DE60005343T2

DE60005343T2 - Verbesserte lager- und haltbarkeit von blutprodukten einschliesslich roten blutzellen und plättchen

Info

Publication number: DE60005343T2
Application number: DE60005343T
Authority: DE
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2020-06-06
Also published as: HUP0201465A2; CZ301803B6; DK1187530T3; US6403124B1; AU774252B2; US7851142B2; CZ20014078A3; CA2374140A1; SK287562B6; SK16632001A3; MXPA01012645A; US20040146846A1; KR20020008412A; IL146517A; HUP0201465A3; US20020102529A1; HK1044099B; PL200250B1; EP1187530A1; KR100713140B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterdrückung des Bakterienwachstums im gesamten Blut und Blutfraktionen, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen (WBCs), Plättchenkonzentraten, Plasma und Plasma-Derivaten, die für eine verlängerte Zeitperiode gelagert werden. Diese Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im gesamten Blut und Blutfraktionen, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen (WBCs) leuko-reduzierten, statistischen Donorplättchenkonzentrate vor der Lagerung, Plasma und Plasma-Derivate, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Diskussion des Standes der Technik
Bezüglich der nationalen und weltweiten Blutzufuhr gibt es zunehmend stärkeres Interesse. Sowohl die Integrität als auch die Zuverlässigkeit von existierenden Zufuhren und die Fähigkeit, größere Lager über die Zeit zu bauen, wurde in Frage gestellt. Ein Grund dafür ist die verhältnismäßig kurze Periode der Lagerungsstabilität von Blutprodukten. Gegenwärtig sind gepackte RBCs (rote Blutzellkonzentrationen oder RCC), die dominante Form von Blutprodukten für Transfusionen und dgl. auf eine 42-tägige Lagerungsperiode beschränkt. Nach dieser Zeit fallen die ATP-Gehalte wesentlich ab, was mit einem signifikanten pH-Verlust verbunden ist, was stark einen Mangel der Lebensfähigkeit anzeigt oder wenn sie lebensfähig sind, eine extreme Zirkulationszeit bei der Infusion in vivo anzeigt. Das gesamte Blut wird nicht für wesentliche Perioden gelagert. Für Plättchen ist die gegenwärtige Lagerungsperiode noch kürzer, wobei der Standard 5 Tage bei 22°C ist. Der Unterschied der Lagerungsstabilität von Plättchenkonzentraten (PC) im Gegensatz zu RBC liegt in den anfangenden metabolischen Reaktionen in den Plättchen, teilweise aufgrund des Vorhandenseins von Mitochondrien in PC und deren Abwesenheit in RBCs. während beide Blutprodukte einen Abfall an ATP zeigen, gekoppelt mit einem Abfall des pH im Verlaufe der Zeit, begleitet von der Produktion von Milchsäure, kann das Vorhandensein von Mitochondrien in PC das Problem aufgrund der Glycolyse vermutlich verschlimmern.
Gleichzeitig wurden Fragen bezüglich der Zuverlässigkeit und Integrität der Blutzufuhr aufgeworfen. Insbesondere wurde wiederholt die Kontamination der Blutzufuhr mit Bakterien oder anderen mikrobiologischen Mitteln ermittelt. Eine solche Situation ist in Ländern mit einer sophistischen Sammlung und Lagerungsverfahren noch ernster. Während Mittel zur Verminderung der Kontamination zu den gesammelten Produkten gegeben werden können, ist dies nicht erwünscht, wodurch das Erfordernis gegeben ist, die Produkte den diese empfangenden Patienten zurückzutransfusieren. Eine wünschenswerte Alternative ist die Bestrahlungsbehandlung der Produkte nach dem Abpacken, typischerweise in plastifizierten Vinyl-Kunststoffbehältern. Eine solche Strahlungsbehandlung würde RBC und vermutlich während der PC-Lagerung verschlimmern, was zu einer verminderten Funktion dieser Zellen führt.
Zusätzlich besteht für einen kleinen, aber zunehmenden Anteil der Bevölkerung, die das Blut erhält, ein Risiko eines im allgemeinen fatalen Zustandes, bekannt als mit der Transfusion zusammenhängender Transplantat-Gegen-Wirt-Erkankung (TA-GVHD), die aufgrund des Vorhandenseins von lebensfähigen allogenen Leukozyten erfolgt. Dieses Syndrom ist typischerweise mit immununterdrückten Patienten verbunden, wie Krebs- und Knochenmarkstransplantationspatienten, kann aber ebenfalls bei immunokompetenten Personen beim Einstellen des beschränkten HLA-Polymorphismus in der Population auftreten.
Eine wesentliche Aufmerksamkeit hat sich auf das Auffinden von Verfahren zur Verlängerung der Lagerungsstabilität gerichtet. Ein solches Verfahren zur Verlängerung der Lagerungsfähigkeit von PCs ist in dem US-Patent 5 466 573 angegeben. Dieses Patent richtet sich auf den Erhalt von PC-Präparaten mit Acetationenquellen, die sowohl als Substrat für die oxidative Phosphorylierung als auch als Puffer zum Gegenwirken irgendeines pH-Abfalls aufgrund der Milchsäureproduktion agieren. Ein solches Verfahren wirkt nicht direkt auf das Problem der Hämolyse und den Membranzusammenbruch. Ein alternatives Verfahren ist in US-Patent 4 496 821 durch diesen Erfinder offenbart und wird allgemein übertragen. Bei diesem Patent wird das gesamte Blut in einem Präparat, das L-Carnitin (LC) oder ein Alkanoyl-Derivat davon enthält, gelagert. Das Patent beschreibt jedoch nicht die Wirkungen auf Blutprodukte wie PC- oder RBC-Suspensionen und bezieht sich zumindest in gewissem Ausmaß auf die Wirkung von LC auf Plasma-Charakteristiken.
WO 87103484 offenbart eine Lösung zum Stabilisieren von roten Blutzellen während der Lagerung, worin eine effektive Konzentration eines Inhibitors bei einem Schritt des metabolischen Glycolyseweges verwendet wird, der nach dem Schritt folgt, der 2,3-DPG bildet, wobei dieser Inhibitor Oxalsäure oder sein Natrium- oder Kaliumsalz oder ein Derivat davon sein kann. EP 0 272 551 offenbart Systeme zur Blutlagerung, umfassend ein Chinolincarbonsäure-Derivat als antibakterielles Mittel. EP 0 552 137 gibt Ester von Acylcarnitinen an, die als antibakterielle Mittel nützlich sind, wobei diese Verbindungen einen langkettigen Alkohol (7 bis 15 Kohlenstoffatome) als Esteranteil aufweisen; diese Verbindungen sind für die systemische Verabreichung angezeigt. WO 97/16967 offenbart ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Schutz von Blut und seinen Komponenten vor der oxidativen Beanspruchung durch Zugabe eines Antioxidans zu dem Blut oder seinen Komponenten. Arduini et al. diskutiert in Transfusion, Band 37, Februar 1997, 166-174 und in WO 98/46073 die Zugabe von L-Carnitin zu RBCs, die bei 4°C gelagert werden, um deren Lebensfähigkeit zu erstrecken, aber es gibt keine Erwähnung bezüglich einer möglichen Wirkung von L-Carnitin bei der Unterdrückung des bakteriellen Wachstums im Blut oder seinen Komponenten und auch nicht bezüglich der Reduktion der Glycolyse in leukoreduzierten, statistischen Donorplättchenkonzentraten vor der Lagerung.
Wie oben erwähnt, ist die Kontamination der Blutzufuhr mit mikrobiologischen Mitteln ein anderes Problem, das sich an die medizinische Gemeinschaft richtet. Ein Verfahren zum Sterilisieren des Produktes und zur Verbesserung der Zuverlässigkeit bezüglich der Kontamination liegt darin, das Produkt zu bestrahlen. Im allgemeinen sind gamma-Bestrahlungswerte von etwa 25 Centigray (cG), wobei das Produkt nach dem Abdichten in einem Kunststoff-, Glas- oder anderen Behälter bestrahlt wird, wünschenswert. Jede Bestrahlung induziert Zellmembranläsionen mit Hämolyse in RBCs. Die Bestrahlung von Blutprodukten einschließlich dem gesamten Blut, gepackten RBCs und PCs setzt das Vorhandensein von Problemen fort.
Zusätzlich wurde bisher nicht über die Wirkung von L-Carnitin auf das bakterielle Wachstum in Blutprodukten wie dem gesamten Blut, roten Blutzellkonzentraten und Plättchenkonzentraten berichtet. Gleichermaßen wurde die Wirkung von L-Carnitin auf die Glycolyse in Blutprodukten wie dem gesamten Blut, roten Blutzellkonzentraten, Plättchenkonzentraten, insbe sondere leuko-reduzierten statistischen Plättchen vor der Lagerung nicht demonstriert.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im gesamten Blut anzugeben.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im gesamten Blut anzugeben, das für verlängerte Zeitperioden gelagert wird.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in Blutfraktionen anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in Blutfraktionen anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in gepackten roten Blutzellen anzugeben. Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in gepackten roten Blutzellen anzugeben, die für eine verlängerte Zeitperiode gelagert werden.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in gepackten weißen Blutzellen anzugeben.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in gepackten weißen Blutzellen anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in Plättchenkonzentraten anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in Plättchenkonzentraten anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im Plasma oder Plasma-Derivaten anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im Plasma oder Plasma-Derivaten anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im gesamten Blut anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im gesamten Blut anzugeben, das für verlängerte Zeitperioden gelagert wird.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in Blutfraktionen anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in Blutfraktionen anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in gepackten roten Blutzellen anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in gepackten roten Blutzellen anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in gepackten weißen Blutzellen anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in gepackten weißen Blutzellen anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in Plättchenkonzentraten anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in Plättchenkonzentraten anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in leuko-reduzierten statistischen Donorplättchen vor der Lagerung anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in leuko-reduzierten statistischen Donorplättchen vor der Lagerung anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im Plasma oder Plasma-Derivaten anzugeben.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im Plasma oder Plasma-Derivaten anzugeben, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Diese und andere Ziele, die während der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden, wurden durch die Feststellung der Erfinde_r durch ausführliche Forschungen erzielt, daß die Membranschädigung, die durch RBCs und PCs bei der Lagerung oder durch die Bestrahlung erfolgt, im wesentlichen verzögert oder unterdrückt werden kann, indem das Blutprodukt in einer konventionellen Konservierungslösung wie AS-3 suspendiert wird, wobei die Konservierungslösung weiterhin L-Carnitin oder ein Alkanoyl-Derivat davon in einer Konzentration von 0,25 bis 50 mM oder mehr enthält. Die Feststellung des Anmelders liegt in der Erkenntnis, daß die hauptsächliche Zersetzung von Blutprodukten, die konventionell mit Verminderungen der ATP-Gehalte assoziiert ist, und der pH tatsächlich mit der Membranschädigung und Hämolyse zusammenhängt. Die Aufrechterhaltung der Membran und deren Wiederherstellung kann durch die Lipid-Reacylierung bewirkt werden, die teilweise durch LC bewirkt wird, wobei die irreversible Aufnahme davon in RBC und ähnlichen Blutprodukten durch die intensive Forschung festgestellt wurde. Der Erfinder hat ebenfalls festgestellt, daß L-Carnitin das bakterielle Wachstum im gesamten Blut und Blutfraktionen unterdrückt, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen (WBCs), Plättchenkonzentraten, Plasma und Plasma-Derivaten, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden. Der Erfinder hat weiterhin festgestellt, daß L-Carnitin die Glycolyse im gesamten Blut und Blutfraktionen, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen (WBCs), Plättchenkonzentraten, insbesondere leuko-reduzierten statistischen Plättchen vor der Lagerung, Plasma und Plasma-Derivaten reduziert, die für verlängerte Zeitperioden gelagert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 Lebensdauerwerte nach der Infusion für 42 Tage gelagerte RBC, in bezug auf den Donor und Kontrolle und LC-Lagerung. Der Pfeil bedeutet den Mittelwert ± SD der Kontrolle bzw. der LC-gelagerten RBC. Im oberen Teil des Diagramms ist der exakt berechnete p-Wert ebenfalls gezeigt.
2 Carnitin-Gehalt der roten Zellen bei unterschiedlichen Wochen der Blutkonservierung. Carnitin wurde wie in Materialien und Verfahren beschrieben untersucht. Die Werte sind der Durchschnitt von drei Experimenten, die im Duplikat durchgeführt wurden. Die Variation zwischen den Experimenten war nicht mehr als 7%. Offene Symbole: RBC, gelagert mit AS-3 allein; geschlossene Symbole: RBC, gelagert in AS-3, ergänzt mit LC (5 mM).
3 Radioaktive Palmitinsäure-Einfügung in RBC LC bei unterschiedlichen Wochen der Blutkonservierung. RBC-Aliquote, die von der in AS-3 alleine oder AS-3 plus LC gelagerten Bluteinheiten gezogen waren, wurden bei 37°C mit [1-¹⁴C]Palmitinsäure, bei der ein Komplex mit fettsäurefreiem BSA gebildet wird, inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die RBC dann wie in Materialien und Verfahren beschrieben bearbeitet. Die radiomarkierte PLC-Bildung wurde als Phosphorgehalt bezeichnet, der im Lipidextrakt vorhanden ist. Die Werte sind der Durchschnitt von drei Experimenten, die im Duplikat durchgeführt wurden. Die Variation zwischen dem Experiment war nicht mehr als 7%. Offene Symbole: RBC, gelagert mit AS-3 alleine; geschlossene Symbole: RBC, gelagert in AS-3, durch LC (5 mM) ergänzt.
4 Radioaktive Palmitinsäure-Einfügung in die rote Zellmembran von Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylcholin (PC) bei unterschiedlichen Wochen der Blutkonservierung. RBC-Aliquote, die von der Bluteinheit, die in AS-3 alleine oder AS-3 plus LC gelagert war, gezogen waren, wurden bei 37°C mit [1-¹⁴C]Palmitinsäure, mit der ein Komplex mit fettsäurefreiem BSA gebildet wird, inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden RBCs dann wie beschrieben verarbeitet. Die Ergebnisse sind als pmol [1-¹⁴C]Palmitinsäure/μg Lipidphosphor, der im Lipidextrakt vorhanden ist, angegeben. Die Werte sind der Durchschnitt von drei Experimenten, die im Duplikat erfolgten. Die Variation zwischen den Experimenten war nicht mehr als 7%. Offene Symbole, RBC, gelagert mit AS-3 alleine, geschlossene Symbole: RBC gelagert in AS-3, ergänzt mit LC (5 mM).
5 Carnitin-System und Membran-Phospholipid-Reacylierungsreaktionen. Dickere Pfeile zeigen den bevorzugten Acylfluß an. Die Dimension der Acylcarnitinbox zeigt die gleichermaßen bezogene Poolgröße an. Die verwendeten Abkürzungen sind: LPL: Lysophospholipide; PLP: Phospholipide, Cn: Carnitin; Acyl-Cn: Acylcarnitin; ACS: Acyl-CoA-Synthetase; LAT: Lysophospholipid-acyl-CoA-Transferase; CPT: Carnitinpalmitoyltransferase.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung wendet L-Carnitin und seine Alkanoyl-Derivate als Mittel an, das die Zellmembranaufrechterhaltung und -Wiederherstellung und die Unterdrückung der Hämolyse in Blutprodukten unterstützt. Diese Erfindung gibt ebenfalls ein Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im gesamten Blut und Blutfraktionen an, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen, Plättchenkonzentraten wie Plasma und Plasma-Derivaten. Diese Erfindung gibt weiterhin ein Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im gesamten Blut und Blutfraktionen, einschließlich gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen, Plättchenkonzentraten, Plasma und Plasma-Derivaten an.
Geeignete Alkanoyl-L-carnitine umfassen C_2–8-Alkanoyl-L-carnitine, und bevorzugte Alkanoyl-L-carnitine umfassen Acetyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl-, Isovaleryl- und insbesondere Propionyl-L-carnitin. Hierin wird auf diese Familie im allgemeinen als LC Bezug genommen, und die Veranschaulichung erfolgt bezüglich L-Carnitin. Die beschriebenen Alkanoyl-L-carnitine und deren pharmakologisch akzeptablen Salze können jedoch anstelle von L-Carnitin verwendet werden.
Beispiele von geeigneten Salzen von L-Carnitin umfassen z.B. L-Carnitinchlorid, L-Carnitinbromid, L-Carnitinorotat, saures L-Carnitinaspartat, saures L-Carnitinphosphat, L-Carnitinfumarat, L-Carnitinlactat, L-Carnitinmaleat, saures L-Carnitinmaleat, saures L-Carnitinoxalat, saures L-Carnitinsulfat, L-Carnitinglucosephosphat, L-Carnitintartrat, saures L-Carnitintartrat und L-Carnitinmucat.
Beispiele von geeigneten Salzen von Alkanoyl-L-carnitin umfassen z.B. C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinchloride, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinbromide, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinorotate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinaspartate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinphosphate, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinfumarate, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinlactate, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinmaleate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinmaleate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinoxalate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinsulfate, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinglucosephosphate, C_2–8-Alkanoyl-L-carnitintartrate, saure C_2–8-Alkanoyl-L-carnitintartrate und C_2–8-Alkanoyl-L-carnitinmucate.
Die Zugabe von LC zum gesamten Blut oder Blutfraktionen, einschließlich RBCs, WBCs, PCs, Plasma und Plasma-Derivaten erfordert, daß LC in einer Menge vorhanden ist, die effektiv ist, um die Membranaufrechterhaltung, -Wiederherstellung und Hämolyseunterdrückung zu ermöglichen und/oder das bakterielle Wachstum zu unterdrücken oder die Glycolyse zu vermindern. Die durchgeführte Forschung, einschließlich den unten angegebenen Beispielen, hat einen minimalen effektiven Bereich für die Produkte der meisten Donoren von etwa 0,25 bis 0,5 mM demonstriert. Die obere Grenze ist eher praktisch als physiologisch. Konzentrationen von 50 mM oder mehr werden leicht toleriert. Werte, die mit den toxikologischen und osmologischen Überlegungen konsistent sind, sind akzeptabel. Bevorzugte Bereiche sind 1 bis 30 mM. Ein Bereich von 1 bis 10 mM oder mehr ist geeignet, wobei Werte zwischen 4-6 mM einen beachtlichen Unterschied machen. Die Wirkungen dieser Erfindung, einschließlich die Verlängerung der Lebensfähigkeit und die Extension der Zirkulationshalbwertszeit bei der Transfusion können stark donorabhängig sein. Demzufolge ist allgemein gesprochen eine effektive Konzentration von LC 0,5 bis 50 mM, jedoch kann es erforderlich sein, daß der Fachmann auf diesem Gebiet diesen Bereich in jede Richtung in Abhängigkeit von den Besonderheiten des Donors ausdehnt. Solche Ausdehnungen erfordern keine erfinderische Tätigkeit.
LC ist mit konventionellen Trägerlösungen (stabilisierende Lösungen) konsistent, die typischerweise zur Erzeugung einer Pufferwirkung hergestellt werden. Allgemein verwendete Lösungen umfassen ACED (Zitronensäure-Natriumcitrat-Dextrose), CPD (Citrat-Phosphat-Dextrose) und Modifikationen davon, einschließlich CPD2/A-3 und verwandte Zusammensetzungen. Typischerweise umfaßt die Zusammensetzung ein Kohlenhydrat wie Glucose oder Mannit, zumindest ein Phosphatsalz, ein Citrat und andere ausgleichende Salze. LC ist konventionell löslich und kann zu diesen Zusammensetzungen frei innerhalb des erforderlichen Bereiches gegeben werden. Geeignete Lösungen sind in dem US-Patent 5 496 821 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme eingefügt wird. Es ist jedoch zu beachten, daß andere Trägerlösungen als die konventionell verwendeten, einschließlich künstlichem Plasma und andere physiologisch akzeptablen Lösungen mit LC in dieser Erfindung verwendet werden können. Die wichtige Komponente der Trägerlösung ist LC.
Die Fähigkeit von LC bei Einfügung in das gesamte Blut oder die Suspension von Blutfraktionen wie RBCs, WBCs, PCs, Plasma und Plasma-Derivaten zur Ausdehnung der Lebenszeit und daher der Halbwertszeit und die Zirkulationsperiode bei der Transfusion in das empfangende Individuum wird unten durch in vitro- und in vivo-Experimente veranschaulicht. Die Experimente verwenden LC, aber Alkanoyl-L-carnitine können verwendet werden. Von besonderer Bedeutung ist der Beweis unten, daß eine verbesserte Leistung durch verbesserte Aufrechterhaltung (einschließlich Wiederherstellung) der Zellmembran und Unterdrückung der Hämolyse erhalten wird.
Materialien und Verfahren
Studiendesign I
Auswertung der in vivo- und in vitro-Qualität von RBC, das mit und ohne LC gelagert wird.
Subjekte
Die Zielpopulation waren männliche oder weibliche Probanden mit einem Alter zwischen 18 und 65 Jahren ohne bekannte mentale oder physische Behinderung und die keine Arzneimittel einnahmen, die die RBC-Lebensfähigkeit beeinträchtigen könnten. Die Individuen wurden rekrutiert, die die konventionellen allogenen Donorkriterien erfüllten, die in Code of Federal Register, Kapitel 2, Standards of the American Association of Blood Banks und Blood Services Directives of the American National Red Cross angegeben sind. Die Studie wurde von dem Institutional Review Board des Medical College of Hampton Roads genehmigt und die Subjekte gaben vor der Teilnahme an der Studie ihre Zustimmung.
Jeder Donor wurde zu zwei verschiedenen Gelegenheiten, die um 72 Tage voneinander getrennt waren, verabreicht und wurde statistisch entweder dem Test- oder Kontrollarm bei der ersten Gabe verabreicht.
Blutlagerungssystem
Ein Standard CP2D/AS-3-System (Miles Inc.) unter Verwendung von Polyvinylchlorid (PVC)-Kunststoff mit Diethyl-(n)hexylphthalat (DEHP) als Plastifizierer wurde verwendet. Für jede Testeinheit wurden 245 mg LC (in 1,1 ml reiner, pyrogenfreier Lösung in einer sterilisierten Glasflasche) zu dem Behälter gegeben, der die AS-3-Additivlösung beinhaltete, unter Erhalt einer Endkonzentration von 5 mM. Für die Kontrolleinheiten wurden 1,1 ml 0,9% NaCl zu der AS-3-Lösung unter Anwendung der gleichen Bedingungen gegeben. Die Zugabe von LC oder Saline zu den Beuteln wurde durch Injektion durch einen Probenstellenkuppler mit einer Spritze durchgeführt. Dies erfolgte in einer laminaren Fließhaube unter UV-Licht.
Donation und Verarbeitung
Standard-Phlebotomie- und Blutentnahmeverfahren wurden verwendet, wobei ungefähr 450 ± 50 ml gesamtes Blut gesammelt wurden. Die gesamte Bluteinheit wurde zwischen 4 und 8 Stunden bei Raumtemperatur vor der Bearbeitung gehalten. Die Einheit wurde unter Anwendung von Standardbedingungen zentrifugiert und nach der Zentrifugation wurde überstehendes Plasma wegexprimiert, und sedimentierte gepackte RBC wurden entweder in der Standard-AS-3-Lösung (Kontrolle) oder der Carnitinhaltigen AS-3-Lösung (Test) resuspendiert. Die suspendierten RBC-Einheiten wurden bei 4°C 42 Tage gelagert.
In vitro-Messungen
Die Messungen, die bei pre- (0 Tage) und post- (42 Tage) Proben durchgeführt wurden, enthielten RBC-ATP-Gehalte; gesamtes und überstehendes Hämoglobin; Hämatokrit (Hct), RBC, WBC und Plättchenzählungen; RBC-osmotische Fragilität; RBC-Morphologie; Lactat- und Glucose-Gehalte; überstehende Kalium-Gehalte. Diese wurden unter Anwendung der Standardvorgehensweisen durchgeführt, wie zuvor beschrieben; Heaton et al., Vox Sang 57: 37-42 (1989).
In vivo-Posttransfusionsmessungen
Nach 42-tägiger Lagerung wurde eine Probe abgezogen, und die gelagerten Zellen mit Cr unter Anwendung von Standardverfahren markiert. Gleichzeitig wurde zur Bestimmung der RBC-Masse eine frische Probe von dem Donor für die RBC-Markierung mit 99 Tc gesammelt. Nach dem Markieren wurden 15 μCi ⁵¹Cr-markierte gelagerte Zellen und 15 μCi ⁹⁹Tc-markierte Frischzellen gemischt und gleichzeitig durch Infusion verabreicht. Blutproben (5 ml) wurden nach der Infusion bei verschiedenen Zeitintervallen für bis zu 35 Tagen genommen, zum Berechnen des Prozentsatzes der 24-stündigen Wiedergewinnung und Überlebens. Der Prozentsatz der 24-Stunden-Wiedergewinnung wurde unter Verwendung des Einzellabel-Verfahrens bestimmt, bei dem die lineare log-Regression der Radioaktivitätsgehalte der Proben, die bei 5, 7,5, 10 und 15 min gezogen wurden, verwendet wurde, um den 0-Zeit-Level zu bestimmen oder wurde durch das Doppellabelverfahren unter Verwendung von Donor-RBC-Masse bestimmt, wie es durch die ⁹⁹Tc-Messung bestimmt war.
Die Zirkulationslebensdauer der transfundierten überlebenden Cr-markierten RBC wurde durch Proben, die bei 24 Stunden und dann zweimal wöchentlich für bis zu 5 Wochen gezogen waren, bestimmt. Die Radioaktivitätsgehalte wurden für eine konstante 1%ige Elution pro Tag korrigiert. Die Daten wurde mit einer linearen Funktion mit Posttransfusionstagen als unabhängige Variable (x-Achse) und die korrigierten Cr-Zählungen als abhängige Variable (y-Achse) angepaßt. Die Lebensdauer der RBC wurde dann als Schnittpunkt der angepaßten Linie mit der x-Achse genommen.
Statistische Analyse
Ein gepaarter t-Test oder eine nicht-parametrische, statistische Routineanalyse wurde bezüglich der Daten von dem in vivo- und in vitro-Versuch der Einheiten durchgeführt, um zu bestimmen, ob es irgendwelche statistische signifikanten Unterschiede (1-Ende) in den Mitteln zwischen den Test- und Kontrolleinheiten gab. Eine statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert von weniger als 0,05 angesehen.
Studiendesign II
Erythrozyten-LC-Aufnahme und Lipid-Reacylierungsstudien mit einer Lagerung von bis zu 42 Tagen.
Chemikalien: Im wesentlichen fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA) wurde von SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. (USA) erhalten. [1-¹⁴C]Palmitinsäure (58 Ci/mol) wurde von New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA) erhalten. Dünnschichtplatten, Whatman LK6 (Silicagel) (20 × 20 cm) mit einer Vorabsorbensschicht wurden von Carlo Erba, Mailand (Italien) erhalten. Palmitoyl-L-carnitin (PLC) und LC waren ein Geschenk von Sigma Tau, Promezia (Italien). Alle anderen verwendeten Verbindungen waren vom Reagenzgrad.
Rote Zellen-Carnitin-Assay. Eine Blutprobe wurde von der gelagerten RCC-Einheit gezogen und einmal mit 4 Volumen kaltem 0,9%igem NaCl gewaschen. RBC wurde dann in 0,9% NaCl bei einem endgültigen Hämatokrit von 50% resuspendiert und mit Perchlorsäure wie in Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988) beschrieben deproteiniert. Aliquote des Endextraktes wurden bezüglich des freien LC-Gehaltes entsprechend dem radiochemischen Assay von Pace et al., Clin. Chem. 24: 32-35 (1978) analysiert.
Die Analyse der Membrankomplex-Lipidreacylierung in gelagertem RBC. Eine Blutprobe wurde von einer gelagerten RCC-Einheit durch einen Probenstellenkuppler mit einer Spritze abgezogen, und die Probe wurde unmittelbar verarbeitet. Dies erfolgte in einer Laminarflußhaube unter UV-Licht. Alle Manipulationen wurden bei 0 bis 5°C durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. RBC wurde zweimal mit 4 Volumen kaltem 0,9%igem NaCl gewaschen. Isolierte RBC wurde einmal erneut mit Inkubationspuffer (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM NaH₂PO₄, 40 mM Saccharose, 5 mM Glucose, 10 mM Tris-HCl, bei pH 7,4) gewaschen und in dem gleichen Puffer bei einem endgültigen Hämatokrit von 5% resuspendiert. Ein Rotabath-Schüttelbad bei 37°C wurde für die Inkubationen verwendet. RBC wurden mit der radioaktiven Palmitinsäure (10 μM) inkubiert, die an fettsäurefreies BSA (1,65 mg/ml) durch Komplex gebunden war. Die Inkubationen wurden durch einmaliges Waschen der Zellen mit kaltem Inkubationspuffer, dreimaliges Waschen mit fettsäurefreiem 1%igem BSA in Inkubationspuffer und schließlich erneut mit Inkubationspuffer beendet. RBC-Lipide wurden von intakten Zellen mit der Rose & Oaklander-Vorgehensweise, J. Lipid Res. 6: 428-431 (1965) extrahiert. Zur Verhinderung der Lipidoxidation wurden 0,1% butyliertes Hydroxytoluol zu den Lipidextrakten gegeben. Aliquote des Lipidextraktes wurden zur Bestimmung des Lipidphosphor-Gehaltes verwendet und durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie analysiert. Kurz gesagt wurden die Chromatogramme entwickelt, wobei in der ersten Dimension Chloroform-Methanol-28%iges Ammoniak (65:25:5) verwendet wurde. Die Chromatogramme wurden dann unter Verwendung von Chloroform-Aceton-Methanol-Essigsäure-Wasser (6:8:2:2:1) in der zweiten Dimension entwickelt. Phosphatidylcholin (PC), ein Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylserin wurden durch kurzes Aussetzen der Platten mit Iod visualisiert und unter Verwendung _von Standards als Referenz identifiziert. Individuelle Phospholipid-Flecken wurden in Ampullen, die Szintillationsfluid enthielten, gekratzt, und die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Identifizierung und Analyse des radioaktiven PLC wurde wie vor kurzem in Arduini et al., J. Biol. Chem. 267: 12673-81 (1992) beschrieben durchgeführt. Die Zähleffizienz wurde durch einen externen Standard ausgewertet.
Die Berechnungen basieren auf den spezifischen Aktivitäten von radioaktiver Palmitinsäure.
Studie I
Vorlagerungs-AS-3-RCC-Einheitscharakteristika
Die Eigenschaften der AS-3-RCC-Produkte waren wie erwartet nach der Verarbeitung der gesamten Bluteinheiten. Kein signifikanter Unterschied zwischen den Test- und Kontrolleinheiten bezüglich den Charakteristiken der AS-3-RBC-Einheit wurde beobachtet, wie durch das Einheitsvolumen, Hct- und WBC-Gehalt und in vitro-RBC-Eigenschaften wie ATP-Gehalten, überstehendes Hämoglobin und Kalium-Gehalte, osmotische Fragilität (Tabelle 1) gemessen wurde.
Tabelle 1 RBC-Vorlagerungscharakteristiken der Konzentrate aus roten Zellen
RBC-Charakteristika nach 42-tägiger Lagerung
Metabolisch
Die Mengen der verbrauchten Glucose und des erzeugten Lactates während 42 Tagen Lagerung waren ähnlich für die Test- und Kontrolleinheiten (Tabelle 2). Wie erwartet wurden eine inverse hohe Korrelation zwischen diesen beiden Parametern der Glycolyse (r = 0,76) festgestellt. Jedoch wurde eine geringere Hämolyse und höhere ATP-Gehalte für mit Carnitin gelagerte RBC-Einheiten im Vergleich zu der Kontrolle festgestellt. Wie in 1 illustriert ist, wurde dieser höhere ATP-Gehalt bis auf ein Paar bei allen beobachtet (p < 0,01).
Tabelle 2 Eigenschaften der Konzentrate aus roten Zellen nach der Lagerung (42 Tage)
Membran
Die Prozent-Hämolyse am Ende der Lagerungsgehalte war weniger mit den Carnitin-Einheiten, wie in 2 gezeigt ist. Auf der anderen Seite wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der überstehenden Kalium-Gehalte, der osmotischen Schockantwort und der morphologischen Bewertung festgestellt, die innerhalb des erwarteten Bereiches am Ende der 42-tägigen Lagerung lagen.
Posttransfusionslebensfähigkeit
Der mittlere Prozentsatz der 24-stündigen Wiedergewinnung für die Kontrolleinheiten war ähnlich zu dem Wert, der zuvor durch uns und andere festgestellt wurde. Jedoch waren die mittleren Wiedergewinnungen in% für die mit Carnitin gelagerten roten Zellen höher als die gelagerten Zellen gemäß der Kontrolle (p < 0,05). Zusätzlich war die mittlere Zirkulationslebensdauer der eingeflößten gelagerten roten Zellen ebenfalls für die mit Carnitin gelagerten Zellen höher (1). Die Donor-RBC-Masse, die bei den zwei Gelegenheiten bestimmt wurde, war ziemlich ähnlich (r = 0,98) und statistisch nicht unterschiedlich.
Korrelationsstudien
Wie erwartet zeigte der Prozentsatz der Wiedergewinnung nach 24 Stunden signifikante Korrelationen zu den ATP-Gehalten (r = 0,63) und anderen Messungen der RBC-Membranintegrität wie Hämolyse (r = 0,57), osmotischen Fragilität (r = 0,71) und morphologischen Bewertungen (r = 0,59). Der Prozentsatz der Hämolyse korrelierte stark mit den ATP-Gehalten (r = 0,83) und ebenfalls mit dem WBC-Gehalt der BBC-Einheiten (r = 0,83). Die RBC-Zirkulationslebensdauer zeigte keine signifikanten Korrelationen mit irgendwelchen anderen in vitro-Parametern.
Studie II
Carnitinaufnahme in gelagertem RBC
RBC, das in AS-3-Medium alleine gelagert wurde, zeigte keinen signifikanten Verlust des LC-Gehaltes während der Lagerung (2). Dies ist in Übereinstimmung mit den Feststellungen von Cooper et al., supra, die zeigen, daß die menschlichen roten Zell-LC nicht frei mit Plasma oder isoosmotischem Puffer austauschen. Wenn rote Zellen in AS-3, das mit LC ergänzt war, gelagert wurden, wurden höhere Mengen an intrazellulärem LC als bei AS-3 alleine ermittelt (2). Der LC-Gehalt erhöhte sich linear während der Lagerungszeit, wobei eine 4-fache Erhöhung bei 42 Tagen erreicht wurde.
Membrankomplex-Lipidreacylierungs-Studien in gelagertem RBC
Ohne vorhandenes Carnitin verminderte sich das radioaktive Palmitat, das im PLC eingefügt war, linear mit der Lagerungszeit (3). Rate Zellen von RCC-Einheiten, die in der LC-haltigen AS-3-Lösung gelagert waren, zeigte eine anfängliche Erhöhung (mit einem Tiefpunkt bei der dritten Woche), mit anschließender rapider Abnahme des radioaktiven Palmitates, das in PLC eingefügt war. Bei den gleichen roten Zellpräparaten wurde die Einfügung des radioaktiven Palmitates in Membranphospholipide ebenfalls ausgewertet. Die radioaktive Palmitateinfügung in die Membran-PE von roten Zellen von der Bluteinheit, die in der AS-3-Lösung alleine gelagert war, zeigte eine konstante signifikante Erhöhung der Radioaktivität im PE während der Lagerungsperiode (4). Rote Zellen, die in der Gegenwart von LC gelagert waren, wurden durch einen plötzlichen Anstieg der PE-Reacylierung zum Ende der Lagerung hin gekennzeichnet, wobei ein Tiefpunkt in der 6. Woche erhalten wurde (4). Die radioaktiven Palmitat-Einfügungsraten in die Membran-PC verminderten sich leicht während der Lagerung, und kein Unterschied wurde zwischen den beiden roten Zellpräparaten beobachtet (4). Es ist festzustellen, daß, weil in unseren Reacylierungsstudien rote Zellen bei 37°C in einem Krebs-Ringer-Puffer, der Glucose enthielt, inkubiert waren, die ATP-Gehalte am Ende der Inkubation nahe bei den physiologischen Werten liegen (Daten sind nicht gezeigt).
Diskussion
Bei dieser Studie bewiesen der in vitro- und in vivo-Test von RBC-Einheiten am Ende der 42-tägigen Lagerung signifikante Unterschiede zwischen mit Carnitin gelagerten RBC im Vergleich zu der RBC-Kontrollagerung. Verschiedene in vitro-RBC-Eigenschaften, die die metabolische und Membranintegrität in ATP und% Hämolyse widerspiegeln, ebenso wie direkte Messung der Zellebensfähigkeit (24 Stunden-Wiederherstellung in% und Zirkulationslebensdauer) waren für die mit Carnitin gelagerten RBCs signifikant besser. Eine Verlängerung der mittleren Lebensdauer der überlebenden RBC, die 24 Stunden nach der Infusion zirkulieren, ist von Interesse. Diese Feststellung kann mit der irreversiblen Aufnahme von LC während der Lagerung zusammenhängen, eine unvorhersehbare und unerwartete Feststellung. Die in der Kontrollstudie für verschiedene RBC-Eigenschaften erhaltenen Werte waren wie erwartet und von den früheren Studien nicht verschieden. Zum Zeitpunkt der Blutsammlung wurden keine signifikanten Unterschiede in der Einheit oder den RBC-Eigenschaften zwischen dem Test und der Kontrolle festgestellt. Wie in den 1 bis 3 erläutert ist, waren die RBC-ATP-Gehalte,% Hämolyse und Zirkulationslebensdauer stark Donor-bezogen, und weil die Studien ein statistisch gepaartes Design mit fünf Test- und fünf Kontrollstudien war, die sowohl bei der ersten als auch bei der zweiten Gelegenheit durchgeführt wurden, ist es unwahrscheinlich, daß die beobachteten Unterschiede aufgrund einer Änderung oder irgendeines namhaften Studiendesigns resultieren. Es ist daher sehr wahrscheinlich, daß die beobachteten Unterschiede, die bei dieser Studie festgestellt wurden, durch die Zugabe von Carnitin zu den Testeinheiten verursacht wurden. Die Möglichkeit, daß die erhöhte Lebensdauer eine verminderte Elution von Cr reflektiert, kann nicht ausgeschlossen werden, aber es ist mit den verbesserten in vitro-Messungen der gelagerten roten Zellen nicht konsistent, bei denen festgestellt wurde, daß dies mit der in vivo-Lebensfähigkeit korreliert.
Mehrere Untersuchungen haben festgestellt, daß LC und seine Acylester eine cytoprotektive/Membran-Stabilisierungswirkung auf verschiedene Zellen, einschließlich rote Zellen ausüben. Vgl. z.B. Synder et al., Arch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). Bei dieser Studie wurde festgestellt, daß LC irreversibel durch die RBC während der Lagerung aufgenommen wurden. Obwohl die Natur dieses Verfahrens nicht vollständig klar ist, kann man die Teil nahme eines spezifischen Trägers für die LC-Aufnahme ausschließen. Unseres Wissens operiert der einzige bekannte LC-Träger im zellulären System, bei dem die interzelluläre Konzentration von LC mehrfach höher ist als normalerweise in der extrazellulären Umgebung vorhandenen Konzentration. Die rote Zell-LC-Konzentration ist ähnlich wie die von Plasma. Unabhängig von der niedrigen Temperatur, APT-Verminderung und anderen möglichen metabolischen Änderungen, die während der Lagerung auftreten, wenn rote Zellen in einem Medium mit relativ hohen Mengen an exogenem LC gelagert werden, scheint eine unidirektionale Aufnahme von LC durch die Zellen sich einzustellen. Im Stand der Technik scheint nichts dies vorherzusagen.
Die Natur der Wirkung von LC auf gelagerte RBC könnte entweder als biophysische und/oder metabolische Intervention auf das Membranabteil angesehen werden. Das Posttransfusions-Überleben von gelagerten roten Zellen hängt mit der Integrität der Membranfunktion zusammen, wie durch die signifikante Korrelation zwischen der in vivo-Lebensfähigkeit von reinfundierten roten Zellen und deren Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis-Messungen nahegelegt ist. Ein hauptsächlicher Beitrag für die RBC-Membranstruktur und Funktion wird durch das Cytoskelettnetzwerk dargestellt, Marchesi, Ann. Rev. Cell. Biol. 1: 531-536 (1985), eine supramolekulare Proteinorganisation, die in der Nähe des inneren Hämiplättchens der RBC-Membran liegt. Wolfe et al. haben in einer begutachtenden Studie bezüglich der Zusammensetzung und Funktion des Cytogerüst-Membranproteins von gelagerten roten Zellen festgestellt, daß die einzige relevante Änderung eine verminderte Fähigkeit von Spektrin zur Assoziation mit Actin in der Gegenwart oder Abwesenheit von Protein 4.1. war. Wolfe et al., J. Clin. Invest. 78: 1681-1686 (1986). Wir haben gezeigt, daß LC die RBC-Membrandeformabilität von Protein 4.1 beeinflußt, das erneut abgedichtete Ghosts enthält, die eine erhöhte Scherbeanspruchung erfahren haben. Arduini et al., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Somit kann LC eine stabilisierende Wirkung auf die Membran durch eine Spektrin-Wechselwirkung mit einer oder mehreren Cytoskelett-Komponenten ausüben. Eine kürzliche paramagnetische Elektronenresonanzstudie von Butterfield und Rangachari, Life Sci. 52: 297-303 (1992) bezüglich der rote Zell-Spectrin-Actin-Wechselwirkung zeigte, daß LC signifikant die Skelettbewegung von Spin-markierten Sties auf Spectrin reduzierte, was die frühere Vermutung bestätigte, daß LC bei der Verstärkung der Wechselwirkung zwischen Spectrin und Actin beinhaltet ist; Arduini et al., supra.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen potentiellen biophysikalischen Aktion können die Verbesserungen, die bei den LC-gelagerten roten Zellen beobachtet werden, ebenfalls das Ergebnis eines vorteilhaften metabolischen Verfahrens sein. Normalerweise erfordert der Deacylierungs-Reacylierungszyklus von Membranphospholipiden ATP für die Erzeugung von Acyl-CoA. Der Acyl-Anteil von Acyl-CoA wird dann in Lysophospholipide durch Lysophospholipid-Acyl-CoA-Transferase transferiert. Zusätzlich folgt während eines oxidativen Austausches das Membranwiederherstellungsverfahren von RBC-Phospholipiden dem gleichen metabolischen Weg. Kürzliche Feststellungen haben gezeigt, daß CPT das Reacylierungsverfahren von Membranphospholipiden in roten Zellen und neuronalen Zellen durch Modulation der Größe des Acyl-CoA-Pools zwischen dem Aktivierungsschritt der Fettsäure und ihren Transfer in Lysophospholipide beeinträchtigt. Arduini et al., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Zusätzlich haben Pulsverfolgungs- und ATP-Verminderungsstudien demonstriert, daß der rote Zell-Acylcarnitin-Pool als Reservoir von aktivierten Acyl-Gruppen dient, ohne daß dies auf Kosten von ATP geht. Arduini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994).
Die Verstärkung der radioaktiven Palmitateinfügung in die Membran-PE von roten Zellen, die in AS-3 alleine gelagert sind, legt nahe, daß die Langzeitlagerung (mit einer progressiven RBC-ATP-Verminderung) ein erhöhtes Bedürfnis von aktivierten Acyl-Einheiten für die Reacylierung von Membranphospholipiden verursacht (5). Während der ersten fünf Wochen der Lagerung scheinen rote Zellen, die in AS-3 ohne LC konserviert werden, mehr Palmitat in PE einzufügen als rote Zellen, die in LC-haltigem AS-3 gelagert werden (4). Rote Zellen, die in der Gegenwart von LC gelagert werden, waren ebenfalls in der Lage, mehr Palmitat in PE am Ende der Lagerung einzufügen. Die Feststellung kann nahelegen, daß ein oxidativer Austausch ziemlich wirksam ist, weil das Aussetzen der roten Zellen gegenüber einem Oxidationsmittel stark das Membran-PE-Reacylierungsverfahren stimuliert, aber nicht das von Membran PC. Dise et al., Biochem. Biophys. Acta 859: 69-78 (1986). Während der ersten fünf Wochen der Lagerung scheinen rote Zellen, die in AS-3 alleine konserviert werden, mehr Palmitat in PE als rote Zellen, die in AS-3 gelagert sind, das LC enthält, einzufügen (4). Dies legt nahe, daß im zuletztgenannten Fall CPT mit dem reacylierendem Enzym für die Acyl-CoA-Verwendung in Wettkampf treten kann. In Übereinstimmung mit diesem Konzept sollten wir jedoch einen viel größeren Unterschied am Ende der Lagerungsperiode beobachtet haben, wenn das Acyl-CoA-Erfordernis für das Reacylierungsverfahren am höchsten ist. Dies war nicht der Fall. Rote Zellen, die mit oder ohne LC gelagert waren, zeigten eine ähnliche Einfügungsrate am Ende der Lagerung (4). Zusätzlich haben wir gezeigt, daß rote Zell-CPT unter einer Vielzahl von verschiedenen experimentellen Bedingungen nicht mit der Reacylierung von Membranphospholipiden in Wettkampf tritt. Arudini et al., Life Chem. Rep. 12: 49-54 (1994).
Die radioaktive PLC-Bildung in den durch LC ergänzten roten Zellen ist größer als die in den roten Zellen, die ohne LC gelagert sind (3). Zusätzlich zeigte der Zeitverlauf der PLC-Bildung in den roten Zellen, die mit LC gelagert sind, eine interessante glockenförmige Kurve mit einem Tiefstpunkt bei der dritten Woche der Lagerung. Die radioaktive PLC-Bildung reflektiert die Poolgröße von kaltem langkettigem Acylcarnitin und die Richtung des CPT-mediierten Acylflusses in intakten roten Zellen. Während der ersten drei Wochen der Lagerung mit verhältnismäßig hoher glycolytischer Aktivität und ATP-Verfügbarkeit scheint CPT den Acylfluß in Richtung zu Acylcarnitin in roten Zellen, die in der Gegenwart von LC gelagert sind, anzutreiben (5a). Nach der dritten Woche der Lagerung wird mit vorhandenem LC der Fluß dann umgekehrt. Diese Änderungen können im wesentlichen die Fähigkeit von CPT reflektieren, aktivierte Acyl-Einheiten zu puffern: ein erhöhtes Erfordernis von Acyl-CoA für das Reacylierungsverfahren führt zu einer niedrigeren Produktion von PLC und umgekehrt und kann einen Mechanismus repräsentieren, bei dem CPT zum Puffern der Erhöhung des Bedürfnisses von Acyl-Einheiten für das Reacylierungsverfahren verwendet wird (5b).
Die höhere 24-stündige Wiedergewinnung in Prozent oder Zirkulationslebensdauer repräsentiert eine Verbesserung um ungefähr 15%, ausgedrückt als Potenz (Menge an transfundiertem zirkulierendem verfügbarem RBC in den Rezipienten mal der durchschnittlichen Lebensdauer). Diese Erhöhung der Potenz könnte sich klinisch in eine Verminderung der Transfusionserfordernisse bei chronisch transfundierten Patienten wie Thalassämie-Patienten oder bei Patienten mit Knochenmarkmangel übertragen. Alternativ kann es möglich sein, die Lebensdauer von flüssigen gelagerten RBCs zu erstrecken.
Unsere Feststellungen legen nahe, daß das Vorhandensein von LC in dem Konservierungsmedium während der RBC-Lagerung eine geringe Wirkung auf den ATP-Pool, der durch die Reacylierung von Phospholipiden für die Membranwiederherstellung verwendet wird, ausübt. Dieses vorteilhafte metabolische Verfahren, assoziiert mit einer möglichen vorteilhaften biophysikalischen Aktion, kann somit die verminderte Hämolyse, höhere ATP-Gehalte und die verbesserte in vivo-Wiederherstellung und Überleben der in LC gelagerten roten Zellen erklären.
Bestrahlung
Das Kontaminationsproblem des Blutproduktes einschließlich gesamtes Blut, RBC, RCC, PC und dgl., kann durch wesentliche Bestrahlungsmengen vermindert werden. Bestrahlungsmengen, die für die Sterilisierung und eine im wesentlichen 100%ige Mortalität der mikrobiologischen Mittel notwendig sind, wurden in großem Umfang untersucht. Zusätzlich und deutlich wichtiger können Leukozyten durch eine ähnliche Bestrahlung zerstört werden. Eine Varietät von Typen der Bestrahlung kann verwendet werden, einschließlich gamma-Bestrahlung (Cobalt GG, Van de Graf-Beschleunigung), UV-Bestrahlung, Infrarotbestrahlung, etc. Eine Bestrahlung, die sehr stark etwa 20 bis 50 cG gamma-Bestrahlung äquivalent ist, ist ausreichend.
Weltweit werden zwischen 60 und 80 Millionen Einheiten des gesamten Blutes jährlich gesammelt und in dem Transfusionsträger einer Vielzahl von Patientenpopulationen verwendet. In den unterentwickelten Ländern sind Sammlungsraten pro 1000 Personen niedriger, und die meisten Bluttransfusionen werden bei der Behandlung der Geburtshilfe und Kinderheilkunde, insbesondere bei mit Malaria zusammenhängender Anämie verabreicht. In den entwickelten Ländern sind die Sammlungsraten pro 1000 Personen 50- bis 10-mal höher und die meisten Transfusionen werden bei der Operation (50%) oder der Behandlung von Patienten mit Krebs assoziierter Anämie, Knochenmarktransplantation, nicht-malignem gastrointestinalem Bluten verabreicht (1). Es gibt viele potentielle nachteilige Wirkungen, die mit der Transfusion von allogenem Blut assoziiert sind. Eine besondere Komplikation, die mit der Bluttransfusion nachteilig zusammenhängt, ist das seltene und üblicherweise fatale Erscheinungsbild, bekannt als "Transfusion associated graft versus host disease (TA-GVHD), eine Komplikation, die durch lebensfähige allogene Immunozyten mediiert wird.
TA-GVHD-Erkrankung ist eine seltene Komplikation der Bluttransfusion, die potentiell in zwei Typen von Patienten gesehen wird, die eine Bluttransfusion erhalten. TA-GVHD hat eine Mortalität in der Nähe von 100%, und die Verhinderung ist die einzig wirksame Annäherung zu diesem Zeitpunkt. Zunächst bei immungefährdeten Patienten wie Patienten nach Knochenmark- oder anderen Organtransplantationen, Hodgkins-Erkrankung oder Erbmängeln des Immunsystems. Dann bei nicht-immungefährdeten Patienten, wenn HLA gleichermaßen zwischen Blutdonor und Blutempfänger existiert. Dies wird am häufigsten bei gerichteten Gaben von nahen Verwandten oder bei Popula tionen mit begrenzterem HLA-Polymorphismus wie in Japan und Israel gesehen. In Anbetracht dessen ist es allgemeine Praxis, zelluläre Blutprodukte mit gamma-Bestrahlung mit einer mittleren Dosis von ungefähr 25 Centigray (cG) zu bestrahlen, um die Replikationsfähigkeit von lebensfähigen Immunozyten zu zerstören. Es sollte festgestellt werden, daß TA-GVHD mit zellulären Produkten assoziiert ist, die frisch sind, d.h. im allgemeinen weniger als 15 Tage. Jedoch ist das "Altern von Blut" noch keine akzeptierte Praxis bei der Verhinderung dieser Komplikation. Obwohl die Immunozyten ein Teil der allogenen Leukozytenpopulation sind, wird das Ausmaß der Leukoverminderung, die gegenwärtig mit Filtern der dritten Generation erzielt wird, zur Zeit nicht als adäquat angesehen, um diese Komplikation zu verhindern. Somit bleibt die gamma-Bestrahlung zu diesem Zeitpunkt die einzige akzeptable prophylaktische Intervention.
Die Schwierigkeit der gamma-Bestrahlung von roten Zellen ist insbesondere die Möglichkeit, die Zellmembran zu schädigen. Es ist klar, daß die Bestrahlung bei dieser Dosis einen Verlust der Potenz von ungefähr 7 bis 8% erzeugt, was in vitro durch ein Verminderung der roten Blutzell-ATP, erhöhter Hämolyse und erhöhtem überstehendem Kalium gemessen wird. Diese Änderungen sind mit einer Membranschädigungswirkung konsistent. Diese in vitro-Änderungen sind mit einer Verminderung der Wiedergewinnung nach 24 Stunden der gamma-bestrahlten roten Blutzellen assoziiert. Im Hinblick auf die Plättchenprodukte hat zumindest eine Publikation einen gewissen Verlust der Lebensfähigkeit nahegelegt.
Ein beachtlicher Beweis zeigt an, daß die gamma-Bestrahlung mehrere Wirkungen durch Erzeugung von aktivierten Sauerstoffspezies wie Singulettsauerstoff, Hydroxy, Radikal und Superoxid-Anion ausübt. Diese Spezies induzieren eine intrazelluläre Schädigung bei DNA und verhindern somit die Zellreplikation, ein Erfordernis für TA-GVHD. Jedoch können diese gleichen Sauerstoffspezies die Membranlipide aus den roten Zellen und möglicherweise Plättchenmembran oxidieren, wodurch eine Membranläsion induziert wird, die die Qualität (Potenz) des zellulären Produktes vermindert.
Es ist bekannt, daß LC eine Schlüsselrolle bei dem Transport von langkettigen Fettsäuren entlang der mitochondrialen Membrane spielt. Erberkrankungen, bei denen es einen Mangel des Carnitin-Systems gibt, langkettige Fettsäuren zu transportieren, führen zu einer signifikanten Beeinträchtigung der Skelettmuskelfunktion. Seit kurzem gibt es ein zunehmendes Interesse für die Rolle von LC bei der roten Zellmembran. Was überraschend ist, ist jedoch, daß die roten Zellen keine Mitochondrien aufweisen, und somit war ein Enzym bei der reversiblen Acylierung von LC involviert, was eine beachtliche Kuriosität und das Vorhandensein von LC und Carnitinpalmitoyl-Transferase ergibt. Es war zunächst unklar, welche Rolle diese innerhalb der roten Zellen spielen könnten. Die rote Zelle kann einer oxidativen Beanspruchung während des langen Lebenszyklus in vivo unterworfen sein, und die Wiederherstellung der oxidierten Membranlipide, die LC beinhalten, könnte für das normale Überleben von roten Zellen wichtig sein.
Eine frühe Zunahme bei acyliertem Carnitin während einer Zeit der erhöhten ATP-Verfügbarkeit kann als Reservoir von aktivierten Fettsäuren fungieren, die anschließend in einem Wiederherstellungsmechanismus für geschädigte oxidierte Membranlipide verwendet werden kann. Eine solche Erläuterung würde die verminderte Hämolyse gut erklären, die während der in vitro-Lagerung von roten Blutzellen supra beobachtet wird und würde zusätzlich die Verbesserung erklären, die mit einer in vivo-Wiederherstellung und Überleben beobachtet wird. Die Nettowirkung der LC-Addition ist eine ungefähr 17%ige Erhöhung der Potenz.
Demgemäß kann LC verwendet werden, um Membranläsionen, die durch Bestrahlung induziert sind, außer Kraft zu setzen, oder zu verhindern. Dies würde durch die Fähigkeit von Carnitin, das in roten Zellen gelagert ist, auftreten, in vitro oxidierte Membranlipide zu reparieren.
Um die Empfindlichkeit der Blutprodukte (RCC, PC und dgl.) für Membranläsionen und Hämolyse zu begrenzen, kann das Blutprodukt zunächst in einer Lösung, einschließlich LC in einer Menge von 0,25 mM bis 50 mM suspendiert sein, die Zellmembranaufrechterhaltung und Unterdrückung der Hämolyse wird in einem ausreichenden Ausmaß erzielt, so daß das abgedichtete Produkt zur Sterilisierung bestrahlt werden kann, und kann anschließend eine verlängerte Lebensdauer und Zirkulationslebensdauer nach der Transfusion genießen. Die Lebensfähigkeit in der Größenordnung der gegenwärtigen Lebensfähigkeiten kann erzielt werden, wobei die Materialien nahezu sicher steril sein müssen und es unwahrscheinlich ist, daß sie TA-GVHD einführen aufgrund der Bestrahlung nach dem Abdichten der Blutproduktsuspension. Es ist zu betonen, daß der Ausdruck Blutprodukt in diesem Zusammenhang breit interpretiert werden sollte und das gesamte Blut, Blutplasma, RCCs, PCs, Mischungen und dgl. beinhaltet.
1. Verwendung von L-Carnitin zur Unterdrückung des bakteriellen Wachstums in Plättchenkonzentraten mit verlängerter Lagerung
Hintergrund
L-Carnitin (LC) reduziert die Glycose in erstreckten (> 5 Tage), gelagerten Plättchenkonzentraten (Sweeny et al., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norwegen, 27. Juni-2. Juli 1998, in Vox Sanguinis, Bd. 74, Nr. Suppl. 1, S. 1226; und Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, 4.-8. Dez. 1998). Die Wirkung von LC auf das bakterielle Wachstum in Plättchenkonzentraten ist für die Auswertung wichtig, ob LC als Additiv zu verwenden ist.
Studienverfahren
Zwei ABO-identische leuko-reduzierte Plättchenkonzentrate vor der Lagerung, die durch die Filtration von plättchenreichem Plasma (MedSep Corp. Covina, CA) in einer Linie produziert waren, wurden gepoolt, dann gleichermaßen in zwei CLX^® (MedSep)-Beutel unterteilt. LC bis zu einer Endkonzentration von 5 mM oder Saline (Kontrolle) wurde zu jeweils einem Paar gegeben. Jeder Behälter wurde mit 1 ml Koagulase negativer Staphylococcen-Suspension am Tag 0 bis zu einer Endkonzentration zwischen 1-48 CFU/ml beladen. Proben wurden von jedem Container aseptisch am Tag 3, Tag 6 und entweder am Tag 7 oder Tag 8 für die Kolonienzählung entfernt. Die Daten wurden durch gepaarte t-Tests analysiert.
Ergebnisse: Elf Paare von Konzentraten wurden untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt. Am Tag 7/8 war das Wachstum in den L-Carnitin-Behältern 33% im Vergleich zu der Kontrolle.
Schlußfolgerung: L-Carnitin bei 5 mM verzögert das Wachstum der Koagulase-negativen Staphylococcen in flüssigen, gelagerten Plättchenkonzentraten.
II. Verwendung von L-Carnitin zur Verminderung der Glycolyse während der verlängerten Lagerung von leuko-reduzierten statistischen Plättchen vor der Lagerung
Hintergrund
L-Carnitin vermindert die Glycolyse in Standard-(nichtleuko-reduzierten)-Plättchenkonzentraten, die für fünf-zehn Tage gelagert ^waren (Sweeny et al., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norwegen, 27. Juni-2. Juli 1998, in Vox Sanguinis, Bd. 74, Nr. Suppl. 1, S. 1226; und Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, 4.-8. Dez. 1998).
Eine ähnliche Wirkung bei leuko-reduzierten statistischen Donorplättchen vor der Lagerung wurde zuvor noch nicht demonstriert.
Studiendesign
Zwei ABO-identische leuko-reduzierte Plättchenkonzentrate vor der Lagerung, die durch Filtration von plättchenreichem Plasma (MedSep Inc., Corvina. CA) in einer Linie erzeugt waren, wurden gepoolt, dann gleichermaßen in zwei CLX-(MedSep)-Behälter unterteilt. L-Carnitin (Endkonzentration 5 mM) oder Saline wurde zu einem Beutel eines jeden Paars von Plättchen gegeben. Die Plättchen wurden für sieben oder acht Tage bei 22°C auf einem Flachbettrührer gelagert, dann untersucht. Die durchgeführten Versuche waren der pH, Plättchenzählung, überstehende Glucose und Lactat, Oberflächen-p-selectin-Expression durch Flußcytometrie, Ausmaß der Formänderung (ESC) und hypotonische Schockantwort (HSR). Der Glucose-Verbrauch und die Lactat-Produktion wurden als mM/10¹² Plättchen/Tag berechnet. Die Daten wurden unter Verwendung der gepaarten t-Tests analysiert.
Ergebnisse
Sieben (7) Paare von Plättchenkonzentraten wurden untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt.
Schlußfolgerung
L-Carnitin reduziert die Glycolyse in gelagerten leuko-reduzierten statistischen Donorplättchen vor der Lagerung.
Die Erfindung dieser Patentanmeldung wurde in allgemeinen Ausdrücken und unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele offenbart. Variationen werden dem Fachmann ohne erfinderisches Zutun ersichtlich. Insbesondere können andere stabilisierende Zusammensetzungen, Blutprodukte, Konservierungsmittel, Inhibitoren und dgl. ohne erfinderisches Zutun modifiziert werden. Zusätzlich variieren spezifische Gehalte, Lebensfähigkeitsperioden und Zirkulationshalbwertszeiten von Donor zu Donor und Empfänger zu Empfänger. Solche Variationen bleiben innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, wenn nicht durch die Angaben der folgenden Patentansprüche spezifisch ausgenommen.

Claims

Verfahren zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums im gesamten Blut oder einer Fraktion davon, umfassend die Zugabe einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Carnitin, Salzen von L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitinen, Salzen von Alkanoyl-L-carnitinen und Mischungen davon zum gesamten Blut oder einer Blutfraktion in einer Menge, die zum Unterdrücken des bakteriellen Wachstums in dem gesamten Blut oder der Blutfraktion effektiv ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Blutfraktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen, Plättchenkonzentraten, Plasma und Plasma-Derivaten.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Blutfraktion gepackte rote Zellen ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten roten Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Blutfraktion gepackte weiße Blutzellen ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten weißen Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Blutfraktion gepacktes Plättchenkonzentrat ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten weißen Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Blutfraktion gepacktes Plasma oder Plasma-Derivat ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten weißen Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 0,25 bis 50 mM enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 1 bis 30 mM enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung L-Carnitin ist. 10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl-L-Carnitin, Propionyl-L-Carnitin, Butyryl-L-carnitin, Isobutyl-L-carnitin, Valeryl-L-carnitin und Isovaleryl-L-carnitin.
Verfahren zur Verminderung der Glycolyse im gesamten Blut oder einer Fraktion davon, wobei die Fraktion aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus gepackten roten Blutzellen, gepackten weißen Blutzellen, Plasma und Plasma-Derivaten, umfassend die Zugabe einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Carnitin, Salzen von L-Carnitin, Alkanoyl-L-carnitinen, Salzen von Alkanoyl-L-carnitinen und Mischungen davon zu gesamten Blut oder einer Blutfraktion in einer Menge, die zur Verminderung der Glycolyse in dem gesamten Blut oder der Blutfraktion wirksam ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Blutfraktion gepackte Blutzellen ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten roten Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Blutfraktion gepackte Blutzellen ist und das Verfahren das Suspendieren der gepackten weißen Blutzellen in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Blutfraktion Plasma oder ein Plasma-Derivat ist und das Verfahren das Suspendieren des Plasma oder Plasma-Derivates in eine Trägerlösung umfaßt, die die Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 0,25 bis 50 mM enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 1 bis 30 mM enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Verbindung L-Carnitin ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl-L-carnitin, Propionyl-L-carnitin, Butyryl-L-carnitin, Isobutyl-L-carnitin, Valeryl-L-carnitin und Isovaleryl-L-carnitin.
Verfahren zur Verminderung der Glycolyse in einem leukoreduzierten statistischen Donor-Plättchenkonzentrat vor der Lagerung, worin das Verfahren die Suspension des Plättchenkonzentrates in einer Trägerlösung umfaßt, die eine Verbindung enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Carnitin und Salzen von L-Carnitin, in einer Menge, die wirksam ist, die Glycolyse in dem leuko-reduzierten statistischen Donor-Plättchenkonzentrat vor der Lagerung zu reduzieren.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 0,25 bis 50 mM enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Verbindung in der Trägerlösung in einer Konzentration von 1 bis 30 mM enthalten ist.