ES2212288T3 - Almacenamiento y mantenimiento mejorado de hemoderivados. - Google Patents

Abstract

Se mejora la conservación de la membrana celular de glóbulos rojos y de concentrados de plaquetas mediante la adición de 1mM-10mM de L-carnitina y derivados de ésta. Esta mejora permite ampliar el periodo de viabilidad de los envases de concentrados de glóbulos rojos y plaquetas más allá de los periodos de validez actuales. Además los materiales tratados de esta manera presentan una vida media de circulación más amplia después de la transfusión al paciente. Las mejoras en el mantenimiento de la membrana conseguido con este procedimiento permite la radiación de envases sellados de productos sanguíneos de forma que se consigue la misma esterilización sustancial y se destruyen los leucocitos contenidos en el mismo.

Description

Almacenamiento y mantenimiento mejorado de hemoderivados.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para mejorar la estabilidad en almacenamiento y la viabilidad de los hemoderivados, incluyendo plaquetas y similares. De manera específica, se suministra un procedimiento para prolongar la viabilidad de estos productos, así como su resistencia a los agentes que lesionan las membranas, como la radiación, almacenando los productos en una suspensión que incluye una cantidad efectiva de L-carnitina o de alcanoíl
L-carnitina.

Antecedentes de la invención

Cada vez preocupan más las reservas de sangre a nivel tanto nacional como mundial. Se ha cuestionado tanto la integridad como la fiabilidad de los suministros existentes, y la capacidad para crear mayores reservas con el tiempo. Una razón para esto es el período de almacenamiento relativamente corto de estabilidad de almacenamiento de los hemoderivados. Actualmente, los concentrados de eritrocitos (CE) empaquetados, la forma dominante de hemoderivado para las transfusiones y similares, están limitados a un período de almacenamiento de 42 días. Después de ese tiempo, las concentraciones de ATP disminuyen de manera sustancial, junto con una disminución significativa del pH, lo que es un claro indicativo de ausencia de viabilidad o, si son viables, de una vida circulante extremadamente corta tras la infusión. In vivo la sangre entera no se almacena durante períodos prolongados. Para las plaquetas, actualmente el período de almacenamiento es incluso más corto, y la norma son 3-5 días a 22ºC. La diferencia en la estabilidad del almacenamiento de los concentrados de plaquetas (CP), en contraposición al de los eritrocitos, se debe a la persistencia de reacciones metabólicas en las plaquetas, debido en parte a la presencia de mitocondrias en los CP y a su ausencia en los CE. Mientras que ambos hemoderivados muestran una caída del ATP, junto a una caída del pH, a lo largo del tiempo, acompañada por la producción de ácido láctico, es probable que la presencia de mitocondrias en los CP empeore este problema, debido a la glucólisis.

De manera simultánea, han surgido preocupaciones sobre la fiabilidad e integridad de los suministros de sangre. En particular, se ha detectado de manera repetida la contaminación de los suministros de sangre por bacterias o por otros agentes microbiológicos o virus. Esta situación es incluso más grave en países con procedimientos menos sofisticados de extracción y almacenamiento. Aunque se pueden añadir a los productos extraídos agentes para reducir la contaminación, no son deseables, dada la necesidad de transfundir los productos de nuevo a pacientes receptores. Una alternativa deseable es el tratamiento de los productos mediante irradiación, después de su empaquetado, de manera típica en contenedores de plástico de vinilo elastificado. Este tratamiento mediante irradiación alteraría aún más el almacenamiento de los CE y los CP, dando lugar a una reducción de la función de estas células.

Además, una parte pequeña pero creciente de la población que recibe sangre tiene riesgo de una enfermedad habitualmente mortal denominada enfermedad de injerto frente al huésped asociada a la transfusión (TAGVHD), que se debe a la presencia de leucocitos alógenos viables. Este síndrome se asocia típicamente a pacientes inmunodeprimidos, como los pacientes con cáncer y con transplante de médula ósea, aunque también puede aparecer en personas inmunocompetentes cuando hay en la población un polimorfismo restringido del locus A de los leucocitos humanos (HLA).

Se ha prestado mucha atención a buscar procedimientos para prolongar la estabilidad durante el almacenamiento. Uno de estos procedimientos para prolongar la vida de almacenamiento de los CP se enumera en la patente de Estados Unidos 5,466,573. Esta patente se dirige a suministrar preparados de CP con fuentes de ion acetato que actúan como sustrato para la fosforilación oxidativa y como tampón para contrarrestar la reducción del pH debida a la producción de ácido láctico. Este procedimiento no actúa directamente sobre el problema de la hemólisis y rotura de la membrana. Un procedimiento alternativo se describe en la patente de Estados Unidos 5,496,821 asignada comúnmente. En esta patente se almacena sangre entera en una preparación que incluye L-carnitina (LC) o alcanoíl derivados de la misma. Sin embargo, la patente no describe los efectos sobre los hemoderivados como los CP o las suspensiones de eritrocitos, y en cierta medida se basa en el impacto de LC sobre las características del plasma.

Como se ha señalado más arriba, la contaminación del suministro de sangre con gérmenes o virus es otro problema que debe abordar la comunidad médica. Un procedimiento para esterilizar el producto y mejorar la fiabilidad en lo referente a la contaminación es irradiar el hemoderivado. En general, son deseables valores de irradiación gamma de aproximadamente 25 centigray (cGy), irradiando el producto después de sellarlo en un contenedor de plástico, vidrio u otro material. Lamentablemente, la irradiación induce lesiones en la membrana celular, con hemólisis en los eritrocitos. La irradiación de los hemoderivados, incluyendo sangre entera, CE y CP, sigue planteando problemas.

Según esto, sigue siendo un objetivo de los expertos en la materia suministrar un procedimiento para prolongar el período de viabilidad y la semivida en la circulación de los eritrocitos y los CP después de la transfusión, más allá del máximo actual. Además, sigue siendo un objetivo de los expertos en la materia encontrar una manera de esterilizar mediante irradiación los hemoderivados, incluyendo sangre entera, CE y CP, sin una lesión importante de la membrana y sin hemólisis.

Resumen de la invención

El Solicitante ha descubierto, mediante amplias investigaciones, que la lesión de membrana que experimentan los CP durante su almacenamiento, o cuando se administra irradiación, se puede retrasar de manera sustancial y suprimir suspendiendo el hemoderivado en una solución convencional de conservación, como AS-3, en la que la solución de conservación incluye además L-carnitina o un alcanoíl derivado de la misma, a una concentración de 0,25-50 mM o más. El descubrimiento del Solicitante se basa en el reconocimiento de que la mayor parte de la descomposición de los hemoderivados, que de manera convencional se asocia a un descenso de la concentración de ATP y del pH, se puede de hecho rastrear hasta la lesión de la membrana y la hemólisis. El mantenimiento y
reparación de la membrana se puede llevar a cabo mediante reacilación de los lípidos, que se lleva a cabo, en parte, mediante la L-carnitina, cuya captación irreversible por los CP se ha establecido mediante las investigaciones de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención emplea L-carnitina, y sus alcanoíl derivados, como agente que favorece el mantenimiento y reparación de la membrana celular, y la supresión de la hemólisis, en los hemoderivados. Las alcanoíl L-carnitinas incluyen acetil, butiril, isobutiril, valeril, isovaleril y, sobre todo, propionil L-carnitina. En la presente memoria descriptiva se hace referencia a esta familia, de manera genérica, como LC, y la demostración se hace expresándola como L-carnitina. Sin embargo, las alcanoíl L-carnitinas descritas y sus sales farmacológicamente aceptables se pueden usar en lugar de L-carnitina.

La adición de LC a los hemoderivados, incluyendo los CP, precisa que haya LC en una cantidad efectiva para permitir el mantenimiento y reparación de la membrana. La investigación que se ha realizado, incluyendo los ejemplos que se presentan más adelante, ha demostrado un intervalo mínimo efectivo para los productos de la mayoría de los donantes de aproximadamente 0,25 mM-0,5 mM. El límite superior es más práctico que fisiológico. Se toleran bien concentraciones tan altas como 50 mM o mayores. Son aceptables valores que son compatibles con aspectos toxicológicos y osmológicos. Los intervalos preferidos son 1-30 mM. Un intervalo de 1-10 mM o más es válido, y los valores entre 4-6 mM suponen una diferencia marcada. Los efectos de la presente invención, incluyendo la prolongación de la viabilidad y la prolongación de la semivida en la circulación después de la transfusión, pueden ser muy dependientes del donante. Según esto, en general, una concentración efectiva de LC es 0,5-50 mM. Sin embargo, el técnico puede tener que ampliar el intervalo, en cualquiera de las dos direcciones, dependiendo de las particularidades del donante. Esas ampliaciones no precisan un esfuerzo de inventiva.

LC es compatible con las soluciones de soporte convencionales (soluciones estabilizantes), que de manera típica se preparan para que permitan un efecto tampón. Las soluciones que se emplean con frecuencia incluyen ACED (ácido cítrico-citrato sódico-glucosa), CPD (citrato-fosfato-glucosa) y modificaciones de los mismos, incluyendo CPD2/A-3, y composiciones relacionadas. De manera típica, la composición incluye un carbohidrato, como glucosa o manitol, al menos una sal fosfato, un citrato, y otras sales equilibradoras. La LC es soluble de manera convencional y se puede añadir libremente a estas composiciones en el intervalo necesario.

Las soluciones adecuadas se describen en la patente de Estados Unidos 5,496,821. Sin embargo, se pueden emplear soluciones de soporte diferentes a las que se usan de manera convencional, incluyendo plasma artificial y otras soluciones fisiológicamente aceptables, siempre que comprendan LC de acuerdo con la invención. El componente importante de la solución de soporte es la LC.

La capacidad de la LC, cuando se la incluye en la suspensión de los CP, de prolongar el tiempo en el que los mismos son viables y, por lo tanto, el período de validez, y el período en la circulación después de la transfusión en el receptor, se demuestra más adelante mediante experimentación in vitro e in vivo. La experimentación emplea LC, aunque se pueden emplear otras alcanoíl L-carnitinas. Tiene un significado particular la demostración, que se presenta más adelante, de que se obtiene un mejor rendimiento mediante la mejora del mantenimiento de la membrana celular (incluyendo la reparación) y la supresión de la hemólisis.

Irradiación

El problema de la contaminación de los hemoderivados, incluyendo los CP, por bacterias u otros agentes microbiológicos o virus, se puede reducir de manera sustancial mediante irradiación. Se han explorado mucho los niveles de irradiación necesarios para la esterilización y para la mortalidad sustancialmente del 100% de los agentes contaminantes arriba mencionados.

Además, lo que es más importante, los leucocitos se pueden destruir mediante una irradiación similar. Se puede usar una variedad de tipos de irradiación, incluyendo radiación gamma (Cobalt GG, acelerador Van de Graf), irradiación UV, irradiación con luz roja, etc. Es suficiente un equivalente próximo a aproximadamente 20-50 cGy de irradiación gamma.

En todo el mundo se extraen cada año entre 60 y 80 millones de unidades de sangre entera y se usan en el soporte transfusional de una variedad de poblaciones de pacientes. En los países subdesarrollados las tasas de extracción por 1000 habitantes son menores y la mayoría de las transfusiones de sangre se administran para el tratamiento de casos obstétricos y pediátricos, particularmente la anemia asociada al paludismo. En los países desarrollados las tasas de extracción por 1000 habitantes son 50-100 veces mayores y la mayoría de las transfusiones se administra en cirugía (50%) o en el tratamiento de pacientes con anemia asociada a cáncer, trasplante de médula ósea y hemorragia gastrointestinal no neoplásica (Figura 1). Hay muchos posibles efectos adversos asociados a la transfusión de sangre alógena. Una complicación particular que se asocia de manera adversa a la transfusión sanguínea es la entidad infrecuente y habitualmente mortal conocida con enfermedad de injerto frente al huésped asociada a la transfusión (TAGVHD), una complicación que es mediada por inmunocitos alógenos viables.

La enfermedad TAGVHD es una complicación infrecuente de la transfusión sanguínea que se puede ver en dos tipos de poblaciones de pacientes receptores de una transfusión sanguínea. La TAGVHD tiene una mortalidad próxima a 100% y en este momento el único tratamiento efectivo es la prevención. Primero, en los pacientes inmunodeprimidos, como los que han recibido un transplante de médula ósea o de otro órgano, los que tienen enfermedad de Hodgkin o deficiencias hereditarias del sistema inmunitario. Segundo, en pacientes no inmunodeprimidos, cuando hay similitud del HLA entre el donante y el receptor de la sangre. Esto se ve la mayoría de las veces en donaciones dirigidas de familiares cercanos o en poblaciones que tienen un polimorfismo del HLA más limitado, como en Japón e Israel. Debido a esto, es una práctica universal irradiar los hemoderivados celulares con irradiación gamma a una dosis en el plano medio de 25 centigray (cGy) a fin de destruir la capacidad de replicación de los inmunocitos viables. Se debe tener en cuenta que la TAGVHD se asocia a productos celulares recientes, es decir, en general de menos de 15 días. Sin embargo, el "envejecimiento" de la sangre no es todavía una práctica aceptada para prevenir esta complicación. Aunque los inmunocitos son parte de la población de leucocitos alógenos, en la actualidad se considera que el grado de depleción leucocitaria que se consigue actualmente con filtros de tercera generación no es adecuado para prevenir esta complicación. Así, en este momento la irradiación gamma sigue siendo la única intervención profiláctica aceptada.

En lo referente a los productos plaquetarios también se ha descrito cierta pérdida de viabilidad.

Hay muchos datos que indican que la irradiación gamma ejerce sus efectos generando especies reactivas del oxígeno, como oxígeno singlete, radical hidroxilo y anión superóxido. Estas especies inducen lesión intracelular del ADN, impidiendo de esta manera la replicación celular, un prerrequisito para la TAGVHD. Sin embargo, estas mismas especies reactivas del oxígeno pueden oxidar la membrana de las plaquetas, induciendo una lesión de membrana que reduce la calidad (potencia) del producto celular.

Se sabe que L-carnitina tiene una función clave en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana mitocondrial. Los trastornos hereditarios en los que hay insuficiencia del sistema carnitina para transportar ácidos grasos de cadena larga producen un deterioro significativo de la función del músculo esquelético.

Se puede usar la L-carnitina de las alcanoíl-carnitinas arriba mencionadas para revertir o prevenir las lesiones de la membrana inducidas por la irradiación.

Para limitar la susceptibilidad de los CP a las lesiones de la membrana y la hemólisis, se puede suspender primero el hemoderivado en una solución que incluye L-carnitina o una de las alcanoíl L-carnitinas arriba mencionadas en una cantidad de 0,25 mM-50 mM. Se consigue el mantenimiento de la membrana celular y la supresión de la hemólisis en un grado suficiente de modo que el producto sellado se puede irradiar con el objetivo de la esterilización, y posteriormente puede disfrutar de una prolongación del período de viabilidad y de la semivida en la circulación después de la transfusión. Se puede conseguir una viabilidad del calibre de las viabilidades actuales con materiales que más seguramente serán estériles y menos probablemente introducirán TAGVHD, debido a la irradiación después de sellar la suspensión del hemoderivado. En relación con esto, se debe interpretar que el término hemoderivado incluye los CP.

Se les ocurrirán variaciones de la presente invención a las personas con conocimientos normales de la materia sin necesidad de ejercitar una facultad inventiva. En particular, se pueden modificar las composiciones estabilizantes alternativas, hemoderivados, inhibidores y similares, sin tener que ejercer una habilidad inventiva. Además, las concentraciones específicas, los períodos de viabilidad y las semividas en la circulación variarán de donante a donante y de receptor a receptor. Esas variaciones siguen estando dentro del alcance de la invención, salvo que se excluyan de manera específica en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Un procedimiento para mejorar el mantenimiento de la membrana y suprimir la hemólisis durante el almacenamiento de los concentrados de plaquetas (CP), que comprende la suspensión de dichos CP en una solución de soporte que comprende un producto de carnitina seleccionado del grupo formado por L-carnitina (LC), alcanoíl L-carnitinas o sus sales farmacológicamente aceptables y sus mezclas, en una cantidad efectiva para mejorar la capacidad de dichos CP de mantener la membrana de dichas plaquetas y, de esta manera, suprimir la hemólisis, en comparación con una solución de soporte idéntica que carece de dicha L-carnitina, alcanoíl L-carnitinas o sus sales farmacológicamente aceptables y sus mezclas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha L-carnitina, alcanoíl L-carnitinas y sus mezclas están presentes en un intervalo de 0,25-50 mM.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha L-carnitina, alcanoíl L-carnitinas y sus mezclas están presentes en una cantidad de 1-20 mM.

4. Un contenedor sellado de CP en una solución estabilizadora, comprendiendo dicha solución estabilizadora L-carnitina, alcanoíl L-carnitinas y sus mezclas en una cantidad de 0,25-50 mM.

5. El contenedor sellado de la reivindicación 4, en el que dicho contenedor, después del sellado, se ha irradiado para esterilizarlo de manera sustancial y destruir los leucocitos de su interior.

6. Un procedimiento para esterilizar de manera sustancial los CP, comprendiendo la suspensión de dichos CP en una solución de soporte, comprendiendo dicha solución LC en una cantidad de 0,25-50 mM, e irradiando dicho hemoderivado después de sellar dicho producto en el interior de un contenedor, para esterilizar sustancialmente dicho hemoderivado.

7. Un procedimiento para tratar los CP para suprimir los leucocitos de su interior, que comprende la irradiación de dichos CP en una solución de soporte que comprende LC en una cantidad de 0,25-50 mM, para destruir sustancialmente los leucocitos de dicha muestra a la vez que se suprime la lesión de las membranas de dichos CP.

8. Un procedimiento para mejorar el mantenimiento de la membrana y suprimir la hemólisis durante el almacenamiento de los concentrados de plaquetas (CP) después de la irradiación de los mismos para destruir los inmunocitos de su interior, que comprende la suspensión de dichos CP en una solución de soporte, comprendiendo dicha solución de soporte un producto de carnitina seleccionado del grupo formado por L-carnitina, alcanoíl L-carnitinas y sus mezclas, en una cantidad efectiva para mejorar la capacidad de dichos CP de mantener la membrana de dichas plaquetas, y por lo tanto suprimir la hemólisis en comparación con una solución de soporte idéntica que carece de dicha carnitina, alcanoíl L-carnitina y sus mezclas.

9. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 7 y 8, en el que la alcanoíl L-carnitina se selecciona del grupo que comprende acetil, propionil, butiril, isobutiril, valeril e isovaleril L-carnitina.

10. El contenido sellado de las reivindicaciones 4 y 5, en el que la alcanoíl L-carnitina se selecciona del grupo que comprende acetil, propionil, butiril, isobutiril, valeril e isovaleril L-carnitina.