MXPA01012645A - Almacenamiento y matenimiento mejorado de productos sanguineos que incluyen celulas rojas de la sangre y plaquetas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al mantenimiento de la membrana celular de las celulas rojas de la sangre y concentrados de plaquetas, mejorados por la adicion de 1 mM-10 mM de L-carnitina y derivados. Este mejoramiento permite prolongar el periodo de viabilidad de las celulas rojas de la sangre envasada y las concentraciones de plaquetas mas alla de periodos actuales. Adicionalmente, los materiales asi tratados, presentan vida media de circulacion prolongada despues de la transfusion a un paciente. Los mejoramientos en el mantenimiento de la membrana, logrados por este metodo, permiten la irradiacion de contenedores sellados de productos sanguineos, para asi, substancialmente esterilizar y destruir los leucocitos en el mismo. La adicion de L-carnitina y derivados tambien suprime el crecimiento bacteriano y reduce la glicolisis en la sangre completa y fracciones de sangre.

Description

ALMACENAMIENTO Y MANTENIMIENTO MEJORADO DE PRODUCTOS SANGUÍNEOS QUE INCLUYEN CÉLULAS ROJAS DE LA SANGRE Y PLAQUETAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención: Esta invención pertenece a un método para el mejoramiento de la estabilidad de almacenamiento, incluyendo resistencia a la hemolisis y viabilidad mejorada, de productos sanguíneos que incluyen células rojas de la sangre envasada (CRS), plaquetas y similares. Específicamente, un método para ampliar la viabilidad de estos productos, asi como también su resistencia a los agentes que dañan la membrana tales como radiación, se proporciona mediante almacenamiento de los productos en una suspensión que incluye una cantidad efectiva de L-carnitma o una carnitina de alcanoilo. La presente invención también se refiere a un método para suprimir el crecimiento bacteriano en la sangre completa y fracciones de sangre, incluyendo células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada (CBS), concentrados de plaquetas, plasma, y derivados del REF. :134183 plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo. La presente invención además se refiere a un método, para reducir la glicólisis en las fracciones de sangre y sangre completa, que incluye células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada (CBS), concentrados de plaquetas, plasma y derivados de plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo.

Discusión del Antecedente: Se ha relacionado firmemente el crecimiento sobre tanto los suministros de sangre nacionales como alrededor del mundo. Tanto la integridad como confiabilidad de los suministros existentes, y la habilidad para acumular grandes existencias con el tiempo, se ha llevado en cuestión. Una razón para esto es el periodo relativamente corto de estabilidad de almacenamiento de los productos sanguíneos. Actualmente, las CRS (concentrados de células rojas de la sangre, o CCR) envasada, la forma dominante del producto sanguíneo para las transfusiones y similares, están limitadas a un periodo de almacenamiento de 42 dias. Después de tal tiempo, los niveles de ATP caen substancialmente, acoplados con una pérdida significante de pH, indicando fuertemente una carencia de viabilidad, o, si es viable, una vida de .. -__ ,..,___ & *.-**.* , - * -»««,•-* '*- *"• • - ~tf~ -• Á '1 ' *••' circulación extremadamente corta después de la infusión, in vivo . La sangre completa no es almacenada por periodos substanciales. Para las plaquetas, el periodo de almacenamiento actual es aún más corto, con el estándar siendo de 5 dias a 22°C. La diferencia en la estabilidad de almacenamiento de los concentrados de plaquetas (CP) , ha sido contraria a CRS, debido a las reacciones metabólicas progresivas en las plaquetas, debidas en parte a la presencia de mitocondrias en CP, y su ausencia en las CRS. En tanto que los productos sanguíneos muestran una calda en ATP, acoplada con una calda en pH, durante el tiempo, acompañados por la producción de ácido láctico, la presencia de la mitocondria en CP probablemente exacerba el problema, debido a la glicólisis . Simultáneamente, se ha logrado relacionar con la conflabilidad e integridad el suministro de sangre. En particular, la contaminación del suministro de sangre con la bacteria, u otros agentes microbiológicos, ha sido detectada repetidamente. Tal situación es aún más severa en paises con menos métodos de almacenamiento y colección sofisticados. Mientras los agentes pueden ser agregados a los productos colectados para reducir la contaminación, estos son indeseables, dando la necesidad para transfundir los productos nuevamente en los pacientes recibidores. Una alternativa deseable es el tratamiento de radiación de los productos después del envasado, típicamente en contenedores plásticos de vinilo plastificados . Tal tratamiento con radiación podrá agravar las CRS y quizás durante el almacenamiento de CP, resulten en una función disminuida de estas células. Adicionalmente, una pequeña pero creciente porción de la población que recibe sangre está en riesgo de una condición generalmente fatal conocida como padecimiento del hospedero contra el implante asociado a la Transfusión (PH-CIAT) , el cuál es debido a la presencia de leucocitos alogénicos viables. Este síndrome está típicamente asociado con los pacientes inmunosuprimidos, tales como pacientes con transplante de médula ósea y cáncer, pero también puede ocurrir en personas inmunocompetentes en la serie de polimorfismo HLA restringido en la población. Se ha dedicado substancial atención para hallar métodos para ampliar la estabilidad de almacenamiento. Uno de tales métodos, para ampliar el tiempo de vida de almacenamiento de los CP, está mencionado en la Patente Estadounidense No. 5,446,573. Esta patente se dirige a proporcionar preparaciones de CP con fuentes de iones de " .i l n 4- IpH hA.. k__ _&&__. _...,.. acetato, las cuales actúan tanto como un substrato para la fosforilación oxidativa como una solución amortiguadora para contrarrestar cualquier disminución de pH debido a la producción de ácido láctico. Tal método no actúa directamente en el problema de hemolisis, y el rompimiento de la membrana. Un método alternativo se describe en la Patente Estadounidense No. 5,496,821, por el inventor aqui y comúnmente asignada. En esta patente, la sangre completa es almacenada en una preparación que incluye L-carnitina (LC) o derivados alcanoilo de los mismos. La patente no describe sin embargo, los efectos en los productos sanguíneos tales como suspensiones de CP o CRS, y depende al menos, de alguna extensión en el impacto de LC en las características del plasma . Como se notó anteriormente, la contaminación del suministro de sangre con agentes microbiológicos es otro problema dirigido por la comunidad médica. Un método para esterilizar el producto, y mejorar la confiabilidad con respecto a la contaminación, es irradiar el producto sanguíneo. En general, los valores de irradiación gama de aproximadamente 25 centigray (cG) (unidades de dosis absorbidas) , irradiando el producto después es deseable sellarlo en un plástico, vidrio u otro contenedor. j-ttSa- .... ? ,_ _____ _ t_?s _.i. % ?, .. . «S.- . Á . .

Lamentablemente, la irradiación induce lesiones de la membrana celular con hemolisis en las CRS. La irradiación de productos sanguíneos, incluyendo sangre completa, CRS y CP envasados continúa representando problemas. Además, todavía no se ha reportado el efecto de L- carnitina en el crecimiento bacteriano en productos sanguíneos, tales como sangre completa, concentrados de células rojas de la sangre y concentrados de plaquetas. Similarmente, no se ha demostrado el efecto de L-carnitina en la glicólisis en productos sanguíneos, tales como sangre completa, concentrados de células rojas de la sangre, concentrados de plaquetas, particularmente plaquetas aleatorias prealmacenadas-leuco-reducidas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En consecuencia, es un objeto de aquellos expertos en la técnica, proporcionar un método para ampliar el periodo de viabilidad, y la vida media de circulación de las CRS y CP después de la transfusión, más allá de los máximos actuales. Es otro objeto de aquellos expertos en la técnica, encontrar una forma por la cual los productos sanguíneos, incluyendo sangre completa, CRS envasada y CP puedan r -- e -ilizarse por . rr -:„,? ;.-., sin daño y lesiones a...4.^,» ?» J--LJ-. «i?>t-> -_.. »» - , .. . . ~~¿kt f. «.^».« ..*.,*- . * -_.«,»-). s.» *„.£.. substanciales a la membrana y hemolisis. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en la sangre completa. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en la sangre completa, la cual es almacenada por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en fracciones de sangre. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en fracciones de sangre, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en células rojas de la sangre envasada. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en células blancas de la sangre envasada, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, i .::.,. ?.ií.á, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en células blancas de la sangre envasada. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en células blancas de la sangre envasada, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas, los cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en el plasma o derivados del plasma. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para suprimir el crecimiento bacteriano en el plasma o derivados del plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en sangre completa .

Lj.l-A--t-- J_L-Jl--«at. _ _____^_____________, ________?___^_? __í________ ?t__?_______?, _t_áti Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en sangre completa, la cual es almacenada por periodos prolongados de tiempo . Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en fracciones de sangre. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en fracciones de sangre, la cual es almacenada por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en células rojas de la sangre envasada. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en células rojas de la sangre envasada, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en células blancas de la sangre envasada. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en células a-fe ._ .......__.Í.? ?_Í?. ,._.__. A_^—>.. . .__.— .... £HkMtafl|MHMMfc^Aß^AM UfaMA|Uía|B|h i_d_|^ ¡j£ aßMf^ MAMfaÉ£¡Édfag ^..» ..» - «-*a blancas de la sangre envasada, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en concentrados de plaquetas. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en concentrados de plaquetas, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en plaquetas aleatorias prealmacenadas-leuco-reducidas . Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en plaquetas aleatorias prealmacenadas-leuco-reducidas, las cuales son almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en el plasma o derivados del plasma. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un método para reducir la glicólisis en el plasma o derivados del plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo. .Í^ S?.„ _ ¿•ÍJ;¡ t-g ¿ ¿£_¿_ Estos y otros objetos, los cuales llegarán a ser aparentes durante la siguiente descripción detallada, se han logrado por el descubrimiento del inventor, a través de la investigación amplia, de que el daño de la membrana experimentado por las CRS y CP después del almacenamiento, o en el lado de irradiación, puede ser substancialmente retrasado o suprimido, suspendiendo el producto sanguíneo en una solución de preservación convencional, tal como AS-3, en donde la solución de preservación además incluye L-carnitina o un derivado alcanoilo del mismo, en una concentración de 0.25-50 mM o más. El descubrimiento del solicitante depende del reconocimiento que la mayoría de la descomposición de los productos sanguíneos, convencionalmente asociados con la disminución en los niveles de ATP y pH pueden ser en efecto, trazados al daño de la membrana y hemolisis. El mantenimiento y reparación de la membrana pueden ser efectuados por la reacilación lipida, efectuada en parte, a través de LC, absorción irreversible de la cual en las CRS y productos sanguíneos similares, se ha establecido a través de la investigación inventiva. El inventor también ha descubierto que la L-carnitina suprime el crecimiento bacteriano en la sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre ,^^__^^^^^*^^. J.» . i -í «- envasada (CBS) , concentrados de plaquetas, plasma y derivados de plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo. El inventor además descubre que la L- carnitina reduce la glicólisis en la sangre completa y fracciones de sangre, incluyendo células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada (CBS) , concentrados de plaquetas, particularmente plaquetas aleatorias prealmacenadas-leuco-reducidas, plasma y derivados del plasma, los cuales son almacenados por periodos prolongados de tiempo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Valores de duración máxima de vida después de la infusión de CBS almacenadas 42 dias con relación al donador y al control y LC-almacenada. Las flechas indican media + SD de control y CRS y LC-almacenada, respectivamente. En la parte superior de la gráfica, también se muestra el valor exacto de p calculado. Figura 2. Contenido de carnitina de células rojas a diferentes semanas de preservación de sangre. La carnitina se ensayó como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son el promedio de tres experimentos hechos por duplicados.

La variación entre los experimentos no fue más de 7%. i A tá.it l.i..*-*.i»t . __t¡*_..».«-, . _, ,. . ,.._ _ _, , . , . .. _, _,_.____ » . .

Símbolos abiertos, CRS almacenadas con AS-3 solo; símbolos cerrados, CRS almacenada en AS-3 suplementada con LC (5 Mm) . Figura 3. Incorporación de ácido palmitico radioactivo en LC de CRS a diferentes semanas de preservación de sangre. Alícuotas de CRS retiradas ya sea de la unidad sanguínea almacenadas en AS-3 sola o AS-3 más LC, se incubaron a 37°C con complejo de ácido palmitico [ 1-14C] a ácido graso libre de BSA. Al final de la incubación, las CRS fueron entonces procesadas como se describe en Materiales y Métodos. La formación de PLC radioetiquetada se refiere al contenido fosforoso presente en el extracto lipido. Los valores son el promedio de tres experimentos hechos por duplicado. La variación entre el experimento no fue de más de 7%. Símbolos abiertos, CRS almacenada con AS-3 sola; símbolos cerrados, CRS almacenada en AS-3 suplementada con LC (5 mM) . Figura 4. Incorporación de ácido palmitico radioactivo en la membrana de las células rojas de fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilcolina (CP) a diferentes semanas de preservación de la sangre. Alícuotas de CRS se retiraron ya sea de la unidad de sangre almacenada en AS-3 sola o AS-3 más LC, fueron incubadas a 37°C con complejo de ácido palmitico [1-14C] a ácido graso libre de BSA. Al final de la incubación, las CRS fueron entonces procesadas como se describe. Los resultados se dan como pmol [ 1-14C] ácido palmitico/µg lipido fosforoso presente en el extracto lipido. Los valores son el promedio de tres experimentos hechos por duplicado. La variación entre los experimentos no fueron más del 7%. Símbolos abiertos, CRS almacenada con AS-3 sola, símbolos cerrados, CRS almacenada en AS-3 suplementada con LC (5 mM) . Figura 5. El sistema carnitina y reacciones de reacilación de fosfolipido de la membrana. Las flechas más gruesas indican el flujo de acilo preferencial. La dimensión de la casilla de acilcarnitina muestra el tamaño de combinación probablemente relacionado. Las abreviaciones usadas son: LPL, lisofosfolipidos ; PLP, fosfolipidos; Cn, carnitina; acil-Cn, acil-carnitina; ACS, acil-CoA sintetasa; LAT, acil fosfolipido-CoA transferasa; CPT, palmitoiltransferasa de carnitina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención emplea L-carnitina, y sus derivados alcanoilo, como un agente que soporta el mantenimiento y reparación de la membrana celular, y la supresión de hemolisis en productos sanguíneos. La presente invención también proporciona un método para suprimir el crecimiento l?.AA Ú A_*. íx_____.i bacteriano en la sangre completa y fracciones de sangre, incluyendo células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada, concentrados de plaquetas, plasma y derivados del plasma. La presente invención además proporciona un método para reducir la glicólisis en la sangre completa, y fracciones de sangre, incluyendo células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada, concentrados de plaquetas, plasma y derivados del plasma. Las L-carnitinas de alcanoilo adecuadas incluyen, L-carnitinas de alcanoiloC2-8f y las L-carnitinas de alcanoilo preferidas incluyen acetilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo y particularmente L-carnitina de propionilo. Aqui, se hace referencia a esta familia genéricamente como LC, y la ejemplificación es en término de L-carnitina. Las L-carnitinas de alcanoilo descritas, y sus sales farmacológicamente aceptables sin embargo, pueden usarse en lugar de L-carnitina. Los ejemplos de sales adecuadas de L-carnitina incluyen, por ejemplo, cloruro de L-carnitina, bromuro de L-carnitina, orotato de L-carnitina, aspartato de ácido de L-carnitina, fosfato ácido de L-carnitina, fumarato de L-carnitina, lactato de L-carnitina, maleato de L-carnitina, maleato ácido de L-carnitina, oxalato ácido de L-carnitina, toita <j ,it?, e?t__? k . - .BÜB-S... ..-.*..._,«*...»__».*_. , -,-.. sui.lfato ácido de L-carnitina, fosfato de glucosa de L-carnitina, tartrato de L-carnitina, tartrato de ácido de L-carnitina y mucato de L-carnitina. Los ejemplos de sales adecuadas de L-carnitina de alcanoilo incluyen por ejemplo, cloruros de L-carnitina de alcanoilo C2~8r bromuros de L-carnitina de alcanoilo C ~8> orotatos de L-carnitina de alcanoilo C2-8r aspartatos ácidos de L-carnitina de alcanoilo C2-8, fosfatos ácidos de L-carnitina de alcanoilo C2-8, fumaratos de L-carnitina de alcanoilo C2-ß , lactatos de L-carnitina de alcanoilo C2-8, maleatos de L-carnitina de alcanoilo C2-8, maleatos ácidos de L-carnitina de alcanoilo C2~3, oxalatos ácidos de L-carnitina de alcanoilo 2-ß r sulfatos ácidos de L-carnitina de alcanoilo C2-8, fosfatos de glucosa de L-carnitina de alcanoilo C2~8, tartratos de L-carnitina de alcanoilo C2-ß, tartratos ácidos de L-carnitina de alcanoilo C2-8 y mucatos de L-carnitina de alcanoilo C2-8- La adición de LC a la sangre completa o fracciones de sangre, que incluyen a las CRS, CBS, CP, plasma y derivados de plasma, requieren LC para estar presentes en una cantidad efectiva para permitir el mantenimiento de la membrana, reparación y supresión de la hemolisis y/o suprimir el crecimiento bacteriano y/o reducir la glicólisis. El ... .-_.. ...1? * t * . intento de investigación que incluyen los ejemplos expuestos abajo, ha demostrado un rango minimo efectivo para los productos de muchos donadores de aproximadamente 0.25 mM-0.5 mM. El limite superior es más práctico que el fisiológico. Las concentraciones tan altas como 50 M o superiores, son fácilmente toleradas. Los valores que son consistentes con las relaciones toxicológicas y osmológicas son aceptables. Los rangos preferidos son 1-30 mM. Un rango de 1-10 mM o más, es adecuado con valores entre 4-6 mM haciendo una marcada diferencia. Los efectos de esta invención, incluyendo la prolongación de la viabilidad, y la ampliación de la vida media de circulación después de la transfusión, pueden ser altamente dependientes del donador. En consecuencia, hablando de manera general, una concentración efectiva de LC es de 0.5-50 mM, sin embargo, los expertos ordinarios en el campo, podrán requerir ampliar tal rango, en cualquier dirección, dependiendo de las particularidades del donador. Tales extensiones no requieren esfuerzo inventivo. El LC es consistente con las soluciones de soporte convencionales (soluciones estabilizantes), las cuales son típicamente preparadas para proporcionar un efecto amortiguador. Las soluciones comúnmente empleadas incluyen ACED (ácido citrico-citrato sódico-dextrosa) , CPD (citrato- 11» Á-ka - j*..*_¡_____--.....t jcfff- ..... , ~ ^ ..-- .-v-, *.,«,.. fosfato-dextrosa) y modificaciones de los mismos, incluyendo CPD2/A-3, y composiciones relacionadas. Típicamente, la composición incluye un carbohidrato, tal como glucosa o manitol, al menos una sal de fosfato, un citrato y otras sales de balanceo. La LC es convencionalmente soluble y puede ser agregada a estas composiciones libremente dentro del rango requerido. Las soluciones estables se describen en la Patente Estadounidense No. 5,496,821, incorporada aqui por referencia. Se nota sin embargo, que las soluciones de soporte preferentemente aquellas usadas convencionalmente, que incluyen plasma artificial y otras soluciones fisiológicamente aceptables, pueden ser usadas con la LC en la invención. El componente importante de la solución de soporte es la LC . La habilidad de LC, cuando se incluye en la sangre completa o la suspensión de fracciones de sangre tales como en las CRS, CBS, CP, plasma y derivados del plasma, para ampliar el tiempo viable y por lo tanto la longitud de anaquel, y el periodo de circulación después de la transfusión en el individuo receptor, es ejemplificada abajo en la experimentación in vi tro e in vivo . La experimentación emplea LC, pero pueden ser empleadas L-carnitinas de i_. particular significado es la demostración abajo, de que se obtiene realización mejorada a través del mantenimiento mejorado (incluyendo reparación) de la membrana celular, y supresión de la hemolisis.

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño de Estudio I: Evaluación de calidad in vivo e in vi tro de CRS almacenadas con y sin LC Sujetos. La población sujeta fueron sujetos de investigación masculino o femeninos, entre las edades de 18 hasta 65 años, sin incapacidades físicas o mentales conocidas, y sin tomar fármacos que podrían afectar la viabilidad de las CRS. Los individuos reclutados fueron quienes cumplieron con el criterio de donador alogenéico convencional como se lista en el Código de Registro Federal, Capitulo 2, los Estándares de la Asociación Americana de Bancos de Sangre, y los Servicios Directivos de Sangre de la Cruzada de Sangre Nacional Americana. El estudio se aprobó por la Junta de Revisión Institucional del Colegio Médico de Hampton Roads y los sujetos dieron consentimiento informado antes de la participación en el estudio. Cada donador hizo donación en dos diferentes __m¡_ia__________tL_í.4'__í__, ,..„ ocasiones, separadas por 72 dias, y fueron aleatorios para ya sea el brazo de prueba o control en la primera donación. Sistema. de almacenamiento de sangre . Sistema estándar CP2D/AS-3 (Miles, Inc.). Usando plástico de cloruro de polivinilo (PLC) se usó con dietil- (n) -hexil-ftalato (DEHP) como plastificador. Para cada unidad de prueba, 245 mg de LC (en 1.1 mL de solución libre de pirógenos, pura en una botella de vidrio esterilizada) , se agregaron al contenedor, manteniendo la solución aditiva AS-3 para dar una concentración final de 5 mM. Para las unidades de control, se agregó 1.1 mL de NaCl al 0.9%, a la solución AS-3 usando las mismas condiciones. La adición de LC o salina a las bolsas se realizó inyectando a través de un muestreo del sitio acoplador con una jeringa. Esto se hizo en una capucha de flujo laminar bajo luz UV. Donación y Procesamiento . Los métodos para retirar sangre y flebotomía estándares, se usaron con la colección de aproximadamente 450+50 mL de sangre completa. La unidad de sangre completa se mantuvo entre 4-8 horas a temperatura ambiente antes de su procesamiento. La unidad se centrifugo usando condiciones estándares y, después de la centrifugación, el plasma sobrenadante fue expresado completamente, y las CRS envasadas sedimentadas se «i *. -l __. á?¡_. .íá?u.-aé, s. j. ______•_ •»*<«-** resuspendieron en ya sea la solución AS-3 estándar (control) o la solución AS-3 que contiene carnitina (prueba) . Las unidades de CRS suspendidas se almacenaron a 4°C por 42 días. Mediciones in vitro. Las mediciones se realizaron en pre-(0 dia) y post- (42 dias), en muestras que incluyen niveles ATP de CRS, hemoglobina de sobrenadante y total; hematocrito (Het) ; CRS, CBS y conteo de plaquetas; fragilidad osmótica de CRS; morfología de CRS; niveles de lactato y glucosa; niveles de potasio del sobrenadante. Estos se realizaron usando procedimientos estándares como describe previamente, Heaton et al., Vox Sang 57:37-42 (1989). Mediciones in vivo post-trans fusiones . Después de 42 días de almacenamiento, se retiró una muestra y las células almacenadas etiquetadas con Cr usando métodos estándares. Al mismo tiempo, para determinar la masa de CRS, se colecto una muestra fresca del donador para etiquetación de las CRS con 99 Te. Después de etiquetar, 15 µCi de células almacenadas etiquetadas con 51Cr y 15 µCi de células frescas etiquetadas con 99Tc, se examinaron y simultáneamente se sometieron a infusión. Las muestras de sangre (5 mL) se tomaron después de la infusión a varios intervalos de tiempo por hasta 35 días, para calcular % de recuperación y supervivencia de 24 horas. El % de recuperación a las 24 1 t-* ? Í. ?.Ú * - «_>_„,. -.. _t Jtete *._.J horas, se determinó usando ya sea el método de etiqueta única, en donde la regresión log-lineal de los niveles de radioactividad de las muestras tomadas a 5, 7.5, 10 y 15 min, se usó para determinar el nivel de tiempo 0, o por el método de doble etiqueta usando masa de CRS del donador, como la determinada por la medición de 99Tc. La duración máxima de vida de circulación de las CRS etiquetadas con Cr sobrevivientes transfundidas, se determinó por las muestras tomadas a las 24 horas y después dos veces semanalmente hasta por 5 semanas. Los niveles de radioactividad se corrigieron por una constante de elusión del 1% por dia. Los datos se fijaron a una función lineal con dias pos-transfusión como variable independiente (e e x) , y los conteos Cr se corrigieron como variable dependiente (eje y) . La duración máxima de vida de las CRS fue tomada entonces como la intersección de la linea fi a con el eje x. Análisis estadístico . Se realizó el análisis estadístico no paramétrico de rutina o prueba t apareada, en datos a partir de las pruebas m vivo e m vi tro de las unidades, para determinar si hay algunas diferencias estadísticamente significantes (extremo 1) en la medias entre las unidades de prueba y control. La significancia estadística se consideró a un valor p menos que 0.05.

Diseño de Estudio II Estudios de reacilación lipida y captación de LC de eritrocitos con almacenamiento hasta de 42 dias Químicos . Se obtuvo albúmina de suero bovino, libre esencialmente de ácidos grasos (BSA) , de SIGMA Chemical Company, St . Louis, Mo . (EUA). Acido Palmitico [1-14C] (58 Ci/mol) se obtuvo de New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (EUA). Placas de capa delgada, Whatman LK6 (gel de silice) (20 x 20 cm) , con una capa pre-absorbente, se obtuvieron de Cario Erba, Milán (Italia). Palmitoil-L- carnitina (PLC) y LC, fueron una clase de obsequio de Sigma Tau, Pomezia (Italia). Todos los otros compuestos usados fueron de grado reactivo. Ensayo de carnitina de células rojas . La muestra de sangre se retiró de la unidad de CCR almacenada y se lavó una vez con 4 volúmenes de NaCl al 0.9% frió. Las CRS fueron entonces suspendidas en NaCl al 0.9% a un hematocpto final de 50%, y desproteinizados con ácido perclórico como describe, Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988). Las alícuotas del extracto final se analizaron por el contenido de LC libre, de conformidad con el ensayo radioquimico de Pace et al., Clin. Chem. 24:32-35 (1978).

Análisis de reacilación lípida del complejo de membrana en CRS almacenadas . Se retiraron muestras de sangre de la unidad de CCR almacenadas, a través de un muestreo del sitio acoplador con una jeringa, y la muestra se procesó inmediatamente. Esto se hizo en una capucha de flujo laminar bajo luz UV. Todas las manipulaciones se realizaron a 0-5°C a menos que se indique. Las CRS se lavaron dos veces con 4 volúmenes de NaCl al 0.9% frió. Las CRS aisladas se lavaron nuevamente una vez con solución amortiguadora de incubación (NaCl 120 M, KC1 5 mM, MgS04 1 mM, NaH2P04 1 mM, sacarosa 40 mM, glucosa 5 mM, Tris-HCl 10 mM, a pH 7.4) y se resuspendieron en la misma solución amortiguadora a un hematocrito final de 5%. Se usó un baño de sacudimiento Rotabath a 37 °C para las incubaciones. Las CRS incubadas con el ácido palmitico radioactivo (10 µM) se sometieron a complejos al BSA libre de ácidos grasos (1.65 mg/ml). Las incubaciones se terminaron por el lavado de las células una vez con solución amortiguadora de incubación, fria, tres veces con BSA libre de ácido graso al 1% en solución amortiguadora de incubación, y finalmente una vez nuevamente con solución amortiguadora de incubación. Las CRS lipidas se extrajeron de células intactas por el procedimiento de Rose & Uü i naer, o. _,^?d .xes. *:-?__o-43I uaooj . .\ra prevenir la ¿_ .*.*... . _. _. __._______- . .... ....... „?.í_, t_Á..... oxidación lipida, se agregó hidroxitolueno butilado al 0.1% a los extractos lipidos. Las alícuotas del extracto lipido se usaron para la determinación del contenido fosforoso lipido, y se analizaron por cromatografía de capa delgada de dos dimensiones. Brevemente, los cromatogramas se desarrollaron usando cloroformo-metanol-amoniaco al 28% (65:25:5) en la primera dimensión. Los cromatogramas entonces se desarrollaron usando cloroformo—acetona-metanol-ácido acético-agua (6:8:2:2:1) en la segunda dimensión. Fosfatidilcolina (CP) , una fosfatidiletanolamina (PE) , y fosfatidilserina se visualizaron por la breve exposición de las placas en yodo y se identificaron usando estándares como referencia. Los manchados de fosfolipidos individuales se rasparon en matraces que contienen fluido de escintilación y se determinó la radioactividad por conteo de escintilación liquida. La identificación y análisis de PLC radioactivo se llevó a cabo como describe recientemente, Arduini et al., J. Biol. Chem. 267:12673-81 (1992). La eficiencia del conteo se evaluó por un estándar externo. Los cálculos se basan en las actividades especificas del ácido palmitico radioactivo.

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Estudio I Cara cterísti cas de la unidad de AS-3 de CCR pre-alma cenadas Las propiedades de los productos de AS-3 de CCR fueron como se esperaba después del procesamiento de las unidades de sangre completa. No se observaron diferencias significantes entre las unidades de prueba y control en las características de la unidad de AS-3 de CRS, como las medidas por el volumen de unidad, Het, y contenido de CBS, y las propiedades de las CRS in vi tro tales como niveles de ATP, niveles de potasio y hemoglobina sobrenadante, fragilidad osmótica (Tabla I).

Tabla I. Características de pre-almacenamiento de CRS de los Concentrados de células Rojas.

Cara cterísti cas de las CRS de alma cenamien to posterior al día 42 Metabólicos . La cantidad de glucosa consumida y lactato producido durante 42 dias de almacenamiento, fueron similares para las unidades de prueba y control (Tabla 2) . Como se esperaba, una correlación alta inversa se encontró entre estos dos parámetros de glicólisis (r =0.76). Sin embargo, se encontraron niveles de ATP superiores y hemolisis menores para las unidades de CRS almacenadas con carnitina comparadas con el control. Como se ilustra en la Figura 1, este nivel de ATP superior se observó en todos pero en pares (p<0.01) .

Tabla 2. Características de pre-almacenamiento (42 dias) de los concentrados de células Rojas.

:P<O.O5) .

Membrana . El porcentaje de hemolisis al final de los niveles de almacenamiento fue menor con las unidades de carnitina, como se muestra en la Figura 2. Por otro lado, no se encontraron diferencias significantes con respecto a los niveles de potasio del sobrenadante, respuesta de golpe osmótico y registro de morfología, los cuales estuvieron dentro del rango esperado al final de 42 dias de almacenamiento . Viabilidad post-trans fusión . La media del % de recuperación de 24 horas para las unidades de control, fue similar a aquél que previamente se ha encontrado por nosotros y por otros. Sin embargo, las medias del % de recuperación para las células rojas almacenadas-carnitina, fueron superiores que las células almacenadas de control (p<0.05). Además, la media de duración máxima de vida de circulación de las células rojas almacenadas sometidas a infusión, fue también superior para las células almacenadas de carnitina (Figura 1) . La masa de las CRS del donador como se determinó en las dos ocasiones, fue altamente similar (r=0.98) y no estadísticamente diferente. Estudios de correlación . Como se esperaba, el % de recuperación de 24 horas, mostró correlaciones significantes con los niveles ATP (r =0.63) y otras mediciones de la _?j_?__ z_-_ _____. . -_. _. integridad de la membrana de las CRS tal como hemolisis (r=0.57), fragilidad osmótica (r=0.71), y registro de morfología (r=0.59). El porcentaje de hemolisis se correlacionó altamente con los niveles de ATP (r =0.83) y también con el contenido de CBS de las unidades de CRS (r=0.83). La duración máxima de vida de circulación de las CRS no mostró correlaciones significantes con cualquiera de los parámetros ín vi tro .

Estudio II Capta ción de carni tina en las CRS alma cenadas Las CRS almacenadas en un medio AS-3 solo, no mostró alguna pérdida significante del contenido de LC a través del almacenamiento (Figura 2) . Esto es de acuerdo con los hallazgos por Cooper et al., supra que muestran que la LC de las células rojas humanas, no se intercambian libremente con ya sea el plasma o amortiguador isoosmótico. Cuando las células rojas se almacenan en AS-3 suplementada con LC, cantidades superiores de LC intracelular que AS-3 sola, son detectadas (Figura 3). El contenido de LC se incrementó linealmente durante los tiempos de almacenamiento, alcanzando un incremento de 4 veces a los 42 dias. _^ ¿^¿fc* Es tudios de rea cilacíón lípida del complejo de membrana en las CRS almacenadas Sin carnitina presente, el palmitato radioactivo incorporado en PLC disminuyó linealmente con el tiempo de almacenamiento (Figura 3). En varianza, las células rojas de la unidad del CCR almacenadas en el LC que contiene la solución AS-3, mostraron un incremento inicial (con un punto más bajo o nadir a las 3 semanas), seguidas por un rápido decremento del palmitato radioactivo incorporado en PLC. En las mismas preparaciones de las células rojas, la incorporación de palmitato radioactivo en los fosfolipidos de la membrana también se evaluó. La incorporación de palmitato radioactivo en la membrana PE de las células rojas de la unidad de sangre almacenada en la solución AS-3 sola, mostró un incremento significante constante de radioactividad en PE a través del periodo de almacenamiento (Fig. 4). Las células rojas almacenadas en la presencia de LC se caracterizaron por un incremento repentino de reacilación PE hacia el final del almacenamiento, con un punto más bajo o nadir a la 6ta. semana (Figura 4). Las relaciones de incorporación de palmitato radioactivo en la membrana CP disminuyeron ligeramente a través del almacenamiento, y no se observaron diferencias entre las dos preparaciones de células rojas (Figura 4) . Deberá anotarse que puesto que en nuestros estudios de reacilación las células rojas se incubaron a 37 °C, en una solución amortiguadora Krebs Ringer que contiene glucosa, los niveles ATP al final de la incubación fueron cercanos a los valores fisiológicos (datos no mostrados).

Discusión En este estudio, las pruebas in vi tro e in vivo de unidades de CRS al final de 42 dias de almacenamiento, demostraron diferencias significantes entre las CRS almacenadas con carnitina, comparadas con las CRS almacenadas de control. Varias propiedades de las CRS in vi tro reflectivas de la integridad metabólica y de la membrana tales como ATP y % de hemolisis, asi como también medición directa de la viabilidad celular (porcentaje de recuperación a las 24 horas y tiempo máximo de vida de circulación) , fueron significantemente superiores para las CRS almacenadas con carnitina. Una prolongación de la media de duración máxima de vida de las CRS de supervivencia que circulan a las 24 horas después de la infusión, es de interés. Este hallazgo puede ser relacionado con la captación irreversible de LC durante el almacenamiento, un descubrimiento imprecedente e inesperado. Los valores obtenidos en los estudios de control S-ü-S ,¿ & _, __. __, & .b__tll _ S j.^ ¡J_?_ _t^t__ ??_.. _..^_.._. __^, __ ,_ _ *._,___, „*+_ a _,. , j. ,. .. -. -. .. -_, „ . _-. . -i.c ij *" £_?_t_t__^__S__ _ para varias propiedades de CRS fueron como se esperaban y no diferentes de los estudios previos. Al tiempo de la colección de sangre, no se encontraron diferencias significantes en la unidad o características de las CRS entre las pruebas y el control. Como se ilustra en las Figuras 1-3, los niveles de ATP de CRS, % de hemolisis, y duración máxima de vida de circulación, fueron fuertemente relacionados con el donador, y, puesto que el estudio fue un diseño aleatoriamente apareado con cinco estudios de control y cinco estudios de prueba realizados en ambas primera y segunda ocasiones, es probable que las diferencias observadas podrán ser debidas a la oportunidad o cualquier diseño de estudio defectuoso. Es por lo tanto, más probable que las diferencias observadas encontradas en este estudio, fueran causadas por la adición de carnitina a las unidades de prueba. La posibilidad de que la duración máxima de vida incrementada refleje disminución de elución de Cr, no puede ser excluida, pero no es consistente con las mediciones in vi tro mejoradas de las células rojas almacenadas que se han encontrado correlacionadas con la viabilidad in vivo . Varias investigaciones han encontrado que la LC y sus esteres de acilo, tienen un efecto estabilizante de la membrana/citoprotector en varias células que incluyen células _-J^-----M.-A-Jl-lt-..¡---h«^-^ ^ « * ..>- ... .-. . _., .J.. - >«-.,,..- , ...._..-. t.?.1 rojas. Véase por ejemplo, Snyder et al., Arch. Biochem. Biophys. 276:132-138 (1990). En este estudio se encontró que la LC fue irreversiblemente tomada por las CRS durante el almacenamiento. Aunque la naturaleza de este proceso no es completamente clara, uno podrá excluir la participación de un portador especifico para la captación de LC . A nuestro conocimiento, el único portador de LC conocido, opera en sistemas celulares en donde la concentración intracelular del LC es varias veces superior que la normalmente presente en el ambiente extracelular. La concentración LC de células rojas es similar a aquélla del plasma. Asi, sin considerar las bajas temperaturas, supresión de ATP y otros posibles cambios metabólicos posibles que ocurren durante el almacenamiento, cuando las células rojas son almacenadas en un medio que contiene cantidades relativamente altas de LC exógeno, una captación unidireccional de LC por las células se observa como establecida. Ninguno en la técnica parece predecir esto. La naturaleza de la acción de LC en CRS almacenadas, podria revisarse ya sea como una intervención biofísica y/o metabólica en el compartimiento de la membrana. La supervivencia de la post-transfusión de las células rojas almacenadas está relacionada con la integridad de la función de la membrana, como se sugiere por la correlación significante entre la viabilidad in vivo de la célula roja re-infusionada y sus mediciones de relación superficie a volumen. Una mayor contribución a la función y estructura de la membrana de las CRS está representada por la red de citoesqueleto, Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol. 1:531-536 (1985), una organización de la proteina supramolecular que se encuentra debajo de la semi-hoja de la membrana de las CRS. Wolfe et al, en un estudio de supervivencia en la composición y función de la proteina de la membrana citoesquelética de las células rojas almacenadas, encuentra que el único cambio relevante es una capacidad de disminución de espectrina asociada con actina ya sea en la presencia o ausencia de la proteina 4.1. Wolfe et al., J. Clin. Invest. 78:1681-1686 (1986) . Hemos mostrado que la LC afecta la deformabilidad de la membrana de las CRS de la proteina 4.1, que contiene espectros liberados sometidos a estrés de corte incrementado. Arduini et al., Life Sci . 47: 2395-2400 (1990). Asi, la LC puede ejercer un efecto estabilizante en la membrana a través de una interacción de espectrina con uno o más componentes citoesqueléticos . Un estudio reciente de resonancia paramagnética del electrón de Butterfield y Rangachari, Life Sci. 52:297-303 (1992), en la interacción de espectrina- actina de las células rojas, mostró que la LC reduce I«t Í.Á.?. . _~ 'tí* "-' -*»* *-k-t significantemente el movimiento segmental de los sitios etiquetados por centrifugación en espectrina, confirmando las sugerencias previas que involucran a la LC en el reforzamiento de la interacción entre espectrina y actina, Arduini et al., supra. Además de un potencia de acción biofísica descrita anteriormente, los mejoramientos observados en las células rojas almacenadas con LC, pueden también ser el resultado de un proceso metabólico favorable. Normalmente, el ciclo de desacilación-reacilación de los fosfolipidos de la membrana, requieren ATP para la generación de acil-CoA. La porción acilo de acil-CoA es entonces transferida en lisofosfolipidos por transferasa acil-CoA de lisofosfolipidos . Además, durante un cambio oxidativo, el proceso de reparación de la membrana de fosfolipidos de las CRS sigue la misma trayectoria metabólica. Recientes hallazgos han mostrado que el CPT afecta el proceso de reacilación de los fosfolipidos de la membrana en las células rojas y células neuronales por la modulación del tamaño de combinación de acil-CoA entre el paso de activación del ácido graso y su transferencia en lisofosfolipidos . Arduini et al., J. Biol. Chem. 267:12673- 12681 (1992). Además, los estudios de supresión de ATP y pulso-ranura, han demostrado que la combinación de acilcarnitina de las células rojas, sirve como un reservorio de grupos acilo activados sin costo de ATP. Arduini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:353-358 (1994). El incremento de la incorporación de palmitato radioactivo en la membrana PE de las células rojas almacenadas en AS-3 sola, sugiere que el almacenamiento de largo término (con una supresión ATP de CRS progresivas), cause una demanda incrementada de unidades acilo activadas para la reacilación de los fosfolipidos de la membrana (Figura 4) . Durante las primeras cinco semanas de almacenamiento, las células rojas preservadas en AS-3 sin LC, se piensa incorporan más palmitato en PE que las células rojas almacenadas en AS-3 que contiene LC (Figura 4). Las células rojas almacenadas en la presencia de LC fueron capaces de incorporar más palmitato en PE al final del almacenamiento. Este hallazgo puede sugerir que un cambio oxidativo es de algún modo operativo, puesto que la exposición de las células rojas al oxidante, fuertemente estimula el proceso de reacilación PE de la membrana, pero no de tal membrana de CP. Dise et al., Biochem. Biophys. Acta 859:69-78 (1986). De interés, durante las primeras cinco semanas de almacenamiento, las células rojas preservadas en AS-3 solo, se piensa incorporan más palmitato en PE que en .jA_.AJJá<A- j i «**«- •- .-*-*»*«.. ... .... .. s. __ _ .„ *.. . _.._*. .._. ._ - - . ..?.- .. . -. . . .... rf t'tf- las células rojas almacenadas en AS-3 que contiene LC (Figura 4) . Esto sugiere que en el último caso el CPT puede competir con la enzima de reacilación para la utilización de acil-CoA. De acuerdo con este concepto, sin embargo, bebemos observar 5 una diferencia mucho mayor al final del periodo de almacenamiento, cuando el requerimiento de acil-CoA para el proceso de reacilación es el más alto. Este no fue el caso. Las células rojas almacenadas con o sin LC, mostraron una relación de incorporación similar al final del almacenamiento 10 (Figura 4) . Además, hemos mostrado que el CPT de las células rojas, bajo una variedad de condiciones experimentales diferentes, no compite con la reacilación de los fosfolipidos de la membrana. Arudini et al., Life Chem. Rep. 12:49-54 (1994) . 15 La formación de PLC radioactivo en las células rojas suplementadas con LC, es mayor que aquellas encontrada en las células rojas almacenadas sin LC (Figura 3) . Además, el curso de tiempo de la formación de PLC en las células rojas almacenadas con LC, mostró una curva en forma de 20 campana interesante con un nadir o punto más bajo en la tercera semana de almacenamiento. La formación de PLC radioactivo es reflectiva del tamaño de combinación de acilcarnitina de cadena larga fria y la dirección del flujo de acilo mediado por CPT en las células rojas intactas. Durante las primeras tres semanas de almacenamiento con actividad glicolitica relativamente alta y biodisponibilidad de ATP, el CPT se piensa, dirige el flujo de acilo hacia la acilcarnitina en las células rojas almacenadas en la presencia de LC (Figura 5) . Después de la tercera semana de almacenamiento con LC presente, el flujo es entonces invertido. Estos cambios pueden reflejar esencialmente, la habilidad de CPT para amortiguar las unidades acilo activadas: un requerimiento incrementado de acil-CoA para el proceso de reacilación resulta en una producción más baja de PLC y viceversa, y puede representar un mecanismo en donde el CPT es usado para amortiguar el incremento de la demanda de unidades acilo para el proceso de reacilación (Figura 5b) . El % de recuperación de 24 horas superior y la duración máxima de vida de circulación, representa un mejoramiento de aproximadamente 15% en términos de potencia (cantidad de CRS de circulación transfundida disponible en la duración de vida máxima promedio del tiempo del receptor) . Este incremento en la potencia podrá traducirse clínicamente en una reducción en requerimientos de transfusión en pacientes crónicamente transfundidos tales como talasémicos o en pacientes con falla de la médula ósea. Alternativamente, .. n- - .ua_s -. »_».. ^ -.-f?r t»..--1-^t|^.^..^tt.t tt-_^ .¡. , .. ... ._._____ _ _ -.«.i.lt puede ser posible ampliar la vida de anaquel de las CRS liquidas almacenadas. Nuestros hallazgos sugieren que la presencia de LC en el medio de preservación durante el almacenamiento de las CRS puede tener una acción escasa en la combinación de ATP usado por la reacilación de los fosfolipidos para reparar la membrana. Este proceso metabólico favorable asociado con una acción biológica benéfica posible, puede además, explicar la hemolisis reducida, niveles ATP superiores, y la recuperación ín vivo mejorada y supervivencia de las células rojas almacenadas .

IRRADIACIÓN El problema de contaminación de productos sanguíneos, incluyendo sangre completa, CRS, CCR, CP y similares, puede ser reducida por la cantidad substancial por irradiación. Los niveles de irradiación necesarios para esterilización, y substancialmente 100% de mortalidad de agentes microbiológicos, han sido ampliamente explorados. Adicionalmente, de manera más importante, los leucocitos pueden ser destruidos por irradiación similar. Una variedad de tipos de irradiación pueden ser usados, incluyendo irradiación gama (Cobait GG, aceleración de Van de Graf) , irradiación UV, irradiación infrarroja, etc. Un equivalente cercano a aproximadamente 20-50 cG de irradiación gama es suficiente . Alrededor del mundo, son colectadas anualmente entre 60 y 80 millones de unidades de sangre completa, y son usadas en el soporte de transfusión de una variedad de población de pacientes. En los países subdesarrollados las proporciones de colección por 1000 poblaciones son más bajas y se dan transfusiones de sangre en el tratamiento de casos obstétricos y pediátricos, particularmente anemia asociada con la malaria. En los países desarrollados, las relaciones de colección por 1000 poblaciones son 50-10 veces superiores y se dan más transfusiones en la cirugía (50%) o en el tratamiento de pacientes con anemia asociada con cáncer, transplante de médula ósea, sangrado gastrointestinal no maligno (Figura 1). Hay muchos efectos adversos potenciales con la transfusión de sangre alogénica. Una complicación particular adversamente asociada con la transfusión de sangre es la entidad rara y usualmente fatal conocida como padecimiento del hospedero contra el implante asociado con la Transfusión (PH-CIAT), una complicación mediada por inmunocitos alogénicos viables. El padecimiento PH-CIAT es una complicación rara de la transfusión sanguínea potencialmente vista en dos tipos de poblaciones de pacientes receptores de transfusión sanguínea. El PH-CIAT tiene una mortalidad cercana al 100% y la prevención es el único procedimiento efectivo en este tiempo. Primero, en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes después del transplante de médula ósea u otro órgano, padecimiento de Hodgkins, o deficiencias hereditarias del sistema inmune. Segundo, en pacientes no inmunocomprometidos, cuando existe similitud de HLA entre el receptor sanguíneo y el donador de sangre. Esto es más a menudo visto en donaciones directas de poblaciones relativas cercanas de más polimorfismo de HLA limitado, tales como en Japón e Israel. Considerando esto, es una práctica universal irradiar productos sanguíneos celulares con irradiación gama o en una dosis de plano medio de aproximadamente 25 centigray (cG) (unidades de dosis absorbidas) para destruir la habilidad replicante de inmunocitos viables. Deberá notarse que el PH-CIAT está asociado con los productos celulares los cuales son frescos, es decir, generalmente menos de 15 dias. Sin embargo, el "envejecimiento" de la sangre todavía no es una práctica aceptada en la prevención de esta complicación.

Aunque los inmunocitos son parte de la población de _-itos alogénicos, el, grado de leucosupresión actualmente .-_ ¡£sa & Áx--i.-.éi >. _. . _>__k_ »i_ .._ .. .__&, ¡ •--. •_,. Í-Í__iM_rt alcanzada con los filtros de tercera generación, no son considerados actualmente adecuados para prevenir esta complicación. Asi, la radiación gama en este tiempo, permanece como la única intervención profiláctica aceptada. La dificultad con la irradiación gama de las células rojas en particular es el potencial al daño de la membrana celular. Es claro que la irradiación a esta dosis produce una pérdida en la potencia de aproximadamente 7-8%, como la medida m vi tro por una reducción en el ATP de las células rojas, hemolisis incrementada y potasio sobrenadante incrementado. Estos cambios son consistentes con un defecto en el daño de la membrana. Estos cambios in vi tro están asociados con una reducción en la recuperación de 24 horas de la irradiación gama de las células rojas. Con respecto a los productos de plaquetas, al menos, una publicación ha sugerido alguna pérdida en la viabilidad. Evidencia considerable indica que la irradiación gama ejerce sus efectos generando especies de oxigeno activado, tales como oxigeno singlete, hidroxi, radical y anión superóxido. Estas especies inducen el daño intracelular al ADN y asi, previenen la replicación celular, un prerrequisito al PH-CIAT. Sin embargo, estas mismas especies de oxigeno pueden oxidar los lipidos de la membrana en las &£._ _S _m_ -_t__________,<- _ _. -¿>#iH-^___., _l ____*___._. __*&_. ._ .. .___.... i. _.. .*.* . ^ _. _.>... ___ -.^. . ^_. _ .___. _ __ __ -___gfa.- _ células rojas y posiblemente la membrana de las plaquetas, induciendo una lesión en la membrana, la cual reduce la calidad (potencia) del producto celular. La LC se conoce que juega un papel clave en la transportación de las cadenas largas de ácidos grasos a través de la membrana mitocondrial . Las alteraciones hereditarias en la cuales hay una falla del sistema de carnitina para transportar las cadenas largas de ácidos grasos, resulta en una diferencia significante en la función del músculo esqueleto. Recientemente, se ha incrementado el interés en el papel de la LC en la membrana de células rojas. Que ha sido sorprendente sin embargo, es que las células rojas carecen de mitocondrias y asi, redondea considerable curiosidad la presencia de LC y transferasa de palmitoilo de carnitina, una enzima involucrada en la acilación reversible de LC . No es claro el papel el cuál ésta pueda jugar dentro de las células rojas. Las células rojas pueden ser sometidas a estrés oxidante a través se su ciclo de vida largo in vi vo, y a la reparación de los lipidos de las membranas oxidadas, involucrando LC, que podria ser importante para la supervivencia normal de las células rojas. El incremento temprano en la carnitina acilada durante un tiempo de biodisponibilidad de ATP incrementada, puede funcionar como un reservorio de ácidos grasos activados, los cuales puede subsecuentemente, ser usados en un mecanismo de reparación para los lipidos de las membranas oxidadas dañadas. Tal explicación podria explicar bien la hemolisis reducida observada durante el almacenamiento in vi tro de las células rojas de la sangre supra y en adición, podria explicar el mejoramiento observado con la recuperación y supervivencia in vivo . El efecto neto de la adición de LC es un aproximado del 17% de incremento en la potencia. En consecuencia, la LC puede ser usada para anular o prevenir las lesiones de la membrana inducidas por la irradiación. Esto podria ocurrir a través de la habilidad de la carnitina almacenada en las células rojas para reparar in vi tro los lipidos de la membrana oxidada. Para limitar la susceptibilidad de los productos sanguíneos (CCR, CP y similares) a las lesiones de la membrana y hemolisis, el producto sanguíneo puede ser primero suspendido en una solución que incluye LC en una cantidad de 0.25 mM-50 mM, el mantenimiento de la membrana celular y supresión de hemolisis se alcanza a un grado suficiente que el producto sellado puede ser irradiado para los propósitos de esterilización, y subsecuentemente puede gozar de una vida de anaquel extendida y una vida media de circulación después de la transfusión. La viabilidad en el orden de viabilidades actuales puede lograrse, con materiales mas cercanamente ciertos a ser estériles y diferentes para introducir PH-CIAT, debido a la irradiación después de sellar la suspensión del producto sanguíneo. Para enfatizar que el termino producto sanguíneo, en esta conexión es interpretado ampliamente, se incluye sangre completa, plasma de sangre, CRS, CP, mezclas y similares .

I . El uso de L-carn tma para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas de almacenamiento prolongado Antecedente: La L-carnitina (LC) reduce la glicolisis en concentrados de plaquetas de almacenamiento prolongado (> 5 días) (Sweeny et al., 25 Congress of the International Society of Blood Transfusión. Oslo, Noruega, Junio 27-Jul?o 2, 1998, en Vox Sanguinis, vol. 74. no. Suppl. 1, p. 1226; y Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40 Annual Meetmg, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998) . El efecto de LC en el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas es importante para evaluar si el LC es usado como un aditivo. Métodos de Estudio: Se combinaron dos concentrados -ts.— «_. fefe A , il .

ABO idénticos de plaquetas pre-almacenadas-leuco reducidas, producidas por una filtración en linea de plasma rico en plaquetas (MedSep Corp. Covina, CA) , después se dividieron igualmente en dos bolsas de CLX®(MedSep) . Ya sea LC a una concentración final de 5 mM, o salina (control), se agregaron a uno de cada par. Cada contenedor se perforó con 1 ml de una suspensión de coagulasa negativa de estafilococos al Dia 0 a una concentración final entre 1-48 CFU/mL. Las muestras se removieron de cada contenedor asépticamente al Dia 3, Dia 6 y 10 ya sea al Dia 7 o Dia 8 para el conteo de colonias. Los datos se analizaron por la prueba de t apareada. Resultados : Doce pares de concentrados se estudiaron. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla abajo. Por el dia 7/8, el crecimiento en los contenedores de 15 L-carnitma fue el 33% que de los controles. Conclusión : La L-carnitina a 5 M, retarda el crecimiento de la coagulasa negativa de estafílococci en los concentrados de plaquetas liquidas almacenadas. 20 BÍ-í-i-J- -H-B S a-i--i--_> .¿k>atr.? ?__Á _.& .-$&éíttx a»M&«»?_. - .. «..I.

Par ControlL* L--carnitin L* P Dia 0 11 1.12+0. .7 1.12+0.7 N/A Dia 3 11 3.11+0. .7 3.04+0.7 0.43 Dia 6 8 4.28+1. .3 3.88+1.0 0.05 Dia 7/8 11 5.09+1. ,5 4.60+1.5 0.002 * Crecimiento bacteriano expresado en Log de CFU/ml II . El uso de L-carnitina para reducir la glicólisis durante el almacenamiento prolongado de plaquetas aleatorias prealmacenadas-leuco-reducidas Antecedente : La L-carnitina (LC) reduce la glicólisis en concentrados de plaquetas almacenadas estándares (no leuco-reducidas) por cinco-diez dias (Sweeny et al., 25 Congress of the International Society of Blood Transfusión. Oslo, Noruega, Junio 27-Julio 2, 1998, en Vox Sanguinis, vol. 74. no. Suppl. 1, p. 1226; y Sweeny et al., The /American Society of Hematology, 40 Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998) . Un efecto similar en las plaquetas de donadores aleatorios pre-almacenadas-leuco-reducidas no se ha demostrado previamente. Diseños de Estudio: Se combinaron dos concentrados ABO idénticos de plaquetas pre-almacenadas-leuco reducidas, ?¿_t^___ ^^:si_._i.k._í_^.-_.ff... ________._.., ¿_fe.-¿=-_i*___. _,. _ . __*-<_.».-- ___^ . producidas por una filtración en linea de plasma rico en plaquetas (MedSep Inc., Corvina, CA) , después se dividieron igualmente en dos contenedores de CLX®(MedSep) . Ya sea L-Carnitina (concentración final de 5 mM) o salina, se agregaron a una bolsa de cada par de plaquetas. Las plaquetas se almacenaron por ya sea siete u ocho dias a 22 °C en un agitador plano, después se sometieron a prueba. Las pruebas realizadas fueron pH, conteo de plaquetas, glucosa sobrenadante y lactato, expresión de p-selectina de la superficie por citometria de flujo, extensión del cambio de forma (ESC) y respuesta al golpe hipotónico (HSR) . El consumo de glucosa y la producción de lactato se calcularon como mM/1012 plaquetas por dia. Los datos se analizaron usando las pruebas de t-apareadas. Resultados : Siete (7) pares de concentrados se estudiaron. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla abajo . Conclusión : La L-carnitina reduce la glicólisis en plaquetas almacenadas de donadores aleatorios pre-almacenados-leuco reducidos. .l? .?_ i, _Ll*?~i** ~, -__?i____r _ . . „„_h_„. ..-.&..._._ _....,^...-,.,,. .... -í..i. . .....

Control L-carnitma P pH 6 . 97+0 . 2 7.09+0.1 <0.01 Concentración de 1 . 25+0 . 2 1.13+0.2 <0.01 glucosa Producción de lactato 1.73+0.3 1.50+0.2 <0.01 P-selectina (% 74 +4 69+9 0.04 positivo) ESC (%) 11 +5 12 +4 0.35 HRS (%) 45+ 13 50+22 0.64 La invención de esta solicitud de patente se ha descrito en tanto términos genéricos como de referencia por los ejemplos específicos. Las variaciones ocurrirán por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica sin el ejercicio de la facultad inventiva. En particular, las composiciones estabilizantes alternas, productos sanguíneos, preservativos, inhibidores y los mismos pueden ser modificados, sin el ejercicio de habilidad inventiva. Adicionalmente, los niveles específicos, periodos de viabilidad y vida media de circulación, variarán de donador a donador y de receptor a receptor. Tales variaciones permanecerán dentro del ámbito de la invención, a menos que I -¿ -i i ... A .t - it.S-i...- ... . _ >,_____m. -- i t i específicamente se excluya por las menciones de las reivindicaciones expuestas abajo.

Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la anterior como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para suprimir el crecimiento bacteriano en la sangre completa o una fracción de la misma, caracterizado porque comprende agregar a la sangre completa o una fracción de sangre, un compuesto seleccionado del grupo que consiste de L-carnitina, sales de L-carnitina, L-carnitinas de alcanoilo, sales de L-carnitinas de alcanoilo y mezclas de los mismos, en una cantidad efectiva para suprimir el crecimiento bacteriano en la sangre completa o fracción de sangre .

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción de sangre se selecciona del grupo que consiste de células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada, concentrados de plaquetas, plasma y derivados del plasma.

3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la fracción de sangre es de células rojas de la sangre envasada, y en donde el método comprende suspender las células rojas de la sangre envasada en una solución de ...... . -.., . -—-' - -• —- - -— r r T'f t i \ ÉÉá soporte, la cual comprende el compuesto.

4. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la fracción de sangre es de células blancas de la sangre envasada, y en donde el método comprende suspender las células blancas de la sangre envasada en una solución de soporte, la cual comprende el compuesto.

5. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la fracción de sangre es un concentrado de plaquetas, y en donde el método comprende suspender el concentrado de plaqueta en una solución de soporte, la cual comprende el compuesto .

6. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la fracción de sangre es plasma o un derivado de plasma y en donde el método comprende suspender el plasma o un derivado de plasma en una solución de soporte la cual comprende el compuesto.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 0.25 hasta 50 mM.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 1 hasta 30 mM.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es L-carnitina.

10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de L-carnitina de acetilo, L-carnitina de propionilo, L-carnitma de butirilo, L-carnitina de isobutilo, L-carnitina de valerilo y L-carnitina de isovalerilo.

11. Un método para reducir la glicólisis en la sangre completa o una fracción de la misma, caracterizado porque la fracción se selecciona del grupo que consiste de células rojas de la sangre envasada, células blancas de la sangre envasada, concentrados de plaquetas, plasma y derivados del plasma, que comprenden agregar a la sangre completa o una fracción de sangre, un compuesto seleccionado del grupo que consiste de L-carnitina, sales de L-carnitina, L-carnitinas de alcanoilo, sales de L-carnitinas de alcanoilo, y mezclas de las mismas, en una cantidad efectiva para reducir la glicólisis en la sangre completa o fracción de sangre.

12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la fracción de sangre es de células rojas de la sangre envasada, y en donde el método comprende suspender las células rojas de la sangre envasada en una solución de soporte la cual comprende el compuesto. IA ..i?t_-it ___***A Á*?- . -..-.--,-.. ..- -.,. .. .. „«_._.___ .. , . ,._._... ,. ,...-_ „__- ,.. _. _. _. - ......y

13. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la fracción de sangre es de células blancas de la sangre envasada, y en donde el método comprende suspender las células blancas de la sangre envasada en una solución de soporte la cual comprende el compuesto.

14. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la fracción de sangre es el plasma o un derivado del plasma, y en donde el método comprende suspender el plasma o derivados del plasma en una solución de soporte la cual comprende el compuesto.

15. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 0.25 hasta 50 mM.

16. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 1 hasta 30 mM.

17. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es L-carnitina.

18. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de L-carnitina de acetilo, L-carnitina de propionilo, L-carnitina de butirilo, L-carnitina de isobutilo, L-carnitina de valerilo y L-carnitina de isovalerilo .

19. Un método para reducir la glicólisis en la sangre en concentrados de plaquetas de donadores aleatorios pre-almacenados-leuco-reducidos, caracterizado porque el método comprende suspender el concentrado de plaquetas en una solución de soporte la cual comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste de L-carnitina y sales de L-carnitina, en una cantidad efectiva para reducir la glicólisis en el concentrado de plaquetas de donadores aleatorios pre-almacenados-leuco-reducidos .

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 0.25 hasta 50 mM.

21. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto está comprendido en la solución de soporte en una concentración de 1 hasta 30 mM. í .i ¿A? _ ?