JP5096148B2

JP5096148B2 - 生物学的試料の殺菌方法

Info

Publication number: JP5096148B2
Application number: JP2007526690A
Authority: JP
Inventors: ナタン、イエフディット; カニアス、タマー
Original assignee: Core Dynamics Ltd
Current assignee: Core Dynamics Ltd
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2005-06-07
Publication date: 2012-12-12
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Description

発明の分野
本発明は、生物学的試料の殺菌に関する。さらに具体的には、本発明は、生物学的試料の殺菌方法および殺菌された生物学的試料に関する。

引用文献のリスト
以下の参照文献が、本発明の背景を理解する目的のために適切であると考えられる。

１．US 2004/067157 生体物質を殺菌するための方法、
２．WO 2004/009138 ミルクを殺菌するための方法、
３．PCT IL2005/000125 生体物質、およびそれらの保存のための方法および溶液、
４．US 5,709,992 赤血球を殺菌するための方法、
５．US 6,482,585 赤血球および血小板を含む血液製剤の貯蔵および管理、
６．ヒューストム（Hustom）等、細菌の成長を抑制するための、濃縮血小板の従来のγ線照射についての有効性の欠如 Am J Clin Pathol. 1998; 109(6):743-7、
７．スミス（Smith）等、ＨＩＶ−１のガンマ線照射 J orthop Res. 2001; 19(5): 815-9。

発明の背景
細胞、組織、または他の生体物質を貯蔵する際に、バクテリア、ウイルス、酵母菌、カビ、菌類等からの汚染の危険が常に存在し、時として汚染物質は、生体物質中に、これを最初に収集した際に存在している。汚染物質は、保存中に生体物質に損傷を与える可能性のある、および／または生成物を用いる（例えば、輸血する、注射する、または摂取する）際に受容者に悪影響をもたらす可能性のある作用物質である。既知の汚染物質の中には、赤血球（ＲＢＣ）サンプル中に通常存在している白血球（ＷＢＣ）がある。輸血液中のＷＢＣの存在は、移植片対宿主病のために問題であり、この病気では、輸血されたＷＢＣ（主に、リンパ球）は、受容者の体を攻撃する。

多くの殺菌方法が、この技術分野において知られており、加熱およびろ過等である。しかしながら、これらのプロセスは、生体物質に損傷を与える可能性があり（例えば、それが熱に敏感である場合）、または非効率であることがわかっている（例えば、生体物質を、ある種の汚染物質と共にろ過する場合に）。殺菌のための他の方法には、電離放射線、主にガンマ放射線がある。例えば、ガンマ放射線は、新鮮な血液単位中の、ＷＢＣ、主に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主要因であるリンパ球の不活性化のために用いられる。これは通常、プラスチックバッグ中の、ＲＢＣ、血小板、顆粒球成分、および非凍結血漿を含む血液または血液成分の液体サンプルに、血液バッグの各部分に１．５メガラド以上のガンマ放射線が行き渡るように、２．５メガラドのガンマ放射線をバッグの中心部に照射することにより行われる（ＡＡＢＢ技術マニュアル、第１４版）。濃厚血小板中のバクテリア量を減少させるための試みが為されているが（ヒューストム（Hustom）等、１９９８）、７．５メガラドまでのレベルのガンマ放射線への曝露は、サンプルを殺菌する効果がないと結論づけている。同様に、ガンマ放射線（１．５〜２．５メガラド）は、凍結させた骨および腱の同種移植片中のＨＩＶタイプ１について殺ウイルス線量にならないということが見出された（スミス（Smith）等、２００１）。

さらに、ガンマ放射線は、放射線に敏感な製品に損傷を与える可能性がある。特に、ガンマ放射線は、赤血球、血小板および顆粒球に対して有害であることが示されている（US 2004/067157）。

他方で、紫外線（ＵＶ）放射線は、ガンマ放射線ほど損傷を与えないと考えられている。しかしながら、ＵＶ放射線は水により吸収されてしまうために、水含有サンプル（液体または氷）中に存在する汚染物質の除去には、実際には効果がない。従って、WO 2004/0091938 には、生体物質の残留溶媒量の低減は、水によるＵＶの吸収を軽減し、よって、ＵＶを用いる生体サンプルの殺菌を可能にすることが教示されている。しかしながら、WO 2004/0091938 における生体物質の殺菌は、湿った生体物質か、または血液試料の非細胞部（すなわち、ＲＢＣまたは血小板を含まない）に制限されており、これは明らかに、「血液等の敏感な生物学的試料は、照射目的のための冷凍、続く患者への投与前の解凍を受けると、生存能力および活性が失われ得る」ためである（同文献）。

用語解説
「生物学的試料」という語は、所望の生物学的実体を含む試料またはサンプル（天然由来の、加工された、または人工の）を示す。「所望の生物学的実体」とは、生きた無核の生物学的実体であり、真核生物の無核細胞（例えばＲＢＣ）、細胞の一部（例えば血小板）、リポソーム等の人工の若しくは半人工の材料を含む。このような生物学的試料の例は、血液、またはＲＢＣ若しくは血小板を含むその分画、血液のＲＢＣ豊富な分画、濃厚ＲＢＣ、または血液の血小板豊富な分画、リポソームのサンプル等を含む。

「生きた（viable）」生物学的試料とは、その中の所望の生物学的実体の少なくとも一部が、構造的に損なわれていないようにみえるもの、または好ましくは、生物学的実体が、少なくとも部分的に所望の生物学的活性を保っている、あるいは乾燥状態の場合は、再水和の際にその活性を取り戻すことができるものである。好ましくは、所望の生物学的実体の少なくとも１０％が、望ましくは少なくとも３０％が、または少なくとも５０％もが、生きている。例えばＲＢＣの場合には、生存細胞の好ましい割合は、時として、少なくとも７５％であり得る。

本発明において、「リポソーム」とは、中空の脂質小胞を意味する。これらは、リポソーム内に運ばれた物質を捕らえるために用いられるか、または重要な薬剤分子を、中空の水性の内部中に取り込む、あるいは凝集表面に静電気的に付着させるのではなく、内在する膜成分として脂質小胞中に取り込ませることができる。

「生体汚染物質」とは、遺伝物質を含み、従って放射線に敏感である生物学的実体を意味すると解釈される。生体汚染物質は、収集する際に生物学的試料中に存在し得るし、またはその後に（例えば、その取り扱いまたは貯蔵中）生物学的試料を汚染することがあり、並びに生物学的試料若しくはその一部、受容者に損傷を与えることがあり、さもなければ、生物学的試料の使用を妨げ得る。このような生体汚染物質は、核酸配列、ウイルス、マイコプラスマ若しくはバクテリア等の原核生物、および菌類、酵母、カビ、単細胞、またはより大きな寄生微生物、またはＷＢＣ等の他の望ましくない細胞単位を含む、任意のタイプの生物学的実体であり得る。

汚染物質の「活性」とは、生物学的試料、その受容者に損傷を与え得る、さもなければ生物学的試料の使用を妨げ得る（法律上の制約を含む）いずれもの活性を意味する。汚染物質は非常に放射線に敏感なものであるため、照射時に、数の上で減少するか、または例えば、増殖する可能性が低くなること（例えば、バクテリア、ＷＢＣ、酵母菌）、または標的とする細胞に影響を及ぼす可能性が低くなること（例えばウイルス）若しくは細胞に形質移入する可能性が低くなること（例えば核酸配列）、または重大な免疫効果を示す可能性が低くなること（例えばＷＢＣ）により活性を低下させる。汚染物質の量または活性を、当該技術分野の任意の方法を用いて、直接的にまたは間接的に調べることができる。

「電離放射線」という語は、これが通過する物質から電子を除去し、イオンを形成するに十分なエネルギを有する、任意の形態の放射線を意味する。これには、アルファ粒子およびベータ粒子、ガンマ放射線、並びにｘ線が含まれる。「ＵＶ放射線」という語は、１００〜４００ｎｍの間の波長を有する放射線を意味する。これは３つの範囲、すなわち、ＵＶ−Ａ（３１５〜４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ（２８０〜３１５ｎｍ）、およびＵＶ−Ｃ（１００〜２８０ｎｍ）を含む。

「乾燥する」、「乾燥させた」または「乾燥」という語は、乾燥前の含水量と比較して、減少した含水量を有する（含水量を減少させる）ことを意味する。乾燥させた試料は、それが得られた元の試料より１０％少ない、元の試料より好ましくは６０％少ないよりも少ない、または７５％少ないよりも少ない、並びに望ましくは元の製剤と比べて９０％少ないよりも少ない水を有し得る。乾燥は、生物学的試料が、所望の生物学的実体の生存能力を保つ限りは、空気乾燥、熱乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥、または霧状化等の、当該技術分野において知られている任意の方法を用いて行うことができる。方法の例は、リポソームの空気乾燥（ヒンチャ（Hincha）等、2003； Biochemica et Biophysica ACTA. 1612(2)：172-177）、胎児腎細胞株およびヒト包皮繊維芽細胞の空気乾燥（ゴー（Gau）等、2000；Nature Biotechnology. 18：168-171）等を含む。バクテリアは、空気乾燥プロセスを経ても生き残り得（デズモンド（Desmond）等、J Appl Microbiol. 2002；93(6)：1003-11）、他の汚染物質も生き残り得る。

「凍結乾燥（lyophilization）」または「フリーズドライ（freeze-drying）」は、材料を凍結させ、および乾燥させるプロセスを意味する。つまり、本発明において、生物学的試料をフリーズドライするまたは凍結乾燥する場合はいつでも、これは、少なくとも２つの工程が実行されていることを意味し得、このうちの１つは、サンプルを凍結する工程であり、もう１つは乾燥する工程である。これらの工程のそれぞれは、任意の既知の方法を用いて行うことができ、好ましくは、所望の生物学的実体に最小限の損傷を与える既知の方法を用いて行うことができる。好ましいフリーズドライの方法は、PCT IL2005/000125 に開示されており、この内容は、参照によりすべて本明細書中に組み込まれている。

本発明の要約
本発明は、所望の無核の生物学的実体、たとえばＲＢＣまたは血小板を含む生物学的試料に、電離放射線またはＵＶ放射線を用いて照射し、乾燥した（例えばフリーズドライした）状態にある場合には、望ましくない生体汚染物質を死滅させ、前記生物学的実体に対して損傷を比較的少なくできるようにするという、本発明者らの驚くべき発見に基づく。「少ない損傷」とは、照射後に、所望の生物学的実体の少なくとも１０％が生きている、望ましくは、上記生物学的実体の少なくとも３０％または少なくとも５０％が生きているということを意味するものと解釈されるべきである。本発明は、ＰＣＴ出願 PCT IL2005/000125 に記載されるように、フリーズドライし、再水和させた生物学的試料に特に適しており、この内容は参照によりすべて本明細書中に組み込まれているが、これに限定されるものではない。一実施形態によれば、本発明は、電離放射線またはＵＶ放射線を用いる、所望の無核の生物学的実体を含む生物学的試料の照射および殺菌を可能にする。

従って、本発明は、１つの態様によれば、所望の生きた生物学的実体を含む生物学的試料の殺菌方法であって、本方法は、乾燥した生物学的試料に、電離放射線またはＵＶ放射線を、生物学的試料中の生体汚染物質の量または活性を減少させるのに十分な強度および時間で照射することを含み、この強度および時間は、サンプル中の所望の生物学的実体の少なくとも一部が、生きたままであるように選択される。

本発明は、ＲＢＣおよび血小板等の血液から得られる所望の生物学的実体を含む生物学的試料に特に適する。

本発明の詳細な説明
上記したように、本発明は、所望の生きた生物学的実体を含む生物学的試料の殺菌のための方法を提供し、生物学的試料中の生体汚染物質の量または活性の低下を可能にする。場合によっては、生物学的試料中の活性な汚染物質の量を、無くなるまで減少させる。照射前に、単一の生物学的試料が１種以上の汚染物質を含む場合には、本発明の方法は、上記汚染物質のうちの少なくとも１種の量または活性の低下を可能にし得るということが意図される。さらに時として、照射前に、生物学的試料が、活性な汚染物質を含まないこともあり、この場合には、本発明は、汚染物質が存在しないことを確実にするであろうし、従って、活性な汚染物質をチェックする必要を減らすか、なくす。

いくつかの実施形態によれば、本方法は、所望の生きた生物学的実体を含む生物学的試料を乾燥する工程を含む。従って、生物学的試料に照射する工程は、当該生物学的試料を乾燥させた、または部分的に乾燥させた後は、いつでも行うことができる。それどころか、照射を、生物学的試料を乾燥させる２つの工程と同時に（または部分的に同時に）、または２つの工程の間で行うことができる。

任意の種類の電離放射線またはＵＶ放射線が、本発明に適しているであろうが、当業者は、照射のタイプ、強度および時間を、生物学的試料の生存能力をできるだけ保ちながら、汚染物質の量または活性をできるだけ減少させるように、最適に選択できるということを理解するであろう。

本発明を理解し、どのように実際に行うことができるか理解するために、好ましい実施形態を、単に非限定的な例として記載する。

実験
材料および方法
他に示さない限り、全ての材料は、シグマ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。

例１凍結乾燥したＲＢＣの生存に対するＵＶ露光の効果
赤血球（ＲＢＣ）に対する照射およびフリーズドライの効果を、この実験において評価した。用いた凍結溶液は、ＰＢＳ（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）デキストランからなっていた。イスラエル血液サービスから入手した濃厚ＲＢＣを、１：１（ｖ／ｖ）の比で、凍結溶液と混合した。２．５ｍｌのＲＢＣ溶液を、１６ｍｍ直径のガラス試験管（Manara、イスラエル）中に入れた後、これを凍結した。凍結を、ＭＴＧ凍結デバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、１０００℃／分の冷却速度；（温度勾配）Ｇ＝５．５℃／分、Ｖ＝３ｍｍ／秒で行った。また、サンプルを５６ＲＰＭ（毎分の回転数）で回転させた。

凍結後、サンプルを、凍結乾燥器（Labconco、米国）中に、３日間（コンデンサ −８０℃）入れた。３日の凍結乾燥後、サンプルが元の含水量の１０％以下を含有した際に、１つのサンプルをペトリ皿に入れ、１時間ＵＶ放射線に曝し、他方を、アルミニウムホイルを用いて光から保護した。１時間の照射後、サンプルを超純水を用いて、３７℃で、その元の体積にまで再水和した。Ｐｅｎｔｒａ６０（ＡＢＸ、フランス）を用いて、ＲＢＣを数え、ヘマトクリット値を調べた。

表Ｉ凍結乾燥したＲＢＣに対するＵＶ露光の効果

表Ｉにおいて見られるように、ＵＶに曝したサンプルは、放射線に曝さなかったサンプルと比較して、わずかにより低い生存率を示した。本発明者等は、凍結溶液へのポリフェノールの添加が、凍結乾燥−解凍処理における細胞の生存率を向上させるということを見出しているため、以下の実験において、１種のそのようなポリフェノールを、生物学的サンプルに添加した。「ポリフェノール」という語は、緑茶中に天然には見出され得る、１種以上の天然のおよび／または合成のポリフェノールを示し、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、没食子酸エピカテキン（ＥＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン（ＥＣ）等である。

例２凍結乾燥したＲＢＣの生存に対するＵＶ放射線の効果
この実験においては、濃厚ＲＢＣを、３０％（ｗ／ｖ）のデキストラン４０，０００ダルトンと０．４７ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ（Cayman Chemical、米国）を含む凍結溶液と共に凍結させた。凍結溶液と濃厚ＲＢＣを、１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した。２．５ｍｌの細胞懸濁液を、１６ｍｍ直径のガラス試験管（Manara、イスラエル）中に入れた。全部で４個の試験管を凍結させた。サンプルを、ＭＴＧデバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、１０００℃／分の冷却速度；（温度勾配）Ｇ＝５．５℃／ｍｍ、Ｖ＝３ｍｍ／秒で凍結させた。また、サンプルを５６ＲＰＭで回転させた。

凍結後、サンプルを液体窒素中に置いた。種々の時間（１／２時間〜数週間）が過ぎた後に、サンプルを凍結乾燥器（Labconco、米国）、−８０℃のコンデンサ温度）に７２時間入れ、サンプルを、これがパウダー状の外観を有し、およびその初期の水分含有量の１０％未満を有するように乾燥させた。サンプルを６０ｍｍのペトリ皿に移し、２つのサンプルをＵＶに１時間曝し、この１時間、他の２つのサンプルをアルミニウムホイルで覆って、光照射を防いだ。その後、全てのサンプルを、超純水を用いて３７℃で、初期の体積にまで再水和し、ＰＥＮＴＲＡ６０カウンタ（ＡＢＸ、フランス）を用いて比較した。結果を、ＥＧＣＧを含む凍結溶液中の新鮮なＲＢＣのパラメータと比較して示す。

表ＩＩ凍結乾燥したＲＢＣの生存に対するＵＶ放射線の効果

表ＩＩからわかるように、５０％を超えるＲＢＣが生存しているようであるが、凍結乾燥した細胞は、新鮮な細胞に比べると生存できず、およびより低いヘマトクリット値を有した。それにも関らず、これらのパラメータは、ＵＶ放射線のわずかな影響を受けるのみである。

例３
ＲＢＣ生存に対する部分乾燥の効果
新鮮なラットの全血（Sprague-Dawley ラットから抽出）を、１回洗浄した。血漿を除去し、濃厚ＲＢＣを、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液中の０．９４５ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧと２０％（ｗ／ｖ）のデキストラン４０ｋＤから成る凍結溶液と、１：３の比（ｖ／ｖ）で懸濁させ、最終的なヘマトクリット値は２５％であった。３つのサンプル（各２．５ｍｌ）を、以下のパラメータを用いた：速度＝３ｍｍ／秒、温度勾配は５．５℃／ｍｍで、ＭＴＧデバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、１６ｍｍ直径のガラス試験管（Ｍａｎａｒａ、イスラエル）中でそれぞれ凍結させ、この試験管を６０ｒｐｍで回転させた。凍結後、サンプルを凍結乾燥までＬＮ中で貯蔵した。凍結乾燥を、同時係属のＰＣＴ出願第 IL2005/000124 号の主題である、−１９０℃のコンデンサ温度を有する特別な凍結乾燥デバイス（ＩＭＴ、イスラエル）中で行い、サンプルを、−２０℃の温度に保った。サンプルをデバイス中に４８時間置いた。４８時間後、サンプルを取り出し、３７℃の水浴中で解凍した。サンプルを部分的に乾燥させたので、１．５ｍｌの３７℃のＰＢＳ（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない）を加えて、細胞を再水和した。ＰＢＳを、水の代わりに加えた。水を加えることが、過剰のＰＢＳと比較して、細胞へのより大きな損傷を引き起こすと予想されるためである。

その後、サンプルをＰｅｎｔｒａ６０細胞カウンタ（ＡＢＸ、フランス）を用いて、完全血球算定評価について評価し、上清の遊離ヘモグロビンレベルを、ドラブキン試薬（Dravkin's reagent）を用いて、シアンメトヘモグロビン法を用いて測定した。吸光度は、照度計（Turner Biosystems、米国）を用いて、５４０ｎｍの波長において読み取った。上清の遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）のパーセンテージは、以下の式（Ｉ）を用いて計算した。

表ＩＩＩ部分的に乾燥させたＲＢＣサンプル

４８時間の凍結乾燥は、約６０％の水損失をもたらした。この水損失は、初期のサンプルの体積を取り戻すために、溶液に加える必要があったＰＢＳの量により値を求めた。凍結乾燥したサンプルにおいて、遊離ヘモグロビンのパーセンテージ（２２．２６％の遊離Ｈｂ）に見られるように、いくらかの細胞の損傷が存在した。しかしながら、顕微鏡観察は、５０％を超える、通常の形態を有する細胞を示した。さらに、この遊離ヘモグロビン率は、解凍プロセスの結果の可能性がある。解凍時でＰＢＳの添加前に、解凍された細胞は、非常に高浸透圧の環境に晒されているためであり、ＰＢＳ添加後は、高浸透圧のままではあるが、より少ない程度である。

例４大腸菌に対する凍結およびフリーズドライの効果
大腸菌を、ＬＢ培地：１リットルの蒸留水中の１０ｇｒのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ、米国）、５ｇｒの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ、米国）、１０ｇｒのＮａＣｌに入れた。１０ｍｌの全体積を、それぞれ５ｍｌの２つのバッチに分けた。ＬＢ培地中の大腸菌の第１のバッチに、ＰＢＳ（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）デキストランおよび０．４７ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ（Cayman Chemical、米国）から成る５ｍｌの凍結溶液を加えた。他のバッチは、手付かずにしておいた。それぞれ２．５ｍｌの細胞懸濁液サンプル（各バッチから２つずつ）を、全部で４つの試験管を調製するように、１６ｍｍ直径のガラス試験管（Manara、イスラエル）中に入れた。試験管を、ＭＴＧデバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、１０００℃／分（５〜−５０℃ ３ｍｍ／秒の速度、および５６ＲＰＭで凍結させた。凍結が完了した後、試験管を液体窒素中に置いた。その後、４つの試験管を、凍結乾燥器（Labcono、米国）中に７２時間入れた。凍結乾燥が完了した後、各試験管からの「粉状の」細胞を、ペトリ皿にこすり落とした。２つのペトリ皿（各バッチを代表するもの）を、１時間ＵＶ放射線に曝し（ペトリ皿を、ＵＶランプ下に、開放したまま置いた）、他の２つのペトリ皿は、放射線に曝さずにおいた（光からの保護のために、アルミニウムホイルで覆った）。１時間後、３７℃の２ｍｌの再蒸留水を、それぞれの皿に加えた。各皿から、寒天を有する３つのペトリ皿を平板培養した。以下の寒天プレートプロトコルを用いた：１０ｇｒのバクトトリプトン、５ｇｒの酵母エキス、１０ｇｒのＮａ^＋Ｃｌ⁻、１０ｇｒの寒天（ＢＤ、ＵＳＡ）。水を１リットルの体積にまで加え、加圧滅菌器で処理し、６５℃にまで冷却して、ペトリ皿に注いだ。全部で１２個のペトリ皿を、３７℃で２４時間培養した。翌日、コロニーを数えた。表ＩＶは、寒天ペトリ皿で成長した数を示す。

表ＩＶ異なる凍結溶液で凍結され、および凍結乾燥された後の大腸菌コロニーの数

表ＩＶに見られるように、大腸菌コロニーは、未照射のバクテリアの皿中でのみ観察された。凍結乾燥した細胞を平板培養した寒天であって、照射されたものでは、コロニーは観察されなかった。さらに、デキストランとＥＧＣＧの添加は、凍結乾燥後のバクテリアのより高い生存率をもたらす。

例５ＲＢＣ試料中の大腸菌に対する凍結およびフリーズドライの効果
調製
１０ｍｌの大腸菌／ＬＢ培地を、８００ｇで１０分間、遠心分離機にかけた。得られたペレットに、ＰＢＳ（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）のデキストラン４０，０００ダルトンと０．４７ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ（Cayman Chemical、米国）から成る１０ｍｌの凍結溶液を加えた。その後、この溶液を、濃厚ＲＢＣと体積比１：１で混合した。２ｍｌのＲＢＣ＆大腸菌を、ペトリ皿に入れた。全部で４つの同様の皿を調製した。２つのペトリ皿を、ＵＶに１時間曝し、他の２つは曝さなかった。１時間後、各グループからの細胞を、３つの寒天プレートに平板培養し、これを３７℃のオーブン中に２４時間入れた。

残るＲＢＣ−大腸菌混合物から、それぞれ２．５ｍｌを含有する４つの試験管を調製した。試験管を、ＭＴＧデバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、１０００℃／分（５〜−５０℃、３ｍｍ／秒の速度、および５６ＲＰＭで凍結した後、凍結乾燥器中に７２時間入れた。凍結乾燥後、各グループから１つの試験管を、ＵＶ放射線に１時間曝した。１時間後、２ｍｌのｄｄＨ_２Ｏを加え、各グループから３つの寒天プレートに接種し、２４時間３７℃のオーブン中に２４時間入れた。結果を表ＩＶに示す。

表ＶＲＢＣを含む、凍結乾燥した、または新鮮なサンプル中の大腸菌の生存に対するＵＶ放射線の効果

表Ｖに見られるように、液体状態における照射は、大腸菌に対して測定される効果を全く有さず、全てのプレートにおいて２００を超えるコロニーが観察された。しかしながら、乾燥（凍結乾燥）状態において照射した際は、２４時間の培養後には、コロニーは観察されなかった。

例６新鮮な濃縮血小板中の大腸菌の生存に対するＵＶ放射線の効果
新鮮な血小板の単位を、イスラエル血液バンクから入手した。血小板を、大腸菌ペレット（２０００ｇで１０分間遠心分離した、ＬＢ培地中の大腸菌）に加えた。血小板＆大腸菌溶液を、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）のデキストラン（４０，０００ダルトン；Amersham Biosciences、米国）と１．８７ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ（Cayman、米国）から成る凍結溶液と、１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した。それぞれ２．５ｍｌの血小板懸濁液の２つのサンプルを、６０ｍｍのペトリ皿の中に入れた。１つの皿を１時間ＵＶ放射線に曝し、もう一方を、アルミニウムホイルで覆って、手付かずのままにしておいた。１時間後、各ペトリ皿からのサンプルを、アガロース中に接種し、３７℃のインキュベータ中に２４時間入れた。２４時間後、コロニーを数えた。

表ＶＩ大腸菌コロニーの数に対するＵＶ放射線の効果

新鮮な濃縮血小板中の大腸菌へのＵＶ照射は、大腸菌の生存に対する効果を有さないことがわかり、放射線に曝したサンプルにおいて２６９のコロニーをもたらし、およびＵＶ放射線に曝さなかったサンプルにおいて２０１をもたらした。

例７凍結乾燥した後に成長した大腸菌コロニーの数に対するＵＶ放射線の効果
血小板−大腸菌溶液を、例６において記載した通りに調製した。この血小板−大腸菌溶液を２つのバッチに分け、各バッチを、以下の凍結溶液：（１）ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）のデキストラン（４０ＫＤａ）および１．８７ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ、または（２）ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）中の３０％（ｗ／ｖ）のデキストラン（４０ＫＤａ）と、１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した。血小板懸濁液の２．５ｍｌのアリコートを、１６ｍｍ直径のガラス試験管（Manara、イスラエル）中に入れた。各バッチから２つの試験管を調製し、全部で４つの試験管を調製した。試験管を、ＭＴＧデバイス中で、５．５℃／ｍｍの温度勾配および１０００℃／分の冷却速度で凍結させた（最終温度は−５０℃であり、速度は３ｍｍ／秒）。

凍結後、全ての試験管を液体窒素中で保ち、その後３日間凍結乾燥して、調製物が、初期の含水量の１０％未満を含む粉末にみえるようにした。得られた乾燥粉末を、６０ｍｍのペトリ皿にこすり落とし、上記のバッチのそれぞれから２つの皿を調製するようにした。各バッチからの１つの皿を、１時間ＵＶ放射線に曝した。他の２つの皿（各バッチから１つずつ）を、アルミニウムホイルで覆って、手付かずにした。各ペトリ皿の内容物を、２ｍｌの超純水を用いて３７℃で再水和し、各皿からのサンプルを、アガロース中に接種し、３７℃で２４時間培養した。２４時間後、コロニーを数えた。

表ＶＩＩ凍結乾燥した後に成長した大腸菌コロニーの数に対するＵＶ放射線の効果

表ＶＩＩに見られるように、ＵＶ放射線は、１／１０未満にまでコロニーの数を減らした。

乾燥状態におけるＵＶ照射時についての血小板の生存を評価するため、凍結乾燥および再水和後に取り出した血小板のサンプル（上記したＥＧＣＧとデキストランから調製）を、ＵＶ照射後に取り出したものと比較した。血小板を、Ｐｅｎｔｒａ６０（ABX、フランス）細胞カウンタを用いて数え、凍結乾燥を生き残った８０．３８％の血小板は、ＵＶ処理にも生き残るということが認められた。

例８西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に汚染された、凍結乾燥したＲＢＣサンプルのガンマ放射線による殺菌
例８Ａガンマ放射線を用いるＲＢＣの殺菌
イスラエル血液サービスから入手した濃厚ＲＢＣを、再蒸留水中の２０％（ｗ／ｖ）のデキストラン４０ｋＤと０．９４５ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧと０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌから成る凍結溶液と、体積比１：１で混合した。２．５ｍｌのサンプルを、以下のウイルス濃度でＷＮＶ（イスラエル獣医協会（Israeli Veterinary Institute）から入手）で汚染した：１０^６．８ＷＮＶ／ｍｌ血液（最大と呼ぶ）、１０^５．８ＷＮＶ／ｍｌ血液（−１と呼ぶ）、および１０^４．８ＷＮＶ／ｍｌ血液（−２と呼ぶ）。非汚染の血液を、感染についての対照として用いた。

２．５ｍｌのサンプルを、ＭＴＧ凍結デバイス（ＩＭＴ、イスラエル）を用いて、上記したものと同じ条件で凍結させた。凍結が完了した後、サンプルを、凍結乾燥器（コンデンサ温度−８０℃）（Labconco、米国）に７２時間入れるまでは、液体窒素中で貯蔵した。

凍結乾燥した血液を、３つの強度（１、２．５、および５メガラド）のうちの１つのガンマ放射線に曝し、一方で、照射についての対照は、照射せずにおいた。照射後、全てのサンプルを、サンプルの元の体積にまで、３７℃で再蒸留水を用いて再水和した。

ウイルスの生存を、生まれたばかりのマウスの脳への、０．０３ｍｌの血液サンプルの注射により調べた。マウスを、感染後１４日間まで観察し、この間ＷＮＶ症状を示した後に死んだマウスの数を記録した。結果を、表ＶＩＩＩにまとめる。

表ＶＩＩＩＷＮＶに汚染された凍結乾燥ＲＢＣの注射に起因するマウスの死亡数

上の表ＶＩＩＩにおいて見られるように、ガンマ放射線による凍結乾燥ＲＢＣの照射は、全ての実験した放射線のレベルにおいて、ＷＮＶの活性を有意に減少させた。１メガラドの強度においてさえ、放射線は、−１および−２の低めの濃度にあるＷＮＶの活性を、検出できるレベル以下にまで減少させた。この放射線のレベル（１メガラド）は、血液サンプルのＷＢＣ不活性化のために一般的に用いられるものをはるかに下回る。

当業者は、種々の改変および変形を、上記した本発明の実施形態に、添付した特許請求の範囲およびその均等物において、およびこれらによって定義されるその範囲から逸脱することなく適用することができるということを、容易に理解するであろう。また、本明細書で用いた語法および専門用語は、記載の目的であり、限定するものとみなされるべきではない。

Claims

所望の生きた無核の生物学的実体を含む生物学的試料の殺菌方法であって、本方法は、（ｉ）没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、没食子酸エピカテキン（ＥＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）およびエピカテキン（ＥＣ）からなる群より選択されるポリフェノールと前記所望の生きた無核の生物学的実体とを含む生きた凍結乾燥した生物学的試料を調製することと；（ｉｉ）前記乾燥した生物学的試料に、前記生物学的試料中の生体汚染物質の量および活性を減じさせるために十分な時間である１時間以下の時間にわたって、ＵＶ放射線を照射することとを含み、前記時間において、サンプル中の前記所望の生物学的実体の少なくとも一部が生きたままである殺菌方法。
前記生物学的試料が、血液またはその一部を含む請求項１に記載の方法。
前記所望の生物学的実体が、赤血球（ＲＢＣ）または血小板から選択される請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
前記生体汚染物質が、バクテリアおよびウイルスから選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記生体汚染物質の量または活性を、無くなるまで減少させる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記乾燥した生物学的試料が、元の試料より６０％少ないよりも少ない水を含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記乾燥した生物学的試料が、前記元の試料より９０％少ないよりも少ない水を含有する請求項６に記載の方法。