht am 19. April 1995 verwiesen. Das Zentrifugieren hat die ungewollte Aktivierung der Plättchen zur Folge und kann nicht auf Produktionsebene übertragen werden. Ferner können die bekannten Verfahren nicht unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden, und bei den bekannten Verfahren gibt es keine Maßnahmen zur Virenreduktion.
Die Diafiltration ist ein bekannter Trennungsprozess, bei dem Membrane verwendet werden, um Bestandteile in einer flüssigen Suspension auf der Basis von Unterschieden in der Partikelgröße zu trennen. Je nach Größe der Membranporen kann ein Bestandteil der flüssigen Suspension selektiv zurückgehalten oder durch die Membran hindurchgelassen werden. Die Diafiltration wird routinemäßig bei Anwendungen verwendet, bei denen Nicht-Blutkörperchen gewonnen werden, um Zellen vom azellulären Medium zu trennen, aber noch nie zuvor war die Diafiltration für die Herstellung eines Blutplättchen- oder eines Blutzellproduktes angepasst worden.
Dementsprechend wird ein Verfahren benötigt, um ein Blutplättchen- oder Blutzellprodukt herzustellen, das keine Aktivierung der Plättchen zur Folge hat, auf Produktionsebene übertragen werden kann und ein Produkt erzeugt, das steril und virensicher ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung verwendet die Diafiltration, um die Nachteile bekannter Blutverarbeitungstechniken zu beseitigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Diafiltration verwendet, um das flüssige Medium zu verarbeiten, in dem die Blutkörperchen suspendiert sind, während gleichzeitig eine übermäßige Aktivierung dieser Zellen verhindert wird.
Die Diafiltration kann verwendet werden, um ein Produkt zu erzeugen, das eine reduzierte Anzahl an unerwünschten Bestandteilen aufweist, die dem Plasma eigen sind, oder die während des Herstellungsverfahrens eingebracht werden.
Das Verfahren beruht entweder auf der Verwendung von Diafiltration in einem Einzelschritt oder in einer Reihe von separaten oder kombinierten Prozessen. Die Diafiltration der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um unerwünschte Plasmaproteine von den Plättchen und anderen Blutkörperchen zu entfernen. Ferner kann das Verfahren verwendet werden, um chemische Verbindungen oder Zusätze hinzuzufügen oder zu entfernen, die zum Beispiel die Plasmakoagulation oder die Plättchenaktivierung verhindern, das Plättchen stabilisieren oder während des Verfahrens als Mittel zur Inaktivierung von Viren wirken können. Ferner kann das Diafiltrationsverfahren der Erfindung verwendet werden, um zum Beispiel das Medium, in dem die Blutkörperchen suspendiert sind, in ein Medium zu verwandeln, das sich für Langzeitlagerung, Kryokonservierung oder Lyophilisation eignet. Des Weiteren kann die Diafiltration als Maßnahme zur Virenreduktion verwendet werden, da sie eine Separation freier, im Plasma befindlicher Virenpartikel von den Blutkörperchen und Plättchen bewirkt.
Zu den besonderen Vorteilen der Erfindung bezüglich Blutplättchen und Blutkörperchen gehören unter anderem, aber nicht ausschließlich, das Verhindern übermäßiger Plättchenaktivierung, die Eignung des Verfahrens für Massenproduktion, die Möglichkeit, hochautomatisiert abzulaufen, der geringe Platzbedarf und die hohen Erträge. Die Technik kann auch als ein validiertes geschlossenes System betrieben werden, das zusammen mit einem validierten Sterilisierungsschritt, der in das Verfahren eingebunden wird, die Herstellung eines sterilen Plättchen- oder Blutzellproduktes erlaubt.
In einem besonderen Ausführungsbeispiel kann die Diafiltration, kombiniert mit einem Verfahren, das zum Stabilisieren von Plättchen oder Blutkörperchen durch Fixieren benutzt wird, verwendet werden, um ein steriles, virensicheres Produkt herzustellen, das eine reduzierte Anzahl an unerwünschten Bestandteilen aufweist, die im Plasma vorhanden sind oder während des Herstellungsprozesses eingebracht werden.
In einem Ausführungsbeispiel wird ein Pool von durch Apherese gewonnenen Plättchen in ca. 1 Liter bis ca. 10 Liter plättchenreichem Plasma auf ca. 1 Liter bis 2 Liter Plättchenkonzentrat konzentriert. In einem ersten Filtrationsschritt wird dieses Plättchenkonzentrat gegen mehrere Austausche, vorzugsweise 8 bis 11, eines Citratsalzpuffers diafiltriert, um den Plasmaproteingrad auf unter ca. 0,15 mg/mL zu reduzieren oder eine Reduktion größer als 99,5 % zu erreichen.
Danach können die Plättchen für einen ausreichend langen Zeitraum, vorzugsweise zwischen 5 Minuten und 24 Stunden, und noch bevorzugter für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer 0,01 bis 10 %, vorzugsweise 1-3 %, Paraformaldehyd-Lösung fixiert werden. Der Fixierungsschritt verleiht den Plättchen Stabilität, damit diese dem Gefrieren, der Lyophilisation und der Rekonstitution standhalten, und stellt einen Schritt zur Reduktion von Viren und Bakterien dar.
In einem zweiten Diafiltrationsschritt werden die Plättchen konzentriert und gegen mehrere Austausche diafiltriert, vorzugsweise ca. 5 bis 15 Austausche einer Pufferlösung, vorzugsweise eine Imidazol-gepufferte Salzlösung, gefolgt von ca. 0-6 Austauschen gegen 0,9 % NaCl. Die insgesamt ungefähr 5-21 Austausche während des zweiten Filtrationsschrittes reduziert den Formaldehydgehalt vorzugsweise auf unter 1 ppm. Am Ende des zweiten Diafiltrationsschrittes sind die Plättchen in einer formulierungs- und lyophilisationsgerechten Salzlösung.
Es wurden verschiedenste Prüfungen entwickelt, mit dem Ziel, Blutplättchenund Blutzellprodukte zu testen. Derartige Prüfungen können auf die diafiltrierten stabilen Blutprodukte der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Zu diesen Prüfungen gehören:
1) Transmissions-Elektronenmikroskopie; 2) Bestimmung der Zahl der Plättchen; 3) Kunicki-Score; 4) Thrombozytenfaktor 3; 5) Plättchenaggregation; 6) Plättchenagglutination; 7) hypotone Schockreaktion; 8) Thromboxanbildung, 9) Proteinbestimmung; 10) ringförmige Perfusionskammer nach Baumgartner; 11) Raster-Elektronenmikroskopie; 12) Glykoprotein-Rezeptorstellen; 13) Feuchtigkeitsgehalt; 14) Thromboelastographie; 15) Bestimmung der Paraformaldehydkonzentration; 16) hämostatisches Blutungszeitmodell für Kaninchen; und 17) Kreislaufmodelle für Kaninchen, Ratten und Paviane; und 18) flusszytometrische Analysen.
Die grundlegenden Prinzipien und Techniken sowie der Zweck jeder Prüfung wurden genau definiert. Einige dieser Prüfungen sind qualitativer Natur, während andere quantitativ und recht sensitiv sind. In kombinierter Form bieten sie eine Möglichkeit, die strukturelle Integrität von Plättchen und Blutkörperchen, ihre äußere Form, ihre Reaktionen auf Agonisten und hypotone Schocks sowie ihre Adhäsion an der Oberfläche eines freigelegten subendothelialen Blutgefäßes zu messen. Ferner bieten sie ein Mittel zum Bewerten der Integrität von Rezeptorstellen und Enzymsystemen, des Grads der Aktivierung und der Fähigkeit der Plättchen, am Koagulationsmechanismus teilzunehmen und eine hämostatische Fehlfunktion zu korrigieren. Diese Prüfungen sind wichtig, um die Entwicklungsstadien der diafiltrierten stabilen Blutprodukte zu lenken sowie ihre Gesamteigenschaften zu bewerten.
Diese Prüfungen zeigen, dass der Diafiltrationsprozess der vorliegenden Erfindung einen Gesamtertrag an Plättchen von ca. 50 bis ca. 90 % ergibt. Die mit dieser Technik hergestellten Plättchen zeigen eine leichte, aber nicht übermäßige Aktivierung, wie durch einen Kunicki-Score von ca. 200 bis ca. 260 nachgewiesen. Die fixierten Plättchen haben einen Ristocetin-Agglutinationswert von ca. 30 bis ca. 60 %, was auf einen gewissen Funktionsverlust im Vergleich zu frischen Plättchen hinweist.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich, in der auf die beifolgenden Zeichnungen Bezug genommen wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein verallgemeinertes Übersichtsdiagramm eines Verfahrens zur Plättchenverarbeitung gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 ist ein Blockflussdiagramm eines Dreipumpen-Diafiltrationssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Proteinentfernung während eines ersten Diafiltrationsschrittes gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung, die die Formaldehydentfernung während eines zweiten Diafiltrationsschrittes gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist ausgerichtet auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Blutplättchen- oder Blutzellretentats und eines Plasmaproteinfiltrats durch Diafiltration von Vollblut oder eines Blutproduktes gegen mindestens einen Austausch eines Puffers, und auf Zusammensetzungen, die mit einem derartigen Verfahren hergestellt werden.
Die Ausgangsmaterialien der vorliegenden Erfindung beinhalten Vollblut und ein Blutprodukt. Der Begriff Vollblut wird hier im Sinne von Blut verwendet, das all seine natürlichen Bestandteile enthält, und von dem nichts durch Verfeinern abgeschieden worden ist. Vollblut kann von einem beliebigen Tier gewonnen werden, einschließlich beispielsweise Menschen, Kaninchen, Ratten, Paviane, Hunde, Katzen und sonstige Säugetiere. Ein Ausgangsmaterial in Form eines Blutproduktes ist ein beliebiges aus Vollblut gewonnenes Produkt und enthält Blutplasma. Zu den Beispielen für Ausgangsmaterialien in Form von Blutprodukten, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, gehören plättchenreiches Plasma und Plättchenkonzentrat.
Plättchenreiches Plasma ist Blutplasma, das in einem bestimmten Plasmavolumen eine größere Zahl an Plättchen aufweist als das gleiche Volumen einer Vollblutprobe normalerweise aufweisen würde. Plättchenreiches Plasma wird aus Vollblut gewonnen und ist Blutplasma, das verfeinert wurde, um einerseits rote und weiße Blutkörperchen zu entfernen und andererseits Plättchen zurückzuhalten. Plättchenreiches Plasma kann durch Anwendung verschiedenster, nach dem Stand der Technik bekannter Techniken hergestellt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, durch Diafiltration, Zentrifugation und die Verwendung eines Apheresegerätes. Mit typischen, nach dem Stand der Technik bekannten Apheresegeräten werden von Blutspendern Plättchen gewonnen. Apheresegeräte trennen die Plättchen von den roten und weißen Blutkörperchen, wodurch man plättchenreiches Plasma erhält. Dieses plättchenreiche Plasma ist im Wesentlichen frei von roten Blutkörperchen, aber es kann mit weißen Blutkörperchen kontaminiert sein.
Auch Plättchenkonzentrat eignet sich als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung. Plättchenkonzentrat ist plättchenreiches Plasma, das konzentriert wurde, so dass die gleiche Zahl an Plättchen, die in einem bestimmten Volumen an Plasma vorhanden waren, in einem kleineren Volumen an Plasma enthalten sind. Eine durch Verwendung eines Apheresegerätes erhaltene Blutprobe eines Spenders würde beispielsweise gewöhnlich plättchenreiches Plasma in einer Menge zwischen ca. 250 und ca. 300 ml ergeben. Dieses plättchenreiche Plasma kann dann noch weiter konzentriert werden, um ca. 50 ml Plasma zu erhalten, das darin etwa die gleiche Menge an Plättchen enthalten würde wie die Menge, die in der 250-300 ml-Probe vorhanden war.
Die Diafiltration der vorliegenden Erfindung führt zur Herstellung eines Retentats, das ein stabiles, diafiltriertes Blutprodukt und ein Plasmaproteinfiltrat umfasst. Das stabile Blutproduktretentat wird aus Vollblut gewonnen und beinhaltet darin Blutplättchen, Blutkörperchen (wie zum Beispiel rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen oder Stammzellen) oder eine Mischung aus Plättchen und Blutkörperchen. Das Retentat ist im Wesentlichen frei von kontaminierenden Plasmaproteinen. Kontaminierende Plasmaproteine finden sich im Filtrat der vorliegenden Erfindung. Beispiele für Plasmaproteine, die aus dem Blutplättchenretentat entfernt wurden und im Filtrat vorhanden sind, beinhalten Albumin, Gammaglobuline, Koagulationsfaktoren, Komplementfaktoren sowie Proteinenzyme und Hormone. Das Retentat der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise einen Proteingehalt von weniger als 0,3 mg/ml, noch bevorzugter weniger als 0,15 mg/ml. Ferner ist das Blutproduktretentat im Wesentlichen frei von roten Blutkörperchen.
Das Blutproduktretentat, das mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, kann wahlweise Verbindungen enthalten, die dem Retentat bestimmte vorteilhafte Eigenschaften verleihen, einschließlich beispielsweise Inaktivierung von Viren, Hemmung der Plättchenaktivierung und Hemmung der Blutplättchenaggregation. Geeignete optionale Bestandteile beinhalten Antikoagulantien, Plättchenhemmer und Wirkstoffe zum Inaktivieren von Viren.
Zu den Antikoagulantien, die sich für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, gehören beispielsweise EDTA, EGTA und Citrat. Geeignete Plättchenhemmer beinhalten beispielsweise Heparin, Antithrombin III, Hirudin, Prostaglandin und Theophyllin. Geeignete Wirkstoffe zum Inaktivieren von Viren beinhalten beispielsweise Paraformaldehyd, Glutaraldehyd, lösungsmittelhaltige Detergentien, Psoralene, B-Propiolacton und Phthalocyaninfarbstoffe.
Das vorliegende Blutproduktretentat kann in verschiedensten Medien suspendiert werden, einschließlich Medien, die sich für Langzeitlagerung, Kryokonservierung oder Lyophilisation eignen. Geeignete Ausführungsbeispiele solcher Medien beinhalten beispielsweise Albumin, Disaccharide, Monosaccharide, Trehalose und Antigefrierproteine.
Das Blutproduktretentat der vorliegenden Erfindung ist stabil, so dass es bei Raumtemperatur gelagert werden kann, beständig und hat eine Haltbarkeit von mehr als fünf Tagen.
In der vorliegenden Erfindung wird das als Ausgangsmaterial dienende Blutprodukt gegen mindestens einen Austausch eines Puffers diafiltriert. Ein Diafiltrationsaustausch von Blut oder Blutprodukten bedeutet, dass die zellulären Bestandteile des Blutes oder des Blutproduktes (einschließlich der Blutkörperchen und der Blutplättchen) auf der einen Seite einer Trennungsmembran verbleiben, während die nicht-zellulären Bestandteile unter vorgeschriebenen Bedingungen bezüglich Durchfluss, Druck, Größe der Membranporen sowie Zusammensetzung und Volumen des Puffers durch die Membran gewaschen werden. In Ausführungsbeispielen mit mehreren Austauschen wird das als Ausgangsmaterial dienende Blut oder Blutprodukt vorzugsweise gegen ca. 5 bis ca. 15 Pufferaustausche diafiltriert, noch bevorzugter gegen ca. 8 bis ca. 12 Austausche, und noch bevorzugter gegen 10 Austausche.
Die Puffer, die sich zur Verwendung in den Diafiltrationsaustauschen eignen, beinhalten Puffer, die nach dem Stand der Technik für die Verwendung bei der Diafiltration bekannt sind. Bevorzugte Puffer beinhalten Puffer aus der Familie der Phosphate, Citrate und Imidazole. Noch bevorzugter beinhalten geeignete Puffer Salzlösungen und Citratsalzlösungen. Die Puffer können nach Verarbeitungspuffern (die während der Diafiltrationsschritte verwendet werden) oder Fixierungspuffern (die während der Fixierungsschritte verwendet werden) kategorisiert werden. Die Verarbeitungspuffer werden vorzugsweise aus salzhaltigen Puffern ausgewählt. Die Fixierungspuffer werden vorzugsweise aus Phosphatpuffern, ACD-Puffern, Imidazol-Puffern, Foramldehyd-, Paraformaldehyd- und Glutaraldehydpuffern ausgewählt oder aus Puffern, die lösungsmittelhaltige Detergentien, Psoralene, B-Propiolacton oder Phthalocyaninfarbstoffe enthalten.
Das Volumen des verwendeten Puffers hängt vom Volumen des als Ausgangsmaterial dienenden Blutes oder Blutproduktes ab, das gemäß der vorliegenden Erfindung diafiltriert werden soll. Vorzugsweise liegt das Volumen des verwendeten Puffers im Bereich zwischen ca. einem und ca. 100 Litern. Die Konzentration der verwendeten Puffer kann im Bereich zwischen ca. 1 mM und ca. 1 M liegen, vorzugsweise zwischen ca. 5 mM und ca. 300 mM.
Die Puffer können optionale Bestandteile beinhalten, einschließlich beispielsweise eines Plättchenhemmers oder eines Antikoagulantiums oder Salzen wie zum Beispiel NaCl, um die physiologische Osmolarität zu erhalten. Ein Plättchenhemmer ist eine Verbindung, die die Aktivierung der Plättchen verhindert. Geeignete Plättchenhemmer beinhalten zum Beispiel Heparin, Antithrombin III, Hirudin, Prostaglandin und Theophyllin. Antikoagulantien, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, sind starke Chelatbildner und werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die EDTA, EGTA und Citrat beinhaltet.
Für die Verwendung in dieser Erfindung eignen sich verschiedene Arten von Membranen. Bevorzugte Membrane sind aus Vinyl, Nylon oder einer Hohlfaserkonstruktion mit einer Porengröße von ca. 0,1 Micron bis ca. 1,0 Micron hergestellt.
Die Diafiltration der vorliegenden Erfindung kann entweder in einem einzigen oder in mehreren Diafiltrationsschritten ausgeführt werden. Optional kann das Verfahren auch einen Fixierungsschritt beinhalten. Der Fixierungsschritt verleiht den Plättchen Stabilität, damit diese dem Gefrieren, der Lyophilisation und der Rekonstitution standhalten. Ferner dient der Fixierungsschritt als Schritt zur Reduktion von Viren und Bakterien. Der Fixierungsschritt wird im Allgemeinen nach mindestens einem Diafiltrationsschritt ausgeführt. Im Fixierungsschritt wird dem plättchenenthaltenden Anteil der vorangehenden Diafiltration eine Fixierungslösung zugefügt. Geeignete Fixierungslösungen beinhalten Formaldehyd, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd und Isopropanol, wobei Formaldehyd und Paraformaldehyd vorzuziehen sind.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines diafiltrierten stabilen Blutproduktes unter Verwendung der Diafiltrationstechnologie wird unter Bezugnahme auf die 1 bis 4 beschrieben. Das Verfahren der Erfindung beinhaltet bis zu drei Schritte, die im Ablaufdiagramm von 1 wie folgt veranschaulicht werden: ein Vorfixierungs-Diafiltrationsschritt („DF1"); ein Fixierungsschritt; und ein Nachfixierungs-Diafiltrationsschritt („DF2").
In Schritt DF1 wird ein Pool mit durch Apherese gewonnenen Plättchen in plättchenreiches Plasma (3 × 10¹² Plättchen in 3 Liter) auf 1-2 Liter konzentriert und dann gegen 8-11 Austausche eines Citratsalzpuffers diafiltriert, um den Gehalt an Plasmaprotein auf unter 0,15 mg/mL zu reduzieren. Dieser Schritt kann für sich allein verwendet werden, um ein plasmafreies Plättchenprodukt herzustellen, wenn nachfolgend die richtigen Stabilisatoren zugefügt werden.
Im Fixierungsschritt werden die Plättchen bis zu einer Stunde lang in einer 0,1 bis 2 % Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur fixiert. Der Fixierungsschritt verleiht den Plättchen Stabilität, damit diese dem Gefrieren, der Lyophilisation und der Rekonstitution standhalten, und stellt einen Schritt zur Reduktion von Viren und Bakterien dar.
In Schritt DF2 werden die Plättchen konzentriert und gegen 8-11 Austausche einer Imidazol-gepufferten Salzlösung diafiltriert, gefolgt von 3 Austauschen gegen Salzlösung. Die insgesamt 11-14 Austausche während Schritt DF2 reduzieren den Formaldehydgehalt auf unter 1 ppm. Am Ende von Schritt DF2 sind die Plättchen in einer Salzlösung, die sich für die Formulierung (5 % humanes Serumalbumin in 0,9 % NaCl) und die Lyophilisation eignet.
Wie in nachstehender Tabelle 1 gezeigt, erzeugt die Diafiltration der vorliegenden Erfindung einen Gesamtertrag an Plättchen zwischen 61 und 71 %. Die mit dieser Technik hergestellten Plättchen zeigen eine leichte, aber nicht übermäßige Aktivierung, wie durch einen Kunicki-Score im Bereich zwischen 216 und 260 nachgewiesen. Die fixierten Plättchen haben einen Ristocetin-Agglutinationswert von 37 bis 41 %, was auf einen gewissen Funktionsverlust im Vergleich zu frischen Plättchen hinweist. Die Bereiche des DF1-Ertrags, des DF2-Ertrags, des Gesamtertrags und der Ristocetin-Agglutination bei drei auf identische Weise verarbeiteten Losen waren klein (73-81 %, 84-92 %, 61-71 % beziehungsweise 37-41 %), wodurch deutlich wird, dass mit dieser Technik ein hoher Grad an Vergleichspräzision verbunden ist.
Wie im Folgenden dargelegt, werden thrombozytopenische Kaninchen verwendet, um die hämostatische Wirksamkeit der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten diafiltrierten Blutprodukte zu testen.
Die in vivo Funktionalität eines diafiltrierten, mit der vorliegenden Erfindung hergestellten Plättchenproduktes wurde in einem Modell mit thrombozytopenischen Kaninchen mit Ohrblutung gezeigt. Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigten alle thrombozytopenischen, mit Ethyl-Palmitat behandelten Kaninchen, die eine Infusion mit 5 × 10¹⁰ von drei auf identische Weise hergestellten Losen lyophilisierter Plättchen erhielten, deutliche Korrekturen der Blutungszeiten von >2700 Sekunden (unbehandelt) auf einen Durchschnitt von 413 bis 534 Sekunden eine Stunde nach der Infusion, und 540 bis 620 Sekunden vier Stunden nach der Infusion.
Pilotserien-Verfahren
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Diafiltrieren von Plättchen gemäß eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung für die Pilotserien-Herstellung von lyophilisierten Paraformaldehyd-fixierten Plättchenpräparaten beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf einem Labormodell-Protokoll und wendet die Diafiltrationstechnologie unter Verwendung von Mikrofiltrationsmembranen an.
Verarbeitungspuffer und -lösungen
Die während des Diafiltrationsverfahrens der vorliegenden Erfindung verwendeten Verarbeitungspuffer wurden unter Verwendung von pyrogenfreiem hochreinem Wasser (WFI) hergestellt. Die Puffer wurden durch eine 0,22 μm Membran in saubere Gefäße sterilgefiltert, um eventuell vorhandene aus Partikeln bestehende Stoffe und Endotoxine zu entfernen. Folgende Puffer wurden verwendet:
Citratsalzpuffer (CS) – 5,4 mM Na₃ Citrat, 146 mM NaCl, pH-Wert mit HCl auf 6,5 bei 25° C eingestellt.
Imidazol-gepufferte Salzlösung (IBS) – 84 mM Imidazol, 146 mM NaCl, pH-Wert mit HCl auf 6,8 bei 25° C eingestellt.
Salzlösung – 146 mM NaCl.
Fixierungspuffer und -lösungen
Die folgenden Fixierungspuffer wurden für den Fixierungsschritt zwischen dem ersten (DF1) und dem zweiten (DF2) Diafiltrationsschritt benötigt:
Phosphatpuffer – 270 mM NaH₂PO₄, pH-Wert auf 6,5 bei 25° C eingestellt.
ACD-Puffer – 170 mM Na₃-Citrat 2H₂O, 129 mM Citronensäure-Monohydrat, 222 mM Dextrose, pH-Wert auf 4,5 bei 25° C eingestellt.
8 % Paraformaldehyd-gepufferte Lösung (PFA) – Paraformaldehyd (2,67 M) wurde in hochreinem Wasser (WFI) suspendiert und gelöst, indem der pH-Wert durch die periodische Zugabe von 50 % NaOH auf 11 eingestellt wurde, bis die Lösung klar war. Nach der vollständigen Lösung des Paraformaldehyds wurde NaH₂PO₄ (270 mM) zugegeben, und der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,2 bei 25° C eingestellt. Die Lösung wurde mit hochreinem Wasser aufgefüllt.
Paraformaldehyd-Fixierungslösung (PFS) – Ein Anteil ACD-Puffer wurde mit 9 Anteilen 5 % PFA-Puffer und 10 Anteilen Phosphat-Puffer gemischt. Der pH- Wert wurde mit konzentriertem HCl und/oder NaOH auf 6,8 bei 25° C eingestellt. Die Lösung wurde durch eine 0,22 μm Membran sterilgefiltert.
Übersicht über das Verfahren
Das Herstellungsverfahren kann in drei Schritte unterteilt werden: 1) Diafiltration 1 (DF1); 2) Paraformaldehyd-Fixierung; und 3) Diafiltration 2 (DF2) (1). Im ersten Schritt (DF1) werden frische oder gelagerte Plättchen oder sonstige Blutkörperchen zu einem Pool zusammengefasst und diafiltriert, um Plasmaproteine zu entfernen. Die während DF1 verwendete Technik muss schonend genug sein, um die Aktivierung und Aggregation der Plättchen zu verhindern. Der Paraformaldehyd-Fixierungsschritt stabilisiert die Plättchen, damit sie dem Gefrieren, der Lyophilisation und der anschließenden Rekonstitution standhalten. Des Weiteren kann der Paraformaldehyd-Fixierungsschritt auch der Reduktion von Viren und Bakterien dienen. Der zweite Diafiltrationsschritt verfolgt zwei Ziele: 1) Paraformaldehyd so weit zu entfernen, dass es nicht mehr nachweisbar ist; und 2) die Plättchen in einen Formulierungspuffer für die nachfolgende Lyophilisation zu suspendieren. Die Vorgehensweise für jeden Schritt wird nachstehend detailliert beschrieben.
Diafiltrationssystem
Ein Ausführungsbeispiel des Diafiltrationsverfahrens der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung des in 2 dargestellten Verarbeitungssystems ausgeführt werden. Das System bestand aus: einer Steuereinheit 1; einem Pufferbehälter 2; einer Pufferpumpe 3; einem Verarbeitungsbehälter 4; einer Förderpumpe 5; einem Filterhalter 6; einer Permeatpumpe oder einem Steuerventil 7; einem Abfallbehälter 8; Druckanzeigen für Zufuhr, Permeat und Retentat 9, 10, 11; Ventilen für Zufuhr, Permeat und Retentat (nicht gezeigt); und einem Wärmetauscher (nicht gezeigt). Die Steuereinheit bestand aus Reglern zum Regulieren der Geschwindigkeiten der Förder- und Permeatpumpe und der digitalen Anzeigen zum Überwachen von Druck, Temperatur und Durchfluss.
Integritätstest der Membrane
Vor DF1 oder DF2 wurde eine einzelne Mikrofiltrationsmembran (4 ft² (0,37 m²) in den Filterhalter 6 montiert. Die Membran wurde mit hochreinem Wasser (10 L/min, Retentatdruck=2-3 psi (13,8-20,7 kPa), 10 min) durchnässt, und es wurden ein Wasserdurchlässigkeitstest und ein Luftdiffusions-Integritätstest nach Herstellerangaben ausgeführt. Das System wurde entweder mit 2 L CS-Puffer (DF1) oder 2 L Salzlösung (DF2) gespült (10 Umin, P_Ret=2-3 psi (13,8-20,7 kPa), 5 min) und entleert.
PRP-Gewinnung
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung kann plättchenreiches Plasma als Ausgangsmaterial verwendet werden. In einem besonderen Ausführungsbeispiel wurde plättchenreiches Plasma (PRP) als Einzelspendereinheiten in ACD gewonnen, wobei entweder ein Apheresegerät von Haemonetics oder von COBE verwendet wurde. Die Plättchen wurden auf eine Vielzahl von infektiösen Wirkstoffen untersucht, und bei negativem Befund wurden sie freigegeben. Die PRP-Einzelspendereinheiten (400 mL; 1,2 × 10⁶ Plättchen/μL) wurden über Nacht in speziell entworfenen isolierten Kisten versandt, die einerseits einen ausreichenden Gasaustausch der Plättchen ermöglichten und andererseits die Temperatur auf 20-25° C hielten. Bei ihrer Ankunft wurden die Plättchen zu einem Pool zusammengefasst, gemischt und gezählt. Der Plättchenpool wurde auf hypotone Schockreaktion, Arachidonsäure, Collagen, duales agonistisches (ADP und Arachidonsäure) Aggregationsverhalten und Ristocetin-Agglutination geprüft.
DF1
Ein Ziel von DF1 ist die Verwendung der Diafiltration, um Plasmaproteine aus einer Lösung mit Blutplättchen, Blutkörperchen oder einer Mischung aus Plättchen und Blutkörperchen herauszuwaschen, wobei die Aktivierung und Aggregation der Blutplättchen oder Blutkörperchen minimiert wird. Ein geeignetes Ausführungsbeispiel des Diafiltrationsverfahrens wird in 2 dargestellt.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wurde der PRP-Pool (3 × 10¹² Plättchen, ≈ 2-3 L) in den Verarbeitungsbehälter 4 gegossen. Das Retentatventil wurde vollständig geöffnet, und die Förderpumpe 5 begann zu laufen (2 L/Kanal/min; d. h. für eine 4 ft² (0,37 m²) Membran mit 5 Kanälen, 10 L/min). Die Permeatpumpe 7 wurde angepasst, um den gewünschten Durchfluss (10-90 L/m²/h) zu erreichen. Der Permeatstrom wurde zu einem Abfallbehälter 8 umgeleitet, und die Plättchen wurden auf ein Volumen von ungefähr 2 L konzentriert. Danach wurden die Plättchen bei konstantem Volumen (2 L gegen CS-Puffer bei 8 Austauschen (16 L)) bei einem Durchfluss von 10-95 L/m²/h diafiltriert. Durch Regulieren der CS-Puffer-Zugabe in den Verarbeitungsbehälter 4 mittels der Pufferpumpe 3 wurde das Volumen konstant gehalten. Nach ungefähr 8 Austauschen wurde die Pufferpumpe 3 abgestellt, und die Plättchen wurden auf das maximal zulässige Niveau (0,8 – 1,0 L) konzentriert. Die Förder- und die Retentatpumpe wurden nun abgestellt. Die Plättchen wurden durch ein Tiefpunkt-Ablaufventil in einen Behälter für die Fixierungsreaktion abgeführt. Das System wurde zweimal durch erneute Zufuhr des CS-Puffers (10 L/min) gespült, wobei das Permeatventil geschlossen war und sich die Permeatpumpe in „AUS"-Position befand. Die beiden Spülvolumen wurden den Plättchen zugefügt, und das Volumen wurde mit dem CS-Puffer für die Fixierungsreaktion auf 4 L aufgefüllt.
Paraformaldehyd-Fixierungsreaktion
In diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung wurden die Plättchen von DF1 (4 L; 4 - 8 × 10⁵ Plättchen/μL) in einen Edelstahlbehälter gegeben. Dann wurden 4 L Paraformaldehyd-Fixierungslösung zugegeben und gründlich vermischt. Die Konzentration der Plättchen während der Fixierung betrug ungefähr 300.000/μL. Der Behälter wurde abgedeckt und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur (22-26° C) ohne weiteres Umrühren stehen gelassen, um die Reaktion zu ermöglichen.
DF2
Die 8 L Plättchensuspension von der Fixierungsreaktion wurden in den Verarbeitungsbehälter gegeben. Das Retentatventil wurde vollständig geöffnet, und die Förderpumpe wurde angestellt (2 L/Kanal/min; d. h. 10 L/min für eine 4 ft² (0,37 m²) Membran). Die Permeatpumpe wurde angepasst, um den gewünschten Durchfluss von 10-95 L/m²/h zu erreichen. Der Permeatstrom wurde in einen Abfallbehälter umgeleitet, und die Plättchen wurden auf ein Volumen von ungefähr 2 L konzentriert. Danach wurden die Plättchen bei konstantem Volumen (2 L) gegen IBS für 11 Austausche (22 L) und dann gegen Salzlösung für weitere 3 Austausche (6 L) diafiltriert. Durch Regulieren der IBS- bzw. Salzlösung-Zugabe mittels der Pufferpumpe in den Verarbeitungsbehälter wurde das Volumen konstant gehalten. Nach den insgesamt 14 Austauschen wurde die Pufferpumpe abgestellt, und die Plättchen wurden auf das maximal zulässige Niveau (≈1 L) konzentriert. Die Förder- und die Retentatpumpe wurden nun abgestellt. Die Plättchen wurden durch ein Tiefpunkt-Ablaufventil in einen Behälter für die Endformulierung abgeführt. Zur Bestimmung des maximal erreichbaren Plättchenertrags wurde das System noch weitere zwei Male mit Salzlösung gespült.
Formulierung und Lyophilisation
Um die endgültige Plättchensuspension auf 5 % HSA in 0,9 % NaCl (pH-Wert 6,8±0,2) bei einer endgültigen Plättchenkonzentration von 500.000-3 Mio Plättchen/μL zu bringen, wurde humanes Serumalbumin (Albuminar-25, Centeon) hinzugefügt. Die Plättchen wurden lyophilisiert und bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20° C oder-70° C gelagert.
Untersuchung zur Proteinentfernung
Der Gehalt an während DF1 in der Retentatflüssigkeit verbleibenden Proteinen wurde durch eine Absorptionsprüfung bei 280 nm kontrolliert. In gewünschten Intervallen wurden Proben (2 mL) aus dem Verarbeitungsbehälter entnommen. Die Proben wurden in 1,5 mL Eppendort-Röhrchen in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge 5415C zentrifugiert (16.000 U/min, 10 min). Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, um das Plättchensediment nicht zu lösen, und in ein sauberes Röhrchen überführt. In einem Beckman DU 640-Spektrophotometer wurde unter Verwendung eines Citratsalzpuffers als Blindprobe der A₂₈₀-Wert bestimmt. Der Proteingehalt wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 cm²/mg berechnet.
Formaldehyd-Untersuchung
Der Gehalt an während DF2 in der Retentatflüssigkeit verbleibendem Formaldehyd wurde durch eine colorimetrische Formaldehyd-Untersuchung kontrolliert. In gewünschten Intervallen wurden Teilproben (3 mL) aus dem Verarbeitungsbehälter entnommen und umgehend in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge 5415C zentrifugiert (16.000 U/min, 8 min). Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, um das Plättchensediment nicht zu lösen, in ein sauberes 15 mL Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff überführt, verschlossen, und bis zur Untersuchung bei -20° C eingefroren.
Experimente zur Blutungszeit an Ohren von Kaninchen
Die hämostatische Wirksamkeit lyophilisierter Plättchen wurde anhand von Experimenten zur Ohrblutungszeit bestimmt, die an thrombozytopenischen Kaninchen durchgeführt wurden. Für diese Experimente wurden jedem thrombozytopenischen Kaninchen 5 × 10¹⁰ lyophilisierte Plättchen injiziert, und durch zwei weitere Injektionen eine bzw. vier Stunden später wurde die Korrektur der Blutungszeit bestimmt. Es wurden drei auf identische Weise verarbeitete Lose getestet, und pro Los erhielten jeweils 8 Kaninchen eine Infusion. Die Ohrblutungszeit normaler Kaninchen beträgt ungefähr 250 Sekunden, während die Ohrblutungszeit thrombozytopenischer Kaninchen mehr als 2.700 Sekunden beträgt. Die getesteten Plättchen wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Diafiltrationsverfahrens hergestellt, außer dass im DF2-Verfahren die Salzlösung durch eine Imidazol-gepufferte Salzlösung ersetzt wurde.
Reinigen der Membrane
Die Membrane waren ausschließlich für die Verwendung in DF1 beziehungsweise DF2 bestimmt. Die jeweilige Membran kann für mehr als ein Produktionslos verwendet werden. Nach jeder Verwendung wurden die Membrane gereinigt und vor ihrem erneuten Gebrauch auf ihre Wasserdurchlässigkeit und Luftintegritätsprioritäten überprüft. Die Membrane wurden in angebrachtem Zustand mit einer Bleichlösung (4 L, 600 ppm Hypochlorit, 50° C) nach Herstellerangaben gereinigt. Unter Verwendung der Bleichlösung wurden die Membrane zweimal gespült (10 L/min, P_Perm=3,0 psi (20,7 kPa), 2-5 min), gefolgt von einem ausgiebigen Waschzyklus (10 L/min, P_perm=3,0 psi (20,7 kPa), 30 min).
ERGEBNISSE
Proteinentfernung während DF1
In 3 ist das Entfernen der Plasmaproteine aus dem Blutprodukt während DF1 dargestellt. Die gezeigten Lose wurden unter identischen typischen Bedingungen verarbeitet (45 L/m₂/h, 2 L/min/Kanal; 0,22 μm 4 ft² (0,37 m²), PVDF Durapore-Membran). Nach 8 Pufferaustauschen waren mehr als 99,5 % der Plasmaproteine entfernt worden, so dass der Proteingehalt unter 0;15 mg/mL lag, wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist.
TABELLE 1 RESTLICHER PROTEINGEHALT NACH DIAFILTRATION 1
Formaldehydentfernung während DF2
In 4 ist das Entfernen von Formaldehyd aus dem Blutprodukt während DF2 dargestellt. Um festzustellen, ob die Diafiltrationstechnik in der Lage ist, effektiv Paraformaldehyd aus der Blutproduktsuspension zu entfernen, wurden die durch ein Ausführungsbeispiel der Erfindung erzeugten Plättchen gegen 12 Austausche einer Salzlösung anstelle des normalen IBS-Puffers diafiltriert. Die drei gezeigten Lose wurden unter identischen Bedingungen verarbeitet (45 L/m²/h, 2 L/min/Kanal; 0,22 μm 4 ft² (0,37 m²)). Die Ergebnisse zeigten, dass das Formaldehyd effektiv und mit großer Vergleichspräzision zwischen den drei Durchläufen entfernt worden war. Nach 12 Pufferaustauschen war der freie Formaldehydgehalt auf unter 1 ppm reduziert worden, wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist.
TABELLE 2 RESTLICHER FORMALDEHYDGEHALT NACH DIAFILTRATION 2
Gewinnung und in vitro Prüfungseigenschaften von Plättchen- und Blutzellprodukten, die durch Diafiltration verarbeitet werden
Der Diafiltrationsprozess kann durch Anpassung der Durchflüsse und der Permeatflussraten an gewünschte Werte gesteuert werden. In einem Ausführungsbeispiel läuft der gesamte Prozess unter Verwendung von im Voraus festgelegten Durchflüssen und Flussraten ab, die nicht während des Prozesses in Abhängigkeit von Änderungen des Retentats, des Permeats oder der transmembranen Drücke angepasst werden.
Drei Plättchen-Lose (Tabelle 3) wurden unter identischen Bedingungen unter Verwendung des hierin beschriebenen Verarbeitungsprotokolls verarbeitet. Die Verarbeitungserträge, Kunicki-Scores und Ristocetin-Agglutinationswerte jedes Loses lagen innerhalb kleiner Bereiche, was auf eine gute Vergleichspräzision des Verfahrens hinweist. Auch die Blutungszeitkorrekturen (Tabelle 4) zeigten sowohl bei der späteren Infusion nach einer Stunde als auch bei der späteren Infusion nach vier Stunden eine gute Vergleichspräzision. TABELLE 3 ERTRÄGE, KUNICKI-SCORE UND RISTOCETIN-AGGLUTINATIONSWERTE LYOPHILISIERTER, DURCH DIAFILTRATION HERGESTELLTER PLÄTTCHEN
TABELLE 4 KORREKTUR DER BLUTUNGSZEITEN THROMBOZYTOPENISCHER KANINCHEN DURCH DIAFILTRIERTE PLÄTTCHEN BEI SPÄTEREN INFUSIONEN NACH 1 STUNDE UND NACH 4 STUNDEN
Auch wenn die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben wurde, wird der Fachmann viele weitere Varianten und Abänderungen sowie andere Verwendungsmöglichkeiten erkennen. Aus diesem Grund ist die vorliegende Erfindung nicht durch die spezielle hierin enthaltene Offenbarung zu beschränken, sondern ausschließlich durch die beifolgenden Ansprüche.

Claims

Methode zur Herstellung eines hochreinen, stabilen Blutplättchenprodukts umfassend: (a) Diafiltration eines Ausgangsmaterials in Form von plättchenreichem Plasma oder Plättchenkonzentrat gegen einen Verarbeitungspuffer, der mindestens einmal ausgetauscht wird, um ein zellhaltiges Retentat zu erhalten, das Plättchen umfasst, die im Wesentlichen proteinfrei sind; (b) Fixierung und Stabilisierung der Plättchen in dem zellhaltigen Retentat mit einer Fixierlösung, um fixierte Plättchen zu erhalten; und (c) Diafiltration der fixierten Plättchen gegen salzhaltige Puffer, die mindestens einmal ausgetauscht werden, um eine rezepturgerechte Salzlösung der fixierten Plättchen zu erhalten.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Diafiltration von Schritt (a) gegen einen Verarbeitungspuffer erfolgt, der 5 bis 15-mal ausgetauscht wird.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Verarbeitungspuffer einen salzhaltigen Puffer umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Verarbeitungspuffer einen oder mehrere Citrat-Salz-Puffer, Imidazol-gepufferte Salzlösungen und salzhaltige Puffer umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Verarbeitungspuffer außerdem mindestens einen Plättchenhemmer und ein Antikoagulantium umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Proteingehalt im zellhaltigen Retentat von Schritt (a) 0,15 mg/Ml oder weniger beträgt.
Methode nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die Fixierlösung aus einem oder mehreren Formaldehyden, Paraformaldehyden, Glutaraldehyden und Isopropanolen ausgewählt wird.
Methode nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die Fixierlösung aus einem oder mehreren Formaldehyden und Paraformaldehyden ausgewählt wird.
Methode nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die Fixierlösung aus Phosphatpuffern, Säure-Citrat-Puffern, Imidazol-Puffern oder Imidazol-, Formaldehyd-, Paraformaldehyd- und Glutaraldehyd-Puffern oder Puffern, die lösungsmittelhaltige Detergentien, Psoralene, B-Propiolacton oder Phthalocyaninfarbstoffe enthalten, ausgewählt wird.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Diafiltration von Schritt (c) gegen eine Pufferlösung mit 5 bis 15-maligem Austausch erfolgt, gefolgt von 0 bis 6-maligem Austausch gegen 0,9 % NaCl.
Methode nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) einen 5 bis 15-maligen Austausch gegen einen Puffer in Form einer Imidazol-gepufferten Salzlösung gefolgt von 0 bis 6-maligem Austausch gegen einen salzhaltigen Puffer umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) einen 8 bis 11-maligen Austausch gegen einen Puffer in Form einer Imidazol-gepufferten Salzlösung gefolgt von 3-maligem Austausch gegen einen salzhaltigen Puffer umfasst.
Methode nach Anspruch 1, wobei die somit erhaltene Salzlösung von Schritt (c) in Medien suspendiert wird, die sich für Langzeitlagerung, Kryokonservierung oder Lyophilisation eignen.
Methode nach Anspruch 13, wobei die für Langzeitlagerung, Kryokonservierung oder Lyophilisation geeigneten Medien aus Albumin, Disacchariden, Monosacchariden, Trehalose und Antigefrierproteinen ausgewählt werden.
Methode nach Anspruch 14, wobei das Medium humanes Serumalbumin umfasst.
Methode nach Anspruch 1 mit einem Gesamtertrag an Plättchen in Höhe von 50 % bis 90 %.
Methode nach Anspruch 4, wobei die somit erhaltene Plättchenlösung einen Kunicki-Score von 200 bis 260 und einen Ristocetin Agglutinationswert zwischen 30 % und 60 % hat.
Methode nach Anspruch 1, wobei die somit erhaltene Plättchenlösung einen Kunicki-Score von 200 bis 260 und einen Ristocetin Agglutinationswert von 30 % bis 60 % hat.
Methode nach Anspruch 12, wobei die Fixierlösung Paraformaldehyd umfasst und der verbleibende Anteil an Paraformaldehyd nach der Diafiltration von Schritt (c) geringer ist als 1 ppm.