SK284688B6

SK284688B6 - Spôsob zlepšenia ochrany membrány a potlačenia hemolýzy počas skladovania trombocytov a ich dôslednej sterilizácie a uzavretý kontajner s ich obsahom

Info

Publication number: SK284688B6
Application number: SK1427-99A
Authority: SK
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2005-09-08
Also published as: SK142799A3; DE69821002D1; ES2212288T3; NZ500534A; HUP0001936A2; KR100508408B1; AU7078198A; US6482585B2; CZ298671B6; EP0975214B1; US6960428B2; PT975214E; JP2001523225A; EP0975214A1; WO1998046073A1; IL132271A0; BR9808911A; PL336294A1; US20010049089A1; KR20010006464A

Abstract

Je opísaný spôsob zlepšenia ochrany membrány a potlačenia hemolýzy počas skladovania koncentrovaných trombocytov, v ktorom sa koncentrované trombocyty suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje karnitínový produkt vybratý zo skupiny obsahujúcej L-karnitín, alkanoyl L-karnitíny alebo ich farmaceuticky prijateľné soli a ich zmesi, v množstve účinnom na zlepšenie schopnosti koncentrovaných trombocytov ochrániť membránu trombocytov, čím sa potláča hemolýza v porovnaní s tým istým podporným roztokom bez obsahu L-karnitínu, alkanoyl L-karnitínov alebo ich farmaceuticky prijateľných solí a ich zmesí. Tiež je opísaný uzavretý kontajner koncentrovaných trombocytov v stabilizačnom roztoku, ktorý obsahuje L-karnitín, alkanoyl L-karnitíny a ich zmesi v množstve 0,25 až 50 mM a spôsob ich dôslednej sterilizácie ožarovaním v podpornom roztoku.

Description

Tento vynález sa týka spôsobu zlepšenia stability počas skladovania vrátane rezistencie proti hemolýze a zlepšenia životnosti krvných produktov, vrátane koncentrátu trombocytov a podobne. Predovšetkým sa týka spôsobu predĺženia životnosti týchto produktov, rovnako ako ich rezistencie proti látkam poškodzujúcim membrány, ako je radiácia, pomocou uskladnenia produktov v suspenzii s obsahom účinného množstva L-kamitínu alebo L-kamitínov.

Doterajší stav techniky

Postupne narastá záujem o národné a svetové zásoby krvi. Otázkou záujmu sa stáva integrita a spoľahlivosť cxistujúcich zásob a tiež možnosť vytvoriť väčšie zásoby. Jedným z dôvodov je relatívne krátka stabilita krvných produktov počas skladovania. Bežne je koncentrát červených krviniek (RBC) hlavnou formou krvného produktu na transfúzie a podobne, ale ich životnosť je časovo obmedzená 42 dňovým skladovaním. Po tomto čase sa podstatne znižuje obsah ATP a súčasne nastáva významný pokles pH, čo znamená nedostatok životnosti, alebo aj keď RBC sú životaschopné, majú extrémne krátky čas prežitia v cirkulácii. In vitro celá krv nie je skladovaná počas dlhého obdobia. V prípade trombocytov, bežný čas skladovania jc dokonca kratší, štandardne 5 dní pri teplote 22 °C. Rozdiel v stabilite pri skladovaní koncentrovaných trombocytov (PC) oproti RBC, je výsledkom prebiehajúcich metabolických reakcii v trombocytoch, čiastočne v dôsledku prítomnosti mitochondrií v PC, a ich neprítomnosti v RBCs. Obidva krvné produkty majú s časom pokles obsahu ATP spolu s poklesom pH a tvorbou kyseliny mliečnej, ako výsledok glykolýzy, a prítomnosť mitochondrií v PC pravdepodobne znásobuje tento problém.

Zvýšil sa aj záujem o životaschopnosť a integritu krvných zásob. Opakovane sa zistila predovšetkým, kontaminácia krvných zásob baktériami, alebo inými mikróbmi, alebo vírusmi. Takýto stav je dokonca závažnejší v krajinách, kde chýbajú moderné spôsoby odberu a uskladnenia. Na zníženie kontaminácie môžu byť pridané do odberných produktov látky, ktoré však nie sú želateľné pri transfúzii produktov pacientom. Jednou želateľnou možnosťou je ošetrenie výrobkov ožiarením po zabalení, typicky do elastických vinylových plastických kontajnerov. Takéto ošetrenie ožiarením by zhoršilo skladovanie RBC a PC v dôsledku zníženia funkcie týchto buniek.

Okrem toho malá, ale narastajúca časť populácie prijímajúca krv, je vystavená riziku všeobecne smrteľných stavov známych ako choroba z transfúzie spojená s reakciou step verzus hostiteľ (TAGVHD), ktorú spôsobujú prítomné životaschopné alogénne leukocyty. Tento syndróm je zvyčajne spojený so zníženou imunitou pacienta, ako u pacientov s rakovinou a po transplantácii kostnej drene, ale môže sa prejaviť aj u imunokompetentných osôb s obmedzeným HLA (human leukocyte locus A) polymorfizmom v populácii.

Veľká pozornosť sa venovala hľadaniu spôsobov ako predĺžiť stabilitu počas skladovania. Jedna takáto metóda, na predĺženie prežívania PC počas skladovania, je uvedená v U.S. Patente 5,466,573. Tento patent sa zameriava na prípravu PC prípravkov v prítomnosti zdroja acetátových iónov, ktoré pôsobia ako substrát na oxidatívnu fosforyláciu a súčasne aj ako pufer proti poklesu pH spôsobeného tvorbou kyseliny mliečnej. Tento spôsob nerieši priamo problém hemolýzy a poškodenia membrány. Iný spôsob je uvedený v U.S. patente 5 496 821. Podľa tohto patentu je celá krv skladovaná v prípravku s obsahom L-kamitínu (LC) alebo jeho alkanoylových derivátov. Patent však neopisuje účinky na krvné produkty, ako sú suspenzie PC alebo RBC a týka sa do určitej miery pôsobenia LC na vlastnosti membrány.

Ako je uvedené, kontaminácia krvných zásob mikróbmi alebo vírusmi je iný problém, na ktorý by sa mala zamerať pozornosť lekárov. Jeden spôsob sterilizácie výrobku a zlepšenia životnosti vo vzťahu ku kontaminácii, je ožiarenie krvného produktu. Všeobecne gama žiarenie približne 25 centigray (cG) je prospešné pre ožiarenie produktu po jeho zatavení v plastovom, sklenenom alebo inom kontajneri. Žiaľ, ožiarenie vyvoláva lezie bunkových membrán a výsledkom je hemolýza RBC. Naďalej zostáva problémom ožiarenie krvných výrobkov vrátane celej krvi, koncentrovaných RBC a PC.

Podobne zostáva predmetom záujmu pre odborníkov vypracovanie spôsobu na predĺženie času životnosti, obehového polčasu RBC a PC po transfúzii nad bežné maximá. Ďalším cieľom pre odborníkov je nájsť spôsob ako môžu byť ožiarením sterilizované krvné produkty vrátane celej krvi, koncentráty RBC a PC, bez podstatného poškodenia membrány, lézií a hemolýzy.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka spôsobu zlepšenia ochrany membrány a potlačenia hemolýzy počas skladovania koncentrovaných trombocytov, v ktorom sa koncentrované trombocyty suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje kamitínový produkt vybraný zo skupiny obsahujúcej L-kamitín, alkanoyl L-kamitíny alebo ich farmaceutický prijateľné soli a ich zmesi v množstve účinnom na zlepšenie schopnosti koncentrovaných trombocytov ochrániť membránu týchto trombocytov, čím sa potláča hemolýza v porovnaní s tým istým podporným roztokom bez obsahu L-kamitínu, alkanoyl L-kamitínov alebo ich farmaceutický prijateľných soli a ich zmesí.

Prihlasovateľ intenzívnym výskumom objavil, že poškodenie membrány PC počas skladovania, alebo v dôsledku ožiarenia, môže byť podstatne oddialené a potlačené tak, že krvný produkt je suspendovaný v konvenčnom ochrannom roztoku, akým je AS-3, kde ochranný roztok ďalej obsahuje L-kamitín alebo jeho alkanoylové deriváty, v koncentrácii 0,25 až 50 mM alebo viac. Zistenie prihlasovateľa spočíva v poznaní, že väčšina dekompozícii krvných výrobkov je zvyčajne spojená s poklesom obsahu ATP a pH, ktoré môžu byť v skutočnosti odvodené od poškodenia membrány a hemolýzy. Ochrana membrány a jej oprava môže byť uskutočnená cez reacyláciu lipidov, čiastočne uskutočňovanú cez L-kamtín, ktorého nereverzibilné vychytávanie v RBC a podobných krvných produktoch bolo zistené vo výskume.

Tento vynález používa L-kamitín a jeho alkanoylové deriváty ako podpornú látku na ochranu membrány a jej opravu, potlačenie hemolýzy v krvných produktoch. Alkanoyl L-kamitíny sú acetyl, butyryl, izobutyryl, valeryl, izovaleryl a čiastočne propionyl L-kamitín. Tento vynález sa odvoláva na túto druhovú rodinu LC, a sú vyjadrené výrazmi L-kamitín. Opísané alkanoyl L-kamitíny a ich farmakologicky prijateľné soli však môžu byť použité namiesto L-kamitínu.

Pridanie LC ku krvným produktom, PC, si vyžaduje aby LC bol prítomný v množstve účinnom na umožnenie ochrany membrány, jej opravy a potlačenia hemolýzy.

Uskutočnený výskum vrátane uvedených príkladov ukázal minimálny efektívny rozsah 0,25 mM až 0,5 mM pre produkty od väčšiny donorov. Horný limit je viac praktický ako fyziologický. Taká vysoká koncentrácia, ako je 50 mM alebo vyššia, je dobre tolerovaná. Toxické a osmologické hodnoty sú akceptovateľné. Výhodné rozsahy sú 1 až 30 mM. Výhodný je rozsah 1 až 10 mM alebo viac, výhodnejší je pre hodnoty 4 až 6 mM, ktoré majú značný rozdiel. Účinky tohto vynálezu vrátane predĺženia životnosti a predĺženia obehového polčasu po transfúzii, môžu byť veľmi závislé od donora, podobne ako aj účinná koncentrácia LC v rozsahu 0,5 až 50 mM. Ale odborník môže byť požiadaný rozšíriť rozsah ktorýkoľvek smerom, v závislosti od konkrétneho donora. Takéto rozšírenia si nevyžadujú vynálezecké úsilie.

LC je kompatibilný s konvenčnými podpornými roztokmi (stabilizátormi roztokov), ktoré sú zvyčajne pripravené na účely pufrovacieho účinku. Všeobecne používané roztoky obsahujú ACED (kyselina citrónová-citrát sodnýdextrózia), CPD (citrát-fosfát-dextróza) a ich modifikácie vrátane CPD2/A-3 a podobné kompozície. Kompozícia typicky obsahuje uhľohydrát, ako je glukóza alebo manitol, najmenej jednu fosfátovú soľ, citrát a iné balastné soli. LC je dobre rozpustný a môže byť pridaný do týchto kompozícií v požadovanom rozsahu.

Vhodné roztoky sú opísané v U.S. patente 5 496 821, ktorý je tu zahrnutý v citáciách. Môžu byť použité aj iné podporné roztoky, ako sú konvenčné používané vrátane umelej plazmy a iných fyziologicky prijateľných roztokov za predpokladu, že obsahujú LC v súhlase s týmto vynálezom. Dôležitou zložkou podporného roztoku je LC.

Schopnosť LC, keď je prítomný v suspenzii krvných produktov, ako sú RBC a PC, predĺžiť čas prežívania a tým aj dĺžku skladovania a obehový čas po transfúzii príjemcovi, je podložená in vitro a in vivo uvedenými príkladmi. V pokusoch bol použitý LC, ale môžu byť tiež použité iné alkanoyl L-kamitíny. Ich význam je najmä v tom, že zlepšenie vlastnosti je dosiahnuté cez zlepšenú ochranu (vrátane opravy) bunkovej membrány a potlačenie hemolýzy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: hodnoty prežívania po infúzii 42 dní skladovaných RBC kontrolných a skladovaných v prítomnosti LC. Šípky smerujú k hodnotám priemer ± SD pre kontrolné a LC skladované RBC. Hore na obrázku je uvedená presná hodnota p = 0,003.

Obrázok 2: obsah kamitínu v červených krvinkách v priebehu niekoľkých týždňov chránenia krvi. Kamitin bol stanovený tak, ako je opísané v časti Materiál a metódy. Hodnoty sú priemerom z troch pokusov uskutočnených v duplikátoch. Rozptyl medzi pokusmi nebol väčší ako 7 %. Prázdne symboly - RBC skladované s AS-3; plné symboly - RBC skladované v AS-3 doplnené LC (5 mM).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vyhodnotenie in vivo a in vitro kvality RBC uskladnených s - a bez LC

Subjekty

Subjektmi výskumu bola populácia mužov a žien vo veku 18 až 65 rokov bez známych mentálnych a fyzických príznakov, bez užívania liekov, ktoré by mohli ovplyvniť životnosť RBC. Do štúdie boli zaradení jednotlivci, ktorí spĺňali konvenčné kritéria pre alogénne darcovstvo tak, ako je uvedené Code of Federal Register, kapitola 2, Štandardy Americkej Asociácie pre krvné banky a Blood Services Directives of Američan National Red Cross (Americky Červený kríž). Štúdia bola schválená Institutional Review Board of the Medical College of Hampton Roads a subjekty po oboznámení dali súhlas pred zaradením do štúdie.

Každej osobe bola odobratá krv dvakrát, druhý odber sa uskutočnil po 72 dňoch od prvého odberu. Odber bol pri prvom odbere náhodný buď pre testované alebo pre kontrolné rameno.

Systém uskladnenia krvi

Štandarda CP2D/AS-3 systém (Miles, Inc.)

Boli použité plastické vrecúška z polyvinyl chloridu (PVC) s prísadou dietyl(n)hexylftalátu (DEHP) ako plastickej látky. Do každej testovanej jednotky bolo pridaných 245 mg LC (v 1,1 ml čistého, apyrogénneho roztoku zo sterilnej sklenenej fľaše) do kontajnera s aditívnym roztokom AS-3 vo výslednej koncentrácii 5 mM. Do kontrolných jednotiek bolo pridaných 1,1 ml 0,9 % NaCl k roztoku AS-3 pri tých istých podmienkach. Pridanie LC alebo solného roztoku do vrecúšok sa uskutočnilo pomocou striekačky cez ventil pre vzorky. Pridanie sa uskutočnilo v laminámom boxe osvetlenom UV žiarením.

Odber a spracovanie

Boli použité štandardné spôsoby odberu krvi zo žily pre odber približne 450 + 50 ml celej krvi. Celý objem krvi (krvná jednotka) bol pred spracovaním udržiavaný 4 až 8 hodín pri izbovej teplote. Jednotka bola centrifugovaná za štandardných podmienok a po centrfugácii bola oddelená plazma vo frakcii supematantu a sedimentované RBC boli resuspendované buď v štandardnom AS-3 roztoku (kontrola), alebo v L-kamitín-AS-3 roztoku (testovaná vzorka). Resuspendované RBC jednotky boli uskladnené pri 4 °C počas 42 dní.

In vitro stanovenia

Vo vzorkách pred- (0 deň) a po- (42. deň) uskladnením sa hodnotili hladiny ATP v RBC; celkový obsah hemoglobínu a hemoglobín v supematante; hematokrit (Het); počet erytrocytov (RBC), leukocytov (WBC) a trombocytov; osmotická fragilita RBC; morfológia RBC; hodnoty laktátu a glukózy; hodnoty draslíka v supematante. Tieto stanovenia boli uskutočnené použitím štandardných postupov, ako už bolo opísané, Heaton a spol., Vox Sang 57 : 37-42 (1989).

In vivo post-transfúzne hodnotenia

Po 42 dňoch skladovania bola odobratá vzorka a skladované bunky boli označené Cr pomocou štandardných metód. Súčasne, pre stanovenie hmotnosti RBC, bola odobratá čerstvá vzorka od darcu pre značenie RBC s Tc. Po označení, 15 pCi Cr - označených skladovaných buniek a 15 pCi ⁹⁹Tc - označených čerstvých buniek bolo zmiešaných a boli spoločne infundované. Vzorky krvi (5 ml) boli odoberané po infúzii v rôznych časových intervaloch 35 dní, aby sa mohlo vypočítať 24-hodinové % regenerácie a prežívanie. 24-hodinové % regenerácia bola stanovená buď pomocou spôsobu jedného značenia, kde log-lineáma regresia rádioaktivity vzoriek odobratá 5, 7,5, 10 a 15 minút bola použitá na stanovenie hodnoty v čase 0, alebo pomocou dvojitého značenia, pri ktorom sa použila metóda značenia RBC darcu pomocou merania ⁹⁹Tc.

Obehový polčas infuzovaných prežívajúcich Cr - označených RBC bol stanovený tak, že vzorky boli odobraté po hodinách a potom dvakrát týždenne v priebehu nasledujúcich 5 týždňov. Hladiny rádioaktivity boli upravené o konštantné 1 % vylučovania denne. Hodnoty boli linearizované v závislosti od posttransfúznych dní ako nezávislá premenná (x-os) a upravené Cr impulzy ako závislá premenná (y-os). Životnosť RBC bola potom určená priesečníkom priamky s osou x.

Štatistická analýza

Na hodnotenie údajov z in vivo a in vitro testovania sa použil párový t-test, alebo bežná neparametrická štatistická analýza. Hodnotili sa štatisticky významné rozdiely (1-smemé) priemerov medzi kontrolnými a testovanými jednotkami. Štatistický rozdiel sa považoval za významný, keď hodnota p bola menšia ako 0,05.

Príklad 2

Vychytávanie LC erytrocytmi a reacylácia lipidov pri skladovaní do 42 dní

Chemikálie

Hovädzí sérový albumín bez esenciálnych mastných kyselín (BSA) bol od SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. (USA).

Kyselina [l-^l4C]palmitová (58 Ci/mol) bola z New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Tenkovrstvové platničky, Whatman LK6 (silikagél) (20 x 20 cm) s preabsorbčnou vrstvou boli od Carlo Erba, Miláno (Taliansko). Všetky ostatné použité zlúčeniny mali reakčnú kvalitu.

Stanovenie kamitínu v RBC

Vzorka krvi bola odobratá z uskladnenej jednotky RCC a bola jedenkrát premytá so 4 objemami 0,9 % NaCÍ. RBC boli potom resuspendované do 0,9 % NaCÍ na výsledný 50 hematokrit a potom boli deproteinované kyselinou perchlórovou, ako je opísané, Cooper a spol. , Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988). V podieloch výsledného extraktu bol analyzovaný obsah LC radiochemickou metódou podľa Pace a spol., Clin. Chem., 24: 32-35 (1978).

Výsledky z príkladu 1

Vlastnosti AS-3 RCC jednotky pred uskladnením

Po spracovaní celých krvných jednotiek boli vlastnosti AS-3 RCC produktov podľa očakávania. Nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel vo vlastnostiach AS-3 RBC jednotky medzi testovanými a kontrolnými jednotkami, čo sa týka objemu, Het a počtu WBC a in vitro RBC vlastností ako hodnoty ATP, obsahu hemoglobínu v supematante a hodnoty draslíka, osmotickej fragility (tabuľka I).

Vlastnosti RBC po 42 dňoch skladovania Metabolické

Množstvá spotrebovanej glukózy a vytvoreného laktátu počas 42-dňového skladovania boli rovnaké v testovaných a kontrolných jednotkách (tabuľka II). Podľa očakávania sa zistila vysoká inverzná korelácia medzi týmito dvoma parametrami glykolýzy (r = 0,76). Zistila sa však nižšia hemolýza a vyšší obsah ATP v jednotkách RBC skladovaných v prítomnosti kamitínu pri porovnaní s kontrolami. Ako je ukázané na obrázku 1, tento vyšší obsah ATP bol pozorovaný pri všetkých s výnimkou jednej vzorky (p c 0,01).

Membrána

Percento hemolýzy na konci skladovania bolo nižšie v jednotkách s L-kamitínom tak, ako ukazuje obrázok 2. Na druhej strane sa nenašli významné rozdiely v obsahu draslíka v supematante, v odpovedi na osmotický šok a v morfológii, ktorých hodnoty boli v rámci očakávaného rozsahu na konci 42-dňového skladovania.

Posttransfúzna životnosť

Priemerná 24-hodinová % regenerácia pre kontrolné jednotky bolo rovnaké, ako sa zistilo v minulosti. Ale priemerné % regenerácia pre červené krvinky skladované s kamitínom bolo vyššie ako pre kontrolne skladované bunky (p < 0,05). Okrem toho, priemerná obehová životnosť infuzovaných uskladnených červených krviniek bola tiež vyššia pre bunky skladované s L-kamitínom (obrázok 1). Hmotnosť RBC od jedného darcu stanovená dvakrát bola veľmi podobná (r = 0,98) a štatisticky nebola rozdielna.

Korelačné štúdie

Podľa očakávania, 24-hodinové % regenerácie ukázalo významné korelácie medzi obsahom ATP (r = 0,63) a inými vlastnosťami charakterizujúcimi integritu membrány RBC, ako sú hemolýza (r = 0,57), osmotická fragilita (r = 0,71) a morfológia (r = 0,59). Percento hemolýzy vysoko korelovalo s obsahom ATP (r = 0,83) a tiež s obsahom WBC v RBC jednotkách (r = 0,83). Obehová životnosť RBC nemala žiadne významné korelácie so žiadnym in vitro parametrom.

Výsledky príkladu 2

Vychytávanie kamitínu v skladovaných RBC

RBC skladované v As-3 médiu samotnom nemali žiadnu významnú stratu v obsahu LC počas skladovania (obrázok 2). Tento výsledok súhlasí so zisteniami Coopera a spol., že ľudské červené krvinky si nevymieňajú LC s plazmou alebo izoosmotickýcm médiom. Keď červené krvinky boli uskladnené v AS-3 obohatenom o LC, zistilo sa väčšie množstvo LC ako v prípade samotného AS-3 (obrázok 2). Obsah LC narastal lineárne s časom skladovania a dosiahol 4-násobné zvýšenie po 42 dňoch.

Diskusia

In vitro a in vivo testovania RBC jednotiek na konci 42 dňového skladovania ukázali významné rozdiely medzi RBC skladovanými s kamitínom a kontrolnými RBC. Rôzne in vitro vlastnosti RBC odrážajúce metabolický stav a integritu membrány ako ATP a % hemolýzy, rovnako ako priame meranie bunkovej životnosti (24-hodínové regenerácie a obehová životnosť) boli významne vyššie pre RBC skladované s kamitínom. Je zaujímavé predĺženie priemernej životnosti prežívajúcich RBC cirkulujúcich 24-hodín po infúzii. Tento nález sa môže vzťahovať k nereverzibilnému vychytávaniu LC počas skladovania, čo predstavuje v minulosti neznámy, neočakávaný objav. Hodnoty získané v kontrolných štúdiách pre rôzne vlastnosti RBC boli také, ako sa očakávalo a nelíšili sa od predchádzajúcich štúdií. V čase odberu krvi sa nenašli významné rozdiely medzí vlastnosťami kontrolných a testovaných jednotiek alebo RBC. Ako ukazujú obrázky 1 až 3, množstvo ATP v RBC, % hemolýzy a obehová životnosť boh veľmi závislé od darcu, a hoci štúdia bola navrhnutá ako náhodne párová s piatimi testovanými a piatimi kontrolnými štúdiami uskutočnenými pri prvom a druhom odbere, je nepravdepodobné, aby pozorované rozdiely mohli byť náhodné alebo z dôvodu inej chyby v protokole štúdie. Preto je zjavné, že pozorované rozdiely nájdené v tejto štúdii boli spôsobené pridaním Lkamitínu do testovaných jednotiek. Nemožno vylúčiť možnosť, že zvýšená životnosť odzrkadľuje vyplavenie Cr, ale toto nie je v súlade so zlepšenými in vitro vlastnosťami uskladnených červených krviniek, pre ktoré sa zistilo, že korelujú so životnosťou in vivo.

Mnohí výskumníci zistili, že L-kamitín a jeho acyl estery majú cytoprotektívne/membránu stabilizujúce účinky na mnohé bunky vrátane červených krviniek. Pozri napríklad Snyder a spol., Árch. Biochem. Biophys., 276: 132138 (1990). V tejto práci sa zistilo, že L-kamitín bol ireverzibilné vychytaný RBC počas skladovania. Hoci podstata tohto javu nie je úplne jasná, možno vylúčiť účasť špecifického nosiča pre vychytávanie L-kamitínu. Podľa našich vedomostí známy nosič L-kamitínu pôsobí v bunkových systémoch, kde koncentrácia L-kamitinu je niekoľkonásobne vyššia ako normálne prítomná v extracelulámom prostredí. Koncentrácia L-kamitínu v červených krvinkách je rovnaká ako v plazme. Takže, bez ohľadu na nízku teplotu, pokles ATP a iných možných metabolických zmien vyskytujúcich sa počas skladovania, keď červené krvinky sú uchovávané v médiu s relatívne vysokým množstvom exogénneho L-kamitinu, sa zdá, že sa uskutočňuje jednosmerné vychytávanie L-kamitínu bunkami. Takáto skutočnosť sa nepredpokladala.

Povaha pôsobenia L-kamitínu na skladované RBC môže byť hodnotená z pohľadu buď biofyzikálneho a/alebo metabolického ovplyvnenia membránového kompartmentu. Post-transfúzne prežívanie skladovaných červených krviniek má vzťah k celistvosti membránovej funkcie, ako sa predpokladá na základe významnej korelácie medzi in vivo životnosťou červených buniek po reinfúzii a pomerom povrch : objem. Hlavnou zložkou membránovej štruktúry a funkcie RBC je cytoskeletová sieť, Marchesi, Ann. Rev. Celí Biol., 1: 531-536 (1985) , zosieťovanie veľkých proteínových molekúl uložené pod vnútorný segment hemu membrány RBC. Wolfe a spol. v štúdii o zložení a funkcii cytoskeletového membránového proteínu v skladovaných červených krvinkách zistili, že jedinou príslušnou zmenou bol pokles schopnosti spektrínu viazať sa s aktínom buď v prítomnosti, alebo neprítomnosti proteínu 4.1. Wolf a spol., J. Clin. Invest., 78: 1681-1686 (1986). Ukázali sme, že L-kamitín pôsobí na deformovatelnosť RBC membránového proteínu 4.1 obsiahnutého v znovuvytvorených štruktúrach po vystavení zvýšenému stresu. Arduini a spol., Lifc Sci., 47: 2395-2400 (1990). Takže L-kamitín môže mať stabilizačný účinok na membránu cez interakciu spektrínu s jednou alebo viacerými cytoskeletovými zložkami. V nedávnej štúdii Butterfielda a Rangachariho, Life Sci., 52: 297303 (1992) o interakcii spektrín-aktin v červených krvinkách bolo zistené pomocou elektrónovej paramagnetickej rezonancie, že L-kamitín významne znižoval pohyb segmentu spinovo označených miest na spektríne.

Okrem možných biofyzikálnych opísaných účinkov zlepšenia pozorované u červených krviniek skladovaných s LC, môžu byť výsledkom výhodného metabolického pochodu. Normálne si deacylačno-reacylačný cyklus membránových fosfolipidov vyžaduje ATP alebo tvorbu acylCoA. Acylová časť acylCoA je potom prenesená do lyzofosfolipidov pomocou lyzofosfolipid acyl-CoA transferázy. Okrem toho, počas oxidatívnej záťaže, membránový opravný mechanizmus RBC fosfolipidov sleduje rovnakú metabolickú cestu. Nedávne nálezy ukázali, žc CPT ovplyvňuje proces reacylácie membránových fosfolipidov v červených krvinkách a neuronálnych bunkách moduláciou veľkosti poolu acyl-CoA medzi aktiváciu mastnej kyseliny a jej prenos do lyzofosfolipidov. Arduini a spol., J. Biol. Chem., 267: 12673-12681 (1982). Štúdie „pulsechase“ a vyprázdnenia ATP ukázali, že acylkamitínový pool v červených krvinkách pôsobí ako zásobáreň aktívnych acylových skupín, na úkor ATP. Arduini a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 187: 353-358 (1994).

Vyššie 24-hodinové % recovery a obehová životnosť znamená zlepšenie približne 15 % v zmysle účinnosti (množstvo cirkulujúcich živých RBC po transfúzii u prijímateľa x (krát) priemerná životnosť). Túto zvýšenú schopnosť možno klinicky interpretovať ako zníženie potrieb transfúzii u pacientov s chronickými transfúziami, ako pri talasémiách, alebo u pacientov so zlyhaním funkcie kostnej drene. Je však možné predĺžiť čas uskladnenia RBC skladovaných v roztokoch.

Naše zistenie predpokladá, že prítomnosť L-kamitínu v konzervačnom médiu počas skladovania RBC môže mať šetriaci účinok na pool ATP používaný na reacyláciu fosfolipidov pri oprave membrány. Tento priaznivý metabolický proces, spojený s možným užitočným biofyzikálnym účinkom, môže vysvetliť zníženie hemolýzy, vyšší obsah ATP a zlepšenie in vivo recovery a prežívania červených krviniek skladovaných v prítomnosti LC.

Ožiarenie

Problém kontaminácie krvných výrobkov vrátane celej krvi, RBC, PC a podobne baktériami alebo inými mikróbmi alebo vírusmi, môže byť znížené dostatočným ožiarením. Hodnoty ožiarenia potrebné na sterilizáciu, a dôkladná 100 % mortalita spomenutých kontaminačných agens je intenzívne skúmaná.

Okrem toho je dôležitejšie, že leukocyty môžu byť zničené podobným ožiarením. Môžu byť použité rôzne typy ožiarenia vrátane gama žiarenia (Cobalt GG, Van de Graf urýchľovanie), UV ožiarenia, ožiarenia červeným svetlom, atď. Dostatočný je úzky rozsah 20 až 50 cG gama ožiarenia.

Na celom svete je ročne použitých 60 až 80 miliónov jednotiek celej krvi pre transfúziu pacientom z rôznych populácii. V nerozvinutých krajinách je menej odberov na 1 000 obyvateľov a väčšina transfúzii je podávaných v pôrodníckych a pediatrických prípadoch, predovšetkým pri anémii maláriového pôvodu. V rozvinutých krajinách, odbery na 1 000 obyvateľov sú 50- až 10-krát vyššie a väčšina transfúzii je podávaná na chirurgii (50 %), alebo pri liečení pacientov s rakovinou ako anémia, transplantácia kostnej drene, nemalígne gastrointestinálne krvácanie (obrázok 1). Existuje veľa možných protichodných účinkov spojených s transfúziou alogénnej krvi. Jednou takouto protichodnou komplikáciou spojenou s transfúziou krvi je zriedkavá a zvyčajne fatálna reakcia známa ako s transfúziou spojená step verzus hostiteľ reakcia (TA-GVHD), komplikácia spôsobená živými alogénnymi imunocytmi.

TA-GVHD reakcia je zriedkavou komplikáciou po krvnej transfúzii, možné ju pozorovať u dvoch typov populácie príjemcov krvnej transfúzie. TA-GVHD má mortalitu blížiacu sa 100 % a v súčasnosti je prevencia jediný účinný prístup. Po prvé, u pacientov s potlačenou imunitou, ako u pacientov po transplantácii kostnej drene alebo iného orgánu, Hodginsovej choroby alebo dedičnej nedostatočnosti imunitného systému. Po druhé, u pacientov s potlačenou imunitou, keď existuje HLA podobnosť medzi darcom krvi a prijímateľom krvi. Toto je často vidieť pri priamom darcovstve od blízkych príbuzných, alebo v populácii s ohraničeným HLA polymorfizmom ako u Japoncov a Izraelčanov. Na predchádzanie tohto javu, a aby sa zničila replikačná schopnosť živých imunocytov, je všeobecnou praxou ožiarenie bunkových krvných zložiek gama žiarením strednej dávky približne 25 centi (cG). Treba poznamenať, že TA-GVHD je spojená s bunkovými produktmi, ktoré sú čerstvé, t. j. všeobecne nie staršie ako 15 dní. Ale „vek“ kr5 vi nie je doteraz prijatou praxou pri prevencii tejto komplikácie. Hoci imunocyty sú časťou alogénnej leukocytovej populácie, stupeň deplécie leukocytov bežne dosiahnutý treťou generáciou filtrov nie je bežne považovaný za dostatočný na zabránenie tejto komplikácie. Takže gama ožiarenie v súčasnosti zostáva jediným prijateľným profylaktickým zásahom.

Problém s gama ožiarením červených krviniek spočíva v možnom poškodení bunkovej membrány. Je jasné, že ožiarenie v tejto dávke spôsobuje stratu pevnosti približne 7 až 8 % pri meraní in vitro spojenú s poklesom obsahu ATP v červených krvinkách, zvýšenou hemolýzou a zvýšeným obsahom draslíka v supematante. Tieto zmeny sú výsledkom poškodenia membrány. Tieto in vitro zmeny sú spojené s poklesom 24 hodinového recovery gama ožiarených červených krvných buniek. Čo sa týka trombocytov, bola pozorovaná určitá strata životnosti.

Významné dôkazy naznačujú, že gama žiarenie vyvoláva svoje účinky cez tvorbu zlúčenín s aktívnym kyslíkom ako reaktívny kyslík, hydroxy radikál a superoxidový anión. Tieto látky indukujú intracelulárne poškodenie DNA, čo zabraňuje replikácii buniek, charakteristické pre ochorenie TA-GVHD. Tieto isté kyslíkové zlúčeniny môžu oxidovať membránové lipidy v červených krvinkách a možno aj v membráne trombocytov, čo indukuje léziu membrány a znižuje kvalitu (pevnosť) bunkového produktu.

Je známe, že L-kamitín zohráva kľúčovú úlohu v transporte mastných kyselín s dlhým reťazcom cez mitochondriálnu membránu. Dedičné poruchy, pri ktorých zlyhá kamitinový systém pre transport mastných kyselín s dlhým reťazcom spôsobí významné poškodenie funkcie kostrových svalov. Nedávno sa zvýšil záujem o úlohu L-kamitínu v membráne červených krviniek. Červené krvinky nemajú mitochondrie a preto je prekvapivou skutočnosťou prítomnosť L-kamitínu a kamitin palmitoyl transferázy, enzýmu ktorý katalyzuje vratnú acyláciu L-kamitínu. Najprv bola nejasná úloha, ktorú môžu zohrávať vnútri červenej krvinky. Červené krvinky môžu byť vystavené oxidačnému stresu počas celého svojho životného cyklu in vivo, a oprava oxidovaných membránových lipidov obsahujúcich L-kamitín môže byť dôležitá pre normálne prežívanie červených krviniek.

Rýchle zvýšenie acylovaného kamitínu počas zvýšenia dostupnosti ATP môže slúžiť ako zásobáreň aktivovaných mastných kyselín, ktoré môžu byť následne použité pri opravných mechanizmoch poškodených oxidovaných membránových lipidov. Takéto vysvetlenie by dobre objasnilo zníženie hemolýzy pozorovanej počas in vitro skladovania červených krvných buniek a okrem toho by vysvetlilo zlepšenie pozorované in vitro v recovery a prežívaní. Čistý účinok pridania L-kamitínu je približne 17 % vzostup schopnosti.

Podobne L-karnitín, alebo ako bolo spomenuté alkanoyl L-kamitiny môžu byť použité na zrušenie alebo ochranu membránových lézií spôsobených ožiarením. Toto by mohlo byť uskutočnené schopnosťou kamitínu uloženého v červených krvinkách opraviť oxidované membránové lipidy in vitro.

Aby sa obmedzila náchylnosť krvných buniek (RCC, PC a podobne) k membránovým léziám a hemolýze, najprv môžu byť krvné bunky suspendované v roztoku s obsahom L-kamitínu alebo s jedným zo skôr menovaných alkanoyl L-kamitínov v množstve 0,25 mM až 50 mM. Dosiahne sa tým ochrana bunkovej membrány a potlačenie hemolýzy v dostatočnej miere, takže zatavený produkt môže byť ožiarený na účely sterilizácie s následným predĺžením skladovania a obehového polčasu po transfúzii. Môže sa dosiah nuť životnosť bežných hodnôt s materiálom skoro iste sterilným a je nepravdepodobné, že vyvolá TA-GVHD, v dôsledku ožiarenia po zatavení suspenzie krvného produktu. Treba objasniť, že výraz krvný produkt, v tomto zmysle treba chápať v širokom slova zmysle, zahrnuje celú krv, krvnú plazmu, RCC, PC, zmes a podobne.

Pre potvrdenie toho, že pridanie L-kamitínu ku kompozíciám červených krviniek pre gama ožiarenie s cieľom sterilizácie, alebo zničenia imunocytov, a následné uskladnenie zvyšuje prežívanie červených krviniek, boli uskutočnené nasledujúce skúšky.

Materiál a metódy Systém uskladnenia krvi

Bolo použité štandardné štvorité vrecko na skladovanie krvi CP2D/AS-1 systém (Baxter, Inc.). Do každej testovacej jednotky bolo pridaných 245 mg/1 kamitínovej vnútornej soli (LC) rozpustenej v 1,1 ml čistého apyrogénneho bezsoľného roztoku do vrecka s AS-1 aditívnym roztokom tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 5 mM. Za rovnakých podmienok bolo do kontrolných jednotiek pridaných 1,1 ml soľného roztoku k AS-1 roztoku.

Odber a spracovanie

Boli použité štandardné metódy flebotómie a odberu krvi v množstve približne 450 ± 50 ml cele] krvi. Jednotka celej krvi bola pred spracovaním udržiavaná- 4 až 8 hodín pri izbovej teplote. Za štandardných podmienok bola jednotka centrifugovaná (pozri: Heaton W. A. a spol. , Vox sanguinis, 1989, 57: 37-42) a po centrifugácii bola vyliata plazma a sediment červených krviniek (RBC) bol resuspendovaný buď do štandardného AS-1 roztoku (kontrola), alebo do LC s obsahom AS-1 roztoku (skúšobná vzorka).

Podmienky skladovania a gama ožiarenie RBC jednotiek

Jednotky so suspenziou RBC (kontrolné a skúšobné) boli uskladnené pri teplote 1 až 6 °C 14 dní a potom boli gama ožiarené v dávke 25 cG. Jednotky RBC boli potom skladované pri teplote 1 až 6 °C do 42 dní.

In vitro merania

Merania sa uskutočnili vo vzorke pred (0 deň) a po (42. deň) skladovaní a hodnotil sa hemoglobín v supematante a priemerný korpuskulárny objem (MCV). Boli použité štandardné metódy ako uvádza Heaton a spol., vyššie.

Štatistická analýza

Veľkosť vzorky je založená na predchádzajúcich údajoch týkajúcich sa variancie hemoglobínu v supematante. Celkový počet tvorilo 94 RBC jednotiek, 47 z každej ruky (kontrola a skúšobná). Analýza hodnôt distribúcie plazmatického hemoglobínu ukázala významné poškodenie (> 2) a zakrivenie krivky (8 - 10). Preto boli hodnoty analyzované pomocou neparametrického testu pre medián pomocou softvérového programu (Epistat, Richardson, TX).

Výsledky

Po spracovaní jednotiek s celou krvou boli vlastnosti RBC jednotiek pred uskladnením také, ako sa očakávalo. Neboli prítomné žiadne významné rozdiely medzi kontrolnými a testovanými vzorkami pri hodnotení hemoglobínu v supematante a MCH (tabuľka A) . Na konci uskladnenia (42 dni), gama ožiarené RBC mali štatisticky významné rozdiely medzi kontrolnými a jednotkami s obsahom LC (viď p hodnoty v tabuľke A). Predovšetkým bola pozorovaná nižšia hemolýza v testovanej vzorke v porovnaní s kontrolnými RBC jednotkami. Hodnota MCV pre RBC jednotku s obsahom LC bola nižšia ako pre kontroly.

Uvedené výsledky ukazujú, že pridanie L-kamitínu k červeným krvinkám zabráni poškodeniam spojeným s gama - ožiarením červených krviniek a skladovaním.

TABUĽKA A

DEŇ 0 DEŇ 42

	Kontrola L-kamitín	p	Kontrola	L-kamitín p
MCV (fL)	91,2	90,7	0,46	100,2	97,5	0,006
Plazma Hb	11,8	11,5	0,58	495	382	0,05
ŕms/dľ)

Tento vynález bol predložený v dvoch generických významoch s odvolaním na špecifické príklady. Pre odborníkov sú možné obmeny bez toho, aby bola potrebná vynálezcovská činnosť. Predovšetkým môžu byť obmenené stabilizátory, krvné produkty, konzervačné látky, inhibítory a podobne bez toho, aby bola potrebná vynálezcovská zručnosť. Okrem toho, špecifické hodnoty, rôzne časové obdobia a obehové polčasy sa budú líšiť medzi jednotlivými darcami a tiež budú závisieť od príjemcu. Takéto rozdiely sú súčasťou cieľa vynálezu, dokiaľ nie sú špecificky vylúčené uvedenými nárokmi.

Tabuľka 1

Vlastnosti RBC pred uskladnením koncentrovaných červených krviniek

KONTROLA... SKÚŠOBNÁ VZORKA (L-karnitín)

Objem...(ml)..	305 + 38....	295 + 41
Uni: He: (Jo)	60 + 3	60 + 2
Jednotka WBC (xlO⁹)	2,6 + 1,1	2,4 + 1,1
ATP (umol/g Hb)	4,6 + 0,2	4,3 + 0,4
Hb v supematante	34+15	26,8 + 8
(mg/dl)
K v supematante	23 + 0,2	2,2 + 0,3
(mEkv/1)
Osmotická odolnosť %	50 + 4	49 + 4

Tabuľka 2

Vlastnosti koncentrovaných červených buniek po skladovaní (42 dní)

KONTROLA... SKÚŠOBNÁ VZORKA (L-kamitin)

Hodnoty in vitro
Glukóza (mg/dl)	208 + 33	193 + 40
Laktát (mg/dl)	201+27	199 + 37
PH	6,33 ± 0,03	6,32 + 0,04
ATP (pmol/g Hb)	3,01 + 0,42	3,24 + 0,38*
Hemolýza (%)	0,47 + 0,41	0,30 + 0,22*
K⁺ v supematante	61 +4	60 + 3
(mEkv/1)
Osmotická odolnosť
(%)	51,3+3	50 + 4
Morfológia	69 + 8	68 + 15
Hodnoty in vivo
24 h % recovery	81,1 +6,2	34,0 + 4,4
(jedno značenie)
24 h % recovery	80,1+6,0	83,9 + 5,0*
(dvojité značenie)
RBC (ml)	1635 + 510	1591 +534
Prežívanie (dni)	85.9+14.3	96.1 + 11.2

* (p < 0,05)

Claims

L Spôsob zlepšenia ochrany membrány a potlačenia hemolýzy počas skladovania koncentrovaných trombocytov, vyznačujúci sa tým, že koncentrované trombocyty sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje kamitínový produkt vybratý zo skupiny obsahujúcej L-kamitín, alkanoyl L-kamitíny alebo ich farmceuticky prijateľné soli a ich zmesi, v množstve účinnom na zlepšenie schopnosti koncentrovaných trombocytov ochrániť membránu trombocytov, čím sa potláča hemolýza v porovnaní s tým istým podporným roztokom bez obsahu L-kamitínu, alkanoyl L-kamitinov alebo ich farmaceutický prijateľných soli a ich zmesi.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že L-kamitín, alkanoyl L-kamitíny a ich zmesi sú prítomné v množstve 0,25 až 50 mM.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že L-kamitin, alkanoyl L-kamitíny a ich zmesi sú prítomné v množstve 1 až 20 mM.
4. Uzavretý kontajner koncentrovaných trombocytov v stabilizačnom roztoku, vyznačujúci sa tým, že stabilizačný roztok obsahuje L-kamitín, alkanoyl L-kamitíny a ich zmesi v množstve 0,2 5 až 50 mM.
5. Uzavretý kontajner podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že po uzavretí je ožiarený na jeho dôslednú sterilizáciu a zničenie prítomných leukocytov.
6. Spôsob dôslednej sterilizácie koncentrovaných trombocytov, vyznačujúci sa tým, žc koncentrované trombocyty sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje L-kamitín v množstve 0,25 až 50 mM a po usadení tohto krvného produktu sa ožaruje vnútri kontajnera na jeho dôslednú sterilizáciu.
7. Spôsob spracovania koncentrovaných trombocytov na potlačenie leukocytov v nich prítomných, vyznačujúci sa tým, že koncentrované trombocyty sa ožarujú v podpornom roztoku obsahujúcom L-kamitín v množstve 0,25 mM až 50 mM na úplné zničenie leukocytov vo vzorke, zatiaľ čo sa potláča poškodenie membrány koncentrovaných trombocytov.
8. Spôsob zlepšenia ochrany membrány a potlačenia hemolýzy počas skladovania koncentrovaných trombocytov po ich ožiarení na zničenie tu prítomných imunocytov, vyznačujúci sa tým, že koncentrované trombocyty sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje kamitínový produkt vybratý zo skupiny pozostávajúcej z L-kamitínu, alkanoyl L-kamitínov a ich zmesí v množstve účinnom na zlepšenie schopnosti koncentrovaných trombocytov ochrániť membránu trombocytov, čím sa potláča hemolýza, v porovnaní s tým istým podporným roztokom neobsahujúcim L-kamitín, alkanoyl L-kamitíny a ich zmesi.
9. Spôsob podľa nárokov 1, 2, 3, 6, 7 a 8, v y značujúci sa tým, že alkanoyl L-kamitín je vybraný zo skupiny obsahujúcej acetyl, propionyl, butyryl, izobutyryl, vaieryl a izovarelyl L-kamitín.
10. Uzavretý kontajner podľa nárokov 4 a 5, vyznačujúci sa tým, že alkanoyl L-kamitín je vybratý zo skupiny obsahujúcej acetyl, propionyl, butyryl, izobutyryl, vaieryl a izovarelyl L-kamitín.