CN116115753A

CN116115753A - 一种新的改善血小板质量的方法

Info

Publication number: CN116115753A
Application number: CN202111346275.7A
Authority: CN
Inventors: 刘俊岭; 樊雪梅
Original assignee: Shanghai Xuyao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xuyao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-05-16
Also published as: WO2023083361A1

Abstract

本发明提供了一种新的改善血小板质量的方法。本发明首次揭示位于血小板线粒体内膜的肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)分子在对血小板生存、制备和储存中的质量极为关键，CPT2蛋白表达量和/或活性的降低将严重影响血小板的质量，而该蛋白正常或高表达提升血小板的质量。本发明通过对CPT2蛋白的直接和间接影响或改造，多角度验证了CPT2对血小板的作用，揭示了对维持血小板活力具有关键作用的通路以及内源性或外源性分子。因此，CPT2本身或其上调剂能够用于维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量；也可基于以该CPT2或其参与的信号通路作为靶点，筛选调节血小板活力或提高血小板储存质量的物质。

Description

一种新的改善血小板质量的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种新的改善血小板质量的方法。

背景技术

血小板是哺乳类动物血液中特有的血细胞，其没有细胞核，内有线粒体、颗粒体、溶酶体等亚细胞结构，由造血干细胞定向增殖演化而来。每个血小板的寿命都很短，血小板在体内血液循环中的寿命大约为7-14天，当血小板完成生命周期发生衰老的时候，脾脏和肝脏负责清除衰老的血小板。

人外周血中血小板计数正常情况下约为1～3×10¹¹个，外周血维持一定数量血小板是极为重要的。当患者经历了全身性抗凝治疗，创伤手术，致死性出血，化疗放疗导致的血小板减少或当人们发生了感染，免疫性血小板减少症或其他出血性疾病时，都会造成血液循环中的血小板数量减少，当外周血血小板计数低于2×10¹⁰时，就有可能引发严重的出血。此时必须对患者输注血小板，预防可能发生的无法控制的出血或纠正出血时间。然而，临床上由于个体差异，血小板在体内或体外的寿命及质量差异巨大，且输注单采血小板是目前重要的临床治疗手段，单采血小板供不应求。

目前临床上使用的血小板主要是通过单成分献血获得的，通过单采献血仪器选择性的收集血小板。机器将献血者的血液抽出，并在机器内部实现血小板与其他血细胞的分离，随后将浓缩的富血小板血浆收集到储存袋中，而血液的其他成分被重新输回献血者体内。

然而，血小板对环境非常敏感，一种储存方法是血小板添加了甘油和DMSO后制备成冷冻血小板，保存在零下80℃，需要使用时解冻，解冻后血小板制品中可能出现絮状的不可逆纤维蛋白沉淀，这表明血小板已处于活化的状态，冷冻血小板主要应用于急诊血小板输注，需要即刻止血时使用。有研究表明冷冻储存会导致血小板膜发生不可逆的改变，从而导致输血后血小板很快被肝脾巨噬细胞吞噬清除。所以说血小板的储存温度对其输血后在循环系统中的存活很重要。上述种种劣势限制了冷冻血小板在临床上广泛的应用。此外，单采血小板的保质期只有5天，血小板自身的衰老、代谢均会影响其衰老、凋亡及病理性死亡，加之输注血小板在前期还要进行血型检测，病原微生物等检测，造成临床使用窗口期很短，输注血小板的活力很低。因此，本领域迫切需要一种能够改善血小板寿命以及质量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控血小板活力或质量的新型靶点，即肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)分子；本发明的目的还在于提供直接或间接作用于该靶点的调控分子，以及它们的应用。

在本发明的第一方面，提供一种肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)或其上调剂在制备组合物中的应用，所述组合物具有以下功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

在一个或多个实施方式中，所述CPT2的功能障碍导致脂肪酸代谢障碍，影响血小板的活性、质量、数量和/或寿命，其上调剂缓解或改善这一状况。

在一个或多个实施方式中，所述的脂肪酸代谢障碍包括：长链脂酰肉碱(C16:0、C18:0)随着时间的增加发生堆积。

在一个或多个实施方式中，所述的脂肪酸代谢障碍包括：血小板血浆内出现脂酰肉碱的浓度升高。

在一个或多个实施方式中，所述血小板为离体血小板或在体血小板。

在一个或多个实施方式中，所述血小板为哺乳动物来源的血小板，如人血小板、鼠血小板、猴血小板或人造血小板。

在一个或多个实施方式中，所述血小板为富血小板血浆(PRP)。

在一个或多个实施方式中，所述减少血小板凋亡指的是施用所述组合物之后的血小板样本中凋亡血小板的数量百分比A1与未使用所述组合物的血小板样本中凋亡血小板的数量百分比A0相比，至少下降5％，10％或20％。

在一个或多个实施方式中，所述延长血小板寿命指的是施用所述组合物之后的血小板生存时间T1与未使用所述组合物的血小板生存时间T0相比，T1/T0至少延长6，12，24，36，48或72小时。

在一个或多个实施方式中，所述提高血小板的数量指的是施用所述组合物的血小板数量P1与未施用所述组合物的血小板数量P0相比，P1/P0至少为1.5，更佳地至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、或100。

在一个或多个实施方式中，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括(但不限于)选自下组的一种或多种：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性的物质；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间的物质。

在一个或多个实施方式中，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括(但不限于)选自下组的一种或多种：

靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂；较佳地，所述降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质是蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂包括降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是线粒体蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是CPT2特异性的；较佳地，所述乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II第79位赖氨酸；较佳地，所述试剂包括(但不限于)：定点突变试剂或定点修饰试剂；较佳地，所述降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂包括基因编辑、基因敲除、siRNA、microRNA、或小分子下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是SIRT3或其激活剂；

CPT1抑制剂；较佳地，所述CPT1抑制剂包括CPT1自身抑制剂、上游AMPK抑制剂(AMPKi)、ACC激动剂；较佳地，所述CPT1抑制剂包括(但不限于)：Malonyl-CoA(丙二酰辅酶A)、Etomoxir(乙莫克舍)、Perhexiline maleate(马来酸哌克昔林)、Dorsomorphin 2HCl；

蛋白乙酰化抑制剂；较佳地包括(但不限于)：赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂，线粒体蛋白乙酰化抑制剂，或其激活剂或表达上调剂；较佳地，所述赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂包括(但不限于)：tip60抑制剂或p300抑制剂；较佳地，所述线粒体蛋白乙酰化抑制剂包括(但不限于)：SIRT3；较佳地，SIRT3的激活剂包括(但不限于)(直接或间接激活)：提高NAD[+]前体浓度的试剂或提高NAMPT酶活性的试剂；较佳地，所述提高NAD[+]前体浓度的试剂包括(但不限于)：烟酰胺单核苷酸(NMN)，烟酰胺(NAM)，烟酰胺核苷(NR)；较佳地，所述提高NAMPT酶活性的试剂包括(但不限于)：P7C3，SBI-797812；

AMPK抑制剂(AMPKi)；较佳地包括(但不限于)：Dorsomorphin 2HCl；

抗氧化剂；较佳地包括(但不限于)：N-乙酰半胱氨酸(NAC)，美司那或谷胱甘肽；

重组表达肉碱棕榈酰转移酶II的表达构建物(包括表达载体)；

促进肉碱棕榈酰转移酶II基因启动子驱动能力的上调剂；或

肉碱棕榈酰转移酶II基因特异性microRNA的下调剂。

在一个或多个实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。

在一个或多个实施方式中，所述乙酰基转移酶包括(但不限于)：tip60抑制剂或p300抑制剂。

在本发明的另一方面，提供一种体外储存血小板的方法，所述方法包括：在储存血小板时，进行包括(但不限于)选自下组的处理：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间；或(d)添加活性的肉碱棕榈酰转移酶II(非乙酰化的酶)。

在一个或多个实施方案中，tip60抑制剂的用量为0.1～100umol/L(如，0.5、1、2、5、10、20、30、50、60、80umol/L)。

在一个或多个实施方案中，p300抑制剂的用量为0.1～100umol/L(如，0.5、1、2、5、10、20、30、50、60、80umol/L)。

在一个或多个实施方案中，所述的NMN的用量(终浓度)为0.05～50mM(如0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、5或10mM)，较佳地0.1～10mM，更佳地0.2～5mM。

在一个或多个实施方案中，所述的烟酰胺的用量(终浓度)为0.05～10mM(如0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、5或10mM)，较佳地0.1～10mM，更佳地0.2～5mM。

在一个或多个实施方案中，所述的烟酰胺核苷的用量(终浓度)为0.05～50mM(如0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、5或10mM)，较佳地0.1～10mM，更佳地0.2～5mM。

在一个或多个实施方案中，所述的P7C3的用量(终浓度)为0.025～50uM(如0.04、0.05、0.2、0.4、0.5、1、2.5、4、5、8、10、15、25或40uM)，较佳地0.05～30uM，更佳地0.25～15uM。

在一个或多个实施方案中，所述的SBI-797812的用量(终浓度)为0.1～200uM(如0.15、0.2、0.8、1.5、2、4、10、15、20、30、40、60、100或150uM)，较佳地0.2～120uM，更佳地1～60uM。

在一个或多个实施方案中，所述的Dorsomorphin 2HCl的用量为0.05～80uM(如0.08、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、0.5、1、2、5、10、15、20、30、40、60或70uM)，较佳地0.1～50uM，更佳地0.5～20uM。

在一个或多个实施方案中，所述的N-乙酰半胱氨酸的用量为0.05～500mM(如0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、5、10、20、50、80、100、200mM)。

在一个或多个实施方案中，所述的美司那的用量为1～1000uM(如1.5、2、4、10、15、20、30、40、60、100、150、200、400、600、800uM)。

在一个或多个实施方案中，所述的谷胱甘肽的用量为10～2000uM(如15、20、30、40、60、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1500、1800uM)。

在一个或多个实施方案中，所述的“用量”包括“添加量”，较佳地包括：相应添加物在组合物(包括后文中的组合物)中的终浓度，相应添加物在血小板或含有血小板的物质中的终浓度。

在一个或多个实施方案中，所述的“含有血小板的物质”包括天然采集(如新鲜采集)的含有血小板的血液/血浆，富集有血小板的血制品，血液加工制品。

在本发明的另一方面，提供一种维持或提高血小板的活力方法，包括针对需要提高血小板活力的受试者，进行包括(但不限于)选自下组的处理：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间；或(d)添加活性的肉碱棕榈酰转移酶II(非乙酰化的酶)

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其具有以下功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量；所述组合物包括肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂。

在一个或多个实施方式中，所述组合物中包括：蛋白乙酰化抑制剂、抗氧化剂和CPT1抑制剂。

在一个或多个实施方式中，所述蛋白乙酰化抑制剂为NMN，所述抗氧化剂为NAC，所述CPT1抑制剂为AMPKi。

在一个或多个实施方式中，所述NMN、NAC和AMPKi按照摩尔比为(50～500)：(500～5000)：1；更佳地为(80～300)：(800～3000)：1(例如，90:900:1，100:1000:1，110:1110:1，120:1200:1，125:1250:1，140:1400:1，，150:1500:1，180:1800:1，200:2000:1，250:2500:1等)。

在一个或多个实施方式中，NMN、NAC和AMPKi组合应用时，所述的NAD+前体NMN在血小板或含有血小板的物质(如血浆，富血小板血浆等)中的添加浓度为0.1～5000uM(如0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、800、1000、1500、2000、3000、4000uM)。

在一个或多个实施方式中，NMN、NAC和AMPKi组合应用时，所述的N-乙酰半胱氨酸在血小板或含有血小板的物质中的添加浓度为1～50000uM(如2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、8000、10000、15000、20000、30000、40000uM)。

在一个或多个实施方式中，NMN、NAC和AMPKi组合应用时，所述的AMPKi在血小板或含有血小板的物质中的添加浓度为0.8～40000nM(如1.6、4、8、16、40、80、160、400、800、1600、4000、6400、8000、12000、16000、24000、32000nM)。

在本发明的另一方面，提供一种药盒，其含有所述的组合物。

在本发明的另一方面，提供所述的组合物或药盒的应用，用于：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

在本发明的另一方面，提供肉碱棕榈酰转移酶II的应用，用于筛选药物(即作为筛药靶点)，所述药物具有选自下组的功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

在本发明的另一方面，提供一种筛选维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量的药物(或潜在的药物)的方法，该方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达肉碱棕榈酰转移酶II；和，

(2)检测所述体系中肉碱棕榈酰转移酶II，若所述候选物质存在选自下组的性能，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物：

(i)肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化位点的乙酰化减弱或丧失；较佳地，所述乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II第79位赖氨酸；

(ii)肉碱棕榈酰转移酶II的表达提高；或

(iii)肉碱棕榈酰转移酶II的活性提高。

在一个或多个实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中肉碱棕榈酰转移酶II，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上促进(如促进20％以上，较佳地促进50％以上；更佳地促进80％以上)肉碱棕榈酰转移酶II的(i)～(iii)任一所述的性能，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一个或多个实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在一个或多个实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对肉碱棕榈酰转移酶II、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的过表达分子如构建体，活性促进分子，化学小分子，相互作用分子等。

在一个或多个实施方式中，所述方法还包括：对获得的药物或化合物(潜在药物或化合物)进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量等有用的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程改造的血小板或其前体，所述血小板或其前体中转化有外源的肉碱棕榈酰转移酶II或其上调剂；较佳地，所述上调剂是生物分子，如多核苷酸、包含多核苷酸的构建体或蛋白质。较佳地，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂是靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂，更佳地为针对乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II的第79位赖氨酸，使其突变。

在一个或多个实施方式中，所述前体是巨核细胞和/或成纤维细胞。

在本发明的另一方面，提供含有所述基因工程改造的血小板或其前体的组合物/培养体系(培养物)。

在本发明的另一方面，提供含有所述基因工程改造的血小板或其前体、或所述组合物/培养体系(培养物)的药盒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、对储存了不同天数的血小板进行分析，发现随储存时间的增加，血小板的功能发生衰退，血小板的凋亡率逐渐增加。

图1B、Western Blot实验实时检测Caspase3的活化程度随着血小板储存的天数增加而增加。Caspase3分子量为35kd，经过剪切活化的Caspase3分子量为17kd。

图2A、通过对不同储存天数的储存血小板做乙酰化修饰定量蛋白组学研究，发现血小板在储存过程中，蛋白质发生修饰程度的改变，在血小板储存到3-4天时，血小板内蛋白质乙酰化的程度发生显著变化

图2B、对差异表达蛋白进行亚细胞结构的统计分析，来自线粒体的蛋白种类高达四分之一。

图2C、针对实验结果进行了基于KEGG通路富集的聚类分析热图的分析。发现产生了乙酰化修饰程度改变的蛋白质主要分布在细胞质和线粒体中，乙酰化修饰程度改变的蛋白多数参与血小板活化与代谢等生化过程。其中发现了很多代谢相关的酶发生了乙酰化修饰相关，如谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT2)/丙酰辅酶A羧化酶(PCCA)/二氢硫辛酸脱氢酶(DLD)/酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)/肉毒碱棕榈酰基转移酶2(CPT2)/胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)/线粒体三功能蛋白(HADHA/HADHB)/极长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADVL)等。

图3A、通过乙酰化修饰定量蛋白组学分析发现，在血小板中，CPT2在79位赖氨酸处发生乙酰化。

图3B、点杂交实验验证，CPT2K79AC抗体只与乙酰化多肽结合，不识别非乙酰化的多肽

图3C、通过免疫沉淀和Western Blot实验验证CPT2分子79位乙酰化的程度随着储存时间改变，当血小板储存到第二天时骤然升高，在随后的储存过程中缓慢降低。

图4A、对血小板进行代谢流分析，通过稳定同位素标记来追踪不同能源物质的最终代谢去路。发现在血小板储存过程中，脂肪酸代谢的效率很低，并随着储存天数的增加而减缓；葡萄糖主要通过糖酵解途径生成乳酸；谷氨酰胺优先被利用，并大量进入三羧酸循环为细胞供能。

图4B、在血小板储存过程中，血浆中脂酰肉碱的含量发生堆积。血小板在储存的过程中每日收样，收集血浆用于质谱检测，采用非衍生化法进行样品前处理后加入稳定同位素标记的脂酰肉碱做标准品，使用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用系统检测七十余种脂酰肉碱。

图4C、流式细胞术检测棕榈酸，棕榈酸加肉碱，棕榈脂酰肉碱对血小板贮藏的影响，参考指标包括血小板活性，Annexin V和线粒体Mitosox的荧光值。

图4D、通过液相色谱质谱串联技术检测到CPT2分子79位的乙酰化可以导致脂酰肉碱在细胞内堆积。而脂酰肉碱的堆积又影响了细胞状态。流式细胞分析，随着脂酰肉碱浓度的提高，细胞的凋亡率以及线粒体内活性氧的水平均有提高。

图4E、透射电子显微镜数据显示，CPT2和KR细胞中的线粒体健康，线粒体排列有序。但是，KQ细胞中的线粒体显示出内膜被破坏且电子密度降低。当细胞暴露于低浓度的棕榈酰肉碱时，KR线粒体能够维持正常的结构。

图5A、降低血小板内蛋白质的乙酰化程度可以有效提升血小板的质量。通过在单采血小板中添加两种具有代表性的乙酰化酶的抑制剂，来观察降低血小板蛋白乙酰化程度对血小板质量的影响。不管是是加入了tip60抑制剂的实验组还是加入了p300抑制剂的实验组，对比对照组，储存7天的单采血小板的质量有明显提升。

图5B、血小板蛋白的去乙酰化修饰在血小板储存老化过程中发挥至关重要的作用。SIRT3敲除的小鼠的血小板对比对照组小鼠的血小板，在储存过程中更易凋亡，且线粒体膜电势下降更快，在代谢过程中累积更多的活性氧。

图5C、与野生型小鼠相比，sirt3敲除小鼠的cpt2分子79位乙酰化程度更高。小鼠血小板在储存过程中，cpt2分子79为乙酰化的程度升高，并且敲除sirt3的小鼠升高程度更显著。

图5D、储存的小鼠血小板内发生脂肪酸代谢的紊乱。随着血小板储存时间的增长，血小板内长链脂酰肉碱的含量会持续积累，并且线粒体蛋白乙酰化的程度可以显著影响血小板内长链脂酰肉碱含量。添加四种化合物对于血小板的质量均有提高。

图5E、多种生物的CPT2分子氨基酸序列比对发现，大鼠是天然的CPT2K79R模型。对比小鼠血小板和大鼠血小板的储存状态，可发现大鼠血小板在更耐储存。小鼠血小板对脂酰肉碱较为敏感，脂酰肉碱可以有效损伤小鼠血小板，但是大鼠血小板可以承受一定浓度的脂酰肉碱。

图5F、大鼠CPT2K79R模型的血小板可以抵制脂酰肉碱在细胞中的积累，保证脂肪酸代谢的正常代谢，从而保证细胞免于凋亡。

图5G、大鼠和小鼠血小板储存期间的相对酰基肉碱水平比较。

图6A、Western Blot技术检测发现，在血小板储存过程中，AMPK-ACC信号通路逐渐活化，血小板的能量代谢异常引发了AMPK的磷酸化，磷酸化而活化的AMPK使其下游底物ACC磷酸化。磷酸化的ACC活性下降，导致脂肪酸合成代谢活性下降，分解代谢活性上升。

图6B、不同浓度的AMPK抑制剂和激动剂对储存血小板的影响。AMPK通路的激活与抑制与血小板储存质量密切相关。通过在血小板中添加不同浓度的AMPK的抑制剂和激动剂，明确了AMPK通路的活化对储存血小板的凋亡，线粒体电势差，活性氧累积，聚集活性有密切关系。并且这种影响呈现出浓度依赖性。

图7、具有抗氧化作用的小分子抑制剂(乙酰半胱氨酸，美司那和谷胱甘肽)可以减少线粒体内活性氧的累积。从而保护了血小板对刺激剂的反应活力以及线粒体电势差。与此同时也降低了储存血小板的凋亡率。

图8A、NAD+前体NMN、ROS清除剂NAC和AMPK抑制剂(AMPKi)三种化合物的组合(在新鲜采集的血小板中，NMN添加量0.5mM NAC添加量5mM，AMPKi添加量4uM)在改善储存的血小板质量方面比其中任何一种都好得多，这使血小板凋亡减少了一半，并将血小板活性提高到对照组的约4倍。

图8B、添加NMN+NAC+AMPKi(NMN 0.5mM，NAC 5mM，AMPKi 4uM)或PBS作为对照，将人血小板浓缩物在体外储存6天。然后用生物素标记它们并输注给NCG小鼠。与对照组相比，NMN+NAC+AMPKi组的血小板清除率较低。

图8C、小鼠富血小板血浆(PRP)在体外储存1天，添加NMN、NAC、AMPK抑制剂、NMN+NAC+AMPK抑制剂(NMN 0.5mM，NAC 5mM，AMPKi 4uM)或PBS作为对照。然后用生物素标记血小板并输注给WT小鼠。NMN、NAC或AMPK抑制剂储存的血小板在体内的存活率高于对照，并且存在三种化合物组合的叠加效应。

图8D、评价NMN、NAC或AMPK抑制剂对ITP患者血小板存活的作用。通过尾静脉注射低剂量抗GPIb抗体R300建立ITP小鼠模型。NMN、NAC或AMPK抑制剂组的血小板存活率和血小板计数恢复率高于对照组，尤其是NMN+NAC+AMPKi组(用量1μmol NMN，10μmol NAC，8nmolAMPKi)。

图8E、CPT2参与的胞内作用机制示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入研究，首次揭示位于血小板线粒体内膜的肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)分子在对血小板生存、制备和储存中的质量极为关键，CPT2蛋白表达量和/或活性的降低将严重影响血小板的质量，而该蛋白正常或高表达提升血小板的质量。本发明通过对CPT2蛋白的直接和间接影响或改造，多角度验证了CPT2对血小板的作用，进而发现了对维持血小板活力具有关键作用的通路以及内源性或外源性分子。因此，CPT2本身或其上调剂能够用于维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量；也可基于本发明首次披露的CPT2的功能及其参与的信号通路筛选调节血小板活力或提高血小板储存质量的物质，本发明证实，通过影响CPT2的各种化合物，单用NAC、NMN、AMPI抑制剂及其组合均能够有效延长血小板的寿命，增强其活力，在体内和体外均可用于改善血小板的质量和生存周期，且此类药物均已有临床应用，安全性更有保障。

CPT2

人CPT2的氨基酸序列可以如GenBank登录号1376所示。本发明还包括来自其它物种(如灵长类动物，啮齿类动物；具体如猴、鼠等)的CPT2同源物及其应用。

本发明所述CPT2可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自人或非人哺乳动物。所述的CPT2也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组CPT2，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的CPT2。所述的CPT2包括全长的CPT2或其生物活性片段。根据CPT2的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的CPT2的氨基酸序列也包括在本发明中。CPT2或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

任何一种CPT2的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，CPT2的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的CPT2的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长CPT2的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长CPT2的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的CPT2，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的CPT2。所述经过修饰或改良的CPT2可以是一种CPT2的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的CPT2可以是与天然存在的CPT2具有较小的共同点，但也能维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量。也就是说，任何不影响CPT2的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

CPT2及其上调剂的应用

在本发明人的研究工作中，意外地发现，在血小板代谢过程中，线粒体来源的蛋白修饰及差异化表达，尤其是血小板线粒体内膜的肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)K79位的乙酰化对血小板的寿命具有严重的影响，并且本发明证实CPT2功能障碍所导致的血小板脂肪酸代谢途径受阻会通过能量代谢途径影响血小板的质量(图8E)。此外，本发明进一步证实了通过直接或间接改变CPT2的功能，例如直接使用蛋白乙酰化抑制剂、激活去乙酰化酶SIRT3基因，或间接对细胞能量代谢通路的关键信号通路(如AMPK-ACC通路、活性氧积累)等进行干预后，能够保护血小板，尤其是血小板的质量。

基于本发明人的新发现，本发明提供了CPT2或其上调剂的应用，用于制备(1)维持或提高血小板的活力；(2)维持或提高血小板的储存质量；或用于作为筛选药物的靶点。

本发明中，所述的CPT2的上调剂可包括但不限于：降低CPT2的乙酰化的物质；提高CPT2活性的物质；提高CPT2的表达、稳定性或有效作用时间的物质等。

如本文所用，所述的CPT2的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高CPT2的活性、维持CPT2的稳定性、促进CPT2的表达、促进CPT2的分泌、延长CPT2有效作用时间、或促进CPT2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为具有上调功能的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的CPT2的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)CPT2的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码CPT2的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，CPT2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生CPT2。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CPT2的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

根据本发明的揭示，血小板储存过程中会发生CPT2的乙酰化。因此，本发明所述的上调剂较为优选的是靶向CPT2乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂，所述乙酰化位点是CPT2第79位赖氨酸。任何能够靶向调控CPT2的这一位点或其邻近位置，进而使其乙酰化水平降低的试剂均可被应用于本发明中。较佳地，所述试剂包括但不限于靶向于该第79位赖氨酸的定点突变试剂或定点修饰试剂。此类定点突变试剂或定点修饰试剂的制备可依托于本领域的多种方法来进行，例如但不限于基因编辑技术、同源重组技术等。

作为另一优选的方式，可以运用蛋白乙酰化抑制剂来抑制CPT2的乙酰化。所述蛋白乙酰化抑制剂可以为赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂，线粒体蛋白乙酰化抑制剂，或其激活剂或表达上调剂。

赖氨酸乙酰基转移酶(HAT)可以乙酰化一系列蛋白来调控蛋白质的活性，进而调控细胞凋亡，细胞代谢等重要的细胞功能。赖氨酸乙酰基转移酶催化乙酰辅酶A的乙酰基转移到底物蛋白的赖氨酸上，进而对底物蛋白的功能产生影响。

tip60和p300均为典型的乙酰转移酶家族的成员。tip60属于MYST乙酰基转移酶家族，在细胞周期检查点激活以及细胞凋亡自噬等进程中发挥重要的调控作用。同时还可以在糖代谢等多种代谢通路中发挥作用。p300是组蛋白乙酰化酶家族中的重要一类，因为其分子量为300kd而得名p300，p300在细胞增殖，凋亡等过程中发挥调节作用。P300与tip60在线粒体中表达，并可以在线粒体内发挥乙酰基转移酶的作用，乙酰化非组蛋白，改变蛋白活性。根据本发明的实施例结果，所述赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂(tip60抑制剂或p300抑制剂)能通过抑制血小板内蛋白的乙酰化，提升血小板的储存质量。这说明了降低血小板内蛋白的乙酰化程度有利于提升血小板的质量。

线粒体蛋白乙酰化抑制剂也可被应用于本发明中。SIRT3是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶，是Sirtuin家族成员之一，是线粒体中关键的蛋白去乙酰化酶，其可以作用于CPT2等线粒体蛋白，使其去乙酰化。本发明的实施例结果显示，缺少SIRT3的血小板，因线粒体蛋白缺少了去乙酰化的机制，导致线粒体蛋白质乙酰化程度增高，从而影响了血小板的储存状态。SIRT3敲除的血小板中的CPT2分子79位的乙酰化程度更高，影响了CPT2分子的正常生理功能，造成血小板的脂肪酸代谢障碍，严重降低了血小板的质量。并且，SIRT3敲除的血小板内脂酰肉碱水平与对照组相比更高，这说明随着血小板储存时间的增长，血小板内长链脂酰肉碱的含量会持续积累；并且线粒体蛋白乙酰化的程度可以显著影响血小板内长链脂酰肉碱含量。这说明血小板内脂肪酸代谢相关的酶的乙酰化程度或发生改变，从而影响了血小板线粒体内的脂肪酸代谢。

根据本发明的实施例结果，所述线粒体蛋白乙酰化抑制剂SIRT3的激活剂、也即提高NAD[+]前体浓度的试剂(烟酰胺(NAM)，烟酰胺核苷(NR))或提高NAMPT酶活性的试剂(P7C3，SBI-797812)均能非常显著地提高血小板的质量。

本发明中，也分析了细胞能量代谢关键通路与CPT蛋白以及血小板质量的相关性，表明抑制AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)的活化对血小板的储存有保护作用。AMPK具有调节机体的能量代谢，维持能量供求平衡的功能。当细胞内能量水平降低时，可以引发AMPK的活化，调控氧化和合成的代谢途径。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是AMPK的下游靶点之一，激活的AMPK可以使ACC磷酸化，从而抑制其功能，减少丙二酰辅酶A合成，增加CPT1的活性从而促进脂肪酸氧化。本发明的实施例结果显示，抑制血小板中AMPK通路的活化可以有效保护储存血小板的质量，而抑制AMPK通路的活化，则可以减少CPT1对脂肪氧化的催化，减少进入线粒体的脂肪肉碱，从而恢复CPT2的功能，AMPK通路抑制剂可以间接恢复CPT2的蛋白功能。因此，作为另一优选的方式，可以运用AMPK通路抑制剂来提高血小板的质量，例如包括但不限于：Dorsomorphin 2HCl。

此外，抗氧化剂能够减少活性氧堆积，间接改善CPT2的功能。因此，抗氧化剂也可被应用于本发明中；较佳地包括(但不限于)：N-乙酰半胱氨酸，美司那或谷胱甘肽。

应理解，本发明的实施例中列举了有限的但具有代表性的蛋白乙酰化抑制剂、线粒体蛋白乙酰化抑制剂、AMPK通路抑制剂、抗氧化剂，与这些抑制剂具有相同或相近功能的其它化合物或蛋白也可被应用于本发明中，一些化合物抑制剂的类似物、衍生物、异构体、前体或盐等，也可被应用于本发明中。

在本发明的实施例中，具体列举的对血小板质量有影响的分子均为内源性或现有临床药物，安全性、可及性强。因此，本发明发现的靶点及其相关影响分子可用于改善储存血小板以及生理微环境中血小板的寿命，同时CPT2作为靶点还可进一步用于血小板的基因工程改造。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的CPT2、或其上调剂、或其类似物，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于提高血小板的质量(包括维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量)。此外，还可同时与其它活性试剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的CPT2、或其上调剂(如过表达该CPT2的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

在得知了所述的CPT2的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的CPT2或其编码基因、或其药物组合物进行施用。所述CPT2或其上调剂的给药方式可根据实际需要而定，主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。当所述的CPT2为化合物时，针对机体中的血小板，可以是全身的或局部的给药；针对体外处理血小板，可以是添加至待处理的血小板或含有血小板的血浆中。

当所述的CPT2为基因或蛋白时，比如可直接将CPT2或其上调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带CPT2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的CPT2。作为一种实施方式，可将所述的CPT2直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码CPT2的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述CPT2的细胞中，使所述的细胞表达CPT2。

CPT2作为药物筛选靶点

在得知了所述的CPT2的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选促进CPT2的表达或活性的物质，所述物质可作为提高血小板质量的候选物质。所述的候选物质可以是但不限于：针对CPT2、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的过表达分子如构建体，活性促进分子，化学小分子，相互作用分子等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到CPT2及其所参与的信号通路或其上下游蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达CPT2或其上下游信号通路的体系。

所述的表达体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达CPT2的细胞；或可以是重组表达CPT2的细胞。所述的表达CPT2的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高血小板的活力或储存质量真正有用的物质。

本发明对于CPT2或其上下游信号通路蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于提高血小板的活力或储存质量等真正有用的物质，从而用于临床。

CPT2作为评估血小板质量的靶点

基于本发明的新发现，可以将CPT2作为评估血小板活力或储存质量的标志物：进行血小板的活力或血小板的储存质量的评估/检测。尤其是针对其乙酰化位点的检测，较佳地该位点为第79位赖氨酸。

可采用各种本领域已知的技术来检测CPT2基因的存在与否、表达情况、表达水平或活性，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测CPT2基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增CPT2的引物；或特异性识别CPT2的探针来确定CPT2基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合CPT2编码的蛋白的抗体或配体来确定CPT2蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出CPT2基因或基因片段。针对CPT2基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与CPT2基因上特定位点发生特异性结合，而不与CPT2基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。此外，利用特异性结合CPT2蛋白的抗体来检测分析物中CPT2蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

本领域中，测定蛋白的乙酰化位点的乙酰化水平已经是成熟的技术了。一般而言，确定乙酰化位点可应用两种常用的方法：在细胞内直接纯化目标蛋白进行质谱鉴定；在体外利用纯化的目标蛋白与乙酰转移酶进行体外乙酰化反应，将反应后的目标蛋白进行质谱鉴定。无论哪种方法确定的乙酰化位点，一般需通过构建突变体进行最后的确定。乙酰化主要发生在赖氨酸(K)上，一般而言，赖氨酸突变为精氨酸(R)相当于模拟去乙酰化，赖氨酸突变为谷氨酰胺(Q)相当于模拟乙酰化。

确定了乙酰化位点，一般就可以利用构建的模拟乙酰化/去乙酰化突变体研究乙酰化对于目标蛋白功能的影响。总体而言，蛋白的乙酰化修饰研究一般包括以下步骤：确定目标蛋白是否存在乙酰化；筛选乙酰化酶/去乙酰化酶；鉴定乙酰化位点；解析乙酰化对目标蛋白的影响；探究目标蛋白乙酰化的生物学功能。

本发明还提供了用于在分析物中检测CPT2基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性检测CPT2蛋白的乙酰化位点的乙酰化水平的试剂；特异性扩增CPT2基因的引物；特异性识别CPT2基因的探针；或特异性结合CPT2蛋白的抗体或配体。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

基因工程改造的血小板或其前体

本发明也提供了一种基因工程改造的血小板或其前体，所述血小板或其前体中转化有外源的肉碱棕榈酰转移酶II或其上调剂。在优选的方式中，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂是靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂，更佳地为针对乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II的第79位赖氨酸，使其突变而乙酰化功能丧失或减弱。

可以在多种来源的血小板中转化本发明所述的肉碱棕榈酰转移酶II或其上调剂。包括人体分离获得的血小板、成纤维细胞或巨核细胞、干细胞诱导分化的血小板。所述的干细胞可以包括造血干细胞、胚胎干细胞、诱导干细胞，它们可在体外诱导分化，产生成熟的有功能的血小板。血小板生成是骨髓基质微环境中多种细胞因子协同相互作用的结果，一般而言可通过模拟血小板体内生成的微环境来获得相对完善的血小板体外培养体系。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法

1、CPT2K79Q点突变小鼠的构建

1.1CPT2K79Q/R小鼠

CPT2的氨基酸序列如UniProtKB-P23786。

CPT2K79Q鼠的建立：以C57BL/6品系为背景，进行CPT2基因EXON3(K79Q：AAG→CAG)点突变，在该位点附近设计以NGG结尾的靶点，切割并在体外构建约90bp的donor，外源donor以同源重组方式插入到切割位点。以上模型鼠构建实验方案由耀邦生物公司提供。

子代基因型鉴定通过测序分析，用正向引物测序，通过峰图查看是否在目的位置出现碱基突变。GuideRNA与基因序列如下：

CPT2-sgRNA2：tgtgttttcttgaaaattacagG(SEQ ID NO:1)；

CPT2-sgRNA3：GAAGACAGAAGTGTTGTGTAAGG(SEQ ID NO:2)；

CPT2(K79Q)-Oligo2：

gtggtttgacctgtgttttcttgaaaattacagACAGACAGAGGTGTTGTGTAAGGATTTTGAGAACGGCATTG*G*G(SEQ ID NO:3)；

CPT2(K79R)-Oligo2：

gtggtttgacctgtgttttcttgaaaattacagAAGGACAGAGGTGTTGTGTAAGGATTTTGAGAACGGCATTG*G*G(SEQ ID NO:4)；

1.2同样方法建立CPT2K79R小鼠，区别在于K79R：AAG——AGG点突变。碱基突变鉴定GuideRNA与基因序列如下：

CPT2-sgRNA2：tgtgttttcttgaaaattacagG(SEQ ID NO:5)；

CPT2-sgRNA3：GAAGACAGAAGTGTTGTGTAAGG(SEQ ID NO:6)；

CPT2(K79R)-Oligo2:

gtggtttgacctgtgttttcttgaaaattacagAAGGACAGAGGTGTTGTGTAAGGATTTTGAGAACGGCATTG*G*G(SEQ ID NO:7)。

2、SIRT3基因敲除小鼠

SIRT3敲除小鼠品系背景为C57BL/6N，应用高通量电转受精卵方式获得SIRT3基因敲除小鼠。小鼠均为SPF(Specific Pathogen Free)级别，自由饮水与进食，饲养环境湿度控制在40-70％之间，温度控制在23℃左右，模拟白天12小时黑夜12小时的节律交替循环，由上海交通大学医学院动物科学部门管理与饲养。

3、小鼠基因型鉴定

小鼠编号，剪尾并采用无水乙醇法提取小鼠基因组DNA，用于PCR扩增后，GelImage System 2500凝胶成像系统，紫外照射凝胶成像。

PCR引物

PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR Buffer	5μl
dNTPs(2mM)	5μl
		MgSO4(25mM)	3μl
KOD-Plus聚合酶(1U/μl)	1μl
		鼠尾DNA(100-200μg/ml)	1μl
引物1(10μM)	1.5μl
		引物2(10μM)	1.5μl
引物3(10μM)	1.5μl
		去离子水	补齐50μl
总体积	50μl

PCR反应条件

PCR产物测序并鉴定基因型

将CPT2点突变小鼠的PCR产物与正向引物一起测序，用4PEAKS软件对返还的碱基序列进行鉴定确认无误。

SIRT3-KO小鼠的基因型鉴定：一条单一的500bp条带，提示小鼠为野生型；一条单一的100bp的条带，提示小鼠为敲除型。若同时出现100bp和500bp的条带，提示小鼠是杂合型。

4、人单采血小板的储存和样品收集

向50ml离心管中加入适量的单采血小板(体积不宜超过15ml/管)，用临床用血小板储存袋作为透气膜覆盖50ml离心管的管口并固定，置于水平摇床，依据管内体积决定转速，确保使血小板充分的晃动，并充分与氧气接触进行呼吸作用，同时不触碰到透气膜。

此方法可以在实验室环境中模拟临床上单采血小板的储存并可用于采样，采样完毕。采出的单采血小板样品可以用于血小板计数，流式指标检测，蛋白质收样，血小板活力检测，ATP含量检测等多种用途。

5、小鼠血小板的储存

取小鼠腹主动脉血，在全血中加入可抑制血小板聚集的Apyrase(终浓度为1U/ml)以及PGE1(终浓度0.1μg/ml)，迅速混匀后离心(1050rpm，室温，10分钟)，两次离心后吸出实验组上层血浆，弃去，保留底部的血小板沉淀。将野生型小鼠的血浆平均分配到实验组小鼠和野生型小鼠的血小板沉淀中，使血小板均匀分散并悬浮后按人血小板方法保存。

6、血小板聚集功能的检测

通过常规方法，采用血小板聚集仪，向聚集管中加入3×10⁸个/ml的血小板300μl，并加入所需的抑制剂，轻柔搅拌后37℃孵育3分钟，建立基线并观察5分钟内的聚集曲线变化。

7、血小板凋亡实验

按照常规方法取样血小板，用Tyrodes’s Buffer血小板浓度稀释到10^8个/ml，实验组血小板和对照组血小板各取25μl加入新的EP管中，每管加入5μl的10×BindingBuffer，以及2μl FITC标记的Annexin V，再加入18μl Tyrodes’s Buffer将反应体系补齐到50μl。室温避光孵育15分钟后加入200μl1×Bingding Buffer上机检测，同时应准备一管未标记的血小板作为阴性对照。标记了Annexin V的血小板在标记后一小时内进行检测，FITC阳性的细胞群即为正处于凋亡过程中的血小板。

8、流式检测稳转细胞系凋亡

用胰酶消化贴壁细胞后收集细胞，4℃离心机2000rmp离心5分钟后用PBS洗涤数次(细胞沉淀中加入1ml PBS后静置3分钟，4℃离心机2000rmp，5分钟)来彻底清除残留的EDTA，离心后去除上清，重悬细胞后加入5μl荧光标记的Annexin V并混匀，室温避光的条件下孵育15分钟，加入5μl碘化丙啶，室温避光条件下继续孵育5分钟，补加200μl×BindingBuffer上机检测，1小时之内完成检测。

9、流式检测线粒体电势差

10.1JC1荧光染料检测血小板线粒体电势差的改变：按常规方法配制JC1工作液并用CCCP处理阳性对照组血小板使线粒体膜电位降低，形成阳性对照。取样血小板稀释到10⁸个/ml。取25μl血小板，加入25μlJC1工作液，混匀后37℃避光孵育30分钟，加入1×JC1染色缓冲液200μl，上机检测荧光强度，用红绿荧光的相对比例来表示线粒体去极化的比例。

10.2 TMRM荧光染料检测血小板线粒体电势差的改变

血小板取样稀释同上，50μl稀释液中加入50μlTyrodes’s Buffer和0.1μlTMRM原液，37℃避光孵育30分钟后，加入500μlTyrodes’s Buffer上机检测，TMRM的荧光强度会根据线粒体电势差的改变出现红移，用荧光强度来表示线粒体电势差的高低。

10.3 TMRM荧光染料检测贴壁细胞线粒体电势差的改变

提前一天稳转细胞铺板，并根据实验要求在不同的细胞中加入不同浓度的脂酰肉碱或其他抑制剂。隔天用1:1000的比例用细胞培养液稀释TMRM配制成工作液，给提前准备的细胞换液，放入培养箱中继续培养30分钟。冰PBS洗细胞两遍，用胰酶消化细胞并收集，600g 5分钟离心得到细胞沉淀，细胞继续用PBS清洗2遍后用200μlPBS重悬，上机检测荧光。

10.Mitosox荧光染料检测

采用常规方法利用，将25μl血小板等比例稀释后，加入0.1μlMitosox试剂(5mM)37℃避光孵育30分钟后加入缓冲液200μl检测荧光强度；贴壁细胞染色：600g离心5分钟去上清，用200μlMitosox工作液重悬细胞，37℃避光孵育30分钟后，600g离心5分钟，用PBS洗涤细胞两次后加入200μlPBS重悬细胞后检测。

11.CPT2，CPT2K79Q和CPT2K79R质粒及稳转细胞系

插入有CPT2K79R的pLVX-IRES-ZsGreen1，插入有CPT2K79Q的pLVX-IRES-ZsGreen1，插入有CPT2的pLVX-IRES-ZsGreen1三个质粒由上海桑尼生物科技有限公司合成。慢病毒转染、293T细胞感染、稳转细胞系均通过常规方法进行。

12、血小板内ATP含量的测定

市售购得ATP检测试剂盒，取血小板3×10⁸个，加入EDTA和Apyrase离心后取得血小板沉淀，在沉淀中加入200μlATP检测裂解液，吹散血小板，置于冰上操作。4℃离心机12000g离心5分钟取上清做后续检测。定标，分别将ATP标准液稀释到10，3，1，0.1，0.01μM/l。按照1:9的比例混合ATP检测试剂和ATP检测试剂稀释液。测定ATP浓度：将100μl ATP检测工作液加入检测孔中，室温放置3-5分钟，在不透光的96孔板检测孔中依次加入20μl不同浓度的标准品和待测样品，迅速混匀，至少间隔2秒后在化学发光检测仪(Luminometer)中测定荧光值，拟合标准曲线，并算出待测样品中的ATP含量并对剩余的待测样品进行BCA蛋白定量，来消除因为蛋白量不同所造成的测量误差。

13、线粒体Mitotracker染色

Mitotracker Deep Red FM-special packaging购自Thermofisher公司。提前一天对实验细胞进行处理，24孔板的板底放置圆形玻璃爬片，将细胞铺板。37℃细胞培养箱内培养过夜，确保第二天每孔细胞密度在50％-70％之间。洗去24孔板中的细胞培养基，用PBS清洗两遍。之后在24孔板中加入Mitotracker工作液(1mM的Mitotracker Deep Red稀释到工作浓度100nM)。将24孔板放回37℃细胞培养箱内继续培养30分钟。染色结束后用PBS清洗细胞，在水平摇床上慢摇5分钟后换入新的PBS缓冲液，重复两遍。每孔加入200μl 4％甲醛，在室温中固定10分钟，再次用PBS清洗细胞；在24孔板中每孔加入200μl即用型的DAPI染料，室温环境下染色10分钟，全程避光。在载玻片上滴一滴防淬灭剂(Anti Fade Reagent)然后将爬片从24孔板内取出，吸干水分，在荧光显微镜下随机选取五个视野拍照，并叠加不同的荧光。

14、Seahorse代谢仪实时监测血小板与稳定转染细胞系的线粒体有氧代谢和糖酵解

按照30000个/孔的比例接种贴壁细胞。如需检测药物对细胞呼吸的影响，在接种细胞时同时加入抑制剂。使用Celltak作为细胞粘合剂包被细胞培养板,使悬浮细胞粘附在Seahorse XF96细胞板的底部。实验当天在孔内加入适量的血小板悬液，糖酵解能力检测的实验孔内接种10⁷个血小板，细胞耗氧量检测实验的实验孔内接种2×10⁷个血小板，粘附在Celltak上。

两种Seahorse检测液的配制：

在37℃水浴的同时用1mM氢氧化钠调节PH到7.4，置于37℃水浴锅备用。

线粒体压力试剂盒与糖酵解压力试剂盒中药物的配制与加药方法

1)检测血小板代谢时的加药方案

2)检测稳定转染细胞代谢时的加药方案

从无二氧化碳的培养箱内取出已水化的测试板，将稀释到加药孔浓度的药物分别加入A/B/C三个加药孔中，其中A孔加20μl，B孔加22μl，C孔加25μl。

15、制备牛血清白蛋白与稳定同位素标记的棕榈酸共轭物

取2.267g无脂肪酸的牛血清白蛋白，搅拌下添加到100ml 150mM的NaCl溶液中，置于37℃水浴中保持温度。另制备17mM的BSA Control储存液，-20℃中储存。向44ml 150mM的NaCl溶液中加入30.6mg稳定同位素标记的棕榈酸，70℃水浴下搅拌。另取50ml BSA溶液，分8次加入40ml棕榈酸溶液，37℃水浴下搅拌1小时以上，用150mMNaCl溶液调整体积到100ml，并调节酸碱度到7.4，制成的浓度为1mM的牛血清白蛋白与稳定同位素标记的棕榈酸共轭物，-20℃保存。

取得新鲜采集的单采血小板，在血小板中加入稳定同位素的标记的棕榈酸(终浓度66μM)，在添加了棕榈酸的实验组中同时添加浓度十倍于棕榈酸的L-肉碱(终浓度660μM)，在储存过程中每天取样，收取0-7天储存血小板的样品，每天取3X10⁸个血小板，添加EDTA和Apyase抑制血小板聚集与活化后800g室温离心5分钟，丢弃上清后用缓冲液清洗一遍血小板后进行第二次离心，将血小板沉淀快速投入液氮中速冻，快速终止血小板内的代谢。稳定同位素标记的血小板样品进行代谢流组(Fluxomics)分析，并在透射电子显微镜下观察细胞线粒体的形态以及线粒体内部构造的改变。

16、小鼠ITP模型构建

WT小鼠分别静脉注射NMN、NAC、AMPK抑制剂或NMN+NAC+AMPK抑制剂。30分钟后，首先使用HEMAVET自动血液学分析仪从全血计数中测定基础血小板计数。静脉注射2μg抗CD42b单克隆抗体R300(购自Emfret)清除小鼠血小板。在不同时间点采集眼眶血，监测血小板清除情况和恢复情况。

17、数据分析

以上所有实验均使用Graphpad Prism 6软件进行统计分析并作图，数据结果以MEAN±SD表示，采用Students’Test检验方法计算P值，P值越小则结果越显著，当P值小于0.05时数据具有统计学意义。

实施例1、储存不同天数的血小板质量随着时间增加而衰退

取刚刚采出的新鲜单采血小板，采用临床上使用的标准一次性血小板常温储存袋(材料为丁酰柠檬酸三正己酯增塑软聚氯乙烯压延膜)(购自四川南格尔公司)储存，在实验室细胞房内无菌操作台中布置了水平摇床来模拟临床上单采血板的储存条件，在标准条件下放置0至7天，每天采集储存不同天数的单采血小板，对血小板的功能和代谢进行追踪。

实验发现，血小板在储存过程中会逐渐丧失对激活剂的响应能力，并且在储存至3-4天的时候，血小板对刺激剂的反应能力快速下降。与此同时，血小板的线粒体电势差(Mitocondrial Potential)也随着储存时间的增加而下降。代表细胞凋亡(Apoptosis)的指标，磷脂酰丝氨酸的暴露水平在储存过程不断增加。血小板对激活剂的反应性(Agregation)也在第4天发生显著的降低。血小板内的活性氧(ROS)水平在储存进行到第3天时发生爆发式的增长(图1A)。

通过对Caspase3进行Western Blot分析，发现血小板在储存过程中激活了Caspase3，引发了Caspase介导的凋亡通路，造成细胞凋亡。随着储存时间的增加血小板内的Caspase3活化程度也呈现出增加的趋势。Caspase3切割体的蛋白丰度代表了Caspase3的活化程度(图1B)。

可见血小板在储存过程中对刺激剂的响应能力丧失，凋亡增加，活性氧积累，线粒体去极化等现象，而且在储存到3-4天时有一个快速的转变。为了进一步阐明这些现象背后的影响因素并予以干预，需要对血小板的代谢和死亡过程进行深入研究。

实施例2、线粒体来源的蛋白差异化表达导致血小板质量降低

1、血小板样品的乙酰化定量蛋白组学研究发现，蛋白的乙酰化水平发生改变

收集储存0至6天的储存血小板样品，通过将TMT标记，高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列技术结合起来，对血小板进行乙酰化定量蛋白质组学研究。

首先将细胞裂解并提取蛋白，用胰酶酶解蛋白成肽段，对其进行TMT标记后做高效液相色谱分级，之后进行液相色谱-质谱串联分析，得到的二级质谱数据在Maxquant(V1.5.2.8)中进行检索。最后对数据进行生物信息学分析。此次实验中共鉴定到3204个具有定量信息的蛋白质，以1.3倍为变化阈值，T-Test P-Value<0.05为标准，那么在定量到的蛋白中，1d/0d比较组中有14个蛋白发生表达上调，6个蛋白发生表达下调。2d/0d比较组中，7个蛋白表达上调，6个蛋白表达下调。3d/0d比较组中，28个蛋白发生表达上调，21个蛋白发生表达下调。4d/0d比较组中，41个蛋白发生表达上调，225个蛋白发生表达下调。5d/0d比较组中，28个蛋白发生表达上调，11个蛋白发生表达下调。6d/0d比较组中，38个蛋白发生表达上调，16个蛋白发生表达下调。进一步对表达改变的血小板进行乙酰化修饰分析发现，当血小板在常规储存条件下储存到3-4天时，血小板内发生乙酰化改变的蛋白数量快速升高(图2A)。

2、确定发生乙酰化修饰的蛋白定位

对发生乙酰化程度改变的蛋白质做进一步生物信息学分析，包括从KEGG通路、亚细胞结构定位等方面进行了详细分析。

使用Wolfpsort软件对于储存第4天时出现乙酰化差异表达的蛋白进行了亚细胞结构的分类统计，发现来自线粒体的蛋白种类高达1/4(图2B)，这提示当血小板储存到4天时，大量线粒体蛋白发生乙酰化修饰程度的变化。

在将不同比较组中的差异蛋白进行了KEGG通路富集之后，本发明人进一步对其进行了聚类分析，旨在找到比较组中差异蛋白功能的相关性。根据富集分析得到的富集检验P值，使用分层聚类的方法将不同组中的相关功能聚集到一起，绘制为热图。热图横向代表了不同比较组的富集检验结果，纵向代表相关功能的描述。不同比较组的差异表达蛋白与功能描述对应的色块表示富集程度的强弱，颜色越红表示富集程度越强，颜色越蓝表示富集程度越弱。分析热图可知，血小板活化通路，脂肪酸代谢相关通路上的富集程度强，可见这两条通路的相关蛋白在血小板储存过程中被乙酰化修饰调控(图2C)。

实施例3、CPT2分子活性降低可能与血小板质量降低相关

实施例1-2分别进行了人类血小板的蛋白组学分析，发现在两次分析中都可以看到大量的脂肪酸代谢相关的酶乙酰化程度随储存时间的变化而发生变化。经过进一步分析，本发明人发现肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)分子在储存过程中发生了随着时间变化的乙酰化，并且是在79位赖氨酸(CPT2K79)处发生乙酰化，说明CPT2蛋白79位赖氨酸的修饰情况明显可以随储存时间发生改变，79位赖氨酸的乙酰化可以改变CPT2分子的功能(图3A)。

本发明人通过合成含有79位赖氨酸乙酰化的CPT2的肽段制备了K79位乙酰化的CPT2分子的抗体。点杂交实验验证，此抗体只与乙酰化多肽结合，不识别非乙酰化的多肽(图3B)。采用此抗体检测了储存0天至7天的人血小板样品中CPT2分子79位乙酰化的程度，通过免疫沉淀与Western Blot实验的检测，发现储存过程中CPT2确实会发生乙酰化。并且CPT2分子79位乙酰化的程度随着储存时间不断增加，在血小板储存到第二天的时候达到乙酰化峰值，随后CPT2分子79位的乙酰化缓慢下降(图3C)。

实施例4、CPT2功能障碍导致的脂肪酸代谢障碍直接影响了血小板的质量

考虑到CPT2分子位于线粒体内膜，是脂肪酸氧化过程中必不可少的催化酶，催化脂酰肉碱分裂为脂肪酰辅酶A和肉碱，把脂肪酸搬运到线粒体内为后续的脂肪酸氧化做准备，提示CPT2蛋白活性减少，可能会通过能量代谢途径影响血小板的质量。

1、血小板中脂肪酸代谢途径受阻

谷氨酰胺和脂肪酸是机体重要的三大能源物质。本发明人利用液相色谱质谱联用仪做了C13追踪代谢途径的实验，向可以进行气体交换的血小板专业储存袋中分别添加C13标记的棕榈酸与肉碱、C13标记的葡萄糖和C13标记的谷氨酰胺。

在添加了稳定同位素标记的棕榈酸和肉碱的实验组中，脂肪酸的代谢明显被抑制，三羧酸循环的中间代谢物的标记率随着储存天数的增加而降低，说明随着储存天数的增加，越来越少的脂肪酸经过氧化进入三羧酸循环。脂肪酸的氧化途径在血小板的储存过程中发生了障碍。在储存到第7天时，苹果酸与富马酸的标记率不足百分之十。说明在血小板储存过程中脂肪酸氧化分解的比率也下降了(图4A)。

2、脂肪酸代谢中，受CPT2功能障碍影响，长链脂酰肉碱(C16:0、C18:0)随着时间的增加发生了堆积

脂肪酸是机体重要的能量来源，脂肪酸在细胞质中经过脂酰CoA合成酶的作用生成脂酰CoA。长链的脂酰CoA不能自由通过线粒体膜，长链的脂酰CoA必须通过定位于线粒体外膜上的肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的催化，与肉碱结合形成脂酰肉碱才可以进入线粒体基质中进行下一步氧化分解。转运到线粒体内的脂酰肉碱通过CPT2的催化，再次生成脂酰CoA和肉碱。脂酰CoA进入线粒体基质中，在β氧化多酶复合体的有序催化作用下生成乙酰CoA，乙酰CoA最终进入三羧酸循环，彻底氧化供能。

在观察到血小板内脂肪酸代谢受阻的现象之后，采用过液相色谱质谱联用仪追踪了脂肪酸代谢中间产物脂酰肉碱的含量，发现在血小板的血浆内，长链脂酰肉碱(C16:0、C18:0)发生了堆积，随着储存时间的增加，血浆中脂酰肉碱的含量升高。血浆内脂酰肉碱的水平代表着脂肪酸代谢的状态，游离的脂肪酸必须通过代谢为脂酰肉碱的途径才能通过线粒体膜上的转运体的转运进入线粒体内部，进行下一步的脂肪酸氧化代谢，为细胞提供能量。脂酰肉碱的含量在血小板储存前期发生了堆积，说明血小板在储存前期进行了非常活跃的脂肪酸代谢，大量的脂肪酸代谢为脂酰肉碱，为脂肪酸完全氧化供能做准备，但CPT2蛋白活性减少，长链脂肪酸无法进入线粒体，无法代谢产生能量，长链脂肪酸脂酰肉碱在细胞内堆积这种异常现象表明，血小板的脂肪酸代谢障碍与CPT2的催化酶功能障碍相关(图4B)。

3、脂酰肉碱浓度的增加危害血小板的储存

血小板内脂酰肉碱堆积的现象吻合了血小板在储存至3-4天时ROS增加和凋亡的现象。因此可以推测脂酰肉碱这个有害的脂肪酸中间代谢产物通过某种机制引发了代谢障碍，从而引发了细胞的凋亡。

为了验证脂酰肉碱对血小板的危害，在新鲜分离血小板中分别添加了棕榈酸、肉碱、棕榈酸加肉碱和棕榈脂酰肉碱，当血小板储存到第二天时，测定血小板活力并检测一系列线粒体相关的指标，包括线粒体电势差与线粒体活性氧水平。流式检测发现，脂酰肉碱浓度的异常提高不利于血小板的储存，添加了棕榈脂酰肉碱的细胞要比对照组细胞凋亡率高，线粒体电势差低，线粒体内活性氧水平更高。同时可以看到，同时添加了脂肪酸加肉碱的实验组，血小板的状态要远远差于只添加了肉碱或者只添加了棕榈酸的实验组。这进一步说明了棕榈酸与肉碱反应得到的中间代谢物棕榈脂酰肉碱对血小板的储存有不利的作用，脂酰肉碱是一种十分有害的脂肪酸中间代谢产物(图4C)。

4、CPT2K79位乙酰化对脂酰肉碱的影响

为了进一步验证CPT2K79位点的乙酰化与脂酰肉碱堆积的相关性，构建了CPT2分子/CPT2K79R突变/CPT2K79Q突变的三个质粒，通过三质粒系统包装慢病毒，并对293T细胞系进行感染，将外源基因整合在宿主基因组中，并通过流式荧光分选筛选构建了四株稳转细胞系。CPT2K79R是将CPT2分子第79位赖氨酸突变为精氨酸，使79位丧失乙酰化的能力。CPT2K79Q是将CPT2分子第79位赖氨酸突变为谷氨酰胺，是在79位模拟乙酰化的模型。

随后，对四株稳转细胞系的各项指标进行了研究，液相色谱质谱连用仪检测四个细胞稳定转染细胞系内脂酰肉碱的含量发现，相比于空载对照组，CPT2K79Q突变的细胞株内积累了更多的脂酰肉碱，CPT2K79R细胞株内积累的脂酰肉碱含量明显低于CPT2K79Q细胞株内的脂酰肉碱含量。

对四个稳定转染的细胞系进行荧光染色，流式结果发现CPT2K79Q细胞系的状态明显不如CPT2K79R细胞系的状态，表现为CPT2K79Q活性氧的累积和细胞凋亡率要明显高于其他三个稳定转染细胞系，且CPT2K79R细胞系内活性氧的累积和细胞凋亡率要明显低于其他三个稳定转染细胞系(图4D)。

实验证明，CPT2分子79位的突变显著影响了细胞内脂酰肉碱的积累，细胞凋亡率以及线粒体活性氧的累积。CPT2分子79位的乙酰化可以抑制其功能，79位乙酰化的CPT2无法催化脂酰肉碱分裂为脂肪酰辅酶A和肉碱，致使脂酰肉碱在细胞内堆积。同时脂酰肉碱的堆积也影响了细胞的状态。脂酰肉碱作为一种有毒的代谢中间产物，常在临床上作为一种脂肪酸代谢异常的指标，随着脂酰肉碱浓度的累积，细胞的凋亡率以及线粒体内活性氧的水平均有提高。

上述实验证实，CPT2K79Q细胞系中CPT2的功能出现障碍，脂酰肉碱累积。CPT2K19R细胞系则作用反之；而CPT2功能障碍必然引起脂酰肉碱无法进行后续代谢，在线粒体内堆积。

用脂酰肉碱处理CPT2和CPT2突变的稳定转染细胞系4小时后，对细胞行固定，并使用电镜观察不同细胞系使用棕榈酰脂酰肉碱处理或未处理的线粒体的状态和结构。对比没有添加棕榈脂酰肉碱的三组细胞的线粒体形态，可以观察到CPT2K79Q细胞系的线粒体出现了结构异常，具体表现在线粒体中嵴形态和排列的异常，嵴结构变得紊乱，断裂，模糊不清，且线粒体中央出现空亮区域，这表明线粒体内膜结构被严重破坏了。观察CPT2K79R细胞系的线粒体和CPT2细胞系的线粒体，可以看到整齐排列且清晰的嵴结构，空量区域较少，表明细胞系内线粒体的状态较为健康。

当在三个细胞系中加入低浓度的棕榈脂酰肉碱并孵育4小时后，可见添加了棕榈脂酰肉碱的线粒体的状态明显要差于不添加棕榈脂酰肉碱的实验组。添加了棕榈脂酰肉碱的细胞中，线粒体内膜进一步空泡化，空泡与空泡相互融合使嵴变为多囊状结构。另外还发现添加了脂酰肉碱的细胞内存在较多的电子密度致密的吞噬体，有可能是吞噬受损线粒体后的溶酶体，进一步说明线粒体受损严重。值得注意的是低剂量的脂酰肉碱处理对CPT2K79R细胞系的线粒体状态影响并不大，即使添加了脂酰肉碱，CPT2K79R细胞系的线粒体也未出现多囊状嵴结构。棕榈脂酰肉碱对CPT2功能有障碍的CPT2K79Q细胞系的作用尤其明显，对CPT2细胞系的状态也较为明显(图4E)。

通过以上实验可以得到结论：

1、棕榈脂酰肉碱对线粒体有毒性作用，可以影响细胞线粒体的形态进而影响细胞的代谢能力。

2、CPT2K79Q细胞因为CPT2分子发生结构性乙酰化，CPT2的催化能力下降，本身线粒体会积累更多的脂酰肉碱，造成线粒体形态改变，代谢能力下降。额外添加脂酰肉碱的情况下，CPT2无法将脂酰肉碱代谢，导致线粒体损伤加剧。

3、CPT2K79R细胞因为CPT2分子不能发生乙酰化，CPT2的催化能力十分稳定，细胞本身线粒体中较少堆积脂酰肉碱，所以线粒体形态良好。在额外添加脂酰肉碱的情况下，CPT2依然有足够的活力保证脂酰肉碱进行代谢，在脂酰肉碱浓度过高的情况下也可以保证细胞内线粒体的结构不被损伤。

实施例5、直接改变CPT2的功能对血小板质量的影响

从前述实验可知，在血小板质量降低的过程中，CPT2表达异常，并从其对血小板代谢途径的影响证明由于CPT2异常导致了脂肪酸代谢异常，最终影响了血小板的质量，为了进一步找到提高CPT2功能并保障血小板质量的方法，进行了以下实验。

1、蛋白乙酰化抑制剂对血小板质量的影响

tip60和p300都是典型的乙酰转移酶家族的成员。tip60属于MYST乙酰基转移酶家族，在细胞周期检查点激活以及细胞凋亡自噬等进程中发挥重要的调控作用。同时还可以在糖代谢等多种代谢通路中发挥作用。p300是组蛋白乙酰化酶家族中的重要一类，因为其分子量为300kd而得名p300，p300在细胞增殖，凋亡等过程中发挥调节作用。P300与tip60在线粒体中表达，并可以在线粒体内发挥乙酰基转移酶的作用，乙酰化非组蛋白，改变蛋白活性。

在新鲜采出的单采血小板中加入tip60和p300的抑制剂，在标准储存条件下储存血小板7天，7天之后检测储存单采血小板的各项指标，包括血小板对刺激剂的反应活性，血小板凋亡程度，线粒体电势差和线粒体氧自由基水平。

实验发现在添加了乙酰基转移酶抑制剂之后，不管是p300的抑制剂还是tip60的抑制剂，都可以通过抑制血小板内蛋白的乙酰化，有效提升单采血小板的质量。添加了tip60抑制剂(添加量10uM)和p300(添加量10uM)抑制剂的实验组对比control组，有效的提高了血小板对刺激剂的反应活性，同时提高了血小板线粒体电势差，减少了血小板的凋亡程度和线粒体活性氧的含量(图5A)。这说明抑制血小板内蛋白的乙酰化，可以提升单采血小板的储存质量。从而说明血小板内蛋白质乙酰化的程度与血小板储存质量密切相关。降低血小板内蛋白的乙酰化程度有利于提升血小板的质量。

2、线粒体蛋白乙酰化抑制剂对血小板的影响

沉默信息调节因子2相关酶类3(SIRT3)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶，是Sirtuin家族成员之一，是线粒体中关键的蛋白去乙酰化酶，其可以作用于CPT2等线粒体蛋白，使其去乙酰化。本实验对SIRT3的作用进行了研究。

(1)SIRT3基因敲除小鼠的血小板质量降低

首先，采用SIRT3基因敲除小鼠的血小板进行了体外储存实验。在无菌环境中制备得到了野生型小鼠与SIRT3敲除型小鼠的血小板沉淀，之后用野生型小鼠的血浆重悬血小板，避免血浆内因素对血小板储存的效果产生干扰。在模拟临床上的单采血小板标准储存条件下，对小鼠的富血小板血浆进行储存，并每天取样，从血小板凋亡率、线粒体电势差、线粒体活性氧累积的角度去评估血小板的状态。

实验发现相较于野生对照型小鼠，SIRT3基因敲除的小鼠的血小板在储存过程中凋亡更快，线粒体内活性氧积累得更多，线粒体电势差也下降得更快(图5B)。这证实了缺少SIRT3的血小板，因线粒体蛋白缺少了去乙酰化的机制，导致线粒体蛋白质乙酰化程度增高，从而影响了血小板的储存状态。这进一步验证了血小板蛋白的乙酰化去乙酰化修饰在血小板储存老化过程中可能发挥至关重要的作用。

(2)SIRT3敲除小鼠CPT2分子79位乙酰化程度高

对比野生型小鼠的血小板，SIRT3敲除小鼠血小板中的CPT2分子79位的乙酰化程度更高。在经过24小时的储存之后，野生型小鼠和SIRT3敲除小鼠血小板内CPT2分子的79位乙酰化程度均有提升，并且SIRT3敲除小鼠的CPT279位乙酰化程度大幅上升。由于血小板内缺少了SIRT3分子，敲除小鼠的血小板在储存过程中，不能进行有效的去乙酰化修饰，导致CPT2分子79位乙酰化程度大幅升高(图5C)，影响了CPT2分子的正常生理功能，造成血小板的脂肪酸代谢障碍，严重降低了血小板的质量。

(3)SIRT3基因敲除小鼠血小板的脂酰肉碱含量增高

在小鼠血小板储存到0天与1天时分别收样，并检测储存到0天与1天时野生型与SIRT3敲除型小鼠的血小板中脂酰肉碱的含量，主要检测了长链脂酰肉碱(棕榈脂酰肉碱和硬脂脂酰肉碱)的含量。

结果显示，野生型小鼠血小板内脂酰肉碱含量要明显低于SIRT3基因敲除小鼠血小板内脂酰肉碱的含量。并且血小板储存过之后，长链脂酰肉碱的水平相较于新鲜血小板内脂酰肉碱的水平有所升高，并且SIRT3敲除的小鼠的血小板内脂酰肉碱水平与对照组相比更高。这说明随着血小板储存时间的增长，血小板内长链脂酰肉碱的含量会持续积累。并且线粒体蛋白乙酰化的程度可以显著影响血小板内长链脂酰肉碱含量(图5D上图)。这说明血小板内脂肪酸代谢相关的酶的乙酰化程度或发生改变，从而影响了血小板线粒体内的脂肪酸代谢，与CPT2酶活性受损的结果一致，进一步验证了CPT2乙酰化、脂肪酸代谢障碍以及血小板质量受损的相关性。

(4)激活SIRT3对血小板质量的影响

SIRT3是NAD(+)依赖性的脱乙酰基酶，SIRT3的酶活性受到细胞中NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADH含量的调节，细胞内NAD+含量升高时，可以激活SIRT3酶活性，相反，当NADH含量升高时，则可抑制SIRT3酶活性。

烟酰胺(NAM)作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体，可以使胞内NAD+含量升高从而增强SIRT3的活性，所以NAM也是SIRT3的激动剂，添加NAM可以间接上调SIRT3的去乙酰化活性。烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)是催化烟酰胺腺嘌呤二核苷(NAD+)合成的限速酶。

烟酰胺核苷(Nicotinamide riboside,NR)也是NAD[+]前体的一种，烟酰胺核苷可以通过烟酰胺核糖苷激酶的催化来增加NAD[+]水平。NAD[+]水平升高可以激活SIRT1和SIRT3，最终可以降低线粒体蛋白的乙酰化程度并增强氧化代谢。

P7C3可以结合NAMPT，增强了NAMPT酶的活性，从而增强NAMPT介导的NAD补救合成途径来增加细胞内NAD的水平。

SBI-797812是一种在结构上类似于烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂的化合物，可以阻断NAMPT的抑制剂与NAMPT的结合，SBI-797812将NAMPT反应平衡转向NMN形成，增加NAMPT对ATP的亲和力，稳定His247处的磷酸化NAMPT，促进焦磷酸盐副产物的消耗，并通过NAD+钝化反馈抑制。

为了验证这些物质通过提高细胞内NAD水平的化合物直接或间接激活SIRT的能力，取新鲜单采血小板，分组后在血小板中分别添加了NMN(0.1mM、0.5mM)、NR(0.1mM、0.5mM)、P7C3(0.5uM、2.5uM)、SBI797812(2uM、10uM)四种化合物，来研究这四种可以提高NAD水平的化合物对血小板质量的影响。

在血小板储存到第7天时对血小板进行取样，通过流式分析血小板的凋亡率，血小板线粒体的电势差，血小板线粒体内活性氧的程度。并通过血小板聚集实验来检测不同实验组的血小板对刺激剂的反应活力。

实验结果显示，与对照组相比，添加了四种化合物的实验组中(无论是高浓度实验组还是低浓度实验组)，血小板的质量均有提高，并且这种改善的效果具有浓度依赖性，添加的小分子化合物的浓度越高，血小板质量的改善程度就越大。具体体现在血小板对刺激剂的反应程度的提高，线粒体电势差的提高以及凋亡率和活性氧水平的降低(图5D下图)。

这说明不论是通过提高前体浓度来提升NAD+浓度还是通过提高NAMPT酶的活性来提高NAD+的浓度都可以在不同程度上改善血小板的质量。这也说明SIRT3的活性对血小板的保存质量至关重要。降低血小板线粒体内蛋白的乙酰化水平可以显著提升血小板的质量。

3、CPT2K79位乙酰化

前述结果中发现，人和小鼠的CPT2K79位乙酰化在CPT2蛋白的表达和功能异常中起到关键的作用，从而对血小板的质量造成了影响。因此，比对了数种动植物CPT2分子的氨基酸序列，发现在哺乳动物中，CPT2是一个保守的蛋白。大部分哺乳动物(人、小鼠等)的CPT2蛋白79位是赖氨酸，但是大鼠CPT2分子的79位是精氨酸(R)，这就表明大鼠是天然的CPT2K79R突变的生物(图5E)，因此对大鼠的血小板是否对脂酰肉碱影响程度进行了验证。

采用腹主动脉抽血的方式采取了野生型大鼠和野生型小鼠的全血，之后分别制备了大鼠和小鼠的富血小板血浆(PRP)，进行血小板的储存实验，并且分别设置了2个额外添加棕榈酰脂酰肉碱的实验组，浓度设置梯度(2μM和10μM)，在储存过程0-4天中分别检测血小板的凋亡率，线粒体内活性氧的含量以及线粒体电势差的改变。

实验发现，大鼠的血小板在储存过程中，无论是血小板凋亡率还是线粒体活性氧的含量都比小鼠要低，而线粒体电势差却比小鼠要高，表明大鼠血小板的状态明显优于小鼠的血小板(图5F)。比较1天和2天的实验结果发现，在血小板储存过程中添加了脂酰肉碱并不会使大鼠血小板的状态发生明显改变，但是脂酰肉碱的添加有效的降低了小鼠血小板的状态，并且这个效应呈现出浓度依赖的趋势。

在野生型大鼠和野生型小鼠血小板储存期间，每天采取血小板的样品用于液相色谱质谱检测脂酰肉碱的含量。分析棕榈脂酰肉碱和硬脂酰肉碱的变化趋势可以发现，大鼠新鲜的血小板中脂酰肉碱的含量明显低于小鼠新鲜的血小板中脂酰肉碱的含量，这说明大鼠CPT2分子79位的突变可以提升CPT2的催化活性。在储存过程中，大鼠血小板内脂酰肉碱的含量平稳变化，在储存到第3天时有轻微的积累。而小鼠血小板内脂酰肉碱的含量随储存时间的增加剧烈波动，在储存到第2天时脂酰肉碱含量骤然升高，之后随着大部分血小板的凋亡极速降低(图5G)。可见大鼠CPT2K79R模型的血小板可以有效抵御脂酰肉碱在细胞中的积累，保证脂肪酸代谢的正常代谢，从而保证细胞免于过早凋亡。

这个实验结果再一次印证了CPT2蛋白79位的乙酰化与脂酰肉碱的积累、血小板的质量息息相关。抑制CPT2蛋白79位的乙酰化可以延缓血小板的凋亡。因此控制CPT2蛋白79位的氨基酸对于血小板的质量有关键的作用。

实施例6、细胞能量代谢关键通路与CPT蛋白以及血小板质量的相关性

AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)具有调节机体的能量代谢，维持能量供求平衡的功能。当细胞内能量水平降低时，可以引发AMPK的活化，调控氧化和合成的代谢途径。

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶，糖代谢生成的乙酰辅酶A可以在ACC的作用下合成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A是脂肪酸合成的第一步产物，其可以通过负反馈抑制棕榈酸转移酶1(CPT1)的活性，从而抑制线粒体的脂肪酸氧化。ACC是AMPK的下游靶点之一，激活的AMPK可以使ACC磷酸化，从而抑制其功能，减少丙二酰辅酶A合成，增加CPT1的活性从而促进脂肪酸氧化(图6A)。

本发明实施例的研究发现，在血小板储存过程中，ATP发生了快速地消耗，ADP/ATP比值上升引发AMPK的活化。经过Western Blot实验的验证，发现AMPK确实在血小板中发生磷酸化而激活了，AMPK的下游底物乙酰辅酶A羧化酶也发生了磷酸化，ACC的活力因为发生磷酸化而降低，从而其代谢产物丙二酰CoA浓度下降，丙二酰CoA对CPT1的抑制作用减弱，CPT1催化大量脂酰肉碱进入线粒体并堆积，导致CPT2功能障碍。

为了验证AMPK活化对血小板的影响，在血小板中添加了AMPK的抑制剂Dorsomorphin 2HCl(1uM、4uM)和AMPK的激动剂AICAR(0.1uM、0.5uM)。并在血小板储存到第4天时，采用流式细胞术的方式检测实验组和对照组血小板各项指标的差异。

实验结果显示，添加了AMPK抑制剂的实验组中，血小板对刺激剂的反应活性，细胞凋亡程度，线粒体活性氧的程度以及线粒体电势差都有不同程度的好转，实验结果证明抑制了AMPK的活化对血小板的储存有保护作用。而在添加了AMPK激动剂的实验组血小板中，发现实验组与对照组相比，激活AMPK通路既不利于血小板对刺激剂的反应活性，又增加了血小板的凋亡率，同时对血小板的线粒体功能也十分有害，线粒体电势差显著降低的同时线粒体内活性氧的水平也有所升高(图6B)。

同时，这种添加了AMPK刺激剂或抑制剂后呈现出的实验结果有明显的浓度依赖性。实验结果证明，抑制血小板中AMPK通路的活化可以有效保护储存血小板的质量，而抑制AMPK通路的活化，则可以减少CPT1对脂肪氧化的催化，减少进入线粒体的脂肪肉碱，从而降低CPT2的负担，因此AMPK通路抑制剂可以间接影响CPT2的蛋白功能，减少其产物脂酰肉碱的堆积。

实施例7、抗氧化剂减少活性氧堆积，间接改善CPT2的功能

在之前的实验中，将活性氧的含量作为衡量血小板质量的指标之一。考虑到细胞的凋亡与活性氧的积累密切相关，推测抑制血小板中活性氧的生成与累积可以提高储存血小板的质量，减少血小板的凋亡率。为了验证这一推测，在新鲜采出的单采血小板中加入抗氧化剂，并在储存到第7天时对血小板的活性氧含量、凋亡率和线粒体电势差进行检测。

N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种常用的抗氧化剂，作为一种含巯基的化合物，NAC具有清除并抑制氧自由基合成的功能，NAC进入细胞后可以生成半胱氨酸，半胱氨酸可以促进谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽正是体内对抗氧化应激的最主要武器。此外NAC还可以通过抑制细胞色素C的释放来抑制Caspase3的活化，直接抑制细胞凋亡。

美司那(Mesna，α-巯基乙基磺酸钠盐)是一种临床上广泛应用的化疗保护剂，该药物具有明显的过氧化物酶活性，同时美司那也可以保护超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的抗氧化活性。

谷胱甘肽(GSH)具有抗氧化的作用和解毒的作用，谷胱甘肽的结构中含有一个活泼的巯基(-SH)易被氧化脱氢，这一基团使得GSH成为体内重要的自由基清除剂，保护蛋白质和酶分子中的巯基。

根据实验结果发现，对比Control实验组，N-乙酰半胱氨酸(添加量5mM)、美司那(添加量50uM)、谷胱甘肽(添加量200uM)三种具有抗氧化作用的小分子抑制剂均可以不同程度上减少线粒体内活性氧的累积。并且添加了抗氧化小分子抑制剂的实验中，血小板对刺激剂的反应活力以及线粒体电势差都得到了保护。与此同时实验组血小板的凋亡率也要低于对照组(图7)。这个实验进一步说明，减少氧自由基的含量对血小板的质量有明显的改善作用。

实施例8、CPT2功能上调剂、CPT1抑制剂和抗氧化剂的组合显著改善了体外和体内的血小板存活

前述实验证实了NAD+耗竭、CPT2 K79乙酰化、AMPK激活、酰基肉碱和mtROS积累是血小板储存损伤的主要特征。而NAD+前体NMN、ROS清除剂NAC和AMPK抑制剂(AMPKi)分别显著提高了储存血小板的质量。从而，NMN、NAC和AMPK抑制剂联合使用对血小板储存损伤的影响值得进一步研究。

首先研究它们对血小板储存过程的影响。图8A中显示的结果表明，NMN、NAC和AMPK抑制剂三种化合物的组合在改善储存的血小板质量方面比其中任何一种都好得多，这使血小板凋亡减少了一半，并将血小板活性提高到对照组的约4倍。

在血小板输注中不希望从循环中快速清除储存的血小板。为了评估上述化合物对体内储存的血小板质量的影响，使用了两种小鼠输血模型。在第一个模型中，储存的人血小板被输注到免疫缺陷NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)小鼠。添加NMN+NAC+AMPKi(NMN 0.5mM,NAC 5mM,AMPKi4uM)或PBS作为对照，将人血小板浓缩物在体外储存6天。然后用生物素标记它们并输注给NCG小鼠。血小板计数在前0.5小时内显著下降。然而，与对照组相比，NMN+NAC+AMPKi组的血小板清除率较低(图8B)。在另一组模型中，小鼠PRP在体外储存1天，添加NMN、NAC、AMPK抑制剂、NMN+NAC+AMPK抑制剂(NMN 0.5mM,NAC 5mM,AMPKi4uM)或PBS作为对照。然后用生物素标记血小板并输注给WT小鼠。NMN、NAC或AMPK抑制剂储存的血小板在体内的存活率高于对照，并且存在三种化合物组合显著优于单用(图8C)。

实施例9CPT2上调剂、CPT1抑制剂和抗氧化剂的组合显著改善了免疫性血小板减少症(ITP)的血小板存活率

ITP是一种自身免疫性疾病，其特征是血小板计数低，可导致致命性出血。以往的研究表明，自身抗体存在的ITP患者的血小板会发生损伤和凋亡，因此寿命较短。为了评价NMN、NAC或AMPK抑制剂对ITP患者血小板存活的作用，通过尾静脉注射低剂量抗CD42b抗体R300建立ITP小鼠模型。

结果显示，NMN、NAC或AMPK抑制剂组的血小板存活率和血小板计数恢复速率高于对照组，尤其是NMN+NAC+AMPKi组(用量1μmol NMN，10μmol NAC，8nmol AMPKi)(图8D)。

CPT2参与的胞内作用机制示意图如图8E。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海循曜生物科技有限公司

<120> 一种新的改善血小板质量的方法

<130> 215293

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 寡核苷酸

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Claims

1.一种肉碱棕榈酰转移酶II或其上调剂在制备组合物中的应用，所述组合物具有以下一种或多种功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括选自下组的一种或多种：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性的物质；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间的物质。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括选自下组的一种或多种：

靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂；较佳地，所述降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质是蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂包括降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是线粒体蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是CPT2特异性的；较佳地，所述乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II第79位赖氨酸；较佳地，所述试剂包括：定点突变试剂或定点修饰试剂；较佳地，所述降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂包括基因编辑、基因敲除、siRNA、microRNA、或小分子下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是SIRT3或其激活剂；

CPT1抑制剂；较佳地，所述CPT1抑制剂包括CPT1自身抑制剂、上游AMPK抑制剂、ACC激动剂；较佳地，所述CPT1抑制剂包括：Malonyl-CoA、Etomoxir、Perhexiline maleate、Dorsomorphin 2HCl；

蛋白乙酰化抑制剂；较佳地包括：赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂，线粒体蛋白乙酰化抑制剂，或其激活剂或表达上调剂；较佳地，所述赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂包括：tip60抑制剂或p300抑制剂；较佳地，所述线粒体蛋白乙酰化抑制剂包括：SIRT3；较佳地，SIRT3的激活剂包括：提高NAD[+]前体浓度的试剂或提高NAMPT酶活性的试剂；较佳地，所述提高NAD[+]前体浓度的试剂包括：烟酰胺单核苷酸，烟酰胺，烟酰胺核苷；较佳地，所述提高NAMPT酶活性的试剂包括：P7C3，SBI-797812；

AMPK抑制剂；较佳地包括：Dorsomorphin 2HCl；

抗氧化剂；较佳地包括：N-乙酰半胱氨酸，美司那或谷胱甘肽；

重组表达肉碱棕榈酰转移酶II的表达构建物；

促进肉碱棕榈酰转移酶II基因启动子驱动能力的上调剂；或

肉碱棕榈酰转移酶II基因特异性microRNA的下调剂。

4.一种体外储存血小板和/或提高体外储存血小板质量的方法，其特征在于，所述方法包括：在储存血小板时，进行包括选自下组的处理：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间；或(d)添加活性的肉碱棕榈酰转移酶II。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用包括选自下组的肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂进行处理：

靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂；较佳地，所述降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质是蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂包括降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是线粒体蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是CPT2特异性的；较佳地，所述乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II第79位赖氨酸；较佳地，所述试剂包括：定点突变试剂或定点修饰试剂；较佳地，所述降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂包括基因敲除、siRNA、microRNA、或小分子下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是SIRT3或其激活剂；

AMPK抑制剂；较佳地包括：Dorsomorphin 2HCl；

重组表达肉碱棕榈酰转移酶II的表达构建物；

促进肉碱棕榈酰转移酶II基因启动子驱动能力的上调剂；或

肉碱棕榈酰转移酶II基因的特异性microRNA的下调剂。

6.一种组合物，其具有以下一种或多种功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量；所述组合物包括肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂，包括选自下组的一种或多种：(a)降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质；(b)提高肉碱棕榈酰转移酶II活性的物质；(c)提高肉碱棕榈酰转移酶II的表达、稳定性或有效作用时间的物质；较佳地，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括选自下组的一种或多种：

AMPK抑制剂；较佳地包括：Dorsomorphin 2HCl；

重组表达肉碱棕榈酰转移酶II的表达构建物；

促进肉碱棕榈酰转移酶II基因启动子驱动能力的上调剂；或

肉碱棕榈酰转移酶II基因特异性microRNA的下调剂。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包括：蛋白乙酰化抑制剂、抗氧化剂和CPT1抑制剂；

较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂为烟酰胺单核苷酸，所述抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸，所述CPT1抑制剂为AMPK抑制剂；

更佳地，所述烟酰胺单核苷酸、N-乙酰半胱氨酸和AMPK抑制剂按照摩尔比为(50～500)：(500～5000)：1；更佳地为(80～300)：(800～3000)：1；

更佳地，所述的烟酰胺单核苷酸在血小板或含有血小板的物质中的添加浓度为0.1～5000uM；或，所述的N-乙酰半胱氨酸在血小板或含有血小板的物质中的添加浓度为1～50000uM；或所述的AMPK抑制剂在血小板或含有血小板的物质中的添加浓度为0.8～40000nM。

8.一种药盒，其含有权利要求6或7所述的组合物。

9.权利要求6或7所述的组合物或权利要求8所述的药盒的应用，用于：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

10.肉碱棕榈酰转移酶II的应用，用于筛选药物，所述药物具有选自下组的功能：(1)维持或提高血小板的活力，(2)维持或提高血小板的储存质量，(3)减少血小板凋亡，(4)延长血小板寿命和/或(5)提高血小板数量。

11.一种筛选维持或提高血小板的活力、维持或提高血小板的储存质量的药物的方法，其特征在于，该方法包括：

(2)检测所述体系中肉碱棕榈酰转移酶II，若所述候选物质存在选自下组的性能，则表明该候选物质是所需的药物：

(ii)肉碱棕榈酰转移酶II的表达提高；或

(iii)肉碱棕榈酰转移酶II的活性提高。

12.一种基因工程改造的血小板或其前体，其特征在于，所述血小板或其前体中转化有外源的肉碱棕榈酰转移酶II或其上调剂；较佳地，所述肉碱棕榈酰转移酶II的上调剂包括选自以下的一种或多种：

靶向肉碱棕榈酰转移酶II乙酰化位点使该位点乙酰化减弱或丧失的试剂；较佳地，所述降低肉碱棕榈酰转移酶II的乙酰化的物质是蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂包括降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是线粒体蛋白乙酰化抑制剂；较佳地，所述乙酰化位点是肉碱棕榈酰转移酶II第79位赖氨酸；较佳地，所述试剂包括：定点突变试剂或定点修饰试剂；较佳地，所述降低乙酰转移酶基因、蛋白表达和/或活性的下调剂包括基因敲除、siRNA、microRNA、或小分子下调剂；较佳地，所述蛋白乙酰化抑制剂是SIRT3或其激活剂；

蛋白乙酰化抑制剂；较佳地包括：赖氨酸乙酰基转移酶抑制剂，线粒体蛋白乙酰化抑制剂，或其表达上调剂；较佳地，所述线粒体蛋白乙酰化抑制剂包括：SIRT3；

重组表达肉碱棕榈酰转移酶II的表达构建物；

促进肉碱棕榈酰转移酶II基因启动子驱动能力的上调剂；或

肉碱棕榈酰转移酶II基因的特异性microRNA的下调剂。