JP4467649B2 - 血液製剤の改良された貯蔵および保存法 - Google Patents

Description

発明の分野
この発明は、濃縮赤血球（ＲＢＣ）、血小板等を含む血液製剤の、溶血に対する抵抗力および改良された生存力を含む保存安定度を高める方法に関する。詳しくは、有効量のＬ-カルニチン、又はアルカノイルＬ-カルニチンを含む懸濁液に製剤を保存することにより、放射線のような膜損傷作用因子に対する製剤の抵抗力を高めるだけでなく、特にこれらの製剤の生存力を高める方法も提供される。
発明の背景
全国的および世界的な規模の血液供給に対して、懸念が確実に高まってきている。現在の血液供給の完全性若しくは確実性と、長期間に渡る大量保存を確立する可能性が、共に疑問視されつつある。この一理由は、血液製剤の保存安定度が比較的短期間であるいうことである。現在、輸血その他のための血液製剤の主な形態である濃縮ＲＢＣ（赤血球濃縮物、ＲＣＣ）は、４２日の保存期間に限られている。その後は、ｐＨの有意な低下と共にＡＴＰレベルがかなり低下し、生存力の低下を強く示すか、あるいはたとえ生存し得ても、輸血後、極端に短い循環期間を示す。生体内では、全血は長期間は蓄積されない。血小板に関しては、現在の保存期間はかなり短く、標準で２２℃にて５日間である。血小板濃縮（ＰＣ）の保存安定度に関するＲＢＣとの相違は、血小板内で進行中の代謝反応によるものであり、一部には、ＰＣにおけるミトコンドリアの存在、およびＲＢＣにおけるミトコンドリアの不在によるものである。両血液製剤は、時間がたつにつれｐＨの低下とともにＡＴＰの低下を示し、酪酸の生成を伴うが、ＰＣにおけるミトコンドリアの存在は、その解糖作用のために、問題を悪化させるようである。
同時に、血液供給の確実性や完全性についての懸念も高まってきた。特に、血液供給物のバクテリアや他の微小因子またはウイルスによる汚染が繰り返し検出されている。これらの状況は精製度の高い採取物や保存法を欠く国においてより深刻ですらある。汚染を減じるために、採取された製剤に試薬を加えてもよいが、当該製剤を受容患者に輸血する必要を考えると望ましくない。これ以外の望ましい方法は、典型的には弾性を持たせたビニルプラスチック容器の中に製剤を封入した後、製剤を照射処理することである。このような照射処理はＲＢＣおよびＰＣの保存を悪化させ、これらの細胞の機能を低下させる結果となる。
加えて、生存力のある同種白血球が存在しているために起こる輸血関連移植片対宿主病（ＴＡＧＶＨＤ）として知られる、一般に致命的な疾患にかかる輸血者集団の割合が、少ないが、しかし増加しつつある。この症候群は典型的には癌や骨髄移植患者のような免疫抑制患者に生じるが、免疫適格者においても、両者に制限されたヒト白血球Ａ座位（ＨＬＡ）多型の状況下では起こり得る。
保存安定度を高めるための方法を見出すのにかなりの研究がなされてきた。ＰＣの保存期間を伸ばすための方法の一つが米国特許５，４６６，５７３に挙げられている。この特許は、酸化的リン酸化のための基質としても、酪酸生成によるｐＨの低下を阻止するためのバッファーとしても作用するアセテ-トイオン源を用いて、ＰＣ調製を提供することを目指している。このような方法は、溶血や膜破壊の問題に直接は作用しない。別の方法が、同一人に譲渡されている米国特許５，４９６，８２１に開示されている。この特許においては、全血がＬ-カルニチン（ＬＣ）又はそのアルカノイル誘導体を含む調剤中に保存されている。しかし、この特許はＰＣやＲＢＣ懸濁液のような血液製剤に対する効果は記述せず、少なくともある程度、血漿成分へのＬＣの影響を確信している。
上述のような、微生物因子またはウイルスによる血液供給物の汚染は、医療分野が注目するもう一つの課題である。製剤を滅菌し、生存能を改良する一つの方法は、血液製剤を照射することである。製剤をプラスチック、ガラスまたは他の容器に封入した後、製剤を照射する、約２５センチグレー（ｃＧ）のγ線値が一般的に望ましい。残念ながら、照射は細胞膜障害を引き起こし、ＲＢＣにおいては溶血を伴う。全血、濃縮ＲＢＣおよびＰＣを含む血液製剤の照射は課題を提起し続ける。
従って、輸血におけるＲＢＣおよびＰＣの生存期間および循環半減期を現在の最大値以上に伸ばす方法を提供することは、当業者にとって未だ研究目標である。そのうえ、実質的な膜損傷や障害、および溶血を伴わずに、全血、濃縮ＲＢＣおよびＰＣを含む血液製剤を照射により滅菌し得る方法を見出すことは、当業者の最終目的である。
発明の概要
長い研究を経て出願人は、ＡＳ-３のような常套の保存溶液にＬ-カルニチンやそのアルカノイル誘導体を０．２５-５０ｍＭまたはそれ以上の濃度で含む保存溶液に、血液製剤を懸濁することにより、保存時や照射に際してＲＢＣやＰＣにおこる膜損傷が実質上遅らされ得、又、抑制され得るということを発見した。出願人の発見は、通常ＡＴＰレベルやｐＨの低下を伴う血液製剤の変質のほとんどが、実際上、膜損傷や溶血に行き着き得るという認識に基づいている。膜の維持と修復は脂肪の再アシル化によりもたらされ得、そしてこれは一部分には、Ｌ-カルニチンによりもたらされ、発明的研究を通してＲＢＣや同様の血液製剤におけるＬ-カルニチンの不可逆の取り込みを確立した。
図面の簡潔な記述
Ｆｉｇｕｒｅ１．提供者および対照およびＬＣ保存されたものに関する４２日間保存されたＲＢＣの輸血後の寿命評価。矢印はおのおの、対照およびＬＣ保存されたＲＢＣの平均±ＳＤを示す。グラフの上に、正確な積算ｐ値も示されている。
Ｆｉｇｕｒｅ２．血液保存中の異なる週における赤血球細胞のカルニチン含量。カルニチンを材料と方法に記載されているように分析した。値は、全く同一になされた３実験の平均である。実験間の変動は７％以下であった。白丸はＡＳ-３のみで保存されたＲＢＣである；黒丸はＬＣ（５ｍＭ）を追加したＡＳ-３に保存されたＲＢＣである。
発明の詳細な説明
本発明では、血液製剤中に細胞膜維持および修復と溶血の抑制を持続させる因子として、Ｌ-カルニチンとそのアルカノイル誘導体を用いる。アルカノイルＬ-カルニチンは、アセチル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、および特にプロピニルＬ-カルニチンを含む。このファミリーを一般にＬＣと記載し、またＬ−カルニチンの語で代表させる。しかし、上記のＬ-カルニチンやその製剤学上許容できる塩をＬ-カルニチンの代わりに用い得る。
ＲＢＣやＰＣを含む血液製剤へのＬＣの添加には、ＬＣが膜の維持、修復および溶血抑制に効果的な量で存在することが必要である。以下で設定された実施例を含む企画研究により、ほとんどの提供者からの製剤に関して、約０．２５ｍＭ-０．５ｍＭの最小有効範囲が明らかにされた。上限は生理学的というよりもむしろ経験的なものである。５０ｍＭもの濃度若しくはそれ以上の濃度が容易に許容される。毒物学上および浸透学上の懸念に見合う値が許容される。好ましい範囲は１-３０ｍＭである。１-１０ｍＭまたはそれ以上が適しており、４−６ｍＭでは有意な差を示している。生存力の延長や輸血後の循環半減期の長期化を含むこの発明の効果は、かなり提供者に依存するものであり得る。従って、一般的に言えば、ＬＣの効果的な濃度は０．５-５０ｍＭである。しかしながら、当業者は、提供者の特性により、この範囲を広げることが必要となり得る。このように範囲を広げることは発明的努力を要しない。
ＬＣは、緩衝効果を提供するために典型的に調製される常套の支持溶液（安定化溶液）と共存する。通常用いられる溶液には、ＡＣＥＤ（クエン酸-クエン酸ナトリウム-ブドウ糖）、ＣＰＤ（クエン酸-リン酸塩-ブドウ糖）およびＣＤＰ２／Ａ-３を含むそれらの変更物、および関連組成物が含まれる。典型的には、組成物はグルコースやマンニトールなどの炭水化物、少なくとも１リン酸塩、クエン酸、およびその他の平衡化塩が含まれる。ＬＣは通常可溶性で、要求される範囲内で大量にこれらの組成物に添加され得る。
ここに引例として組み込まれている好適な溶液は、米国特許５，４９６，８２１に記載されている。しかし、本発明に従ってＬＣを含む場合、人工血漿および他の生理学的に許容される溶液を含む、通常用いられる支持溶液以外の支持溶液を使用してもよい。支持溶液の重要な要素はＬＣである。
ＲＢＣやＰＣのような血液製剤の懸濁液に含有された時の、生存力やそれゆえ保存期間、および受容者への輸血後の循環期間をのばすＬＣの能力は、インビトロおよび生体内での実施例により以下に例示されている。実施例はＬＣを用いているが、他のアルカノイルＬ-カルニチンを用いてもよい。改良された能力は細胞膜の維持（修復を含む）や溶血の抑制を通じて得られる、という以下の確証は特に重要である。
材料と方法
研究計画Ｉ
ＬＣと共におよびＬＣなしで保存されたＲＢＣの特性の生体内およびインビトロでの評価
対象者．対象者は、１８から６５才の、既知の精神的若しくは肉体的疾病に罹患しておらず、ＲＢＣの生存能力に影響を及ぼし得る薬物を摂取していない、男性若しくは女性の研究対象者であった。官報規範２章の、アメリカ血液銀行協会の基準およびアメリカ国際赤十字の血液提供指導に列挙されているような、常套の同種提供者基準を満たす者が採用された。研究はハンプトン ロード医科大学の国際批評会議により認可され、被験者は研究への参加に先だってインフォームドコンセントを受けた。
おのおのの提供者は７２日の間隔を置いて２回献血し、最初の献血において、テスト腕か対照腕かを無作為に決められた。
血液貯蔵システム．標準ＣＰ２Ｄ／ＡＳ-３システム（マイルスインコーポレイテッド）
可塑剤としてジエチル（ｎ）ヘキシルフサレート（ＤＥＨＰ）を有するポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プラスチックバッグを使用した。各テストユニットに関して、２４５ｍｇのＬＣ（滅菌ガラスボトル中、１．１ｍＬの精製パイロジェン不含溶液）を５ｍＭの最終濃度になるように、ＡＳ-３添加溶液の入った容器に加えた。対照ユニットに関しては同じ条件を用いて、１．１ｍＬの０．９％ＮａＣｌをＡＳ-３溶液に加えた。バッグへのＬＣ若しくは塩水の添加は、注射器を有する採取部位カプラーを通した注射により行った。これを層流フード内、紫外線下で行った。
献血およびプロセッシング．およそ４５０±５０ｍＬの全血を、標準的な瀉血および血液吸引法を用いて採取した。全血ユニットを、加工前に４−８時間、室温に置いた。このユニットを標準の条件を用いて遠心分離し、遠心分離後、上清の血漿を搾り出し、沈降した濃縮ＲＢＣを標準ＡＳ−３溶液（対照）またはＬ−カルニチンを含有するＡＳ−３溶液（テスト）のどちらかに再懸濁した。懸濁したＲＢＣユニットを４℃で４２日間保存した。
インビトロ測定：保存前（０日）および後（４２日）標本に関して行った測定は、ＲＢＣ ＡＴＰレベル；全および上清ヘモグロビン；ヘマトクリット（Ｈｃｔ）；ＲＢＣ、ＷＢＣ、および血小板数；ＲＢＣ浸透脆性；ＲＢＣ形態；酪酸およびグルコースレベル；上清カリウムレベルを含む。これらを既に記載されているような（ヒートンら．ヴォックス サン ５７：３７-４２（１９８９）標準的手法を用いて行った。
生体内輸血後測定．４２日間の保存後、標本を回収し、保存細胞を常套法を用いてＣｒで標識した。同時に、ＲＢＣ量を決定するために、新鮮な標本を９９Ｔｃを用いたＲＢＣの標識化のために提供者から採取した。標識後、１５μＣｉの５１Ｃｒで標識した保存細胞と１５μＣｉの９９Ｔｃで標識した新鮮な細胞を混合し、同時に注射した。２４時間の回収および生存％を算出するために、３５日に至る間の様々な時間間隔で、注射後に血液標本（５ｍＬ）を採取した。５、７．５、１０および１５分で採取した標本の放射能レベルのｌｏｇ直線回帰を用いて０時間レベルを決定する単一標識法か、９９Ｔｃ測定により決定された提供者のＲＢＣ量を用いた二重標識法かのどちらかを用いて、２４時間回収％を決定した。
輸血された生存Ｃｒ標識ＲＢＣの循環寿命を、２４時間および次いで５週間まで週に２回採取された標本により決定した。放射能レベルを１日あたりの一定 １％溶出に補正した。データは独立変数（ｘ軸）として輸血後の日数を、従属変数（ｙ軸）として補正されたＣｒ数を持つ一次関数に一致した。ＲＢＣの寿命を次いで、一致した直線のｘ軸との交差点としてとった。
統計学的分析．ユニットの生体内およびインビトロ検査からのデータに関して一組のｔ-テストまたは慣例の非媒介変数統計分析を行い、テストユニットとコントロールユニットの間に方法において統計学的に有意な差（１-テール）があるかどうかを決定した。統計学的有意性はｐ値で０．０５以下とみなした。
研究企画ＩＩ
４２日までの保存による赤血球のＬＣ摂取および脂肪の再アシル化研究
試薬．本質的に脂肪酸を含まない牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をシグマ ケミカルカンパニー、セント ルイス、Ｍｏ．（ＵＳＡ）から得た。［１-¹⁴Ｃ］パルミチン酸（５８Ｃｉ／ｍｏｌ）をニュージーランド原子力会社、ボストン、マサチューセッツ、（ＵＳＡ）から得た。前吸収層を有するすず層状プレート、ホワットマンＬＫ６（シリカゲル）（２０×２０ｃｍ）を、カルロ エルバ、ミラノ（イタリア）から得た。使用した他の全組成物は試薬等級である。
赤血球カルニチン分析．保存ＲＣＣユニットから血液試料を取り、４倍量の冷０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した。ＲＢＣを次いで、５０％の最終ヘマトクリットで０．９％のＮａＣｌに再懸濁し、クーパーら、バイオケム、バイオフィズ．アクタ９５９：１００-１０５（１９８８）に記述されているような過塩素酸でタンパク質を取り除いた。等分した最終抽出物を遊離ＬＣ内容物に関してペースら、クリン．ケム．２４：３２-３５（１９７８）の放射化学分析に従い分析した。
結果
研究Ｉ
保存前のＡＳ-３ＲＣＣユニットの特徴
ＡＳ-３ＲＣＣ製剤の特徴は、全血ユニットのプロセッシング後に期待されていたごとくであった。ユニット体積、Ｈｃｔ、およびＷＢＣ含量、およびＡＴＰレベル、上清ヘモグロビンおよびカリウムレベル、浸透脆性のようなインビトロＲＢＣ特性により評価した時、ＡＳ-３ＲＢＣユニットの特徴において、テストおよび対照ユニット間で有意な差は全く見られなかった（表１）。
４２日保存後のＲＢＣの特徴
代謝．４２日間の保存の間に消費されたグルコースおよび生産された酪酸の量はテストおよび対照ユニットで似通っていた（表２）。予期していた通り、解糖のこれら２つのパラメータの間には逆の高い相関関係が見られた（ｒ＝０．７６）。しかし、カルニチン保存されたＲＢＣユニットに関しては、対照に比べ、少ない溶血と高いＡＴＰレベルが見られた。図１に例示されているように、この高いＡＴＰレベルは、１対を除く全てに見られた（ｐ＜０．０１）。
膜．貯蔵レベルの終わりにおける溶血率は、図２に示されるようにＬ-カルニチンについては少なかった。他方で、４２日間の貯蔵の終わりに予期されたの範囲内にある上清カルシウムレベル、浸透圧衝撃応答、および溶血スコアに関しては、有意な差は見られなかった。
輸血後の生存力．対照ユニットの平均２４時間回収％は、これまでに見られているものと同じであった。しかし、カルニチン保存された赤血球細胞の平均回収％は、対照に貯蔵された細胞よりも高かった（ｐ＜０．０５）。加えて、注射された保存赤血球細胞の平均循環寿命はＬ-カルニチンに保存された細胞に関して高かった（図１）。２つの場合に測定される提供者のＲＢＣ容量はかなり似通っており（ｒ＝０．９８）、統計上、差はなかった。
関連研究．期待通り２４時間回収％は、ＡＴＰレベル（ｒ＝０．６３）および溶血（ｒ＝０．５７）、浸透脆性（ｒ＝０．７１）、および溶血スコア（ｒ＝０．５９）のようなＲＢＣ膜完全性の他の測定値と有意な相関を示した。溶血率はＡＴＰレベル（ｒ＝０．８３）と高度に相関しており、ＲＢＣユニットのＷＢＣ含量（ｒ＝０．８３）とも高度に関連していた。ＲＢＣ循環寿命はいずれのインビトロパラメータとも有意な関連性を示さなかった。
研究ＩＩ
貯蔵ＲＢＣにおけるカルニチンの摂取
ＡＳ-３溶媒のみに貯蔵されたＲＢＣは、保存を通じて、ＬＣ含量の有意な低下を全く示さなかった（図２）。これは、ヒト赤血球細胞ＬＣは、血漿または等浸透性緩衝液のどちらとも自由には置き換わらないことを示している、クーパーら、既出による発見と一致する。赤血球細胞をＬＣを追加したＡＳ-３に保存した時、ＡＳ-３のみに保存した時よりも多量の細胞内ＬＣが検出された（図２）。ＬＣ含量は保存期間中、直線状に増加し、４２日で４倍増量に達した。
考察
４２日間の保存の終わりにおけるインビトロおよび生体内でのＲＢＣユニットのテストは、カルニチンに保存したＲＢＣとコントロールに保存したＲＢＣの間の有意な差を立証した。細胞の生存力（２４時間回収％および循環寿命）という直接的な基準はもちろん、ＡＴＰや溶血％などの代謝および膜完全性の反映である、様々なインビトロＲＢＣ特性も、カルニチン保存したＲＢＣが有意に優れていた。注射後２４時間における循環生存ＲＢＣの平均寿命の延長は、注目すべきである。この発見は、先例のない突然の発見である保存中のＬＣの不可逆な摂取と関係があり得る。様々なＲＢＣ特性に関してコントロール研究において得られた値は期待通りであり、それまでの研究と異ならなかった。血液採取時、ユニットやＲＢＣ特性について、テストとコントロールの間に有意な差は見られなかった。図１-３に例示されているように、ＲＢＣ ＡＴＰレベル、溶血％および循環寿命は強く提供者に関連したものであり、研究は、第１および第２の場合の両方に関して行われた、５つのテストおよび５つのコントロール研究を無作為に組み合わせる企画であったため、観察された差が偶然やいずれかの間違った研究企画によるものではあり得そうもない。それゆえ、この研究で発見された、観察された差が、テストユニットへのＬ-カルニチンの添加によるものであったということは明らかである。延長された寿命が減じられたＣｒの溶出を反映している可能性は除かれ得ないが、生体内での生存力と関連があると見出された保存赤血球細胞の改良されたインビトロ評価とは一致しない。
いくらかの研究により、Ｌ-カルニチンおよびそのアシルエステルが、赤血球を含む様々な細胞に細胞防御性／細胞膜安定化効果を有するということが見出された。例えば、スニダーら、アーク．バイオケム．バイオフィズ．２７６：１３２-１３８（１９９０）を参照されたい。この研究で、貯蔵中、Ｌ-カルニチンがＲＢＣにより不可逆的に摂取されることが見出された。この過程の特徴は完全に明らかになっているわけではないが、Ｌ-カルニチンの摂取に関する特異的キャリアーの関与は除外されるであろう。われわれの知る限りでは、Ｌ-カルニチンの細胞内濃度が細胞外の環境に通常存在しているよりもいく倍も高い細胞系で、既知のＬ-カルニチンキャリアーが機能しているにすぎない。赤血球細胞のＬ-カルニチン濃度は、血漿の濃度と同じである。従って、低温度、ＡＴＰの涸渇、および貯蔵中に起こっている可能性のある他の代謝変化に関係なく、赤血球を比較的多量の外来のＬ-カルニチンを含む溶媒に保存する時、細胞による単一方向へのＬ-カルニチンの摂取が確立されるようである。当業者の誰もこれを予想していないと思われる。
保存されたＲＢＣに対するＬ-カルニチンの作用の性質は、膜区画上におけるその生理学的介入および／若しくは代謝的介入のどちらかとしてと見られ得る。保存赤血球細胞の輸血後の生存能力は、再注入された赤血球細胞の生体内での生存能力とその表面対容積比測定の間の有意な相関関係により示唆されるように膜機能の完全性に関連している。ＲＢＣの細胞膜構造と機能に対する主な寄与因子は、細胞骨格ネットワーク（ＲＢＣ膜のインナーヘミリーフレットの真下に存在する超分子タンパク質組織、マルケシ、アン．レビュー．セル バイオロジー．１：５３１-５３６（１９８５））に示されている。保存された赤血球細胞の細胞骨格膜タンパクの構造と機能に関する調査研究で、ウォルフェらは、唯一の関連変化は、タンパク質４．１の存在または不在下でのスペクトリンのアクチンへの結合能の減少であることを見出した；ウォルフェら．、ジェイ．クリン．インベスト．７８：１６８１-１６８６（１９８６）。われわれは、タンパク質４．１を含む再封じされたゴーストの増加したずり応力に対するＲＢＣ膜変形性にＬ-カルニチンが影響を与えることをすでに示している（アルドゥイニら、ライフ サイエンス．４７：２３９５-２４００（１９９０）。即ち、Ｌ-カルニチンは１またはそれ以上の細胞骨格成分とスペクトリンの相互作用による膜の安定化効果を発揮し得る。バターフィールドおよびランガシャリら、ライフ サイエンス．５２：２９７-３０３（１９９２）の赤血球細胞スペクトリン-アクチン相互作用に関する電子常磁性共鳴の最近の研究は、Ｌ-カルニチンがスペクトリン上のスピンラベルされたセグメント間の運動を懸著に減じるということを示した。
上述の電位生理学的作用に加えて、ＬＣ保存された赤血球細胞に観察された改良点は好ましい代謝過程の結果でもあり得る。通常、膜リン脂質の脱アシル化-再アシル化サイクルはＡＴＰまたはアシル-ＣｏＡの生成を要する。リゾリン脂質アシル-ＣｏＡトランスフェラーゼにより、アシル-ＣｏＡのアシル部分は次いで、リゾリン脂質内に輸送される。加えて、酸化攻撃の間、ＲＢＣリン脂質の膜修復過程は、同じ代謝経路に従う。最近の知見により、脂肪酸の活性化段階とそのリゾリン脂質への輸送の間のアシル-ＣｏＡプールのサイズを調節することにより、ＣＰＴが赤血球細胞および神経細胞における膜リン脂質の再アシル化過程に影響を及ぼすことが示された；アルドゥイニら．、ジェイ．バイオル．ケム．２６７：１２６７３-１２６８１（１９９２）。加えて、パルスチェイスの、およびＡＴＰ欠乏研究により、赤血球細胞のアシルカルニチンプールが、ＡＴＰを費やすことなく活性化されたアシルグループの貯蔵所として役立つことが立証された；アルドゥイニら．、バイオケム．バイオフィズ．レス．コム：１８７：３５３-３５８（１９９４）。
いっそう高い２４時間回収％および循環寿命は、効能に関しておよそ１５％の改良を表す（受容者に有効な輸血循環ＲＢＣの量×平均寿命）。このように有効性が増大するということは、臨床的に、地中海貧血のように慢性的に輸血される患者や骨髄疾患の患者における輸血の要請が減少するということに言い換えられる。これとは別に、液体保存されたＲＢＣの保存寿命の延長が可能であり得る。
われわれの知見は、ＲＢＣ保存中の保存溶媒中のＬ-カルニチンの存在が、膜修復のためのリン脂質の再アシル化により用いられるＡＴＰプールの節約作用を有することを示唆する。可能性のある有利な生理学的作用を伴うこの好ましい代謝過程は、減ぜられた溶血、高いＡＴＰレベル、ＬＣ-保存された赤血球細胞の改良された生体内回復と生存を説明し得る。
照射
全血やＲＢＣ、ＰＣおよびその他を含む血液製剤のバクテリアや他の微生物因子またはウイルスによる汚染の問題は、実質量、照射により減じられ得る。滅菌や前述の汚染因子の実質上１００％の死亡率に必要とされる照射のレベルが広く調べられてきた。
加えてより重要なことには、同様の照射により白血球が破壊され得る。γ線照射（コバルトＧＧ、ファン デ グラフ加速）、ＵＶ照射、赤色光照射等を含む様々なタイプの照射が用いられ得る。約２０-５０ｃＧのγ線照射と等価の照射が十分である。
世界中で、全血の６０万から８０万ユニットが１年間に集められ、様々な患者集団の輸血を支えている。未発達国では１０００人あたりの採取物比はもっと低く、また、ほとんどの血液輸血は、産科および小児科疾患、特に貧血を伴うマラリアの治療に与えられる。先進国では、１０００人当たりの採取比は５０-１０倍高く、ほとんどの輸血は手術（５０％）または貧血を伴う癌、骨髄移植、非悪性胃腸出血（図１）の治療に与えられる。同種血液の輸血に伴う多くの潜在的な副作用がある。輸血に副作用的に付随する、ある特別な合併症は、輸血関連性移植片対宿主病（ＴＡ-ＧＶＨＤ）として知られるまれで通常致命的となる合併症であり、生存力のある同種免疫細胞が介在する合併症である。
ＴＡ-ＧＶＨＤ病は、２タイプの血液輸血受容患者集団に潜在的に見られる珍しい血液輸血合併症である。ＴＡ-ＧＶＨＤは、１００％にも達する死亡率を有し、今日では予防が唯一の効果的な対抗手段である。第１のタイプは、骨髄や他の組織移植後の患者のような免疫無防備状態の患者、ホジキン病の患者、免疫系の遺伝的欠損の患者において見られる。第２のタイプは血液提供者と血液受容者の間にＨＬＡ同一性がある場合の非免疫無防備状態の患者において見られる。これは近親者からの直接の提供または、日本やイスラエルにおけるようなより制限されたＨＬＡ多形の人々においてもっと頻繁に見られる。このために、生存能力のある免疫細胞の複製能力を破壊するために、およそ２５センティグレー（ｃＧ）の中程度の投与量まで細胞血液製剤をγ線で照射するのが、万国共通の常套手段である。ＴＡ-ＧＶＨＤが、新鮮な、即ち一般に１５日以内の細胞製剤と関連があることは、注目すべきである。しかし今もって、血液を「熟成させること」が、この合併症を予防するのに許容される手段ではない。免疫細胞は同種白血球集団の一部であるが、第３世代フィルターを用いて現在達成される白血球減少の程度がこの合併症を予防するのに十分であるとは、今のところ考えられない。このように、現在のγ線照射は許容される唯一の予防的処置である。
特に赤血球細胞のγ線照射に関する問題点は、細胞膜を損傷する可能性があることである。この量の照射が、赤血球細胞ＡＴＰの減少、増加した溶血、増加した上清カリウムによりインビトロで計測されるように、効能において約７-８％の損失を生むことは明らかである。これらの変化は、膜障害結果と一致する。これらインビトロ変化は、γ線照射赤血球細胞の２４時間回収の低下と関連がある。血小板製剤に関しては、生存力に関してある程度の減損が既に報告されている。
考慮すべき証拠により、γ線が、一重項酸素、水酸基、ラジカル、およびスーパーオキシドアニオンのような活性化された酸素種を生み出すことによりその効果を発揮することが示される。これらの酸素種はＤＮＡに細胞内損傷を引き起こし、次いでＴＡ-ＧＶＨＤにとっての必要条件である細胞複製を妨げる。しかし、この同じ酸素種が、赤血球細胞およびあるいは血小板の膜上の膜脂質を酸化し、細胞製剤の質（能力）を損なう膜障害を引き起こし得る。
Ｌ-カルニチンはミトコンドリア膜を横切る長鎖脂肪酸の輸送に重要な役割を果たすことが知られている。長鎖脂肪酸を輸送するカルニチンシステムに欠損がある遺伝的疾患は、結果的に、骨格筋機能における重大な障害となる。最近Ｌ-カルニチンの赤血球細胞膜における役割に対する関心が増してきている。しかし、驚くべきことは、赤血球細胞がミトコンドリアを欠いている事であり、またそれゆえ、Ｌ-カルニチンおよびＬ-カルニチンの可逆的なアシル化に関わる酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの存在は、かなり興味深いことである。はじめは、赤血球細胞内でこれらが果たし得る役割については不明であった。赤血球細胞は生体内におけるその長い生活環を通じて酸素ストレスを受けやすく、Ｌ-カルニチンを含む酸化された膜脂質の回復は、赤血球細胞が正常に生き残るのに重要であり得る。
ＡＴＰの利用が増大している間のアシル化カルニチンの初期の増加は、損傷した酸化膜脂質のための修復機構において後に用いられ得る活性化脂肪酸の貯蔵として機能し得る。このような事実は、上述の赤血球細胞のインビトロでの保存中に観察される溶血の減少を十分に説明し、加えて、生体内での回収と生存に関して観察される改良点を説明するものであろう。Ｌ-カルニチン添加の正味の効果は、能力における約１７％の増加である。
しかるべく、Ｌ-カルニチン又は前述のアルカノイルＬ-カルニチンは、照射により引き起こされる膜障害を取り除くか、若しくは予防するのに用いられ得る。これは、赤血球細胞中に貯蔵されたカルニチンの酸化された膜脂質を修繕する能力により、インビトロで起こる。
血液製剤（ＲＣＣ、ＰＣおよびその他）の膜障害や溶血に対する罹患性を制限するために、血液製剤をまず、Ｌ-カルニチン又は、前述のアルカノイルＬ-カルニチンを０．２５-５０ｍＭの量で含む溶液に懸濁してもよい。細胞膜の維持と溶血の抑制は、かなりの程度で達成されるので、封入された製剤は滅菌の目的のために照射され得、続いて、長期の保存寿命および輸血後の循環半減期を享受し得る。現在の生存能力のような生存力を、血液製剤懸濁液を封入した後の照射により無菌であること、およびＴＡ-ＧＶＨＤを引き起こしそうにないことがほとんど確実な物質を用いて、達成し得る。血液製剤という語は、この文脈では広く、全血、血液血漿、ＲＣＣ、ＰＣ、混合物およびその他を含むと解釈されるべきであると強調する。
滅菌のため、あるいはその中の免疫細胞を貯蔵の前に破壊するためにγ線が照射され、次いで貯蔵される赤血球細胞組成物にＬ−カルニチンを添加することにより、赤血球細胞生存能力が改良されるということを確証するために、以下の試験を行った。
材料と方法
血液保存システム． 標準の４部分から成る血液貯蔵バッグＣＰ２Ｄ／ＡＳ-１システム（バクスター、インコーポレイテッド．）を使用した。各テストユニットに関して、１．１ｍｌの精製パイロジェンフリー生理塩水溶液に溶解した２４５ｍｇのＬ-カルニチン内部塩（ＬＣ）をＡＳ-１追加溶液の入ったバッグに、最終５ｍＭ濃度になるように加えた。コントロールユニットに関して、同じ条件下で１．１ｍｌの生理塩水溶液をＡＳ-１溶液に添加した。
献血と加工． 常套の静脈切開および血液導引法を用いて、およそ４５０±５０ｍｌの全血を採取した。加工前に全血ユニットを４-８時間室温に置いた。このユニットを常套の条件を用いて遠心し（ヒートン ダブリュ．エイ．ら；ヴォックス サングイニス、１９８９、５７：３７-４２を参照されたい。）、遠心後、上清の血漿を除去し、沈降させた濃縮赤血球細胞（ＲＢＣ）をＡＳ-１溶液（コントロール）、またはＡＳ-１を含むＬＣに（テスト）懸濁した。
貯蔵条件およびＲＢＣユニットのγ線照射 懸濁されたＲＢＣユニット（コントロールおよびテスト）を１-６℃で１４時間貯蔵し、次いで２５ｃＧの投与量までγ線を照射した。続いてＲＢＣユニットを１-６℃で４２日まで貯蔵した。
インビトロ測定 保存前（０日）および後（４２日）サンプルに関して行った測定は、上清ヘモグロビンおよび平均赤血球容積（ＭＣＶ）を含む。これらをヒートンら、既出に記述されている常套の手法を用いて行った。
統計学的分析 試料のサイズは上清ヘモグロビンにおける変動に関するこれまでのデータに基づいて定めた。全数９４のＲＢＣユニットを、各アーム（対照およびテスト）につき４７に分けた。血漿ヘモグロビンデータ分布の分析は、有意な非対象（＞２）と尖度（８-１０）を示した。それゆえ、データをソフトウェアプログラム上での中央値に関して、非媒介変数テストを用いて分析した（エピスタット、リチャードソン．ＴＸ）。
結果
全血ユニットのプロセッシング後、貯蔵前のＲＢＣユニットの特性は、期待通りであった。上清ヘモグロビンとＭＣＨにおいて、対照とＬＣ-含有ＲＢＣユニットの間に有意な差は観察されなかった（表Ａ）。貯蔵の終わりに（４２日）γ線照射したＲＢＣは、対照とＬＣ-含有ユニットの間に統計学上有意な差を呈した（表Ａにおけるｐ値を参照されたい。）。特に対照ＲＢＣユニットと比べてテストにおいて低溶血が観察された。ＬＣを含有するＲＢＣユニットのＭＣＶ値は対照のＭＣＶ値よりも低かった。
上記テストにより、赤血球細胞製剤の保存前のγ線照射に関連する損傷が、Ｌ-カルニチンの赤血球細胞製剤への添加により予防されるということが立証される。

本発明を一般的に、また特定実施例を引用して開示してきた。発明的努力なしに、当業者はこれを改変することが出来る。特に、既存のものに代わる安定化組成物、血液製剤、保存剤、インヒビター等を、発明的努力なく変更し得る。加えて、特定のレベル、生存期間および循環半減期は提供者ごとに、および受容者ごとに変動する。このような変動は、以下に示された請求項により特に除外される以外は発明の範囲内にある。

Claims (6)

1. 血小板濃縮物（ＰＣ）を支持溶液に懸濁することを含む、
   ここで、該支持溶液が、
   Ｌ-カルニチン、アルカノイルＬ-カルニチンまたはその薬理学上許容される塩およびその混合物から成る群から選択されるカルニチン産物を、
   カルニチン産物を含まない以外は該支持溶液と同一である溶液と比較して、ＰＣが該血小板の膜を維持し、それにより溶血を抑制する能力を改良するのに効果的な量で含む、
   血小板濃縮物（ＰＣ）の保存に際して膜の維持を改良し、溶血を抑制する方法。
2. 該カルニチン産物が０．２５-５０ｍＭの範囲で存在する、請求項１の方法。
3. 該カルニチン産物が１-２０ｍＭの量で存在する、請求項２の方法。
4. 密封容器中に、Ｌ-カルニチン、アルカノイルＬ-カルニチンまたはその薬理学上許容される塩およびその混合物から成る群から選択されるカルニチン産物を、０．２５-５０ｍＭの量で含む安定化溶液中のＰＣを格納してなる、請求項１〜３のいずれかの方法に使用するための、血液製剤製品。
5. アルカノイルＬ-カルニチンがアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、およびイソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択される、請求項１、２、および３の何れかに記載の方法。
6. アルカノイルＬ-カルニチンが、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリルおよびイソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択される、請求項４に記載の血液製剤製品。

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