SK287562B6

SK287562B6 - Spôsob potlačenia rastu baktérií a redukcie glykolýzy v celej krvi alebo jej frakcii

Info

Publication number: SK287562B6
Application number: SK1663-2001A
Authority: SK
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2011-02-04
Also published as: HK1044099B; BR0011430B1; ATE249738T1; US7816073B2; KR20020008412A; US6403124B1; EP1187530B1; IL146517A; HUP0201465A2; DE60005343T2; MXPA01012645A; JP2003501364A; WO2000074483A1; US7851142B2; CZ301803B6; SK16632001A3; IL146517A0; HUP0201465A3; CZ20014078A3; KR100713140B1

Abstract

Predložený vynález sa týka spôsobu potlačenia rastu baktérií v celej krvi alebo jej frakciách, ktorý tvorí pridanie do celej krvi, do krvných frakcií zlúčeniny vybratej zo skupiny pozostávajúcej z L-karnitínu, alkanoyl karnitínov, solí alkanoyl karnitínov a ich zmesí, v množstve účinnom na potlačenie rastu baktérií v uvedenej celej krvi alebo krvných frakciách. Tiež je opísaný spôsob redukcie glykolýzy v celej krvi alebo krvnej frakcii s použitím uvedenej zlúčeniny.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu potlačenia rastu baktérií v celej krvi a krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek (WBC), koncentrátov krvných doštičiek, plazmy a derivátov plazmy, ktoré sú skladované počas dlhého obdobia. Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu redukcie glykolýzy v celej krvi a krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek (WBC), koncentrátov krvných doštičiek, plazmy a derivátov plazmy, ktoré sú skladované počas dlhého obdobia.

Doterajší stav techniky

Problém sa týka národných aj svetových zásob krvi. Významnou sa stáva otázka integrity a spoľahlivosti existujúcich zásob, rovnako aj možnosti vytvárať väčšie zásoby na dlhší čas. Jedným z dôvodov je relatívne krátky čas skladovania výrobkov z krvi. Zhluknuté červené krvinky (koncentráty červených krviniek, RCC), ktoré predstavujú hlavnú formu výrobkov z krvi na transfúzie a pod., môžu byť skladované len 42 dní. Po tomto čase klesajú hladiny ATP, nastáva pokles hodnoty pH, čo výrazne indikuje stratu životaschopnosti alebo v prípade, ak sú životaschopné pri infúzii in vivo veľmi krátku životnosť pri cirkulácii. Celá krv sa neuskladňuje dlhodobo. Krvné doštičky sa bežne skladujú ešte kratšie, bežne 5 dní pri teplote 22 °C. Rozdiel v stabilite počas skladovania koncentrátov krvných doštičiek je v kontraste s koncentrátom červených krviniek z dôvodu prebiehajúcich metabolických reakcií v krvných doštičkách, čiastočne kvôli prítomnosti mitochondrií v koncentrátoch krvných doštičiek a kvôli ich neprítomnosti v koncentrátoch červených krviniek. Hoci obidva krvné produkty vykazujú pokles ATP spoločne s poklesom hodnoty pH a tvorbu kyseliny mliečnej v závislosti od dĺžky skladovania, prítomnosť mitochondrií v koncentráte krvných doštičiek pravdepodobne vyvoláva tento problém v dôsledku glykolýzy.

Narástli problémy týkajúce sa spoľahlivosti a integrity zásob krvi, ktoré sa týkajú predovšetkým opakovane zistených kontaminácií baktériami alebo kontaminácií krvných zásob inými mikróbmi. Takýto stav je ešte horší v krajinách bez moderných spôsobov odberu a skladovania. Hoci na zníženie kontaminácie sa môžu pridať látky, tieto sú neželateľné, pretože sa pri transfúzii dostávajú do tela pacienta. Jednou vhodnou alternatívou je ožiarenie výrobkov po ich zabalení, typicky do plastového vinylového obalu. Takéto ožiarenie zhorší vlastnosti koncentrátu červených krviniek a koncentrátu krvných doštičiek v zmysle zníženia funkcie týchto buniek.

Okrem toho existuje malá, ale narastajúca skupina populácie, u ktorej sa môže po transfúzii vyvinúť riziko všeobecne smrteľného stavu známeho ako potransfuzna reakcia „štep proti príjemcovi“ (TA-GVHD), spôsobeného prítomnosťou živých alogénnych leukocytov. Tento syndróm sa zvyčajne vyvinie u pacienta s imunosupresiou, akou je rakovina a u pacientov s transplantovanou kostnou dreňou, ale môže sa vyvinúť tiež u ľudí s neporušenou imunitou, ale s obmedzeným HLA polymorfizmom.

Veľká pozornosť sa venovala hľadaniu spôsobu na zlepšenie stability počas skladovania. Jeden takýto spôsob týkajúci sa predĺženia životnosti počas skladovania koncentrátov krvných doštičiek je uvedený v americkom patente U. S. 5 466 573. Tento patent sa týka preparátov koncentrátov krvných doštičiek so zdrojom octanových iónov, ktoré pôsobia ako substrát na oxidačnú fosforyláciu a súčasne ako pufer na úpravu zníženého pH spôsobeného tvorbou kyseliny mliečnej. Tento spôsob priamo neovplyvňuje hemolýzu a poškodenie membrány. Iný spôsob je opísaný v patente U.S. 5 496 821. V tomto patente sa celá krv skladuje s prípravkom L-kamitínu (LC) alebo s jeho alkanoyl derivátmi. Patent však neopisuje účinky na krvné produkty, ako sú koncentráty krvných doštičiek alebo koncentráty červených krviniek a týka sa do určitej miery pôsobenia L-kamitínu na vlastnosti plazmy.

Ako je uvedené, mikrobiálna kontaminácia zásob krvi predstavuje ďalší problém, ktorému musí čeliť lekárska komunita. Jeden spôsob sterilizácie výrobku a zlepšenia spoľahlivosti v zmysle kontaminácie, je ožiarenie krvného výrobku. Vo všeobecnosti je vhodné gama ožiarenie 25 centgray (cG), ožarujú sa výrobky po zatavení v plastovom obale, skle alebo inom materiáli. Ožiarenie však spôsobuje lézie v bunkových membránach a hemolýzu červených krviniek. Nevyriešeným problémom zostáva ožiarenie výrobkov z krvi vrátane celej krvi, zhluknutých červených krviniek a krvných doštičiek.

Okrem toho doteraz nebol zaznamenaný účinok L-kamitínu na rast baktérií vo výrobkoch z krvi, ako sú celá krv, koncentráty červených krviniek a koncentráty krvných doštičiek. Rovnako doteraz nebol zaznamenaný účinok L-kamitínu na glykolýzu vo výrobkoch z krvi, ako sú celá krv, koncentráty červených krviniek a koncentráty krvných doštičiek.

Podstata vynálezu

Cieľom predloženého vynálezu je spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi alebo jej frakciách, ktorý tvorí pridanie do celej krvi alebo do krvných frakcií zlúčeniny vybratej zo skupiny pozostávajúcej z L-karnitínu, solí L-kamitínu, alkanoyl kamitínov, solí alkanoyl kamitínov a ich zmesi, v množstve účinnom na potlačenie rastu baktérií v uvedenej celej krvi alebo krvných frakciách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi, ktorá je skladovaná dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérii v krvných frakciách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v krvných frakciách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých červených krvinkách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých červených krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom je poskytnúť spôsob potlačenie rastu baktérií v zhluknutých bielych krvinkách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých bielych krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v plazme alebo derivátoch plazmy.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v plazme alebo derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v celej krvi.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v celej krvi, ktorá je skladovaná dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných frakciách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných frakciách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých červených krvinkách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých červených krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých bielych krvinkách.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých bielych krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v koncentrátoch krvných doštičiek.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v koncentrátoch krvných doštičiek, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných doštičkách s redukciou leukocytov pred uskladnením.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných doštičkách s redukciou leukocytov pred uskladnením, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v plazme alebo derivátoch plazmy.

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v plazme alebo derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Tieto a iné ciele, ktoré budú zrejmé z ďalšieho opisu, sa dosiahli skúmaním pôvodcu, ako výsledok intenzívneho skúmania, že poškodenie membrány červených krviniek a krvných doštičiek pri skladovaní, alebo ako následok ožiarenia, sa môže podstatne oddialiť alebo potlačiť tým, že krvný produkt sa suspenduje v bežnom konzervačnom roztoku, ako AS-3, kde konzervačný roztok ďalej obsahuje L-kamitín alebo jeho alkanoyl derivát, v koncentrácii 0,25 až 50 mM, alebo vyššej. Objav je založený na poznaní, že väčšina rozkladov krvných produktov, bežne spojená s poklesom hladín ATP a hodnoty pH, môže byť v skutočnosti označená ako poškodenie membrány a hemolýza. Intenzívnym výskumom sa zistilo, že zachovanie membrány a jej oprava môže byť účinná cez recykláciu lipidov, čiastočne pôsobením L-kamitínu, ktorého nereverzibilné vychytávanie je prítomné v červených krvinkách a podobných krvných produktoch. Pôvodca tiež zistil, že L-kamitín potláča rast baktérií v celej krvi a v krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas. Pôvodca ďalej zistil, že L-kamitín znižuje glykolýzu v celej krvi a krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, najmä v krvných doštičkách s redukovanými leukocytmi pred skladovaním, a derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Tento vynález používa L-kamitín a jeho alkanoyl deriváty ako látku podporujúcu celistvosť bunkovej membrány a na potlačenie hemolýzy v krvných výrobkoch. Tento vynález tiež poskytuje spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi a krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a v derivátoch plazmy. Predložený vynález ďalej poskytuje spôsob na zníženie glykolýzy v celej krvi a krvných frakciách vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a v krvných derivátoch.

Vhodné alkanoyl L-kamitíny sú C₂-8-alkanoyl L-kamitíny a výhodne sú to alkanoyl L-kamitíny ako acetyl, butyryl, izobutyryl, valeryl, izovaleryl a predovšetkým propionyl L-kamitín. Tu sa používa generická rodina označená ako L-kamitíny, ale namiesto L-kamitínu a jeho farmakologicky prijateľných solí sa môžu použiť alkanoyl L-kamitíny.

Vhodné soli L-kamitínu sú napríklad L-kamitín chlorid, L-kamitín bromid, L-kamitín bromid, L-kamitín orotát, L-kamitín kyseliny aspartátovej, L-kamitín kyseliny fosforečnej, L-kamitín fumarát, L-kamitín laktát, L-kamitín maleát, L-kamitín kyseliny maleínovej, L-kamitín kyseliny šťaveľovej, L-kamitín kyseliny sírovej, L-kamitín glukózo fosfát, L-kamitín vínanu, L-kamitín kyseliny vínnej a L-kamitín kyseliny slížovej.

Vhodné soli alkanoyl L-kamitínu sú napríklad C₂.₈-alkanoyl L-kamitín chloridy, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín bromidy, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín orotáty, C₂.₈-alkanoyl L-kamitíny kyseliny aspartátovej, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín fosforečnany, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín fumaráty, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín mliečnany, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín maleínany, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín šťaveľany, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín sírany, C₂_8-alkanoyl L-kamitín glukózo fosforečenanov, C₂.₈-alkanoyl L-kamitíny kyseliny vínnej, C₂.₈-alkanoyl L-kamitín vínany a C₂.₈-alkanoyl L-kamitíny slizanov.

Pridanie L-kamitínu k celej krvi alebo krvným frakciám vrátane červených krviniek, bielych krviniek, krvných doštičiek, plazmy, a derivátov plazmy, si vyžaduje prítomnosť L-kamitínu v množstve účinnom na zachovanie celistvosti membrány, na potlačenie hemolýzy a/alebo na potlačenie rastu baktérií a/alebo na zníženie glykolýzy. Výskum vrátane príkladov uvedených ďalej ukázal, že minimálny účinný rozsah vo výrobkoch od väčšiny darcov je 0,25 mM až 0,5 mM. Horný limit je viac praktický ako fyziologický. Koncentrácie vyššie ako 50 mM sú dobre tolerované. Toxikologické a osmologické hodnoty sú prijateľné. Výhodné rozsahy sú 1 až 30 mM. Rozsah 1 až 10 mM a viac je výhodnejší v rozsahu 4 až 6 mM. Účinky predloženého vynálezu vrátane predĺženia životaschopnosti a predĺženia cirkulačného polčasu po transfúzii, môže byť závislý od darcu. Vo všeobecnosti účinná koncentrácia L-kamitínu je 0,5 až 50 mM, ale odborníci môžu požadovať rozšírenie tohto rozsahu v oboch smeroch, v závislosti od jednotlivých darcov. Takéto rozšírenie si však nevyžaduje vynálezcovský krok.

L-karnitín je konzistentný v podporných roztokoch (stabilizačné roztoky), ktoré majú pufrovací účinok. Bežne sa používajú roztoky ako ACED (kyselina citrónová-citran sodný-dextróza), CPD (citrát-fosforečnandextróza) a ich modifikácie vrátane CPD2/A-3 a podobné zmesi. Typicky zmesi obsahujú uhľovodík, ako je glukóza alebo manitol, a najmenej jednu fosforečnanovú soľ a prípadne iné soli. L-kamitín je bežne rozpustný a môže sa pridať k týmto zmesiam v rozsahu požadovaných koncentrácií. Vhodné roztoky sú opísané v patente U.S. 5 496 821, ktorý je tu zahrnutý ako odkaz. Je potrebné poznamenať, že iné podporné roztoky, ako sa bežne používajú vrátane umelej plazmy a iných fyziologicky prijateľných roztokov, sa môžu použiť spolu s L-kamitínom podľa vynálezu. Dôležitou zložkou podporného roztoku je L-kamitín.

Schopnosť L-kamitínu po pridaní k celej krvi alebo k suspenzii krvných frakcií, ako sú červené krvinky, biele krvinky a krvné doštičky, plazma a deriváty plazmy, predlžuje čas životnosti počas skladovania a cirkulačný čas po transfúzii príjemcovi, čo je nasledovne doložené v in vitro a in vivo pokusoch. V pokusoch sa použil L-kamitín, môžu sa však použiť aj alkanoyl L-kamitíny. Zvlášť vhodný je dôkaz uvedený neskôr, o zlepšenom účinku v zmysle zlepšeného zachovania (vrátane opravy) bunkovej membrány a potlačenia hemolýzy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Životnosť po infúzii 42 dní skladovaných červených krviniek v štandardných podmienkach (kontrola) a po uskladnení v prítomnosti L-kamitínu. Šípky označujú hodnoty priemere ± SD pre kontrolné červené krvinky a červené krvinky skladované v prítomnosti L-kamitínu. Hore na grafe sú zaznamenané presné, vypočítané hodnoty p.

Obrázok 2: Obsah kamitínu v červených krvinkách v rôznych týždňoch skladovania krvi. Kamitín bol stanovený tak, ako je opísané v časti „Materiál a metódy“. Hodnoty sú priemerom z troch pokusov uskutočnených v duplikátoch. Odchýlka medzi pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú zmeny pre červené krvinky skladované so samotným AS-3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované v AS-3 plus L-kamitín (5 mM).

Obrázok 3: Inkorporácia rádioaktívnej kyseliny palmitovej do červených krviniek L-kamitínu počas týždňov skladovania krvi. Časť červených krviniek z krvi skladovanej v AS-3 alebo v AS-3 plus L-kamitín sa inkubovala pri 37 °C s (1-¹⁴C) kyselinou palmitovou, ktorá bola naviazaná na BSA bez mastných kyselín. Na konci inkubácie sa červené krvinky spracovali tak, ako je opísané v časti „Materiál a metódy“. Tvorba rádioaktívneho PLC sa hodnotila ako obsah fosforu prítomného v extrakte lipidov. Hodnoty sú priemernou hodnotou z troch pokusov, ktoré sa uskutočnili v duplikátoch. Odchýlka medzí pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované so samotným AS-3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované v AS-3 plus L-kamitín (5 mM).

Obr. 4: Inkorporácia rádioaktívnej kyseliny palmitovej do fosfatidyletanolamínu (PE) a fosfatidylcholínu (PC) v membránach červených krviniek v rôznych týždňoch skladovania krvi. Časť červených krviniek z krvi skladovanej v AS-3 alebo v AS-3 plus L-kamitín sa inkubovala pri 37 °C s (1-¹⁴C) kyselinou palmitovou naviazanou na BSA bez mastných kyselín. Na konci inkubácie sa červené krvinky spracovali tak, ako je opísané v časti „Materiál a metódy“. Výsledky sú vyjadrené ako pmol (1 -¹⁴C) kyseliny palmitovej/pg lipidového fosforu prítomného v lipidovom extrakte. Hodnoty sú priemerom troch pokusov uskutočnených v duplikátoch. Odchýlka medzi pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované so samotným AS-3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované v AS-3 plus L-kamitín (5 mM).

Obr. 5a a obr. 5b: Kamitínový systém a reakcia reacylácie membránových fosfolipidov. Tenšie šípky predstavujú prednostný tok acylu. Plocha acylkamitínového symbolu ukazuje pravdepodobnú veľkosť zásoby. Použité sú skratky: LPL - lyzofosfolipidy; PLP - fosfolipidy; Cn - kamitín; acyl-Cn - acylkamitín; ACS - acyl-CoA syntetáza; LAT - lyzofosfolipid acyl Co A transferáza; CPT - kamitín palmytoyltransferáza.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Štúdia I:

In vivo a in vitro hodnotenie kvality červených krviniek skladovaných s L-kamitínom alebo bez neho

Subjekty - Populáciu subjektov tvorili muži alebo ženy vo veku 18 až 65 rokov bez známych mentálnych alebo fyzických porúch, bez užívania liekov, ktoré môžu pôsobiť na životaschopnosť červených krviniek. Jednotlivci spĺňali konvenčné kritériá pre alogénnych darcov podľa Kódexu Federálneho registra, kapitola 2, Štandardy americkej asociácie krvných bánk a Príkazov amerického národného červeného kríža pre krvné služby. Štúdia bola schválená Komisiou lekárskej fakulty Hampton Roads a jednotlivci vyjadrili súhlas s účasťou v štúdii.

Každý darca daroval krv dvakrát, druhý odber bol po 72 dňoch od prvého odberu. Pri prvom darovaní boli odbery z ramena náhodne označené buď ako skúšobné alebo kontrolné vzorky.

Systém skladovania krvi - Použil sa štandardný systém CP2D/AS-3 (Miles, Inc.) s použitím polyvinylchloridového plastu (PVC) s dietyl-n-hexylftalátom (DEHP) ako zmäkčovadia. Do každej testovanej jednotky obsahujúcej AS-3 adičný roztok sa pridalo 245 mg L-kamitínu (v 1,1 ml čistom, apyrogénnom roztoku do sterilnej sklenenej fľaše), výsledná koncentrácia L-kamitínu bola 5 mM. Do kontrolných jednotiek obsahujúcich AS-3 roztok sa za rovnakých podmienok pridalo 1,1 ml 0,9 % NaCl. Pridanie L-kamitínu alebo soľného roztoku sa uskutočnilo injekčné pomocou striekačky. Toto pridanie sa uskutočnilo v laminámom boxe a pri UV ožiarení.

Odber a spracovanie - Použila sa štandamá flebotómia a odber približne 450 ± 50 ml celej krvi. Celá krv sa pred spracovaním uskladnila na 4 až 8 hodín pri izbovej teplote. Potom sa krv odstreďovala za štandardných podmienok, po odstreďovaní sa supemantant plazmy odsal a sediment zhluknutých červených krviniek sa resuspendoval buď v štandardnom roztoku AS-3 (kontrola), alebo v roztoku AS-3 s obsahom L-kamitínu (skúška). Suspendované jednotky červených krviniek sa skladovali pri teplote 4 °C počas 42 dní.

In vivo merania - Merania sa uskutočnili pred (deň 0) a po 42 dňoch skladovania vzoriek. Hodnotil sa obsah ATP v červených krvinkách; celkový hemoglobín a hemoglobín v supematante; hematokrit (Het); počet červených krviniek, bielych krviniek a krvných doštičiek; osmotické vlastnosti červených krviniek; morfológia červených krviniek; hladiny laktátu a glukózy; koncentrácia draslíka v supematante. Tieto analýzy sa uskutočnili podľa štandardných postupov opísaných v minulosti, Heaton a kol., Vox Sang 57, 37 - 42, (1989).

In vivo merania po transfúzii - Po 42 dňoch skladovania sa odobrala vzorka a skladované bunky sa označili Cr štandardnou metódou. Súčasne na stanovenie hmotnosti červených krviniek, s odobrala krv darcu a červené krvinky sa označili s 99 Tc. Po označení sa zmiešalo s 15 pCi ^5lCr označených skladovaných buniek s 15 pCi Tc-označenými čerstvými bunkami a tieto sa zmiešali a infundovali. Po infúzii sa odoberali vzorky krvi (5 ml) v rôznych časových intervaloch až do 35 dní, čo umožnilo vypočítať 24 hodinové % zotavenie a prežívanie. 24-hodinové % zotavenie sa stanovilo buď metódou jedného značenia, keď sa použila metóda log-lineámej regresie rádioaktivity vzoriek odobratých v 5, 7,5, 10 a 15 minúte, čím sa určila hodnota pre čas 0. Metóda dvojitého značenia hodnotí hmotnosť červených krviniek darcu ⁹⁹Tc.

Životnosť infundovaných a prežívajúcich červených krviniek označených Cr v krvnom obehu sa stanovila odobratím vzoriek krvi po 24 hodinách a potom dvakrát týždenne počas 5 týždňov. Hodnoty rádioaktivity sa upravili pre konštantný 1 % pokles denne. Hodnoty sa vyniesli do lineárnej krivky, kde os x predstavuje dni po transfúzii a na osi y boli hodnoty upravených Cr impulzov. Životnosť červených krviniek predstavoval priesečník s osou x.

Štatistická analýza - Hodnoty sa spracovali párovým t-testom, alebo bežnou neparametrickou štatistickou analýzou. Hodnotenie in vitro a in vivo skúšok poukázať na prítomnosť štatisticky významných rozdielov v priemeroch medzi kontrolami a testovanými skupinami. Štatisticky významný rozdiel sa vyjadril hodnotou p < 0,05.

Štúdia II

Vychytávanie L-kamitínu červenými krvinkami a štúdie reacylácie lipidov pri skladovaní do 42 dní

Chemikálie - Hovädzí sérový albumín (BSA) bez esenciálnych mastných kyselín bol od SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo (USA). [1-^I4C] kyselina palmitová (58 Ci/mol) bola z New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Platne s tenkou vrstvou Whatman LK6 (silikagél) (20 x 20 cm) s preabsorpčnou vrstvou bola od Carlo Erba, Miláno (Taliansko). Palmitoyl-L-kamitín (PLC) a L-kamitín boli darom od Sigma Tau, Pomezia (Taliansko). Všetky ostatné chemikálie boli čistoty pre reakčné činidlo.

Stanovenie kamitínu v červených krvinkách - Z uskladnených jednotiek koncentrátu červených krviniek sa odobrali vzorky, ktoré sa jedenkrát premyli 4 objemami studeného roztoku 0,9 % NaCl. Červené krvinky sa potom resuspendovali v 0,9 % roztoku NaCl, výsledný hematokrit bol 50 %, a pridaním kyseliny perchlórovej sa bunky deproteinizovali tak, ako je opísané v Cooper a kol., Biochem. Biophys. Acta 959: 100 - 105 (1988). Vo výslednom extrakte sa analyzoval obsah voľného L-kamitinu podľa rádiochemickej metódy autorov Pace a kol. Clin. Chem. 24: 32-35 (1978).

Analýza reaclácie lipidových komplexov v membránach skladovaných červených krviniek - Z koncentrátoch skladovaných červených krviniek sa odobrali vzorky a okamžite sa spracovali. Analýza sa uskutočnila v laminámom boxe pod UV žiarením a pri teplote 0 až 5 °C. Červené krvinky sa premyli dvakrát so 4 objemami studeného roztoku 0,9 % NaCl. Izolované červené krvinky sa ešte raz premyli inkubačným pufrom (NaCl 120 mM, KC1 5 mM, MgSO₄ 1 mM, NaH₂PO₄ 1 mM, sacharóza 40 mM, glukóza 5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH = 7,4) a resuspendovali v rovnakom pufri tak, aby výsledný hematokrit bol 5 %. Na inkubácie sa použil kúpeľ s teplotou 37 °C a s rotačným pohybom. Červené krvinky sa inkubovali s rádioaktívne označenou kyselinou palmitovou (10 μΜ) naviazanou na BSA bez mastných kyselín (1,65 mg/ml). Inkubácia sa ukončila pridaním chladného inkubačného média, potom sa bunky premyli trikrát inkubačným médium s 1 % BSA a nakoniec opäť s inkubačným roztokom. Lipidy červených krviniek sa extrahovali z intaktných buniek postupom podľa Rose a Oaklander, J. Lipid Res. 6: 428-431 (1965). Na zabránenie oxidácie lipidov sa do lipidových extraktov pridal 0,1 % butylovaný hydroxytoluén. Lipidový extrakt sa analyzoval na obsah fosforu dvojrozmernou tenkovrstvovou chromatografiou. Chromatogramy sa rozdelili v prvom smere pomocou zmesi chlóroform-metanol-28 % amoniak (65 : 25 : 5). Pri rozdelení v druhom smere sa použila zmes chlóroform-acetón-metanol-kyselina octová-voda (6 : 8 : 2 : 2 : 1). Fosfatidylcholín (PC), fosfatidyl-etanolamin (PE) a fosfatidylserín (PS) sa zviditeľnili krátkou expozíciou platní jódom a tieto sa identifikovali pomocou štandardných vzoriek. Jednotlivé fosfolipidové škvrny sa vyškrabali do nádobiek obsahujúcich scintilačný roztok a merala sa rádioaktivita. Identifikácia a analýza rádioaktívnych palmitoyl L-kamitínov (PLC) sa uskutočnila podľa nedávno publikovanej metódy autorov Arduiny a kol., J. Biol. Chem. 267: 12673-81 (1992). Pri meraní rádioaktivity sa použila externá štandarda. Pri výpočte sa použila hodnota špecifickej aktivity rádioaktívnej kyseliny palmitovej.

Výsledky Štúdia I

Vlastnosti koncentrátu červených krviniek pred uskladnením v AS-3

Po spracovaní celej krvi sa vlastnosti koncentrátov červených krviniek podľa očakávania. Nepozorovali sa žiadne významné rozdiely medzi jednotkami pre kontrolné a testované vzorky v objeme, Het, v obsahu bielych krviniek a in vivo vlastnostiach červených krviniek, ako je obsah ATP, obsah hemoglobínu v supernatante, koncentrácia draslíka, osmotická fragilita (tabuľka 1)

Tabuľka 1

Vlastnosti koncentrátu červených krviniek pred uskladnením

	Kontroly	L-kamitín
Objem (ml)	305 ±38	295 ±41
Hematokrit (%)	60 ±3	60 ±3
Biele krvinky (x 10⁹)	2,6 ± 1,1	2,4 ± 1,1
ATP (pmol/g Hb)	4,6 ± 0,2	4,3 ± 0,4
Hb v supematante (mg/dl)	34 ± 15	26 ± 0,3
K⁺ v supemantante )mEkq/l)	2,3 ± 0,2	2,2 ± 0,3
Osmotícká fragilita (%)	50±4	49 ±4

Vlastnosti červených krviniek po 42 dňovom skladovaní

Metabolické štúdie - Množstvo zmetabolizovanej glukózy a vytvoreného laktátu počas 42 dní skladovania bolo rovnaké v kontrolných a aj v testovaných jednotkách (tabuľka 2). Podľa očakávania sa zistila významná obrátená korelácia medzi týmito dvoma hodnotami glykolýzy (r = 0,76). Ale nižšia hemolýza a vyššie koncentrácie ATP sa zistili v koncentrátoch červených krviniek skladovaných v prítomnosti kamitínu ako pri kontrolných jednotkách. Ako ukazuje obrázok 1, takáto vyššia hodnota ATP sa pozorovala vo všetkých testovaných vzorkách s výnimkou jednej vzorky (p < 0,01).

	Kontrola	L-kamitín
Hodnoty in vitro	208 ± 33	193 ±40
Glukóza (mg/dl)	201 ±27	199 ±37
Laktát (mg/dl)	6,33 ± 0,03	6,32 ± 0,04
PH	3,01 ± 0,42	3,24 ± 0,38*
ATP (pmol/g Hb)	0,47 ± 0,41	0,30 ± 0,22*
Hemolýza (%)	61 ±4	60 ±3
Supematant K⁺ (mEkq/1)	51 ±3	50 ±4
Morfológia	69 ±8	68 ± 15
Hodnoty in vivo
24 h % zotavenia (jedno značenie)	81,1 ±6,2	84,0 ± 4,4
24 h % zotavenia (dvojité značenie)	80,1 ±6,0	83, 9 ± 5,0’
Hmotnosť červených krviniek (ml)	1634 ±510	1591 ±534
Prežívanie (dni)	85,9 ± 14,3	96,1 ± 11,2’

*(p<0,5)

Membrány - Na konci skladovania bolo percento hemolýzy nižšie v jednotkách s prítomným kamitínom tak, ako ukazuje obrázok 2. Na druhej strane sa však nezistili významné rozdiely v koncentrácii draslíka v supematante, v osmotickej odpovedi na šok a v morfológii, ktorých hodnoty boli na konci 42 dňového skladovania v očakávanom rozsahu.

Životaschopnosť po transfúzii - Priemerné 24-hodinové % zotavenia pre kontrolné jednotky bolo rovnaké, ako sa zistilo v minulosti pôvodcami aj inými výskumníkmi, ale priemerné % zotavenie pre červené krvinky skladované v prítomnosti kamitínu bolo vyššie ako pri kontrolných červených krvinkách (p < 0,05). Okrem toho, priemerná životnosť skladovaných červených krviniek v cirkulácii bola tiež vyššia v bunkách skladovaných v prítomnosti kamitínu (obrázok 1). Stanovená hmotnosť koncentrátu červených krviniek darcov bola veľmi podobná (r = 0,98) a nebola štatisticky rozdielna.

Korelačné štúdie - Ako sa očakávalo, 24-h % zotavenia vykazovalo významné korelácie s hladinami ATP (r = 0,63) a inými hodnotami pre membránovú integritu červených krviniek, ako je hemolýza (r = 0,57), osmotická fragilita (r = 0,71), morfológia (r = 0,59). Percento hemolýzy vysoko korelovalo s hladinami ATP (r = 0,83) a tiež s obsahom bielych krviniek v jednotkách červených krviniek (r = 0,83). Životnosť červených krviniek v cirkulácii ukázala, že táto nekorelovala so žiadnymi in vitro hodnotami.

Štúdia II

Vychytávanie kamtitínu do skladovaných červených krviniek

Červené krvinky skladované v samotnom AS-3 médiu nevykazovali žiaden významný pokles obsahu L-kamitínu počas skladovania (obrázok 2). Tieto nálezy sú v súhlase so zisteniami Cooper a kol., že ľudské červené krvinky si voľne nevymieňajú L-kamitín s plazmou alebo izoosmotickým pufŕom. Keď sa červené krvinky skladovali v AS-3 médiu obohatenom o L-kamitín, zistilo sa vyššie množstvo L-kamitínu v červených krvinkách ako pri bunkách skladovaných len v samotnom AS-3 médiu (obrázok 2). Obsah L-kami tmu lineárne narastal v závislosti od doby skladovania a dosiahlo štvornásobné zvýšenie pod 42 dňoch skladovania.

Štúdie reacylácie lipidových komplexov v membránach skladovaných červených krviniek

Bez kamitínu klesala inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do palmytoyl L-kamitínu (PLC) lineárne s dobou skladovania (obrázok 3). Naproti tomu červené krvinky skladované v AS-3 roztoku s prítomným L-kamitínom vykazovali začiatočné zvýšenie (s dosiahnutím plató po troch týždňoch), po ktorom nastal rýchly pokles inkorporácie rádioaktívneho palmitátu do PLC. V tých istých vzorkách červených krviniek sa tiež hodnotila inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránových fosfolipidov. Inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidyletanolamínu červených krviniek skladovaných len v samotnom AS-3 médiu vykazovala konštantný významný vzostup inkorporácie počas skladovacieho obdobia (obrázok

4). Červené krvinky skladované v prítomnosti L-kamitínu charakterizoval náhly vzostup recyklácie fosfatidyletanolamínu ku koncu skladovania, keď sa plató dosiahlo v šiestom týždni (obrázok 4). Inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidylcholínu mierne klesala v priebehu skladovania a nezistili sa žiadne rozdiely medzi kontrolnými a testovanými jednotkami (obrázok 4). Má sa zdôrazniť, že v recyklačných štúdiách pôvodcu sa červené krvinky inkubovali pri 37 °C v Krebsovom-Ringerovom pufri s obsahom glukózy a obsah ATP na konci inkubácie bol takmer na úrovni fyziologických hodnôt (hodnoty nie sú uvedené).

Diskusia

V tejto štúdii in vitro a in vivo hodnotenie koncentrátov červených krviniek po 42 dňoch skladovania ukázalo významné rozdiely medzi červenými krvinkami skladovanými v prítomnosti L-kamitínu a kontrolnými bunkami. Rôzne in vitro vlastnosti červených krviniek hodnotiace metabolickú a membránovú integritu, ako sú ATP a % hemolýzy, rovnako ako aj priame meranie životaschopnosti buniek (24-h zotavenie a životnosť v cirkulácii) boli významne vyššie pre červené krvinky skladované v prítomnosti kamitínu. Zaujímavé je predĺženie priemernej životnosti prežívajúcich červených krviniek v cirkulácii 24 hodín po infúzii. Tento nález sa môže vzťahovať na nereverzibilné vychytávanie L-kamitínu počas skladovania, je to neočakávaný objav, ktorý dosiaľ nebol pozorovaný. Hodnoty rôznych vlastností kontrolných červených krviniek boli podľa očakávania a nelíšili sa od predchádzajúcich štúdií. Po odbere krvi neboli prítomné rozdiely vo vlastnostiach červených krviniek určených ako kontrolné alebo testované vzorky. Ako ukazujú obrázky 1 až 3, hladiny ATP v červených krvinkách, % hemolýzy a životnosť v cirkulácii boli veľmi závislé od darcu, a hoci štúdia bola náhodná, päť kontrolných a päť testovaných štúdií uskutočnené pri prvom a druhom odbere, je nepravdepodobné, že pozorované zmeny môžu byť výsledkom náhody alebo zlého plánu pokusu. Je preto veľmi pravdepodobné, že pozorované zmeny v tejto štúdii sa prispôsobili pridaním kamitínu k testovaným jednotkám. Nie je možné vylúčiť možnosť, že predĺžená životnosť odzrkadľuje pokles vylúčenia Cr, ale nie je v súhlase so zlepšenými in vitro hodnotami skladovaných červených krviniek, čo sa zistilo, že koreluje s in vivo životaschopnosťou.

Mnohé štúdie zistili, že L-kamitín a jeho acetylestery majú cytoprotektívny účinok a stabilizujú membrány v rôznych bunkách vrátane červených krviniek. Pozri napríklad Snyder a kol., Árch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). V tejto štúdii sa zistilo, že L-kamitín je ireverzibilné vychytávaný červenými krvinkami počas skladovania. Hoci charakter tohto procesu nie je úplne známy, je potrebné vylúčiť účasť špecifických nosičov na vychytávanie L-kamitínu. Podľa skúseností pôvodcov jediný známy nosič L-kamitínu pôsobí v bunkových systémoch, kde intraceluláma koncentrácia L-kamitínu je niekoľkonásobne vyššia, ako je jeho normálna koncentrácia v extracelulámom priestore. Koncentrácia L-kamitínu v červených krvinkách je rovnaká ako v plazme. Takže bez ohľadu na nízku teplotu, pokles ATP a iné možné metabolické zmeny počas skladovania, keď červené krvinky sa skladujú v médiu s obsahom relatívne vysokých množstiev exogénneho L-kamitínu týmito bunkami. V odbore neexistujú dôkazy o existencii takéhoto procesu.

Charakter pôsobenia L-kamitínu na skladované červené krvinky sa môže vysvetliť na úrovni biofyzikálneho a/alebo metabolického účinku na membránu. Prežívanie skladových červených krviniek po transfúzii závisí od integrity membrány, čo vyplýva z významnej korelácie medzi in vivo životaschopnosťou reinfundovaných červených krviniek a ich pomerom povrch : objem. Hlavnou zložkou prispievajúcou k štruktúre a funkcii membrány červených krviniek. Wolf a kol. v prehľadnej štúdii o zložení a funkcii proteínov membránového cetoskeletonu v skladovaných červených krvinkách zistili, že len jedinou zmesou sa znížila schopnosť spektrínu viazať sa s aktínom či už v prítomnosti, alebo neprítomnosti proteínu 4.1. Wolfe a kol., J. Clin. Invest. 78: 1681-1686 (1986). Ukázalo sa, že L-kamitín ovplyvňuje deformovateľnosť membrány červených krviniek na úrovni proteínu 4.1. Ardurini a kol., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Takže L-kamitín môže vykazovať stabilizačný účinok na membránu cez ovplyvnenie interakcie spektrínu s jednou alebo viacerými zložkami cytoskeletonu. Nedávna štúdia Butterrfielda a Rangachari, Life Sci. 52: 297-303 (1992) zistila pomocou elektrónovej paramagnetickej rezonancie zameranej na interakciu spetrín-aktín v červených krvinkách, že L-kamitín významne znižuje pohyb segmentov spin-označených sond v spektríne. Tieto výsledky potvrdili predchádzajúce predpoklady o účasti L-kamitínu pri spevnení interakcie medzi spektrínom a aktínom, Aurduini a kol.

Okrem možného biofyzikálneho účinku opísaného skôr, zlepšenia pozorované pri červených krvinkách skladovaných v prítomnosti L-kamitínu môžu byť tiež výsledkom výhodného metabolického procesu. Normálne si deacylačno-reacylačný proces v membránových fosfolipidoch vyžaduje ATP na tvorbu acyl-CoA. Acylový podiel z acyl-CoA sa potom preniesol do lyzofosfolipidov pôsobením lyzofosfolipid acyl-CoA transferázy. Okrem toho, počas oxidácie, oprava fosfolipidov v červených krvinkách používa rovnaké metabolické cesty. Nedávne pozorovania ukázali, že CPT ovplyvňuje reacyláciu membránových fosfolipidov v červených krvinkách a neurónoch tým, že moduluje veľkosť acyl-CoA poolu na úrovni kroku aktivácie mastnej kyseliny a jej prenosu do lyzofosfolipidov. Arduini a kol., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Okrem toho „pulse-chace“ pokusy a štúdie zamerané na depléciu ATP ukázali, že acylkamitínový zásobník červených krviniek je rezervoárom aktivovaných acylových skupín, bez účasti ATP. Arduini a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994).

Zvýšenie inkorporácie rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidyletanolamínu (PE) červených krviniek skladovaných v samotnom AS-3 predpokladá, že dlhodobé skladovanie (s progresívnou depléciou ATP v červených krvinkách) spôsobuje zvýšenú spotrebu aktívnych acylových jednotiek na reacyláciu membránových fosfolipidov (obrázok 4). Zdá sa, že počas prvých piatich týždňov skladovania červené krvinky skladované v AS-3 médiu bez L-kamitínu inkorporujú viac palmitátu do PE ako červené krvinky skladované v AS-3 médiu s pridaným L-kamitínom (obrázok 4). Červené krvinky skladované v prítomnosti L-kamitínu boli schopné inkorporovať viac palmitátu do PE na konci skladovania. Toto zistenie môže predpokladať prítomnosť účinnej oxidácie, pretože vystavenie červených krviniek oxidačnému činidlu veľmi stimuluje reacyláciu membránového PE, ale nie membránového PC. Dise a kol., Biochem, Biophys. Acta 859: 6978 (1986). Je zaujímavé, že počas prvých piatich týždňov skladovania, červené krvinky uskladnené v samotnom AS-3 médiu inkorporujú viac palmitátu do PE ako červené krvinky skladované v AS-3 roztoku + L-kamitín (obrázok 4). Tieto zistenia predpokladajú, že v prípade kamitínu, CPT môže súťažiť s reacylačným enzýmom o využitie acyl-CoA. V súhlase s touto koncenpciou sa však mal pozorovať oveľa väčší rozdiel na konci skladovania, keď požiadavka na acyl-CoA na reacyláciu je najvyššia. Nebola to však pravda, červené krvinky skladované s L-kamitínom alebo bez neho vykazovali rovnakú rýchlosť inkorporácie na konci skladovania (obrázok 4). Okrem toho sa ukázalo, že CPT červených krviniek, v mnohých rôznych pokusných podmienkach, nesúťaží s reacyláciou membránových fosfolipidov. Arduini a kol., Life Chem. Rep. 12: 49-54 (1994).

Tvorba rádioaktívneho palmitoyl L-kamitínov (PLC) v červených krvinkách suplementovaných L-kamitínom je vyššia ako v tých červených krvinkách, ktoré boli skladované v neprítomnosti L-kamitínu (obrázok 3). Časová závislosť tvorby PLC v červených krvinkách skladovaných v prítomnosti L-kamitínu ukázala zaujímavú krivku zvonovitého tvaru s vrcholom v treťom týždni skladovania. Tvorba rádioaktívneho PLC odzrkadľuje veľkosť zásobníka rádioaktívne neoznačeného acylkamitínu s dlhoreťazcovitými mastnými kyselinami a smer CPT-sprostredkovaného toku acylu do intaktných červených krviniek. Počas prvých troch týždňov skladovania pri relatívne vysokej glykolytickej aktivite a dostupnosti ATP, sa zdá, že CPT smeruje tok acylov smerom k acylkamitínu v červených krvinkách skladovaných v prítomnosti L-kamitínu (obrázok 5a). Po treťom týždni skladovania sa v prítomnosti L-kamitínu obracia smer toku. Tieto zmeny môžu odzrkadľovať schopnosť CPT pufrovať aktívne acyl-jednotky: zvýšená požiadavka acyl-CoA na reacyláciu vedie k nižšej tvorbe PLC a naopak, a môže predstavovať mechanizmus, v ktorom CPT pufruje zvýšenú požiadavku na acylové jednotky na reacyláciu (obrázok 5b).

Vyššie 24-hodinové % zotavenia a životnosť v cirkulácii znamená zlepšenie približne o 15 % v zmysle účinku (množstvo infudovaných cirkulujúcich červených krviniek podaných príjemcovi krát priemerná životnosť). Toto zvýšenie účinnosti sa môže klinicky prejaviť v znížení počtu transfúzií u pacientov vyžadujúcich chronické transfúzie, napríklad pri ochorení na tasémiu alebo poškodenie kostnej drene. Na druhej strane je však možné predĺžiť čas skladovania červených krviniek v roztoku.

Zistenia pôvodcov predpokladajú, že prítomnosť L-kamitínu v ochrannom médiu počas skladovania červených krviniek môže mať ochranný účinok na zásobník ATP, ktorý sa využíva pri reacylácii fosfolipidov na opravu membrány. Tento výhodný metabolický pochod, spojený s možným benefičným biofyzikálnym účinkom, môže vysvetľovať zníženie hemolýzy, vyššie hodnoty ATP a zlepšenie in vivo zotavenia a prežívanie červených krviniek skladovaných v prítomnosti L-kamitínu.

Ožiarenie

Problém kontaminácie krvných výrobkov vrátane celej krvi, červených krviniek, koncentrátu červených krviniek, krvných doštičiek a podobne, môže byť znížený pôsobením žiarenia. Intenzívnym štúdiom sa zistilo množstvo potrebného ožiarenia na sterilizáciu a 100 % usmrtenie mikróbov. Veľmi dôležitou je skutočnosťou, že podobné ožiarenie poškodzuje biele krvinky. Môžu sa použiť rôzne typy ožiarenia vrátane gama žia

SK 287562 Β6 renia (Kobalt GG, Van de Graf urýchlovač), UV ožiarenie, infračervené žiarenie atď. Dostatočným je ožiarenie v rozsahu 20 až 50 cG.

Ročne sa vo svete uskutoční asi 60 až 80 miliónov odberov krvi, ktoré sa použijú na transfúzie u rôznych populácií pacientov. V menej rozvinutých krajinách odber krvi na 1 000 obyvateľov je nižší a krvné transfúzie sú použité v pôrodníctve a pediatrii, predovšetkým u pacientov s anémiou vyvolanou maláriou. V rozvinutých krajinách počet odberov na 1 000 obyvateľov je 50- až 100-krát vyšší a väčšina transfúzií je použitá pri chirurgických zásahoch (50 %), alebo na liečenie amerických pacientov na podklade rakoviny, pri transplantácii kostnej drene, pri nenádorovom krvácaní gastrointestinálneho traktu (obrázok 1). Existuje veľa možných škodlivých účinkov pri transfúzii alogénnej krvi. Jednou takouto komplikáciou pri krvnej transfúzii je zriedkavá a nezvyčajne smrteľná entita, známa ako potransfuzna reakcia „štep proti príijemcovi“ (TAGVHD), komplikácia spôsobená živými alogénnymi imunocytmi.

TA-GVHD ochorenie je zriedkavá komplikácia po infúzii krvi, ktorá sa vyskytuje u dvoch typov populácie pacientov - príjemcov krvnej transfúzie. TA-GVHD má mortalitu približujúcu sa k 100 % a v súčasnosti je jediným účinným prístupom len prevencia. Po prvé, u pacientov s oslabeným imunitným systémom, ako sú pacienti po transplantácii kostnej drene alebo iných orgánov, pacienti chorí na Hodkinsonovu chorobu alebo dedičnú nedostatočnosť imunitného systému. Po druhé, u pacientov s oslabeným imunitným systémom, keď je prítomná HLA podobnosť medzi darcom a príjemcom. Toto sa často stáva pri priamom darcovstve od blízkych príbuzných alebo u populácie s obmedzenejším HLA polymorfizmom , ako v Japonsku a Izraeli. Z tohto dôvodu je všeobecnou praxou ožiarenie bunkových krvných produktov gama žiarením v dávke približne 25 centigray (cG), aby sa tak zničila replikačná schopnosť živých imunocytov. Treba poznamenať, že TA-GVHD je spojená s bunkovými produktami, ktoré sú čerstvé, to znamená, všeobecne menej ako 15 dní. Ale „starnutie“ krvi nie je v súčasnosti akceptované pri predchádzaní tejto komplikácie. Imunocyty sú časťou alogénnej populácie leukocytov, stupeň odstránenia leukocytov pri použití filtrov tretej generácie nie je dostatočné, na zabránenie tejto komplikácie. Jediným prijateľným profylaktickým zásahom v súčasnosti zostáva gama ožiarenie.

Ťažkosti s gama ožiarením červených krviniek spočíva predovšetkým v tom, že môže nastať poškodenie bunkovej membrány. Je známe, že ožiarenie touto dávkou vyvoláva pokles účinnosti približne o 7 až 8 %, hodnotené in vitro poklesom obsahu ATP v červených krvinkách, zvýšenie hemolýzy a zvýšenie draslíka v supematante. Tieto zmeny charakterizujú poškodenie membrány. Tieto in vitro zmeny sú spojené so znížením 24 hodinového % zotavenia červených krviniek po gama ožiarení. Čo sa týka krvných doštičiek, jedna publikácia predpokladá určitý pokles životaschopnosti.

Pozoruhodné dôkazy naznačujú, že gama ožiarenie vykazuje účinok tak, že dochádza k tvorbe zlúčenín aktívneho kyslíka, ako je samotný kyslík, hydroxy, radikál a superoxidový anión. Tieto zlúčeniny indikujú vnútrobunkové poškodenie DNA a tak zabraňujú replikácii, čo je nevyhnutný predpoklad pre TA-GVHD. Ale tieto isté zlúčeniny kyslíka môžu oxidovať membránové lipidy červených krviniek a pravdepodobne aj lipidy v membránach krvných doštičiek, čo indukuje lézie v membránach a tak znižuje kvalitu a účinok buniek.

L-kamitín je známy tým, že má kľúčovú úlohu pri transporte mastných kyselín s dlhým reťazcom cez mitochondriálnu membránu. Dedičné poruchy kamitínového systému na úrovni transportu mastných kyselín s dlhým reťazcom sa prejavujú vo významnom poškodení funkcie kostrových svalov. Nedávno sa zvýšil záujem o úlohu L-kamitínu v membráne červených krviniek. Prekvapivé je však to, že červené krvinky nemajú mitochondrie, aleje prítomný L-kamitin a kamitín palmitoyl transferáza, enzým ktorý katalyzuje reverzibilnú acyláciu L-kamitínu. Spočiatku bolo nejasné, aké úlohy môžu mať tieto látky vnútri červených krviniek. Červené krvinky môžu byť počas svojho dlhého životného cyklu vystavené oxidačnému stresu in vivo a oprava oxidovaných membránových lipidov zahrnujúca L-kamitín môže byť dôležitá na normálne prežívanie červených krviniek.

Rýchly vzostup acylovaného kamitínu počas zvýšenia dostupnosti ATP môže pôsobiť ako zásoba aktivovaných mastných kyselín, ktoré môžu byť následne použité v opravnom mechanizme oxidáciou poškodených membránových lipidov. Takéto vysvetlenie by dobre vysvetlilo zníženú hemolýzu pozorovanú počas in vitro skladovania červených krviniek a okrem toho by vysvetlilo zlepšenie in vivo zotavenia a prežívania. Čistý účinok pridania L-kamitínu predstavuje približne 17 % zvýšenie účinnosti.

Podobne môže byť L-kamitín použitý na zrušenie alebo prevenciu lézií vyvolaných ožiarením. Spôsobí to schopnosť kamitínu uskladneného v červených krvinkách opraviť oxidované membránové lipidy in vitro.

Aby sa obmedzila náchylnosť krvných produktov (červených krviniek, krvných doštičiek a podobne) na lézie v membránach a na hemolýzu, krvný produkt by mal byť najskôr suspendovaný v roztoku s obsahom L-kamitínu v koncentrácii 0,25 mM až 50 mM, čím sa dosiahne dostatočný stupeň zachovania membrány a potlačenia hemolýzy, takže zatavený produkt môže byť ožiarený na účely sterilizácie a následne môže mať predĺžený čas skladovania. Tiež po transfúzii môže mať predĺžený polčas v cirkulácii. Môže sa dosiahnuť životaschopnosť bežných hodnôt, v materiáloch takmer s istotou sterilnými a malou pravdepodobnosťou, že vyvolávajú TA-GVHD, v dôsledku ožiarenia po zatavení suspenzie krvného produktu. V tomto zmysle výraz krvný produkt možno interpretovať široko, zahrnuje celú krv, krvnú plazmu, koncentráty červených krviniek, koncentráty krvných doštičiek, zmesí a podobne.

1. Použitie L-kamitínu na potlačenie rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek s predĺženým skladovaním

Úvod - L-kamitín (LC) redukuje glykolýzu v koncentrátoch krvných doštičiek skladovaných viac ako 5 dní. (Sweeny a kol., Congress of the Intemational Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27-July

2, 1998, vo Vox Sanguinis, zv. 74, č. Suppl., str. 1226; a Sweeny a kol., The Američan Society of Hematology, 40* Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998). Dôležité je vyhodnotiť účinok LC na rast baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek a tiež či LC sa môže použiť ako aditívum.

Metódy - Zmiešali sa dva ABO identické koncentráty krvných doštičiek, pri ktorých sa pred skladovaním znížil obsah leukocytov. Koncentráty sa pripravili in-line filtráciou plazmy bohatej na krvné doštičky (MedSep Corp. Covina, CA). Zmiešané koncentráty sa potom rozdelili na dve rovnaké časti a vložili do dvoch CLX® (MedSep) sáčkov. Do jedného sáčku sa pridal LC vo výslednej koncentrácii 5 mM, do druhého sáčku sa pridal soľný roztok. V deň 0 sa do každého kontajneru pridala injekčnou ihlou na koagulázu negatívna stafylokoková suspenzia (1 ml), výsledná koncentrácia bola 1 až 48 CFU/ml. Na počítanie kolónií sa vzorky aseptický odobrali tretí deň, šiesty deň a buď siedmy alebo ôsmy deň. Výsledky sa analyzovali párovým t-testom.

Výsledky - Hodnotilo sa jedenásť párov koncentrátov. Získané výsledky zaznamenáva tabuľka uvedená neskôr. Do 7/8 dňa rast v kontajneroch s L-kamitínom vykazoval 33 % kontrolných hodnôt.

Závery - L-kamitín v koncentrácii 5 mM spomaľuje rast na koagulázu negatívnych stafylokokov v roztoku skladovaného koncentrátu krvných doštičiek.

	Pár	L-kamitín’	Kontrola’	P
Deň 0	11	1,12 ±0,7	1,12 ±0,7	N/A
Deň 3	11	3,11 ±0,7	3,04 ± 0,7	0,43
Deň 6	8	4,28 ± 1,3	3,88 ± 1,0	0,05
Deň 7/8	11	5,09 ± 1,5	4,60 ±1,5	0,002

’rast baktérií vyjadrený v log CFU/ml

II. Použitie L-kamitínu na redukciu glykolýzy počas predĺženého skladovania krvných doštičiek so zníženým obsahom leukocytov pred uskladnením

Úvod - L-kamitín redukuje glykolýzu v štandardných (bez redukovaných leukocytov) koncentrátoch krvných doštičiek počas päť až desať dní skladovania (Sweeny a kol., 25⁴ Congress of The Intemational Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27 - July 2 1998, Vox Sanguinis. zv. 74, č. Suppl. 1, str. 1226; a Sweeny a kol., The Američan Society of Hematology, 40⁴ Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, (Dec. 4-8, 1998). Podobný účinok na krvné doštičky darcov s redukovanými leukocytmi nebol doteraz zaznamenaný.

Metódy - Zmiešali sa dva identické ABO koncentráty krvných doštičiek, pri ktorých sa pred skladovaním znížil obsah leukocytov. Koncentráty sa pripravili in-line filtráciou plazmy bohatej na krvné doštičky (MedSep Corp. Covina, CA). Zmiešané koncentráty sa potom rozdelili na dve rovnaké časti a vložili do dvoch CLX® (MedSep) vrecúšok. Do jedného vrecúška sa pridal LC vo výslednej koncentrácii 5 mM, do druhého vrecúška sa pridal soľný roztok. Krvné doštičky sa skladovali buď sedem alebo osem dní pri teplote 22 °C v plochej trepačke a vzorky sa potom skúšali. Hodnotilo sa pH, počet krvných doštičiek, obsah glukózy a laktátu v supematante, prietokovou cytometriou sa merala expresia povrchového p-selektínu, rozsah zmien tvaru (ESC) a odpoveď na hypotonický šok (HSR). Spotreba glukózy a tvorba laktátu sa vyjadrila ako mM/10⁷krvných doštišiek/deň. Výsledky sa vyhodnotili párovým t-testom.

Výsledky - Hodnotilo sa sedem párov koncentrátov krvných doštičiek. Získané výsledky zaznamenáva tabuľka neskôr.

Závery - L-kamitín znižuje glykolýzu v skladovaných krvných doštičkách s redukovanými leukocytmi pred uskladnením.

	Kontrola	L-kamitín	P
pH	6,97 ± 0,2	7,09 ±0,1	<0,01
Koncentrácia glukózy	1,25 ±0,2	1,13 ±0,2	<0,01
Tvorba laktátu	1,73 ±0,3	1,50 ±0,2	<0,01
P-selektín (% pozitívne)	74 ±4	69 ±9	0,04
ESC (%)	11 ± 5	12 ±4	0,35
HSC (%)	45 ± 13	50 ±22	0,64

Vynález je v tejto patentovej prihláške opísaný generickými výrazmi a odkazmi na konkrétne príklady. Odborníkom sú známe obmeny bez účinku na podstatu vynálezu. Predovšetkým môžu byť modifikované stabilizačné kompozície, krvné produkty, ochranné látky, inhibítory a podobne. Okrem toho špecifické hladiny, trvanie životaschopnosti a polčasy v cirkulácii sa budú meniť v závislosti od darcov a príjemcov. Takéto obmeny sú súčasťou predkladaného vynálezu, keď nie sú špecificky vylúčené citovaním v nárokoch, ktoré nasledujú.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi alebo jej frakciách, ktorý tvorí pridanie do celej krvi alebo do krvných frakcií zlúčeniny vybratej zo skupiny pozostávajúcej z L-kamitínu, solí L-kamitínu, alkanoyl kamitínov, solí alkanoyl kamitínov a ich zmesí, v množstve účinnom na potlačenie rastu baktérií v uvedenej celej krvi alebo krvných frakciách.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia je vybratá zo skupiny pozostávajúcej zo zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, koncentrátov krvných doštičiek, plazmy a derivátov plazmy.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté červené krvinky, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

4. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté biele krvinky, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

5. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia je koncentrát krvných doštičiek, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

6. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia je plazma alebo derivát plazmy, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 0,25 až 50 mM.

8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 1 až 30 mM.

9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je L-kamitín.

10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo sku- piny pozostávajúcej z L-kamitínu, propionyl L-kamtitínu, butyryl L-kamitínu, izobzutyl L-kamitínu, valeryl L-kamitínu a izovaleryl L-kamitínu.

11. Spôsob redukcie glykolýzy v celej krvi alebo krvnej frakcii, pričom krvná frakcia je vybratá zo skupiny pozostávajúcej zo zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, plazmy a derivátov plazmy, vyznačujúci sa tým, že sa pridá k celej krvi alebo ku krvným frakciám zlúčenina vybratá zo skupiny pozostávajúcej z L-kamitínu, solí L-kamitínu, alkanoyl L-kamitínov, solí alkanoyl L-karnitínov a ich zmesí v množstve účinnom redukovať glykolýzu v celej krvi alebo krvnej frakcii.

12. Spôsob podľa nároku 11, v y z n a č u j ú c i sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté červené krvinky, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté biele krvinky, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia je plazma alebo derivát plazmy, ktoré sa suspendujú v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.

15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 0,25 až 50 mM.

16. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 1 až 30 mM.

17. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je L-kamitín.

18. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo skupiny pozostávajúcej z L-kamitínu, propionyl L-kamtitínu, butyryl L-kamitínu, izobzutyryl L-kamitínu, valeryl L-kamitínu a izovaleryl L-kamitínu.

19. Spôsob redukcie glykolýzy v koncentráte krvných doštičiek darcu, v ktorom boli redukované leukocyty pred uskladnením, vyznačujúci sa tým, že koncentrát krvných doštičiek sa suspenduje v podpornom roztoku, ktorý obsahuje zlúčeninu vybratú zo skupiny pozostávajúcej z L-kamitínu a solí L-karnitínu v množstve účinnom redukovať glykolýzu v uvedenom koncentráte krvných doštičiek s redukovanými leukocytmi pred uskladnením.

20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 0,25 až 50 mM.

21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v podpornom roztoku je 1 až 30 mM.

5 výkresov