JP2003189875A - 膵β細胞関連転写因子の遺伝子導入によるインスリン産生細胞の形成誘導 - Google Patents
膵β細胞関連転写因子の遺伝子導入によるインスリン産生細胞の形成誘導Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、膵へ導入
し、インスリン産生細胞の形成を誘導するインスリン産
生細胞の形成誘導法を提供すること。 【解決手段】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆
管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵の組
織幹細胞へ導入し、インスリン産生細胞の形成誘導を行
う。本発明においては、膵β細胞関連転写因子の遺伝子
として、ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３等を用
い、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するた
めのベクターとして、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を利用
したアデノウイルスベクター等を用いる。本発明の方法
により、インスリン産生細胞の形成を誘導することによ
り、糖尿病の再生治療を可能とする。
し、インスリン産生細胞の形成を誘導するインスリン産
生細胞の形成誘導法を提供すること。 【解決手段】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆
管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵の組
織幹細胞へ導入し、インスリン産生細胞の形成誘導を行
う。本発明においては、膵β細胞関連転写因子の遺伝子
として、ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３等を用
い、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するた
めのベクターとして、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を利用
したアデノウイルスベクター等を用いる。本発明の方法
により、インスリン産生細胞の形成を誘導することによ
り、糖尿病の再生治療を可能とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、膵のインスリン産
生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連転写因子の遺
伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導
することを特徴とするインスリン産生細胞の形成誘導法
に関する。
生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連転写因子の遺
伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導
することを特徴とするインスリン産生細胞の形成誘導法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病患者の膵臓では、膵島のインスリ
ン産生細胞であるβ細胞数の絶対的減少が認められ、イ
ンスリン分泌不全をきたしている（J Am Optom Assoc 6
9(11),727-32, 1998）。近年、糖尿病の移植医療の観点
から、膵島移植が行われているが、移植用膵島のドナー
不足や術後の拒絶反応に対する長期的な免疫抑制を要す
ることなど、多くの問題が残されているのが現状である
（Ann Med 33(3), 186-92, 2001）。近年、生体内に存
在し、必要に応じて増殖と分化を繰り返す未分化細胞、
すなわち、組織幹細胞への関心が高まっている。組織幹
細胞はＥＳ細胞に比べ、その分化段階がより分化した細
胞に近いと考えられるため、比較的容易にインスリン産
生細胞へ分化させることが可能と考えられる。
ン産生細胞であるβ細胞数の絶対的減少が認められ、イ
ンスリン分泌不全をきたしている（J Am Optom Assoc 6
9(11),727-32, 1998）。近年、糖尿病の移植医療の観点
から、膵島移植が行われているが、移植用膵島のドナー
不足や術後の拒絶反応に対する長期的な免疫抑制を要す
ることなど、多くの問題が残されているのが現状である
（Ann Med 33(3), 186-92, 2001）。近年、生体内に存
在し、必要に応じて増殖と分化を繰り返す未分化細胞、
すなわち、組織幹細胞への関心が高まっている。組織幹
細胞はＥＳ細胞に比べ、その分化段階がより分化した細
胞に近いと考えられるため、比較的容易にインスリン産
生細胞へ分化させることが可能と考えられる。
【０００３】膵における組織幹細胞の存在については、
それを示唆するいくつかの研究結果がこれまで報告され
ている。Ｒａｍｉｙａらは、１型糖尿病のモデル動物と
考えられているＮＯＤマウス由来の膵管上皮細胞を単離
培養した後、インスリン産生細胞へ分化誘導したことを
報告している（Nat Med 6(3), 278-82, 2000）。また、
Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒらはヒトの膵管上皮細胞を培養
し、インスリン陽性細胞群を形成したことを報告してい
る（Proc Natl Acad Sci U S A 97(14), 7999-8004, 20
00）。これらはいずれも、膵幹細胞が膵管上皮近傍に存
在することを示唆する報告である。更にｉｎ ｖｉｖｏ
では、Ｓｈａｒｍａらが、膵部分切除を施したラットの
膵断端では再生像が認められ、同時に膵管のみならず膵
島でも、膵β細胞特異的転写因子の遺伝子であるｐｄｘ
−１の発現が高まっていることを報告している（Diabet
es 48(3), 507-13, 1999）。Ｋｒｉｔｚｉｋらは、ＩＦ
Ｎγを膵島細胞特異的に過剰発現するトランスジェニッ
クマウスにおいて、本来β細胞特異的転写因子であるべ
きｐｄｘ−１を発現する膵管上皮の増生と同時に、膵管
内に膵島の新生が認められると報告している（Am J Phy
siol 269(6 PT 1),E1089-94, 1995、J Endocrinol 163
(3), 523-30, 1999）。これらから、膵の組織幹細胞は
ｐｄｘ−１などの転写因子活性化のシグナルを受けて内
分泌細胞へ分化することが示唆される。
それを示唆するいくつかの研究結果がこれまで報告され
ている。Ｒａｍｉｙａらは、１型糖尿病のモデル動物と
考えられているＮＯＤマウス由来の膵管上皮細胞を単離
培養した後、インスリン産生細胞へ分化誘導したことを
報告している（Nat Med 6(3), 278-82, 2000）。また、
Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒらはヒトの膵管上皮細胞を培養
し、インスリン陽性細胞群を形成したことを報告してい
る（Proc Natl Acad Sci U S A 97(14), 7999-8004, 20
00）。これらはいずれも、膵幹細胞が膵管上皮近傍に存
在することを示唆する報告である。更にｉｎ ｖｉｖｏ
では、Ｓｈａｒｍａらが、膵部分切除を施したラットの
膵断端では再生像が認められ、同時に膵管のみならず膵
島でも、膵β細胞特異的転写因子の遺伝子であるｐｄｘ
−１の発現が高まっていることを報告している（Diabet
es 48(3), 507-13, 1999）。Ｋｒｉｔｚｉｋらは、ＩＦ
Ｎγを膵島細胞特異的に過剰発現するトランスジェニッ
クマウスにおいて、本来β細胞特異的転写因子であるべ
きｐｄｘ−１を発現する膵管上皮の増生と同時に、膵管
内に膵島の新生が認められると報告している（Am J Phy
siol 269(6 PT 1),E1089-94, 1995、J Endocrinol 163
(3), 523-30, 1999）。これらから、膵の組織幹細胞は
ｐｄｘ−１などの転写因子活性化のシグナルを受けて内
分泌細胞へ分化することが示唆される。
【０００４】一方、生体への遺伝子導入の手段として、
簡便かつ効率の高いアデノウイルスベクターは多くの研
究で用いられている（Nature 371(6500), 802-6, 199
4、Science 265(5173), 781-4, 1994）。これまで、そ
の投与方法としては主として静脈投与法が用いられてき
たが、肝以外の臓器へは導入効率が極めて低いこと、ま
た全身投与であるため僅かながらも他臓器での外来蛋白
発現による悪影響も否定できないことなど、問題点も挙
げられている。これらの問題を解決する方法として、経
総胆管投与法がある。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝臓
への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、静
脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導入
が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7(1
4), 1693-9, 1996）。更に、ＲａｐｅｒとＤｅＭａｔｔ
ｅｏは、その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルス
を注入することで、膵に高い特異性を持たせることに成
功したと報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 199
6）。
簡便かつ効率の高いアデノウイルスベクターは多くの研
究で用いられている（Nature 371(6500), 802-6, 199
4、Science 265(5173), 781-4, 1994）。これまで、そ
の投与方法としては主として静脈投与法が用いられてき
たが、肝以外の臓器へは導入効率が極めて低いこと、ま
た全身投与であるため僅かながらも他臓器での外来蛋白
発現による悪影響も否定できないことなど、問題点も挙
げられている。これらの問題を解決する方法として、経
総胆管投与法がある。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝臓
への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、静
脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導入
が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7(1
4), 1693-9, 1996）。更に、ＲａｐｅｒとＤｅＭａｔｔ
ｅｏは、その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルス
を注入することで、膵に高い特異性を持たせることに成
功したと報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 199
6）。
【０００５】しかし、これらは何れもラットにおける報
告であり、マウスでは膵管や胆管の脆弱性から同様の手
法は困難を極める。マウスは種々の遺伝子操作動物を作
製しやすく、加えてこのような外来遺伝子の導入が可能
となれば、各種研究を進める上で大変意義が深い。そこ
で、マウス肝管の結紮を行わないことで、注入時に過度
に膵管に圧をかけることなく適度な流入が可能であれ
ば、この方法は、ヒトにおいては非観血的で安全性の高
い内視鏡的逆行性膵・胆管造影（ＥＲＣＰ）などの技術
と類似点も多く、膵への効果的な遺伝子導入法として臨
床応用も期待できる（Dig Dis Sci 45(2), 230-6, 200
0）。
告であり、マウスでは膵管や胆管の脆弱性から同様の手
法は困難を極める。マウスは種々の遺伝子操作動物を作
製しやすく、加えてこのような外来遺伝子の導入が可能
となれば、各種研究を進める上で大変意義が深い。そこ
で、マウス肝管の結紮を行わないことで、注入時に過度
に膵管に圧をかけることなく適度な流入が可能であれ
ば、この方法は、ヒトにおいては非観血的で安全性の高
い内視鏡的逆行性膵・胆管造影（ＥＲＣＰ）などの技術
と類似点も多く、膵への効果的な遺伝子導入法として臨
床応用も期待できる（Dig Dis Sci 45(2), 230-6, 200
0）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、膵の
インスリン産生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連
転写因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞
の形成を誘導するインスリン産生細胞の形成誘導法を提
供することにある。
インスリン産生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連
転写因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞
の形成を誘導するインスリン産生細胞の形成誘導法を提
供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記発明の
課題を解決すべく、鋭意研究の結果、例えば、β細胞の
分化に必要な転写因子の遺伝子を、膵の組織幹細胞へ導
入し、強制的に発現させることで成熟した膵内分泌細胞
へ分化誘導することができるように、膵β細胞関連転写
因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形
成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を行うことがで
きること、及び膵への遺伝子導入法として、経総胆管投
与を用い、マウスの場合のように、肝管の結紮を行わず
に、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流
入を行うことにより、膵への効果的な遺伝子の導入が可
能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
課題を解決すべく、鋭意研究の結果、例えば、β細胞の
分化に必要な転写因子の遺伝子を、膵の組織幹細胞へ導
入し、強制的に発現させることで成熟した膵内分泌細胞
へ分化誘導することができるように、膵β細胞関連転写
因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形
成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を行うことがで
きること、及び膵への遺伝子導入法として、経総胆管投
与を用い、マウスの場合のように、肝管の結紮を行わず
に、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流
入を行うことにより、膵への効果的な遺伝子の導入が可
能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は膵β細胞関連転写因子
の遺伝子を、総胆管を結紮することなく、経総胆管投与
によって、膵の組織細胞へ導入し、インスリン産生細胞
の形成を誘導することにより、インスリン産生細胞の形
成を行うことよりなる。本発明においては、膵β細胞関
連転写因子の遺伝子として、ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇ
ｅｎｉｎ３等が、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵
へ導入するためのベクターとして、アデノウイルスベク
ター等が用いられる。本発明の方法により、インスリン
産生細胞の形成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を
行うことにより、糖尿病の再生治療が可能となる。ま
た、本発明の遺伝子の膵への導入方法は、ヒトにおいて
は非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造影
（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多く、膵への効果的
な遺伝子導入法として臨床応用も期待できるものであ
る。
の遺伝子を、総胆管を結紮することなく、経総胆管投与
によって、膵の組織細胞へ導入し、インスリン産生細胞
の形成を誘導することにより、インスリン産生細胞の形
成を行うことよりなる。本発明においては、膵β細胞関
連転写因子の遺伝子として、ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇ
ｅｎｉｎ３等が、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵
へ導入するためのベクターとして、アデノウイルスベク
ター等が用いられる。本発明の方法により、インスリン
産生細胞の形成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を
行うことにより、糖尿病の再生治療が可能となる。ま
た、本発明の遺伝子の膵への導入方法は、ヒトにおいて
は非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造影
（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多く、膵への効果的
な遺伝子導入法として臨床応用も期待できるものであ
る。
【０００９】すなわち本発明は、膵β細胞関連転写因子
の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、イン
スリン産生細胞の形成を誘導することを特徴とするイン
スリン産生細胞の形成誘導法（請求項１）や、膵β細胞
関連転写因子の遺伝子が、膵β細胞の分化関連転写因子
の遺伝子であり、インスリン産生細胞の形成の誘導が、
膵に存在する組織幹細胞の分化誘導であることを特徴と
するインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項２）や、
膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆管を結紮するこ
となく、経総胆管投与によって、膵へ導入することを特
徴とする請求項１又は２記載のインスリン産生細胞の形
成誘導法（請求項３）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝
子が、ｐｄｘ−１又はｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３であるこ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のインスリ
ン産生細胞の形成誘導法（請求項４）や、膵β細胞関連
転写因子の遺伝子を、アデノウイルス発現ベクターに組
込んで、膵へ導入することを特徴とする請求項１〜４の
いずれか記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求
項５）や、アデノウイルス発現ベクターが、Ｃｒｅ−ｌ
ｏｘＰ組換え系を利用したアデノウイルスベクターであ
ることを特徴とする請求項５記載のインスリン産生細胞
の形成誘導法（請求項６）や、アデノウイルス発現ベク
ターに、レポーター遺伝子ＥＧＦＰを組込んだことを特
徴とする請求項５又は６記載のインスリン産生細胞の形
成誘導法（請求項７）からなる。
の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、イン
スリン産生細胞の形成を誘導することを特徴とするイン
スリン産生細胞の形成誘導法（請求項１）や、膵β細胞
関連転写因子の遺伝子が、膵β細胞の分化関連転写因子
の遺伝子であり、インスリン産生細胞の形成の誘導が、
膵に存在する組織幹細胞の分化誘導であることを特徴と
するインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項２）や、
膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆管を結紮するこ
となく、経総胆管投与によって、膵へ導入することを特
徴とする請求項１又は２記載のインスリン産生細胞の形
成誘導法（請求項３）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝
子が、ｐｄｘ−１又はｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３であるこ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のインスリ
ン産生細胞の形成誘導法（請求項４）や、膵β細胞関連
転写因子の遺伝子を、アデノウイルス発現ベクターに組
込んで、膵へ導入することを特徴とする請求項１〜４の
いずれか記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求
項５）や、アデノウイルス発現ベクターが、Ｃｒｅ−ｌ
ｏｘＰ組換え系を利用したアデノウイルスベクターであ
ることを特徴とする請求項５記載のインスリン産生細胞
の形成誘導法（請求項６）や、アデノウイルス発現ベク
ターに、レポーター遺伝子ＥＧＦＰを組込んだことを特
徴とする請求項５又は６記載のインスリン産生細胞の形
成誘導法（請求項７）からなる。
【００１０】また本発明は、請求項１〜７のいずれか記
載のインスリン産生細胞の形成誘導法を用いることを特
徴とする糖尿病の再生治療方法（請求項８）からなる。
載のインスリン産生細胞の形成誘導法を用いることを特
徴とする糖尿病の再生治療方法（請求項８）からなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、膵β細胞関連転写因子
の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、イン
スリン産生細胞の形成を誘導することにより、インスリ
ン産生細胞の形成を行うことよりなる。本発明におい
て、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するに際
しては、従来ラットにおいて報告されていたような、総
胆管を結紮する方法ではなく、総胆管を結紮することな
く、経総胆管投与によって、膵へ導入することにより、
注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入を
行うことができ、膵への効果的な遺伝子の導入が可能と
なる。
の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、イン
スリン産生細胞の形成を誘導することにより、インスリ
ン産生細胞の形成を行うことよりなる。本発明におい
て、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するに際
しては、従来ラットにおいて報告されていたような、総
胆管を結紮する方法ではなく、総胆管を結紮することな
く、経総胆管投与によって、膵へ導入することにより、
注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入を
行うことができ、膵への効果的な遺伝子の導入が可能と
なる。
【００１２】本発明において用いられる膵β細胞関連転
写因子の遺伝子としては、ｐｄｘ−１及びｎｅｕｒｏｇ
ｅｎｉｎ３（Development 127, 3533-3542, 2000）が有
利に利用できる。本発明において、膵β細胞関連転写因
子の遺伝子を膵へ導入するには、ベクターとしてアデノ
ウイルス発現ベクターを用い、該膵β細胞関連転写因子
の遺伝子を組込んで、膵へ導入することができる。アデ
ノウイルス発現ベクターの構築には、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ
組換え系を利用したアデノウイルスベクターの作製法
（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）を用いるこ
とができる。アデノウイルス発現ベクターに組込む膵β
細胞関連転写因子の遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞
株からＲＴ−ＰＣＲ法により全長をクローニングして取
得することができる。例えばマウスｐｄｘ−１ ｃＤＮ
Ａは、マウスインスリノーマ由来のβ細胞株であるＭＩ
Ｎ６細胞のｔｏｔａｌＲＮＡから、またマウスｎｅｕｒ
ｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの
脳のｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法により全長
をクローニングして取得することができる。
写因子の遺伝子としては、ｐｄｘ−１及びｎｅｕｒｏｇ
ｅｎｉｎ３（Development 127, 3533-3542, 2000）が有
利に利用できる。本発明において、膵β細胞関連転写因
子の遺伝子を膵へ導入するには、ベクターとしてアデノ
ウイルス発現ベクターを用い、該膵β細胞関連転写因子
の遺伝子を組込んで、膵へ導入することができる。アデ
ノウイルス発現ベクターの構築には、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ
組換え系を利用したアデノウイルスベクターの作製法
（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）を用いるこ
とができる。アデノウイルス発現ベクターに組込む膵β
細胞関連転写因子の遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞
株からＲＴ−ＰＣＲ法により全長をクローニングして取
得することができる。例えばマウスｐｄｘ−１ ｃＤＮ
Ａは、マウスインスリノーマ由来のβ細胞株であるＭＩ
Ｎ６細胞のｔｏｔａｌＲＮＡから、またマウスｎｅｕｒ
ｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの
脳のｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法により全長
をクローニングして取得することができる。
【００１３】本発明において、膵β細胞関連転写因子の
遺伝子の導入を確認するためには、アデノウイルスベク
ターに、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰ（Enhanced G
reenFluorescent Protein）遺伝子を組込むことによっ
て、その緑色蛍光により遺伝子が導入された細胞を判別
することができる。経総胆管投与の方法は、適宜公知の
方法を用いて行うことができる（Hum GeneTher 7(14),
1693-9, 1996）。本発明の方法により、インスリン産生
細胞の形成誘導を起こさせ、インスリン産生細胞の再生
を図ることにより、糖尿病に対する再生治療を行うこと
ができる。
遺伝子の導入を確認するためには、アデノウイルスベク
ターに、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰ（Enhanced G
reenFluorescent Protein）遺伝子を組込むことによっ
て、その緑色蛍光により遺伝子が導入された細胞を判別
することができる。経総胆管投与の方法は、適宜公知の
方法を用いて行うことができる（Hum GeneTher 7(14),
1693-9, 1996）。本発明の方法により、インスリン産生
細胞の形成誘導を起こさせ、インスリン産生細胞の再生
を図ることにより、糖尿病に対する再生治療を行うこと
ができる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 Ａ．実験方法 Ａ−１．供試動物 全実施例を通して、９週齢で雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｊ
ｃｌ、体重２５〜２８ｇのマウスを用いた。マウス室
は、気温を一定に保ち、１２時間毎の明暗サイクルで、
飲水や食餌は特に制限を加えない状態で維持した。
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 Ａ．実験方法 Ａ−１．供試動物 全実施例を通して、９週齢で雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｊ
ｃｌ、体重２５〜２８ｇのマウスを用いた。マウス室
は、気温を一定に保ち、１２時間毎の明暗サイクルで、
飲水や食餌は特に制限を加えない状態で維持した。
【００１５】Ａ−２．アデノウイルスベクターの作製
アデノウイルスベクターに組み込むマウスｐｄｘ−１
ｃＤＮＡ（配列番号１）は、マウスインスリノーマ由来
のβ細胞株であるＭＩＮ６細胞の全ＲＮＡから、またマ
ウスｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡ（配列番号３）
はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳の全ＲＮＡから、ＲＴ−
ＰＣＲ法にて全長をクローニングした後、全塩基配列を
確認し使用した。本発明者の教室において開発したＣｒ
ｅ−ｌｏｘＰ組み換え系を利用したアデノウイルスベク
ター作製法（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）
を用いて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、さ
らに特別なｃＤＮＡを組み込まないコントロールの、計
３種類のアデノウイルスベクターを作製した（図１）。
発現カセットには多くの細胞種で強い発現活性をもつＣ
ＡＧ（cytomegalovirus immediate-early enhancer-chi
cken β-actin hybrid）プロモーター下に（Gene 108
(2), 193-9, 1991）、ｐｄｘ−１ ｃＤＮＡ、またはｎ
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡを、更にその下流にＩ
ＲＥＳ、ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細
胞が緑色蛍光により判別可能となっている（FEBS Lett
470(3), 263-8, 2000）。尚、生体に投与するアデノウ
イルスベクターはセシウムクロライド勾配精製法を用い
て精製した（J Virol Methods 4(6), 343-52, 1982）。
ｃＤＮＡ（配列番号１）は、マウスインスリノーマ由来
のβ細胞株であるＭＩＮ６細胞の全ＲＮＡから、またマ
ウスｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡ（配列番号３）
はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳の全ＲＮＡから、ＲＴ−
ＰＣＲ法にて全長をクローニングした後、全塩基配列を
確認し使用した。本発明者の教室において開発したＣｒ
ｅ−ｌｏｘＰ組み換え系を利用したアデノウイルスベク
ター作製法（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）
を用いて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、さ
らに特別なｃＤＮＡを組み込まないコントロールの、計
３種類のアデノウイルスベクターを作製した（図１）。
発現カセットには多くの細胞種で強い発現活性をもつＣ
ＡＧ（cytomegalovirus immediate-early enhancer-chi
cken β-actin hybrid）プロモーター下に（Gene 108
(2), 193-9, 1991）、ｐｄｘ−１ ｃＤＮＡ、またはｎ
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ ｃＤＮＡを、更にその下流にＩ
ＲＥＳ、ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細
胞が緑色蛍光により判別可能となっている（FEBS Lett
470(3), 263-8, 2000）。尚、生体に投与するアデノウ
イルスベクターはセシウムクロライド勾配精製法を用い
て精製した（J Virol Methods 4(6), 343-52, 1982）。
【００１６】Ａ−３．ウェスタンブロットによるｐｄｘ
−１の発現確認 ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感染させた２９３細胞を蛋白抽出
液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４
０，０．１％ ＳＤＳ、０．１％ sodium deoxycholat
e）に懸濁し、細胞破砕した。ブラッドフォードアッセ
イ用キット（BioRad,Hercules,CA,USA）を用い、蛋白定
量を行った後、ＳＤＳサンプルバッファー（７５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），６％ ＳＤＳ，１５
％ グリセロール，１５％ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０１５％ ブロモフェノールブルー）と混合
し、９８℃で５分加熱した。その後、サンプルを１０％
ポリアクリルアミドゲルへ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Mi
llipore,Bedford,MA）へエレクトロブロッティングし
た。蛋白の吸着した膜をウサギ抗マウスｐｄｘ−１抗血
清（大阪大学第１内科・梶本先生より寄贈）とともに３
時間室温で振盪し、洗浄後、更にペルオキシダーゼ結合
抗ウサギＩｇＧ抗体とともに１時間室温で振盪した。そ
の後、化学発光技術によるウェスタンブロット検出キッ
ト（ECL kit;Amersham Corp.,Arlington Heights, IL,
USA）およびＸ線フィルム（FUJI MEDICAL X-RAY FILM;F
UJI PHOTO FILM, Kanagawa, Japan）を用いて蛋白の検
出を行った。
−１の発現確認 ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感染させた２９３細胞を蛋白抽出
液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４
０，０．１％ ＳＤＳ、０．１％ sodium deoxycholat
e）に懸濁し、細胞破砕した。ブラッドフォードアッセ
イ用キット（BioRad,Hercules,CA,USA）を用い、蛋白定
量を行った後、ＳＤＳサンプルバッファー（７５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），６％ ＳＤＳ，１５
％ グリセロール，１５％ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０１５％ ブロモフェノールブルー）と混合
し、９８℃で５分加熱した。その後、サンプルを１０％
ポリアクリルアミドゲルへ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Mi
llipore,Bedford,MA）へエレクトロブロッティングし
た。蛋白の吸着した膜をウサギ抗マウスｐｄｘ−１抗血
清（大阪大学第１内科・梶本先生より寄贈）とともに３
時間室温で振盪し、洗浄後、更にペルオキシダーゼ結合
抗ウサギＩｇＧ抗体とともに１時間室温で振盪した。そ
の後、化学発光技術によるウェスタンブロット検出キッ
ト（ECL kit;Amersham Corp.,Arlington Heights, IL,
USA）およびＸ線フィルム（FUJI MEDICAL X-RAY FILM;F
UJI PHOTO FILM, Kanagawa, Japan）を用いて蛋白の検
出を行った。
【００１７】Ａ−４．アデノウイルスの注入
マウスをペントバルビタールによる全身麻酔下で開腹
後、総胆管の十二指腸合流部位から逆行性に２９Ｇ針を
刺入し、２５０μｌの乳酸リンゲル液にて調整したアデ
ノウイルスベクター１×１０9plaque forming units
を、３０秒間かけてゆっくりと注入した。その際、過度
の圧が膵管にかかると外傷性の膵外分泌腺炎を惹き起こ
す可能性があるため、膵の腫大が生じないように留意し
た。逆流のないことを確認した後、腹部を縫合した。静
脈投与に際しては、尾静脈より同様に調製したアデノウ
イルス液を注入した（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。
その後、７〜１２日で各種検討を行った。
後、総胆管の十二指腸合流部位から逆行性に２９Ｇ針を
刺入し、２５０μｌの乳酸リンゲル液にて調整したアデ
ノウイルスベクター１×１０9plaque forming units
を、３０秒間かけてゆっくりと注入した。その際、過度
の圧が膵管にかかると外傷性の膵外分泌腺炎を惹き起こ
す可能性があるため、膵の腫大が生じないように留意し
た。逆流のないことを確認した後、腹部を縫合した。静
脈投与に際しては、尾静脈より同様に調製したアデノウ
イルス液を注入した（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。
その後、７〜１２日で各種検討を行った。
【００１８】Ａ−５．ＥＧＦＰ及びβガラクトシダーゼ
の発現確認 ＥＧＦＰの発現を確認するため、単離した肝及び膵を固
定せずにスライドグラスにのせ、蛍光顕微鏡にて４６０
〜４９０ｎｍバンドパスフィルター及び、５１０ｎｍロ
ングパスフィルターを用いて観察した。βガラクトシダ
ーゼの発現を確認するため、単離した肝及び膵をＯＴＣ
コンパウンド（Tissue-TEC, Miles, Elkhart, In, US
A）に埋包し、液体窒素にて凍結した。その後、凍結切
片作製装置にて１０μｍの切片を作製し、１％グルタル
アルデヒドで固定し、5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D
-galactosidase（Ｘ−Ｇａｌ）にて４時間の染色を行っ
た。
の発現確認 ＥＧＦＰの発現を確認するため、単離した肝及び膵を固
定せずにスライドグラスにのせ、蛍光顕微鏡にて４６０
〜４９０ｎｍバンドパスフィルター及び、５１０ｎｍロ
ングパスフィルターを用いて観察した。βガラクトシダ
ーゼの発現を確認するため、単離した肝及び膵をＯＴＣ
コンパウンド（Tissue-TEC, Miles, Elkhart, In, US
A）に埋包し、液体窒素にて凍結した。その後、凍結切
片作製装置にて１０μｍの切片を作製し、１％グルタル
アルデヒドで固定し、5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D
-galactosidase（Ｘ−Ｇａｌ）にて４時間の染色を行っ
た。
【００１９】Ａ−６．組織化学的解析
単離した膵を２０％ホルマリン液にて固定し、パラフィ
ンに埋包した。３〜５μｍ厚の切片を作製し、脱パラフ
ィン処理をした。乾燥させた後、ヘマトキシリン・エオ
ジンにて染色した。また、インスリン免疫染色は以下の
ように行った。脱パラフィン処理後、非特異的染色を避
けるため、１０％正常ブタ血清（コスモバイオ社製，東
京，日本）とともに１０分間、室温放置した。その後、
ブタ抗ヒト・インスリン抗体（オリエンタル酵母社製，
東京，日本）とともに１６時間、低温で放置した。次
に、ビオチン付加されたウサギ抗ブタＩｇＧ抗体（ＤＡ
ＫＯ，京都，日本）とともに３０分間、室温で放置し、
最後にＤＡＢ（２０ｍｇ（3,3'-diaminobenzidine, tet
rahydrochloride）、２０μｌ（30% hydrogen peroxida
se in 100ml PBS））とともに５分間、室温で放置し
た。水で洗浄した後、光学顕微鏡にて観察した。
ンに埋包した。３〜５μｍ厚の切片を作製し、脱パラフ
ィン処理をした。乾燥させた後、ヘマトキシリン・エオ
ジンにて染色した。また、インスリン免疫染色は以下の
ように行った。脱パラフィン処理後、非特異的染色を避
けるため、１０％正常ブタ血清（コスモバイオ社製，東
京，日本）とともに１０分間、室温放置した。その後、
ブタ抗ヒト・インスリン抗体（オリエンタル酵母社製，
東京，日本）とともに１６時間、低温で放置した。次
に、ビオチン付加されたウサギ抗ブタＩｇＧ抗体（ＤＡ
ＫＯ，京都，日本）とともに３０分間、室温で放置し、
最後にＤＡＢ（２０ｍｇ（3,3'-diaminobenzidine, tet
rahydrochloride）、２０μｌ（30% hydrogen peroxida
se in 100ml PBS））とともに５分間、室温で放置し
た。水で洗浄した後、光学顕微鏡にて観察した。
【００２０】Ａ−７．組織学的変化の評価
インスリン陽性細胞の新生など組織学的変化を定量的に
検討するため、各々のアデノウイルスベクターについ
て、４匹以上のマウスの膵から、各４以上の非連続切片
を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリ
ン免疫染色を行った。インスリン陽性細胞群を、インス
リン陽性細胞数が５以上の正常膵島、４以下の正常膵
島、細胞数が４以上の新生膵島様の集塊、３以下の新生
インスリン陽性細胞の４つのグループに分けて観察し、
各アデノウイルス投与群間で比較検討した。
検討するため、各々のアデノウイルスベクターについ
て、４匹以上のマウスの膵から、各４以上の非連続切片
を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリ
ン免疫染色を行った。インスリン陽性細胞群を、インス
リン陽性細胞数が５以上の正常膵島、４以下の正常膵
島、細胞数が４以上の新生膵島様の集塊、３以下の新生
インスリン陽性細胞の４つのグループに分けて観察し、
各アデノウイルス投与群間で比較検討した。
【００２１】Ａ−８．ＲＴ−ＰＣＲ
２９３細胞内でのアデノウイルスベクターの発現を確か
めるため、感染後３日目の２９３細胞から、Acid Guani
dinium-Phenol-Chloroform法を用いて全ＲＮＡを抽出し
た。これを鋳型に一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｅｖｅ
ｒＴｒａ Ａｃｅα；東洋紡社製．，東京，日本）を用
いて、逆転写反応を行った。生成物をＡｄＶ−ｐｄｘ−
１検出用プライマー（forward primer：ACCATGAACAGTGA
GGAGCAG：配列番号５）、（backward primer：TCCTCTTG
TTTTCCTCGGGTTC：配列番号６），ＡｄＶ−ｎｇｎ３（fo
rward primer：TGGCACTCAGCAAACAGCGA：配列番号７）、
（backward primer：ACCCAGAGCCAGACAGGTCT：配列番号
８）検出用プライマーを用いてＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｇｅｎｅ Ｔａｑ；和光社製，大阪，日本）によ
るＰＣＲ反応で増幅した。また、各々のテンプレートに
加えられる全ｃＤＮＡ量の差を補正するため、ＨＰＲＴ
検出用プライマー（forward primer：CTCGAAGTGTTGGATA
CAGG：配列番号９）、（backward primer：TGGCCTATAGG
CTCATAGTG：配列番号：１０）を用いてＰＣＲ反応を行
った。
めるため、感染後３日目の２９３細胞から、Acid Guani
dinium-Phenol-Chloroform法を用いて全ＲＮＡを抽出し
た。これを鋳型に一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｅｖｅ
ｒＴｒａ Ａｃｅα；東洋紡社製．，東京，日本）を用
いて、逆転写反応を行った。生成物をＡｄＶ−ｐｄｘ−
１検出用プライマー（forward primer：ACCATGAACAGTGA
GGAGCAG：配列番号５）、（backward primer：TCCTCTTG
TTTTCCTCGGGTTC：配列番号６），ＡｄＶ−ｎｇｎ３（fo
rward primer：TGGCACTCAGCAAACAGCGA：配列番号７）、
（backward primer：ACCCAGAGCCAGACAGGTCT：配列番号
８）検出用プライマーを用いてＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｇｅｎｅ Ｔａｑ；和光社製，大阪，日本）によ
るＰＣＲ反応で増幅した。また、各々のテンプレートに
加えられる全ｃＤＮＡ量の差を補正するため、ＨＰＲＴ
検出用プライマー（forward primer：CTCGAAGTGTTGGATA
CAGG：配列番号９）、（backward primer：TGGCCTATAGG
CTCATAGTG：配列番号：１０）を用いてＰＣＲ反応を行
った。
【００２２】また、アデノウイルスベクター投与１週間
後のマウスより単離した膵から、同様に全ＲＮＡを抽出
し、逆転写反応を行った。膵における内因性のｐｄｘ−
１（forward primer：TGGATAAGGGAACTTAACCT：配列番号
１１）、（backward primer：TTGGAACGCTCAAGTTTGTA：
配列番号：１２）、ＣＫ１９（forward primer：AAGACC
ATCGAGGACTTGCG：配列番号１３）、（backward prime
r：CTATGTCGGCACGCACGTCG：配列番号：１４）、ｎｅｓ
ｔｉｎ（forward primer：GGAGAGTCGCTTAGAGGTGC：配列
番号１５）、（backward primer：GTCAGGAAAGCCAAGAGAA
G：配列番号：１６）の発現を定量化するため、各々の
プライマーを用いてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅ
ｎｅ Ｔａｑ，和光社製，大阪，日本）によるＰＣＲ反
応を行った。更に２％アガロースゲルによる電気泳動を
行った後、エチヂウムブロマイドにて染色したゲルをＦ
ｌｕｏｒ−Ｃｈｅｍ（Alpha Innotech,san Leandro,C
A）にて撮影し、ＰＣＲ産物の定量をAlphaEase FC soft
ware（Alpha Innotech）を用いて行った。この方法を用
いて、ｍＲＮＡの発現レベルを、それぞれＨＰＲＴの発
現量に対する比として定量化し、比較検討した。
後のマウスより単離した膵から、同様に全ＲＮＡを抽出
し、逆転写反応を行った。膵における内因性のｐｄｘ−
１（forward primer：TGGATAAGGGAACTTAACCT：配列番号
１１）、（backward primer：TTGGAACGCTCAAGTTTGTA：
配列番号：１２）、ＣＫ１９（forward primer：AAGACC
ATCGAGGACTTGCG：配列番号１３）、（backward prime
r：CTATGTCGGCACGCACGTCG：配列番号：１４）、ｎｅｓ
ｔｉｎ（forward primer：GGAGAGTCGCTTAGAGGTGC：配列
番号１５）、（backward primer：GTCAGGAAAGCCAAGAGAA
G：配列番号：１６）の発現を定量化するため、各々の
プライマーを用いてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅ
ｎｅ Ｔａｑ，和光社製，大阪，日本）によるＰＣＲ反
応を行った。更に２％アガロースゲルによる電気泳動を
行った後、エチヂウムブロマイドにて染色したゲルをＦ
ｌｕｏｒ−Ｃｈｅｍ（Alpha Innotech,san Leandro,C
A）にて撮影し、ＰＣＲ産物の定量をAlphaEase FC soft
ware（Alpha Innotech）を用いて行った。この方法を用
いて、ｍＲＮＡの発現レベルを、それぞれＨＰＲＴの発
現量に対する比として定量化し、比較検討した。
【００２３】Ａ−９．統計学的検討
統計学的手法を用いての検定では、全てにおいて、Ｓｔ
ｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を用い、いずれも、ｐ＜０．０
５で有意とした。
ｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を用い、いずれも、ｐ＜０．０
５で有意とした。
【００２４】Ｂ．実験結果
Ｂ−１．ＨＥＫ２９３細胞での発現確認
本発明者は作製したアデノウイルスベクターが、目的の
遺伝子を発現することができるかを、ヒト胎児腎細胞株
である２９３細胞を用いて検討した。２９３細胞へＡｄ
Ｖ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、コントロールのア
デノウイルスベクターを１０ｍｏｉで感染後、３日目に
ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認した。その後、細胞
を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを施行した。その結果、導入遺
伝子のｍＲＮＡの発現が確認された（図２Ａ）。更に、
２９３細胞から抽出した蛋白を用いて、ｐｄｘ−１のウ
ェスタンブロットを施行した。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感
染させた２９３細胞ではマウスのβ細胞株であるＭＩＮ
６細胞から抽出した蛋白をコントロールとして、ｐｄｘ
−１の４６ｋＤのバンドが確認できた（図２Ｂ）。同様
のバンドは、コントロールでは認められなかった。以上
の結果から、今回作製したアデノウイルスベクターによ
り目的の遺伝子と蛋白を細胞内で発現することが確認さ
れた。
遺伝子を発現することができるかを、ヒト胎児腎細胞株
である２９３細胞を用いて検討した。２９３細胞へＡｄ
Ｖ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、コントロールのア
デノウイルスベクターを１０ｍｏｉで感染後、３日目に
ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認した。その後、細胞
を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを施行した。その結果、導入遺
伝子のｍＲＮＡの発現が確認された（図２Ａ）。更に、
２９３細胞から抽出した蛋白を用いて、ｐｄｘ−１のウ
ェスタンブロットを施行した。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感
染させた２９３細胞ではマウスのβ細胞株であるＭＩＮ
６細胞から抽出した蛋白をコントロールとして、ｐｄｘ
−１の４６ｋＤのバンドが確認できた（図２Ｂ）。同様
のバンドは、コントロールでは認められなかった。以上
の結果から、今回作製したアデノウイルスベクターによ
り目的の遺伝子と蛋白を細胞内で発現することが確認さ
れた。
【００２５】Ｂ−２．肝・膵におけるＥＧＦＰの発現確
認 本実施例で作製したアデノウイルスベクターではＣＡＧ
プロモーター下に目的遺伝子を、更にその下流にＩＲＥ
Ｓ−ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細胞が
ＥＧＦＰの緑色蛍光により判別可能となっている。アデ
ノウイルスベクター投与後、１０日目の肝及び膵の外観
を蛍光顕微鏡下で観察した（図３；参考写真１参照）。
励起されたＥＧＦＰの発現は、肝では経静脈投与に比し
明らかに経総胆管投与において強いことがわかる（図３
Ａ、Ｂ；参考写真１参照）。また膵において、ＥＧＦＰ
の発現は経静脈投与ではまったく認められなかったが、
経総胆管投与では広範囲に認められた（図３Ｃ、Ｄ；参
考写真１参照）。また、どちらの場合も脾臓や胃にはＥ
ＧＦＰの発現は認めなかった。乳酸リンゲルのみを投与
したコントロールマウスでは、ＥＧＦＰの発現は認めら
れなかった。
認 本実施例で作製したアデノウイルスベクターではＣＡＧ
プロモーター下に目的遺伝子を、更にその下流にＩＲＥ
Ｓ−ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細胞が
ＥＧＦＰの緑色蛍光により判別可能となっている。アデ
ノウイルスベクター投与後、１０日目の肝及び膵の外観
を蛍光顕微鏡下で観察した（図３；参考写真１参照）。
励起されたＥＧＦＰの発現は、肝では経静脈投与に比し
明らかに経総胆管投与において強いことがわかる（図３
Ａ、Ｂ；参考写真１参照）。また膵において、ＥＧＦＰ
の発現は経静脈投与ではまったく認められなかったが、
経総胆管投与では広範囲に認められた（図３Ｃ、Ｄ；参
考写真１参照）。また、どちらの場合も脾臓や胃にはＥ
ＧＦＰの発現は認めなかった。乳酸リンゲルのみを投与
したコントロールマウスでは、ＥＧＦＰの発現は認めら
れなかった。
【００２６】Ｂ−３．肝・膵におけるβガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現確認 アデノウイルスベクターの組織レベルでの導入効率を更
に検討するため、本発明者は、ＣＡＧプロモーター下に
（Gene, 108(2), 193-9, 1991）、βガラクトシダーゼ
遺伝子を発現するアデノウイルスベクターであるＡｄＶ
−ＬａｃＺを経静脈投与及び経総胆管投与法にて投与
し、肝及び膵の凍結切片を作製してＸ−ｇａｌ染色を行
った（図３Ｅ、Ｆ；参考写真１参照）。膵においては、
経静脈投与ではまったく発現を確認できなかったが、経
総胆管投与では膵管を中心に広範な発現を確認した（図
３Ｆ；参考写真１参照）。また、組織学的に明らかな炎
症像や、破壊像を認めなかった。以上の結果から、膵へ
の本発明者のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導
入において、経総胆管投与は経静脈投与に比し非常に有
効性が高くかつ安全であることが示された。以下の膵へ
の遺伝子導入の実験に際しては、経総胆管投与法にて投
与した。
ゼ遺伝子の発現確認 アデノウイルスベクターの組織レベルでの導入効率を更
に検討するため、本発明者は、ＣＡＧプロモーター下に
（Gene, 108(2), 193-9, 1991）、βガラクトシダーゼ
遺伝子を発現するアデノウイルスベクターであるＡｄＶ
−ＬａｃＺを経静脈投与及び経総胆管投与法にて投与
し、肝及び膵の凍結切片を作製してＸ−ｇａｌ染色を行
った（図３Ｅ、Ｆ；参考写真１参照）。膵においては、
経静脈投与ではまったく発現を確認できなかったが、経
総胆管投与では膵管を中心に広範な発現を確認した（図
３Ｆ；参考写真１参照）。また、組織学的に明らかな炎
症像や、破壊像を認めなかった。以上の結果から、膵へ
の本発明者のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導
入において、経総胆管投与は経静脈投与に比し非常に有
効性が高くかつ安全であることが示された。以下の膵へ
の遺伝子導入の実験に際しては、経総胆管投与法にて投
与した。
【００２７】Ｂ−４．アデノウイルスベクター投与後の
膵の組織化学的解析 次に、膵でβ細胞分化に関連する転写因子を高発現さ
せ、その影響を組織学的に検討した。投与後７〜１２日
で膵を単離し、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリ
ン・エオジン染色及び抗ヒト・インスリン抗体を用いた
インスリン免疫染色を行った。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与
群では、１２日目の膵組織像のヘマトキシリン・エオジ
ン染色において、膵実質内に多数の膵管増殖領域が認め
られた（図４Ａ；参考写真２参照）。その領域ではイン
スリン陽性細胞が単独であるいは膵島様の集塊として散
在しており、インスリン産生細胞の新生と考えられた
（図４Ｂ；参考写真２参照）。こうした新生像は、コン
トロールのアデノウイルスベクター投与群においては認
められなかった。ＡｄＶ−ｎｇｎ３投与群では、ＡｄＶ
−ｐｄｘ−１と同様の変化が僅かに認められた。こうし
た変化を定量的に検討するため、各々のアデノウイルス
ベクターを投与した複数のマウスの膵を採取し、複数の
非連続切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及
びインスリン免疫染色を行い、各グループ間で統計学的
検討を行った。その結果、正常な膵島の総数は、各グル
ープ間で変わりはなかったが、新生したと考えられるイ
ンスリン陽性細胞やその集塊の数はＡｄＶ−ｐｄｘ−１
投与群で有意に高かった（図５）（ｐ＜０．０５）。以
上の結果から、膵管より投与されたアデノウイルスベク
ターにより遺伝子導入を受けた膵細胞は膵管の増殖をき
たし、一部はインスリン産生細胞へ分化したと考えられ
た。
膵の組織化学的解析 次に、膵でβ細胞分化に関連する転写因子を高発現さ
せ、その影響を組織学的に検討した。投与後７〜１２日
で膵を単離し、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリ
ン・エオジン染色及び抗ヒト・インスリン抗体を用いた
インスリン免疫染色を行った。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与
群では、１２日目の膵組織像のヘマトキシリン・エオジ
ン染色において、膵実質内に多数の膵管増殖領域が認め
られた（図４Ａ；参考写真２参照）。その領域ではイン
スリン陽性細胞が単独であるいは膵島様の集塊として散
在しており、インスリン産生細胞の新生と考えられた
（図４Ｂ；参考写真２参照）。こうした新生像は、コン
トロールのアデノウイルスベクター投与群においては認
められなかった。ＡｄＶ−ｎｇｎ３投与群では、ＡｄＶ
−ｐｄｘ−１と同様の変化が僅かに認められた。こうし
た変化を定量的に検討するため、各々のアデノウイルス
ベクターを投与した複数のマウスの膵を採取し、複数の
非連続切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及
びインスリン免疫染色を行い、各グループ間で統計学的
検討を行った。その結果、正常な膵島の総数は、各グル
ープ間で変わりはなかったが、新生したと考えられるイ
ンスリン陽性細胞やその集塊の数はＡｄＶ−ｐｄｘ−１
投与群で有意に高かった（図５）（ｐ＜０．０５）。以
上の結果から、膵管より投与されたアデノウイルスベク
ターにより遺伝子導入を受けた膵細胞は膵管の増殖をき
たし、一部はインスリン産生細胞へ分化したと考えられ
た。
【００２８】Ｂ−５．アデノウイルスベクター投与後の
膵におけるＲＴ−ＰＣＲによる各種マーカーの検討 こうして示された組織学的変化の原因を、検討する目的
で、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡを抽出し、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによりその発現の
強弱を定量的に比較検討した。その結果、投与７日目で
は、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群において内因性ｐｄｘ−
１の活性化が認められた（ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。
これまでｐｄｘ−１遺伝子はｐｄｘ−１蛋白自身による
自己調節能が報告されている（Proc Natl Acad Sci U S
A, 98(3), 1065-70, 2001、MolCell Biol 20(20), 758
3-90, 2000）ことから、アデノウイルスベクター由来の
ｐｄｘ−１によるｐｄｘ−１遺伝子の活性化が示唆され
た。また、ＡｄＶ−ｐｄｘ１投与群においては、膵管の
マーカーであるＣＫ１９の発現がコントロールの２．６
倍を示し、膵管の増殖を裏付ける結果となった（図６
Ｂ）。ＡｄＶ−ｎｇｎ３については、組織像での僅かな
変化を反映するデータは得られなかった。また、膵内分
泌前駆細胞のマーカーとして近年報告されているｎｅｓ
ｔｉｎ（Diabetes 50(3), 521-33, 2001）の発現は、ｐ
ｄｘ−１投与群で高い傾向が認められたが、有意な差は
認められなかった（図６Ｃ）。しかし、これは膵全体で
のｍＲＮＡの発現をみているため、膵管増生領域におけ
る局所でのｎｅｓｔｉｎの発現など、今後更なる検討が
必要と考えられる。以上の結果より、アデノウイルスベ
クターにより転写因子遺伝子の導入された膵において、
内因性ｐｄｘ−１の発現が惹起され、直接あるいは間接
的に膵管の増殖をきたし、また、内分泌前駆細胞に於
は、内分泌細胞への分化が誘導されたと考えられる。
膵におけるＲＴ−ＰＣＲによる各種マーカーの検討 こうして示された組織学的変化の原因を、検討する目的
で、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡを抽出し、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによりその発現の
強弱を定量的に比較検討した。その結果、投与７日目で
は、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群において内因性ｐｄｘ−
１の活性化が認められた（ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。
これまでｐｄｘ−１遺伝子はｐｄｘ−１蛋白自身による
自己調節能が報告されている（Proc Natl Acad Sci U S
A, 98(3), 1065-70, 2001、MolCell Biol 20(20), 758
3-90, 2000）ことから、アデノウイルスベクター由来の
ｐｄｘ−１によるｐｄｘ−１遺伝子の活性化が示唆され
た。また、ＡｄＶ−ｐｄｘ１投与群においては、膵管の
マーカーであるＣＫ１９の発現がコントロールの２．６
倍を示し、膵管の増殖を裏付ける結果となった（図６
Ｂ）。ＡｄＶ−ｎｇｎ３については、組織像での僅かな
変化を反映するデータは得られなかった。また、膵内分
泌前駆細胞のマーカーとして近年報告されているｎｅｓ
ｔｉｎ（Diabetes 50(3), 521-33, 2001）の発現は、ｐ
ｄｘ−１投与群で高い傾向が認められたが、有意な差は
認められなかった（図６Ｃ）。しかし、これは膵全体で
のｍＲＮＡの発現をみているため、膵管増生領域におけ
る局所でのｎｅｓｔｉｎの発現など、今後更なる検討が
必要と考えられる。以上の結果より、アデノウイルスベ
クターにより転写因子遺伝子の導入された膵において、
内因性ｐｄｘ−１の発現が惹起され、直接あるいは間接
的に膵管の増殖をきたし、また、内分泌前駆細胞に於
は、内分泌細胞への分化が誘導されたと考えられる。
【００２９】Ｃ．考察
本発明においては、膵への効果的な転写因子遺伝子の導
入による膵内分泌細胞の再生に重点をおいて実験を進め
た。これまで、生体への簡便且つ高率な遺伝子導入手段
として、アデノウイルスベクターは、多くの研究で用い
られてきた。しかし、静脈投与では肝以外の臓器へは導
入効率が極めて低く、一方で全身への投与であるため、
他臓器での悪影響の可能性も否定できない。また、膵へ
の特異的遺伝子導入法としてＭｃＣｌａｎｅらは、マウ
スの膵実質へ直接に針を刺入する方法を提唱している
が、局所的であると同時に、ある程度の侵襲は避けられ
ない（Hum Gene Ther 8(18), 2207-16,1997、Pancreas
15(3), 236-45, 1997、Hum Gene Ther 8(6), 739-46, 1
997）。こうした理由から、今回本発明者は、膵への特
異的遺伝子導入法として、マウスの総胆管から逆行性に
アデノウイルスベクターを注入する方法、すなわち、経
総胆管投与法を用いた。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝
臓への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、
静脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導
入が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7
(14), 1693-9, 1996）。
入による膵内分泌細胞の再生に重点をおいて実験を進め
た。これまで、生体への簡便且つ高率な遺伝子導入手段
として、アデノウイルスベクターは、多くの研究で用い
られてきた。しかし、静脈投与では肝以外の臓器へは導
入効率が極めて低く、一方で全身への投与であるため、
他臓器での悪影響の可能性も否定できない。また、膵へ
の特異的遺伝子導入法としてＭｃＣｌａｎｅらは、マウ
スの膵実質へ直接に針を刺入する方法を提唱している
が、局所的であると同時に、ある程度の侵襲は避けられ
ない（Hum Gene Ther 8(18), 2207-16,1997、Pancreas
15(3), 236-45, 1997、Hum Gene Ther 8(6), 739-46, 1
997）。こうした理由から、今回本発明者は、膵への特
異的遺伝子導入法として、マウスの総胆管から逆行性に
アデノウイルスベクターを注入する方法、すなわち、経
総胆管投与法を用いた。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝
臓への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、
静脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導
入が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7
(14), 1693-9, 1996）。
【００３０】一方、ＲａｐｅｒとＤｅＭａｔｔｅｏは、
その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルスを注入す
ることで、膵に高い特異性を持たせることに成功したと
報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 1996）。しか
し、これらは何れもラットにおける報告であり、マウス
では膵管や肝管の脆弱性から同様の手法は困難を極め
る。マウスは種々の遺伝子改変動物を作製しやすく、加
えてこのような外来遺伝子の導入が可能となれば、各種
研究を進める上で大変意義が深い。そこで、本発明者
は、肝管の結紮は行わず、あえて肝へのウイルスの流入
によるウイルス量の損失は甘受した。そのため、流入時
に過度に膵管に圧がかかることなく適度な注入が可能と
なったと考えている。膵へのウイルスの感染及び発現の
確認は、今回、目的の転写因子に加えて、ＥＧＦＰを同
時に発現するように設計された発現カセットを用いてい
るため、蛍光顕微鏡下で確認が可能となった。結果的
に、経総胆管投与法を用いて、肝・膵への選択的で、か
つ高率な導入ができた。
その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルスを注入す
ることで、膵に高い特異性を持たせることに成功したと
報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 1996）。しか
し、これらは何れもラットにおける報告であり、マウス
では膵管や肝管の脆弱性から同様の手法は困難を極め
る。マウスは種々の遺伝子改変動物を作製しやすく、加
えてこのような外来遺伝子の導入が可能となれば、各種
研究を進める上で大変意義が深い。そこで、本発明者
は、肝管の結紮は行わず、あえて肝へのウイルスの流入
によるウイルス量の損失は甘受した。そのため、流入時
に過度に膵管に圧がかかることなく適度な注入が可能と
なったと考えている。膵へのウイルスの感染及び発現の
確認は、今回、目的の転写因子に加えて、ＥＧＦＰを同
時に発現するように設計された発現カセットを用いてい
るため、蛍光顕微鏡下で確認が可能となった。結果的
に、経総胆管投与法を用いて、肝・膵への選択的で、か
つ高率な導入ができた。
【００３１】次に、β細胞の分化関連転写因子について
考察する。ｐｄｘ−１はインスリン、グルコキナーゼ、
ＧＬＵＴ２などの転写調節を通して血糖値の恒常性維持
に働く膵β細胞特異的転写因子であるが、膵の発生にも
大きく関与している。ｐｄｘ−１は胎生期に膵芽発生部
位周辺の前腸に発現し、その後発生後期では膵島及び小
腸に限局し、生後は膵β細胞に特異的に発現する。変異
ｐｄｘ−１のヘテロ接合体をもつヒトやマウスでは膵β
細胞の減少に伴う糖尿病を惹き起こす。ホモのマウスで
は膵の無形成が認められる（Mol Cell Biol20(20), 758
3-90, 2000、Development 122(5), 1409-16, 1996、EMB
O J 13(5),1145-56, 1994）。
考察する。ｐｄｘ−１はインスリン、グルコキナーゼ、
ＧＬＵＴ２などの転写調節を通して血糖値の恒常性維持
に働く膵β細胞特異的転写因子であるが、膵の発生にも
大きく関与している。ｐｄｘ−１は胎生期に膵芽発生部
位周辺の前腸に発現し、その後発生後期では膵島及び小
腸に限局し、生後は膵β細胞に特異的に発現する。変異
ｐｄｘ−１のヘテロ接合体をもつヒトやマウスでは膵β
細胞の減少に伴う糖尿病を惹き起こす。ホモのマウスで
は膵の無形成が認められる（Mol Cell Biol20(20), 758
3-90, 2000、Development 122(5), 1409-16, 1996、EMB
O J 13(5),1145-56, 1994）。
【００３２】同様にβ細胞の分化関連転写因子であるｎ
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は膵の発生過程で膵前駆細胞が膵
島の内外分泌細胞へ分化する際、Ｎｏｔｃｈシグナルを
介した系で内分泌細胞への分化の方向を決定する重要な
因子である。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３はＥ１５．５で膵
内分泌前駆細胞に発現のピークを呈し、生後消失する。
ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子のホモ欠損マウスでは発
生過程において膵島細胞は形成されず、糖尿病にて生後
１〜３日で死亡する。またこのマウスでは、膵でのｐａ
ｘ４、ｐａｘ６、ｎｅｕｄｏＤ／ＢＥＴＡ２の発現を認
めないことがわかっている（Genes Dev 15(4), 444-54,
2001、Mol Cell Biol 20(9), 3292-307, 2000、Diabet
es 49(2), 163-76, 2000、Diabetes 50(5), 928-36, 20
01、Nature 400(6747), 877-81, 1999、Proc Natl Acad
Sci USA 97(4), 1607-11, 2000、Mol Cell Neurosci 8
(4), 221-41, 1996）。以上のことから、ｐｄｘ−１及
びｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は、その下流に多くの転写因
子が存在しており、膵幹細胞の内分泌細胞へ向けた最終
分化はｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、またそれ
らにより制御されるの多くの転写因子により制御されて
いると思われる。
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は膵の発生過程で膵前駆細胞が膵
島の内外分泌細胞へ分化する際、Ｎｏｔｃｈシグナルを
介した系で内分泌細胞への分化の方向を決定する重要な
因子である。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３はＥ１５．５で膵
内分泌前駆細胞に発現のピークを呈し、生後消失する。
ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子のホモ欠損マウスでは発
生過程において膵島細胞は形成されず、糖尿病にて生後
１〜３日で死亡する。またこのマウスでは、膵でのｐａ
ｘ４、ｐａｘ６、ｎｅｕｄｏＤ／ＢＥＴＡ２の発現を認
めないことがわかっている（Genes Dev 15(4), 444-54,
2001、Mol Cell Biol 20(9), 3292-307, 2000、Diabet
es 49(2), 163-76, 2000、Diabetes 50(5), 928-36, 20
01、Nature 400(6747), 877-81, 1999、Proc Natl Acad
Sci USA 97(4), 1607-11, 2000、Mol Cell Neurosci 8
(4), 221-41, 1996）。以上のことから、ｐｄｘ−１及
びｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は、その下流に多くの転写因
子が存在しており、膵幹細胞の内分泌細胞へ向けた最終
分化はｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、またそれ
らにより制御されるの多くの転写因子により制御されて
いると思われる。
【００３３】近年、そうした転写因子を外来性に導入し
て非β細胞を類β細胞化しようという試みが多く行われ
ている。Ｗａｔａｄａらはα細胞由来の細胞株であるα
ＴＣ１細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入すると、βセルリ
ン存在下でインスリン、グルコキナーゼなどのβ細胞特
異的蛋白の発現が誘導されることを報告している（Diab
etes 45(12), 1826-31, 1996）。また、最近、Ｆｅｒｂ
ｅｒらは、ｐｄｘ−１遺伝子を発現するアデノウイルス
を静脈投与することで肝へ高発現させると、一部の細胞
はインスリン産生細胞となり、さらにこの方法でＳＴＺ
誘発糖尿病のマウスの血糖値を改善することに成功した
と報告している（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。多く
の細胞では単一遺伝子の導入で分化や分化転換が誘導さ
れるわけではなく、α細胞株や肝細胞など、β細胞に発
生学的に近い細胞であるため、このような結果が導かれ
ると考えられる。膵に存在する組織幹細胞もやはり、膵
内外分泌細胞にある程度方向付けられた細胞群のひとつ
と考えられる。そこで本発明者は、β細胞の分化に必要
な転写因子ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３を膵の
組織幹細胞へ遺伝子導入することで分化誘導ができれ
ば、膵内分泌細胞の再生医療に向けた新たな可能性が広
がると考えた。
て非β細胞を類β細胞化しようという試みが多く行われ
ている。Ｗａｔａｄａらはα細胞由来の細胞株であるα
ＴＣ１細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入すると、βセルリ
ン存在下でインスリン、グルコキナーゼなどのβ細胞特
異的蛋白の発現が誘導されることを報告している（Diab
etes 45(12), 1826-31, 1996）。また、最近、Ｆｅｒｂ
ｅｒらは、ｐｄｘ−１遺伝子を発現するアデノウイルス
を静脈投与することで肝へ高発現させると、一部の細胞
はインスリン産生細胞となり、さらにこの方法でＳＴＺ
誘発糖尿病のマウスの血糖値を改善することに成功した
と報告している（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。多く
の細胞では単一遺伝子の導入で分化や分化転換が誘導さ
れるわけではなく、α細胞株や肝細胞など、β細胞に発
生学的に近い細胞であるため、このような結果が導かれ
ると考えられる。膵に存在する組織幹細胞もやはり、膵
内外分泌細胞にある程度方向付けられた細胞群のひとつ
と考えられる。そこで本発明者は、β細胞の分化に必要
な転写因子ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３を膵の
組織幹細胞へ遺伝子導入することで分化誘導ができれ
ば、膵内分泌細胞の再生医療に向けた新たな可能性が広
がると考えた。
【００３４】これまで、膵幹細胞の局在については、多
くの報告から、膵管上皮近傍、膵島内などの可能性が示
唆されているが、いまだ不明な点が多い（Nat Med 6
(3), 278-82, 2000、J Virol Methods 4(6), 343-52, 1
982）。そのため、本実施例においては、膵管上皮及び
その近傍の膵実質組織を標的として遺伝子導入を試み
た。その結果、膵管上皮そのものの増殖像と、その領域
中に、インスリン陽性細胞の新生を確認した。こうした
変化が生じた原因について検討するため施行したＲＴ−
ＰＣＲにおいて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群で膵での内
因性のｐｄｘ−１の発現が高まっていることが判明し
た。ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域には、ｐｄｘ
−１蛋白自身の結合領域があり、自己調節を行ってお
り、そのことがβ細胞の特異性に関わっていると考えら
れている（Proc Natl Acad Sci USA 98(3),1065-70, 20
01、Mol Cell Biol 20(20), 7583-90, 2000）。そこか
ら類推されるに、今回認められた内因性のｐｄｘ−１の
活性化はアデノウイルスベクターによる外来性のｐｄｘ
−１により惹き起こされたためと考えられる。また、膵
管のマーカーであるＣＫ１９は、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投
与群で有意に高い発現を認めたが、これは組織像で確認
された膵管上皮の活発な増生を反映していると考えられ
た。
くの報告から、膵管上皮近傍、膵島内などの可能性が示
唆されているが、いまだ不明な点が多い（Nat Med 6
(3), 278-82, 2000、J Virol Methods 4(6), 343-52, 1
982）。そのため、本実施例においては、膵管上皮及び
その近傍の膵実質組織を標的として遺伝子導入を試み
た。その結果、膵管上皮そのものの増殖像と、その領域
中に、インスリン陽性細胞の新生を確認した。こうした
変化が生じた原因について検討するため施行したＲＴ−
ＰＣＲにおいて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群で膵での内
因性のｐｄｘ−１の発現が高まっていることが判明し
た。ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域には、ｐｄｘ
−１蛋白自身の結合領域があり、自己調節を行ってお
り、そのことがβ細胞の特異性に関わっていると考えら
れている（Proc Natl Acad Sci USA 98(3),1065-70, 20
01、Mol Cell Biol 20(20), 7583-90, 2000）。そこか
ら類推されるに、今回認められた内因性のｐｄｘ−１の
活性化はアデノウイルスベクターによる外来性のｐｄｘ
−１により惹き起こされたためと考えられる。また、膵
管のマーカーであるＣＫ１９は、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投
与群で有意に高い発現を認めたが、これは組織像で確認
された膵管上皮の活発な増生を反映していると考えられ
た。
【００３５】以上から、本発明者は組織学的変化の生じ
た機序を次のように推測する。すなわち、膵管上皮細胞
内では、生体内の他の細胞同様、種々の蛋白が発現し、
活性化と抑制の均衡の上に恒常性を維持していると考え
られる。ｐｄｘ−１は膵管上皮細胞では発生時期にのみ
発現しているが、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により外来性に高
発現したｐｄｘ−１により、内因性ｐｄｘ−１を含めた
種々の遺伝子の活性化が生じ一時的に発生時期の未成熟
な性格を取り戻し膵管の増殖に至ったのではないだろう
か。Ｓｈａｒｍａらの膵部分切除モデルにおいても、膵
管上皮にみられる脱分化や再分化の像は内因性ｐｄｘ−
１活性化を伴う転写因子の不均衡による影響ではないか
と考察されている（Diabetes 48(3), 507-13, 1999）
が、推測の域を出ない。また、インスリン陽性細胞の由
来としては、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により遺伝子導入を受
けた膵管近傍の組織幹細胞がｐｄｘ−１の発現、及びそ
れにより活性化された転写因子の影響により、インスリ
ン産生細胞への最終分化を果したという可能性が考えら
れる。
た機序を次のように推測する。すなわち、膵管上皮細胞
内では、生体内の他の細胞同様、種々の蛋白が発現し、
活性化と抑制の均衡の上に恒常性を維持していると考え
られる。ｐｄｘ−１は膵管上皮細胞では発生時期にのみ
発現しているが、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により外来性に高
発現したｐｄｘ−１により、内因性ｐｄｘ−１を含めた
種々の遺伝子の活性化が生じ一時的に発生時期の未成熟
な性格を取り戻し膵管の増殖に至ったのではないだろう
か。Ｓｈａｒｍａらの膵部分切除モデルにおいても、膵
管上皮にみられる脱分化や再分化の像は内因性ｐｄｘ−
１活性化を伴う転写因子の不均衡による影響ではないか
と考察されている（Diabetes 48(3), 507-13, 1999）
が、推測の域を出ない。また、インスリン陽性細胞の由
来としては、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により遺伝子導入を受
けた膵管近傍の組織幹細胞がｐｄｘ−１の発現、及びそ
れにより活性化された転写因子の影響により、インスリ
ン産生細胞への最終分化を果したという可能性が考えら
れる。
【００３６】ＡｄＶ−ｎｇｎ３の投与では、内因性ｐｄ
ｘ−１の活性化及び組織変化は僅かであったが、発生過
程で、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は一度強く発現するもの
のやがて消失し、その後成熟した膵島細胞が出現する。
そこで、アデノウイルスベクターによるｎｅｕｒｏｇｅ
ｎｉｎ３の一過性高発現消失後に 、インスリン陽性細
胞が出現する可能性をＡｄＶ−ｎｇｎ３投与１ヵ月後の
膵を用いて検討したが、明らかな変化は認められなかっ
た。この結果から、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３単独の遺伝
子導入では、ｐｄｘ−１と同等の効果は得られないと考
えられた。今回、本発明者は、アデノウイルスベクター
を経総胆管投与法を用いることで、高率にかつ安全にマ
ウス膵への遺伝子導入に成功した。ｐｄｘ−１遺伝子の
導入では、膵実質内に膵管の増殖像が認められ、その領
域において、新生インスリン陽性細胞の出現を認めた。
ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、そうした変化は、内因性
のｐｄｘ−１やＣＫ１９の活性化との関連が示唆され
た。このような、生体における膵組織幹細胞の転写因子
による分化誘導の試みはこれまで初めてであり、遺伝子
導入による糖尿病の治療に道を開くものである。
ｘ−１の活性化及び組織変化は僅かであったが、発生過
程で、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は一度強く発現するもの
のやがて消失し、その後成熟した膵島細胞が出現する。
そこで、アデノウイルスベクターによるｎｅｕｒｏｇｅ
ｎｉｎ３の一過性高発現消失後に 、インスリン陽性細
胞が出現する可能性をＡｄＶ−ｎｇｎ３投与１ヵ月後の
膵を用いて検討したが、明らかな変化は認められなかっ
た。この結果から、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３単独の遺伝
子導入では、ｐｄｘ−１と同等の効果は得られないと考
えられた。今回、本発明者は、アデノウイルスベクター
を経総胆管投与法を用いることで、高率にかつ安全にマ
ウス膵への遺伝子導入に成功した。ｐｄｘ−１遺伝子の
導入では、膵実質内に膵管の増殖像が認められ、その領
域において、新生インスリン陽性細胞の出現を認めた。
ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、そうした変化は、内因性
のｐｄｘ−１やＣＫ１９の活性化との関連が示唆され
た。このような、生体における膵組織幹細胞の転写因子
による分化誘導の試みはこれまで初めてであり、遺伝子
導入による糖尿病の治療に道を開くものである。
【００３７】
【発明の効果】本発明によって、膵β細胞関連転写因子
ｐｄｘ−１遺伝子をアデノウイルスベクターへ組み込
み、これをマウスの総胆管へ投与すると膵臓の組織細胞
へ効率よく遺伝子が導入され、インスリン産生細胞の形
成誘導がなされるので、インスリン産生細胞が再生さ
れ、糖尿病に対する再生医療が可能となる。特に、本発
明の方法は、Ｉ型糖尿病の根本的治療への道を開くもの
である。本発明の方法は、総胆管遺伝子導入法を用い
て、肝管の結紮を行わないで、注入時に過度に膵管に圧
をかけることなく適度な流入が可能であり、ヒトにおい
ては非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造
影（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多いので、膵への
効果的な遺伝子導入法として臨床応用も期待できる。ま
た、本発明の方法は、膵管や胆管の脆弱なマウスにも適
用することができ、本発明の方法をマウスに適用する
と、マウスは種々の遺伝子操作動物を作製しやすいとい
う利点を有するので、実験動物として各種研究を進める
上で大変意義深い。更に、本発明の方法では、アデノウ
イルスベクターを経総胆管投与法を用いることで、高率
にかつ安全に膵への遺伝子導入を可能とし、該遺伝子の
導入によりインスリン産生細胞の形成誘導に成功してい
る。このような生体における膵組織幹細胞の転写因子に
よる形成誘導の試みはこれまで初めてであり、本発明の
方法は、遺伝子導入による糖尿病のような病気の治療に
大きな展望を開くものである。
ｐｄｘ−１遺伝子をアデノウイルスベクターへ組み込
み、これをマウスの総胆管へ投与すると膵臓の組織細胞
へ効率よく遺伝子が導入され、インスリン産生細胞の形
成誘導がなされるので、インスリン産生細胞が再生さ
れ、糖尿病に対する再生医療が可能となる。特に、本発
明の方法は、Ｉ型糖尿病の根本的治療への道を開くもの
である。本発明の方法は、総胆管遺伝子導入法を用い
て、肝管の結紮を行わないで、注入時に過度に膵管に圧
をかけることなく適度な流入が可能であり、ヒトにおい
ては非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造
影（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多いので、膵への
効果的な遺伝子導入法として臨床応用も期待できる。ま
た、本発明の方法は、膵管や胆管の脆弱なマウスにも適
用することができ、本発明の方法をマウスに適用する
と、マウスは種々の遺伝子操作動物を作製しやすいとい
う利点を有するので、実験動物として各種研究を進める
上で大変意義深い。更に、本発明の方法では、アデノウ
イルスベクターを経総胆管投与法を用いることで、高率
にかつ安全に膵への遺伝子導入を可能とし、該遺伝子の
導入によりインスリン産生細胞の形成誘導に成功してい
る。このような生体における膵組織幹細胞の転写因子に
よる形成誘導の試みはこれまで初めてであり、本発明の
方法は、遺伝子導入による糖尿病のような病気の治療に
大きな展望を開くものである。
【００３８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
<120> Induction of differentiation of insulin-producing cells
by introducing genes of deffrentiation-related
transcription factors
<130> P005P01
<140>
<141>
<160> 16
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (280)..(1134)
<400> 1
aaaattgaaa caagtgcagg tgttcgcggg cacctaagcc tccttcttaa ggcagtcctc 60
caggccaatg atggctccag ggtaaaccac gtggggtgcc ccagagccta tggcacggcg 120
gccggcttgt ccccagccag cctctggttc cccaggagag cagtggagaa ctgtcaaagc 180
gatctggggt ggcgtagaga gtccgcgagc cacccagcgc ctaaggcctg gcttgtagct 240
ccgacccggg gctgctggcc ccaagtgccg gctgccacc atg aac agt gag gag 294
Met Asn Ser Glu Glu
1 5
cag tac tac gcg gcc aca cag ctc tac aag gac ccg tgc gca ttc cag 342
Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp Pro Cys Ala Phe Gln
10 15 20
agg ggc ccg gtg cca gag ttc agc gct aac ccc cct gcg tgc ctg tac 390
Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro Pro Ala Cys Leu Tyr
25 30 35
atg ggc cgc cag ccc cca cct ccg ccg cca ccc cag ttt aca agc tcg 438
Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Phe Thr Ser Ser
40 45 50
ctg gga tca ctg gag cag gga agt cct ccg gac atc tcc cca tac gaa 486
Leu Gly Ser Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Glu
55 60 65
gtg ccc ccg ctc gcc tcc gac gac ccg gct ggc gct cac ctc cac cac 534
Val Pro Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Ala Gly Ala His Leu His His
70 75 80 85
cac ctt cca gct cag ctc ggg ctc gcc cat cca cct ccc gga cct ttc 582
His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro Pro Gly Pro Phe
90 95 100
ccg aat gga acc gag cct ggg ggc ctg gaa gag ccc aac cgc gtc cag 630
Pro Asn Gly Thr Glu Pro Gly Gly Leu Glu Glu Pro Asn Arg Val Gln
105 110 115
ctc cct ttc ccg tgg atg aaa tcc acc aaa gct cac gcg tgg aaa ggc 678
Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Trp Lys Gly
120 125 130
cag tgg gca gga ggt gct tac aca gcg gaa ccc gag gaa aac aag agg 726
Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Glu Pro Glu Glu Asn Lys Arg
135 140 145
acc cgt act gcc tac acc cgg gcg cag ctg ctg gag ctg gag aag gaa 774
Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu
150 155 160 165
ttc tta ttt aac aaa tac atc tcc cgg ccc cgc cgg gtg gag ctg gca 822
Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg Val Glu Leu Ala
170 175 180
gtg atg ttg aac ttg acc gag aga cac atc aaa atc tgg ttc caa aac 870
Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
185 190 195
cgt cgc atg aag tgg aaa aaa gag gaa gat aag aaa cgt agt agc ggg 918
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys Arg Ser Ser Gly
200 205 210
acc ccg agt ggg ggc ggt ggg ggc gaa gag ccg gag caa gat tgt gcg 966
Thr Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu Gln Asp Cys Ala
215 220 225
gtg acc tcg ggc gag gag ctg ctg gca gtg cca ccg ctg cca cct ccc 1014
Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Val Pro Pro Leu Pro Pro Pro
230 235 240 245
gga ggt gcc gtg ccc cca ggc gtc cca gct gca gtc cgg gag ggc cta 1062
Gly Gly Ala Val Pro Pro Gly Val Pro Ala Ala Val Arg Glu Gly Leu
250 255 260
ctg cct tcg ggc ctt agc gtg tcg cca cag ccc tcc agc atc gcg cca 1110
Leu Pro Ser Gly Leu Ser Val Ser Pro Gln Pro Ser Ser Ile Ala Pro
265 270 275
ctg cga ccg cag gaa ccc cgg tga ggacagcagt ctgagggtga gcgggtctgg 1164
Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg
280 285
gacccagagt gtggacgtgg gagcgggcag ctggataagg gaacttaacc taggcgtcgc 1224
acaagaagaa aattcttgag ggcacgagag ccagttggat agccggagag atgctgcgag 1284
cttctggaaa aacagccctg agcttctgaa aactttgagg ctgcttctga tgccaagcta 1344
atggccagat ctgcctctga ggactctttc ctgggaccaa tttagacaac ctgggctcca 1404
aactgaggac aataaaaagg gtacaaactt gagcgttcca atacggacca gcaggcgag 1463
<210> 2
<211> 284
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp
1 5 10 15
Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro
20 25 30
Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Gln Phe Thr Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp
50 55 60
Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Ala Gly
65 70 75 80
Ala His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro
85 90 95
Pro Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr Glu Pro Gly Gly Leu Glu Glu
100 105 110
Pro Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala
115 120 125
His Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Glu Pro
130 135 140
Glu Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu
145 150 155 160
Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg
165 170 175
Arg Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys
180 185 190
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys
195 200 205
Lys Arg Ser Ser Gly Thr Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro
210 215 220
Glu Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Val Pro
225 230 235 240
Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Gly Val Pro Ala Ala
245 250 255
Val Arg Glu Gly Leu Leu Pro Ser Gly Leu Ser Val Ser Pro Gln Pro
260 265 270
Ser Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg
275 280
<210> 3
<211> 1861
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1093)..(1737)
<400> 3
ggatcccaag gtgatattga acctggccaa gcaatagttt ctgagtagaa aggacttgag 60
cagggaccgt ctctggtcac tctgtcctct ttcccaggat ggagtcagtc tgtgaaacat 120
ggttgcacac acatttcctg acccaaccca tagtggcgga gagctggata gcactttgaa 180
ctaatgggcg ctcctcccag ctgccagcca agaagacact tgactccttg atcgctggtt 240
catttagaca agccgtttcc ctctctgagc caaaagaccc catgtgtaat actcaaagaa 300
gaggccttcc ttatatatat ataggcaccc ccaaacctcc ttcatgctac caagaaaggg 360
tctggacaca tgccaaaaag aaagaggaaa aggcaaagct ctccccagcg gccggacggg 420
actcttctgg ctgggcgagg ctctttgagg aaccgagagt tgctgggact gagcccgcga 480
cgggggaggc gtggagtggg ggaacaaaca gagtgctgct cccctccccc gacccctgcc 540
ctttgtccgg aatccagctg tgctctgcgg gtgggggttg tggggggagg agcgggctcg 600
cgtggcgcag cccctgggcc ccctccgctg attggcccgt ggtgcaggca gcagcccggc 660
aggcacgctc ctggccgggg gcagagcaga taaagcgtgc caggggacac acgacttgca 720
tgcagctcag aaatccctct gggtctcatc actgcagcag tggtcgagta cctcctcgga 780
gcttttctac gacttccaga cgcaatttac tccaggcgag ggcgcctgca gtttagcaga 840
acttcagagg gagcagagag gctcagctat ccactgctgc ttgacactga ccctatccac 900
tgctgcttgt cactgactga cctgctgctc tctattcttt tgagtcggga gaactaggta 960
acaattcgga aactccaaag ggtggatgag gggcgcgcgg ggtgtgtgtg ggggatactc 1020
tggtcccccg tgcagtgacc tctaagtcag aggctggcac acacacacct tccatttttt 1080
cccaaccgca gg atg gcg cct cat ccc ttg gat gcg ctc acc atc caa gtg 1131
Met Ala Pro His Pro Leu Asp Ala Leu Thr Ile Gln Val
1 5 10
tcc cca gag aca caa caa cct ttt ccc gga gcc tcg gac cac gaa gtg 1179
Ser Pro Glu Thr Gln Gln Pro Phe Pro Gly Ala Ser Asp His Glu Val
15 20 25
ctc agt tcc aat tcc acc cca cct agc ccc act ctc ata cct agg gac 1227
Leu Ser Ser Asn Ser Thr Pro Pro Ser Pro Thr Leu Ile Pro Arg Asp
30 35 40 45
tgc tcc gaa gca gaa gtg ggt gac tgc cga ggg acc tcg agg aag ctc 1275
Cys Ser Glu Ala Glu Val Gly Asp Cys Arg Gly Thr Ser Arg Lys Leu
50 55 60
cgc gcc cga cgc gga ggg cgc aac agg ccc aag agc gag ttg gca ctc 1323
Arg Ala Arg Arg Gly Gly Arg Asn Arg Pro Lys Ser Glu Leu Ala Leu
65 70 75
agc aaa cag cga aga agc cgg cgc aag aag gcc aat gat cgg gag cgc 1371
Ser Lys Gln Arg Arg Ser Arg Arg Lys Lys Ala Asn Asp Arg Glu Arg
80 85 90
aat cgc atg cac aac ctc aac tcg gcg ctg gat gcg ctg cgc ggt gtc 1419
Asn Arg Met His Asn Leu Asn Ser Ala Leu Asp Ala Leu Arg Gly Val
95 100 105
ctg ccc acc ttc ccg gat gac gcc aaa ctt aca aag atc gag acc ctg 1467
Leu Pro Thr Phe Pro Asp Asp Ala Lys Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu
110 115 120 125
cgc ttc gcc cac aac tac atc tgg gca ctg act cag acg ctg cgc ata 1515
Arg Phe Ala His Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Thr Gln Thr Leu Arg Ile
130 135 140
gcg gac cac agc ttc tat ggc ccg gag ccc cct gtg ccc tgt gga gag 1563
Ala Asp His Ser Phe Tyr Gly Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Gly Glu
145 150 155
ctg ggg agc ccc gga ggt ggc tcc aac ggg gac tgg ggc tct atc tac 1611
Leu Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gly Asp Trp Gly Ser Ile Tyr
160 165 170
tcc cca gtc tcc caa gcg ggt aac ctg agc ccc acg gcc tca ttg gag 1659
Ser Pro Val Ser Gln Ala Gly Asn Leu Ser Pro Thr Ala Ser Leu Glu
175 180 185
gaa ttc cct ggc ctg cag gtg ccc agc tcc cca tcc tat ctg ctc ccg 1707
Glu Phe Pro Gly Leu Gln Val Pro Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Pro
190 195 200 205
gga gca ctg gtg ttc tca gac ttc ttg tga agagacctgt ctggctctgg 1757
Gly Ala Leu Val Phe Ser Asp Phe Leu
210 215
gtggtgggtg ctagtggaaa gggaggggac cagagccgtc tggagtggga ggtagtggag 1817
gctctcaagc atctcgcctc ttctggcttt cactacttgg atcc 1861
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Ala Pro His Pro Leu Asp Ala Leu Thr Ile Gln Val Ser Pro Glu
1 5 10 15
Thr Gln Gln Pro Phe Pro Gly Ala Ser Asp His Glu Val Leu Ser Ser
20 25 30
Asn Ser Thr Pro Pro Ser Pro Thr Leu Ile Pro Arg Asp Cys Ser Glu
35 40 45
Ala Glu Val Gly Asp Cys Arg Gly Thr Ser Arg Lys Leu Arg Ala Arg
50 55 60
Arg Gly Gly Arg Asn Arg Pro Lys Ser Glu Leu Ala Leu Ser Lys Gln
65 70 75 80
Arg Arg Ser Arg Arg Lys Lys Ala Asn Asp Arg Glu Arg Asn Arg Met
85 90 95
His Asn Leu Asn Ser Ala Leu Asp Ala Leu Arg Gly Val Leu Pro Thr
100 105 110
Phe Pro Asp Asp Ala Lys Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu Arg Phe Ala
115 120 125
His Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Thr Gln Thr Leu Arg Ile Ala Asp His
130 135 140
Ser Phe Tyr Gly Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Gly Glu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gly Asp Trp Gly Ser Ile Tyr Ser Pro Val
165 170 175
Ser Gln Ala Gly Asn Leu Ser Pro Thr Ala Ser Leu Glu Glu Phe Pro
180 185 190
Gly Leu Gln Val Pro Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Pro Gly Ala Leu
195 200 205
Val Phe Ser Asp Phe Leu
210
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-pdx-1
forward primer
<400> 5
accatgaaca gtgaggagca g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-pdx-1
backward primer
<400> 6
tcctcttgtt ttcctcgggt tc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-ngn3
forward primer
<400> 7
tggcactcag caaacagcga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-ngn3
backward primer
<400> 8
acccagagcc agacaggtct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:HPRT forward
primer
<400> 9
ctcgaagtgt tggatacagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:HPRT backward
primer
<400> 10
tggcctatag gctcatagtg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:endogenous
ｐｄｘ-1 forward primer
<400> 11
tggataaggg aacttaacct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:endogenous
ｐｄｘ-1 backward primer
<400> 12
ttggaacgct caagtttgta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CK19 forward
primer
<400> 13
aagaccatcg aggacttgcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CK19 backward
primer
<400> 14
ctatgtcggc acgcacgtcg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nestin forward
primer
<400> 15
ggagagtcgc ttagaggtgc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nestin backward
primer
<400> 16
gtcaggaaag ccaagagaag 20
【図１】本発明の実施例で使用したアデノウイルスベク
ターの構造を示す図である。
ターの構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、作製したアデノウイ
ルスベクターが、目的の遺伝子を発現することができる
かを、ヒト胎児腎細胞株である２９３細胞を用いて検討
した結果を示す、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認し
た図である。
ルスベクターが、目的の遺伝子を発現することができる
かを、ヒト胎児腎細胞株である２９３細胞を用いて検討
した結果を示す、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認し
た図である。
【図３】本発明の実施例において、ＣＡＧプロモーター
下に目的遺伝子を，更にその下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
を組み込んで作製したアデノウイルスベクターを投与
後、１０日目の肝及び膵の外観をＥＧＦＰの緑色蛍光に
より蛍光顕微鏡下で観察した写真を示す図である。
下に目的遺伝子を，更にその下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
を組み込んで作製したアデノウイルスベクターを投与
後、１０日目の肝及び膵の外観をＥＧＦＰの緑色蛍光に
より蛍光顕微鏡下で観察した写真を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、膵でβ細胞分化に関
連する転写因子を高発現させ、その影響を組織学的に検
討するために、投与後７〜１２日で膵を単離し、パラフ
ィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び
抗ヒト・インスリン抗体を用いたインスリン免疫染色を
行って観察した結果を示す図である。
連する転写因子を高発現させ、その影響を組織学的に検
討するために、投与後７〜１２日で膵を単離し、パラフ
ィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び
抗ヒト・インスリン抗体を用いたインスリン免疫染色を
行って観察した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、膵でβ細胞分化に関
連する転写因子を高発現させ、発現の状況を定量的に検
討するために、各々のアデノウイルスベクターを投与し
た複数のマウスの膵を採取し、複数の非連続切片を作製
してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリン免疫
染色を行い、各グループ間で統計学的検討を行った結果
を示す図である。
連する転写因子を高発現させ、発現の状況を定量的に検
討するために、各々のアデノウイルスベクターを投与し
た複数のマウスの膵を採取し、複数の非連続切片を作製
してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリン免疫
染色を行い、各グループ間で統計学的検討を行った結果
を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、アデノウイルスベク
ターにより遺伝子導入を受けた膵細胞の組織学的変化を
検討するために、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡ
を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによ
りその発現の強弱を定量的に比較検討した結果を示す図
である。
ターにより遺伝子導入を受けた膵細胞の組織学的変化を
検討するために、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡ
を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによ
りその発現の強弱を定量的に比較検討した結果を示す図
である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(72)発明者 谷口 秀典
大阪府箕面市粟生間谷西町２−６−16−
202
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA04 DA02 DA03
EA02 GA11 HA17
4B065 AA90X AA99Y AB01 AC15
AC20 BA02 CA44
4C084 AA13 CA18 DC50 NA14 ZC352
4C087 AA01 BB51 BB63 CA12 NA14
ZC35
Claims (8)
- 【請求項１】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、経総
胆管投与によって、膵へ導入し、インスリン産生細胞の
形成を誘導することを特徴とするインスリン産生細胞の
形成誘導法。 - 【請求項２】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子が、膵β
細胞の分化関連転写因子の遺伝子であり、インスリン産
生細胞の形成の誘導が、膵に存在する組織幹細胞の分化
誘導であることを特徴とするインスリン産生細胞の形成
誘導法。 - 【請求項３】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆
管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵へ導
入することを特徴とする請求項１又は２記載のインスリ
ン産生細胞の形成誘導法。 - 【請求項４】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子が、ｐｄ
ｘ−１又はｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３であることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか記載のインスリン産生細胞
の形成誘導法。 - 【請求項５】 膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、アデ
ノウイルス発現ベクターに組込んで、膵へ導入すること
を特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のインスリン
産生細胞の形成誘導法。 - 【請求項６】 アデノウイルス発現ベクターが、Ｃｒｅ
−ｌｏｘＰ組換え系を利用したアデノウイルスベクター
であることを特徴とする請求項５記載のインスリン産生
細胞の形成誘導法。 - 【請求項７】 アデノウイルス発現ベクターに、レポー
ター遺伝子ＥＧＦＰを組込んだことを特徴とする請求項
５又は６記載のインスリン産生細胞の形成誘導法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか記載のインスリ
ン産生細胞の形成誘導法を用いることを特徴とする糖尿
病の再生治療方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001399251A JP2003189875A (ja) | 2001-12-28 | 2001-12-28 | 膵β細胞関連転写因子の遺伝子導入によるインスリン産生細胞の形成誘導 |
| PCT/JP2002/013684 WO2003057878A1 (en) | 2001-12-28 | 2002-12-26 | INDUCTION OF THE FORMATION OF INSULIN-PRODUCING CELLS VIA GENE TRANSFER OF PANCREATIC β-CELL-ASSOCIATED TRANSCRIPTIONAL FACTOR |
| US10/877,706 US20050042754A1 (en) | 2001-12-28 | 2004-06-25 | Induction of the formation of insulin-producing cells via gene transfer of pancreatic beta-cell-associated transcriptional factor |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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