ES2206256T3

ES2206256T3 - Almacenamiento y conservacion mejorados de hemoderivados incluyendo globulos rojos y plaquetas.

Info

Publication number: ES2206256T3
Application number: ES00940739T
Authority: ES
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2020-06-05
Also published as: US20040146846A1; BR0011430A; HK1044099B; JP2003501364A; PL352208A1; DE60005343D1; IL146517A; ATE249738T1; EP1187530B1; US7851142B2; CA2374140C; CA2374140A1; SK287562B6; DK1187530T3; US20070248941A1; IL146517A0; BR0011430B1; HUP0201465A2; AU5563700A; HUP0201465A3

Abstract

Un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa o una fracción de la misma, que comprende la adición a sangre completa o a una fracción sanguínea de un compuesto seleccionado del grupo constituido por L-carnitina, sales de L-carnitina, alcanoil L-carnitinas, sales de alcanoil L-carnitinas, y mezclas de las mismas, en una cantidad efectiva para suprimir el crecimiento bacteriano en dicha sangre completa o fracción sanguínea.

Description

Almacenamiento y conservación mejorados de hemoderivados, incluyendo glóbulos rojos y plaquetas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención trata de un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos (GR), concentrados de glóbulos blancos (GB), concentrados de plaquetas, plasma y derivados plasmáticos, que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. La presente invención trata además de un procedimiento para reducir la glucólisis en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos (GB), concentrados de plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionados antes del almacenamiento, plasma y derivados plasmáticos, que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Discusión sobre los antecedentes

La preocupación respecto a las reservas de sangre tanto a nivel nacional como internacional ha crecido continuamente. Se ha llevado a debate tanto la integridad como la fiabilidad de las reservas existentes, así como la capacidad de desarrollar mayores existencias con el tiempo. Una de las razones de esto es el relativamente corto periodo de estabilidad al almacenamiento de los hemoderivados. Actualmente, los concentrados de GR (CGR), la forma predominante de hemoderivado para transfusiones y similares, se limitan a un periodo de almacenamiento de 42 días. Después de ese tiempo, los niveles de ATP caen considerablemente, junto con una pérdida significativa de pH, lo que indica firmemente una falta de viabilidad o, en caso de viabilidad, una vida de circulación extremadamente corta tras la infusión, in vivo. La sangre completa no se almacena durante periodos considerables. Para las plaquetas, el periodo actual de almacenamiento es incluso más corto, estando el estándar en 5 días a 22ºC. La diferencia en la estabilidad al almacenamiento de los concentrados de plaquetas (CP), opuesta a la de los GR, es debida a reacciones metabólicas en curso en las plaquetas, debido en parte a la presencia de mitocondrias en el CP, y a su ausencia en los GR. Mientras que ambos hemoderivados muestran una caída del ATP, unida a una caída del pH con el tiempo, acompañada por la producción de ácido láctico, la presencia de mitocondrias en el CP probablemente agrava el problema, debido a la glucólisis.

Simultáneamente, ha aumentado la preocupación sobre la fiabilidad e integridad de las reservas de sangre. En particular, se ha detectado repetidamente contaminación de las reservas de sangre con bacterias u otros agentes microbiológicos. Tal situación es incluso más grave en países con procedimientos de recogida y almacenamiento menos sofisticados. Aunque pueden añadirse agentes al producto recogido para reducir la contaminación, éstos no son deseables dada la necesidad de transfundir los productos de vuelta a los pacientes receptores. Una alternativa deseable es el tratamiento por radiación de los productos tras su envasado, típicamente en recipientes plásticos de vinilo plastificado. Tal tratamiento por radiación podría perjudicar a los GR y quizás durante el almacenamiento del CP, produciendo una función disminuida de estas células.

Adicionalmente, una porción pequeña pero creciente de población receptora de sangre corre el riesgo de padecer un cuadro clínico generalmente fatal conocido como "enfermedad injerto contra huésped asociada a la transfusión" (EICH-AT), que es debida a la presencia de leucocitos alogénicos viables.

Este síndrome está asociado típicamente con pacientes inmunodeprimidos, tales como pacientes con cáncer o transplantados de médula ósea, pero también se puede producir en personas inmunocompetentes en el caso de polimorfismo del CMH limitado en la población.

Se ha prestado una especial atención a la búsqueda de procedimientos para prolongar la estabilidad al almacenamiento. Uno de estos procedimientos para aumentar el tiempo de vida de almacenamiento de los CP se describe en la patente de EE.UU. 5.466.573. Esta patente está dirigida a proporcionar preparaciones de CP con fuentes de ión acetato, que actúa tanto como sustrato para la fosforilación oxidativa como de tampón para contrarrestar cualquier disminución del pH debida a la producción de ácido láctico. Dicho procedimiento no actúa directamente sobre el problema de la hemólisis y la rotura de membranas. En la patente de EE.UU. 5.496.821 se describe un procedimiento alternativo, por el inventor de la presente invención y comúnmente asignado. En esta patente se almacena sangre completa en una preparación que incluye L-carnitina (LC) o derivados alcanoílos de la misma. La patente no describe, sin embargo, los efectos sobre hemoderivados tales como suspensiones de CP o GR, y se basa al menos en parte en el impacto de la LC sobre las características del plasma.

El documento WO87/03484 describe una disolución para estabilizar glóbulos rojos durante su almacenamiento en la que una concentración efectiva de un inhibidor de una etapa de la vía metabólica de la glucólisis que es posterior a la etapa que forma 2,3-DPG, este inhibidor puede ser ácido oxálico o su sal sódica o potásica o un derivado de los mismos. El documento EP0272551 describe sistemas para almacenamiento de sangre que contienen un derivado de ácido carboxílico de quinolona como agente antibacteriano. El documento EP0552137 proporciona ésteres de acilcarnitinas útiles como agentes antibacterianos, teniendo dichos compuestos un alcohol de cadena larga (de 7 a 15 átomos de carbono)como parte éster; estos compuestos están indicados para su administración por vía sistémica. El documento WO97/16967 describe un procedimiento y una composición para proteger la sangre y sus componentes del estrés oxidativo mediante la adición de un antioxidante a la sangre o a su componente. En Arduini y col., en Transfusion, Volumen 37, febrero de 1997, 166-174, y en el documento WO98/46073, se discute la adición de L-carnitina a los GR almacenados a 4ºC con objeto de prolongar su viabilidad, pero no se menciona un posible efecto de la L-carnitina de suprimir el crecimiento bacteriano en sangre o sus componentes ni de reducir la glucólisis en concentrados de plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionados antes del almacenamiento.

Como se apunta anteriormente, la contaminación de las reservas de sangre con agentes microbiológicos es otro problema al que debe dirigirse la comunidad médica. Un procedimiento para esterilizar el producto y mejorar su fiabilidad con respecto a la contaminación consiste en irradiar el hemoderivado. En general, es deseable un valor de radiación gamma de aproximadamente 25 centigray (cG), irradiando el producto después de precintarlo en un recipiente de plástico, vidrio u otro. Lamentablemente, la radiación induce lesiones en la membrana celular con hemólisis en los GR. La radiación de hemoderivados, incluyendo sangre completa, concentrados de GR y CP continúa presentando problemas.

Además, todavía no se ha informado sobre el efecto de la L-carnitina sobre el crecimiento bacteriano en hemoderivados, tales como sangre completa, concentrados de glóbulos rojos y concentrados de plaquetas. Similarmente, no se ha demostrado el efecto de la L-carnitina sobre la glucólisis en hemoderivados tales como sangre completa, concentrados de glóbulos rojos, concentrados de plaquetas, y particularmente, plaquetas aleatorias leucodeplecionadas antes del almacenamiento.

Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa que se almacena durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en fracciones sanguíneas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en fracciones sanguíneas que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de glóbulos rojos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de glóbulos rojos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de glóbulos blancos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de glóbulos blancos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en plasma o derivados plasmáticos.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en plasma o derivados plasmáticos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en sangre completa.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en sangre completa que se almacena durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en fracciones sanguíneas.

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Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en fracciones sanguíneas que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de glóbulos rojos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de glóbulos rojos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de glóbulos blancos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de glóbulos blancos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de plaquetas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de plaquetas que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionadas antes del almacenamiento.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionadas antes del almacenamiento que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en plasma o derivados plasmáticos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la glucólisis en concentrados de plasma o derivados plasmáticos que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Estos y otros objetos, que se harán patentes durante la siguiente descripción detallada, han sido conseguidos por el hallazgo del inventor, a lo largo de una extensa investigación, que el daño en las membranas experimentado por los GR y CP durante el almacenamiento, o frente a una radiación, pueden retrasarse y suprimirse sustancialmente mediante la suspensión del hemoderivado en una disolución conservante convencional tal como AS-3, en la que la disolución conservante incluye además L-carnitina o un derivado alcanoílo de la misma, en una concentración de 0,25-50 mM o más. El hallazgo del solicitante reposa sobre la identificación de que la mayor parte de la descomposición de los hemoderivados, habitualmente asociada con disminuciones de los niveles de ATP y del pH, puede ser de hecho debida a daño en la membrana y hemólisis. La conservación y reparación de la membrana puede realizarse mediante reacilación lipídica, efectuada en parte a través de la LC, cuya captación irreversible por parte de los GR y hemoderivados similares ha sido establecida a lo largo de esta investigación inventiva. El inventor también ha descubierto que la L-carnitina elimina el crecimiento bacteriano en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos (GB), concentrados de plaquetas, plasma y derivados plasmáticos, que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. El inventor ha descubierto además que la L-carnitina reduce la glucólisis en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos (GB), concentrados de plaquetas, particularmente plaquetas aleatorias leucodeplecionadas antes del almacenamiento, plasma y derivados plasmáticos, que se almacenan durante periodos prolongados de tiempo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 valores de duración de la vida tras infusión de GR almacenados durante 42 días relativos al donante y al control y a LC almacenada. Las flechas indican la media \pm DT del control y de GR con LC almacenada, respectivamente. En la parte superior del gráfico también se muestra el valor exacto calculado de p.

Figura 2 contenido en carnitina de los glóbulos rojos a diferentes semanas de la conservación de la sangre. La carnitina se analizó según se describe en Materiales y Procedimientos. Los valores son la media de tres experimentos realizados por duplicado. La variación entre los experimentos no fue mayor del 7%. Los puntos blancos se refieren a GR almacenados sólo con AS-3; los puntos negros se refieren a GR almacenados en AS-3 complementado con LC (5 mM).

Figura 3 incorporación de ácido palmítico radioactivo en GR con LC a diferentes semanas de la conservación de la sangre. Las alícuotas de GR que se tomaron tanto de la unidad de sangre almacenada sólo con AS-3 como con AS-3 más LC, se incubaron a 37ºC con ácido palmítico [1-14C] complejado con ácido graso libre de ASB. Al final de la incubación se procesaron los GR según se describe en Materiales y Procedimientos. La formación de PLC radiomarcada se refirió al contenido en fósforo presente en el extracto lipídico. Los valores son la media de tres experimentos realizados por duplicado. La variación entre los experimentos no fue mayor del 7%. Los puntos blancos se refieren a GR almacenados sólo con AS-3; los puntos negros se refieren a GR almacenados en AS-3 complementado con LC (5 mM).

Figura 4 incorporación de ácido palmítico radioactivo en la membrana de glóbulos rojos de fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilcolina (PC) a diferentes semanas de la conservación de la sangre. Las alícuotas de GR que se tomaron tanto de la unidad de sangre almacenada sólo con AS-3 como con AS-3 más LC, se incubaron a 37ºC con ácido palmítico [1-14C] complejado con ácido graso libre de ASB. Al final de la incubación se procesaron los GR según se describe. Los resultados se dan como pmol de ácido palmítico [1-14C]/\mug de fósforo lipídico presente en el extracto lipídico. Los valores son la media de tres experimentos realizados por duplicado. La variación entre los experimentos no fue mayor del 7%. Los puntos blancos se refieren a GR almacenados sólo con AS-3; los puntos negros se refieren a GR almacenados en AS-3 complementado con LC (5 mM).

Figura 5 el sistema de carnitina y las reacciones de reacilación de los fosfolípidos de membrana. Las flechas gruesas indican el flujo de acilo preferente. El tamaño de la caja de L-carnitina muestra el tamaño probable del conjunto relacionado. Las abreviaturas usadas son: LPL, lisofosfolípidos; PLP, fosfolípidos; Cn, carnitina; acil-Cn, acil-carnitina; ACS, acilCoA sintetasa; LAT, lisofosolípido acilCoA transferasa; CPT, carnitina palmitoil transferasa.

Descripción detallada de la invención

La invención emplea L-carnitina y sus derivados alcanoilos como un agente de mantenimiento en la conservación y reparación de la membrana celular y la eliminación de la hemólisis en los hemoderivados. La presente invención también proporciona un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos, concentrados de plaquetas, plasma y derivados plasmáticos. La presente invención proporciona además un procedimiento para reducir la glucólisis en sangre completa y fracciones sanguíneas, incluyendo concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos, concentrados de plaquetas, plasma y derivados plasmáticos.

Las alcacanoil L-carnitinas adecuadas incluyen C2-8-alcanoil L-carnitinas, y las alcacanoil L-carnitinas preferibles incluyen acetil, butiril, isobutiril, valeril, isovaleril, y particularmente, propionil L-carnitina. En la presente memoria se hace referencia a esta familia de forma genérica como LC, y la ejemplificación es en términos de L-carnitina. Sin embargo, pueden usarse las alcanoil L-carnitinas descritas y sus sales farmacológicamente aceptables en lugar de L-carnitina.

Algunos ejemplos de sales adecuadas de L-carnitina incluyen, por ejemplo, cloruro de L-carnitina, bromuro de L-carnitina, orotato de L-carnitina, aspartato ácido de L-carnitina, fosfato ácido de L-carnitina, fumarato de L-carnitina, lactato de L-carnitina, maleato de L-carnitina, maleato ácido de L-carnitina, oxalato ácido de L-carnitina, sulfato ácido de L-carnitina, fosfato de L-carnitina glucosa, tartrato de L-carnitina, tartrato ácido de L-carnitina y mucato de L-carnitina.

Algunos ejemplos de sales de alcanoil L-carnitina adecuadas incluyen, por ejemplo, cloruros de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, bromuros de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, orotatos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, aspartatos ácidos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, fosfatos ácidos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, fumaratos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, lactatos de alcanoil C_{2-8}L-carnitina, maleatos de alcanoil C_{2-8}L-carnitina, maleatos ácidos de alcanoil C_{2-8}L-carnitina, oxalatos ácidos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, sulfatos ácidos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, fosfatos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina glucosa, tartratos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina, tartratos ácidos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina y mucatos de alcanoil C_{2-8} L-carnitina.

La adición de LC a sangre completa o fracciones sanguíneas, incluyendo GR, GB, CP, plasma y derivados plasmáticos, requiere que la LC esté presente en una cantidad efectiva para permitir la conservación de la membrana, la reparación y la eliminación de la hemólisis y/o para suprimir el crecimiento bacteriano y/o reducir la glucólisis. La investigación emprendida, incluyendo los ejemplos detallados a continuación, ha mostrado un intervalo efectivo mínimo para los productos de la mayoría de los donantes de aproximadamente 0,25 mM-0,50 mM. El límite superior es más práctico que fisiológico. Concentraciones tan altas como 50 mM o mayores son toleradas con facilidad. Son aceptables los valores que son coherentes con las consideraciones toxicológicas y osmológicas. Los intervalos preferibles son 1-30 mM. Un intervalo de 1-10 mM o más es adecuado con valores entre 4-6 mM dando una marcada diferencia. Los efectos de esta invención, incluyendo la prolongación de la viabilidad y la extensión de la vida media de circulación tras la transfusión, pueden ser altamente dependientes del donante. Consecuentemente, hablando de modo general, una concentración efectiva de LC es 0,5-50 mM; sin embargo, el experto habitual en la materia puede requerir ampliar este intervalo en cualquier dirección, dependiendo de las particularidades del donante. Tales ampliaciones no requieren un esfuerzo inventivo.

La LC es compatible con disoluciones de mantenimiento convencionales (disoluciones estabilizantes), que se preparan típicamente para proporcionar un efecto tamponante. Las disoluciones habitualmente empleadas incluyen ACED (ácido cítrico-citrato sódico-dextrosa), CPD (citrato-fosfato-dextrosa) y modificaciones de las mismas, incluyendo CDP2/A-3 y composiciones relacionadas. Típicamente, la composición incluye un carbohidrato como glucosa o manitol, al menos una sal de fosfato, un citrato y otras sales de equilibrio. La LC habitualmente es soluble en agua, y puede añadirse a estas composiciones en forma libre dentro del intervalo requerido. Las disoluciones adecuadas se describen en la patente de EE.UU. 5.496.821., se incorporan en la presente memoria a modo de referencia. Nótese, sin embargo, que pueden usarse con LC, en la invención, disoluciones de mantenimiento distintas a las usadas habitualmente, incluyendo el plasma artificial y otras disoluciones fisiológicamente aceptables. El componente importante de la disolución de mantenimiento es la LC.

La capacidad de la LC para prolongar el tiempo viable, y por tanto, la duración de almacenamiento y el periodo de circulación tras la transfusión en el individuo receptor, cuando está incluida en sangre completa o en la suspensión de fracciones sanguíneas, tales como GR, GB, CP, plasma y derivados plasmáticos, se ejemplifica a continuación mediante experimentación in vitro e in vivo. La experimentación emplea LC, pero pueden emplearse alcanoil L-carnitinas. Es de especial importancia en la siguiente demostración, a continuación que la realización mejorada se obtiene mediante una conservación mejorada (incluyendo la reparación) de la membrana celular y la eliminación de la hemólisis.

Materiales y procedimientos

Diseño de estudio I

Evaluación de la calidad in vitro e in vivo de GR almacenados con y sin LC

Sujetos: la población de sujetos era de sujetos de investigación machos o hembras con edades comprendidas entre los 18 y los 65 años, sin ninguna discapacidad mental o física conocida y sin tomar medicamento alguno que pudiera afectar a la viabilidad de los GR. Se reclutaron individuos que cumplían con los criterios de donación alogénica habituales, según se detalla en el Code of Federal Register, Capítulo 2, de Standars of the American Association of Blood Banks, y de Blood Services Directives of the American National Red Cross. El estudio fue aprobado por el Institutional Review Board of the Medical College of Hampton Roads, y los sujetos dieron consentimiento informado previo a la participación en el estudio.

Cada donante donó en dos ocasiones diferentes separadas por 72 días, y en la primera donación se decidió aleatoriamente el brazo de ensayo o el de control.

Sistema de almacenamiento de la sangre: sistema estándar CP2D/AS-3 (Miles, Inc.). Se usó plástico de cloruro de polivinilo (PVC), con dietil-(n)hexil-ftalato (DHEP) como plastificante. Para cada unidad de ensayo se añadieron al envase, que contenía la disolución de aditivo AS-3, 245 mg de LC (en 1,1 ml de disolución pura, libre de pirógenos, en un recipiente de vidrio esterilizado), para dar una concentración final de 5 mM. Para las unidades de control se añadieron 1,1 ml de NaCl al 0,9% a la disolución de AS-3 usando las mismas condiciones. La adición de LC o salino a las bolsas se realizó mediante inyección a través del conector del punto de muestreo con una jeringa. Esto se realizó en una campana de flujo laminar bajo luz UV.

Donación y tratamiento: se usaron procedimientos estándar de flebotomía y extracción de sangre, recogiendo aproximadamente 450\pm50 ml de sangre completa. La unidad de sangre completa se mantuvo entre 4-8 horas a temperatura ambiente antes de su tratamiento. La unidad se centrífugo en condiciones estándar, y después de la centrifugación se retiró el plasma sobrenadante, y el sedimento de concentrado de GR se resuspendió bien en la disolución estándar AS-3 (control) o bien en la disolución de AS-3 que contiene carnitina (ensayo). Las unidades de GR suspendidas se almacenaron a 4ºC durante 42 días.

Medidas in vitro: se realizaron medidas en pre-muestras (0 días) y post-muestras (42 días) que incluían niveles de ATP de los GR; hemoglobina total y sobrenadante; hematocrito (Hct); recuento GR, GB, y plaquetas; fragilidad osmótica de GR; morfología de GR; niveles de lactato y de glucosa; niveles de potasio sobrenadante. Estas medidas se realizaron usando procedimientos estándar según se describió previamente, en Heaton y col., Vox Sang 57: 37-42 (1989).

Medidas in vivo post-transfusión: tras 42 días de almacenamiento se tomó una muestra, y las células almacenadas se marcaron con Cr usando procedimientos estándar. Al mismo tiempo, para determinar el peso de GR, se tomó una muestra fresca del donante para marcar el GR con 99Tc. Tras el marcaje se mezclaron 15 \muCi de células almacenadas marcadas con 51Cr y 15 \muCi de células frescas marcadas con 99Tc y se infundieron simultáneamente. Se tomaron muestras de sangre (5 ml) tras la infusión a diversos intervalos de tiempo durante hasta 35 días, para calcular el porcentaje de recuperación y supervivencia en 24 horas. El porcentaje de recuperación en 24 horas se determinó usando bien el procedimiento de marcaje único, en el que se usó la regresión lineal logarítmica de los niveles de radioactividad de las muestras tomadas a 5, 7,5, 10 y 15 min para determinar el nivel a tiempo 0, o mediante el procedimiento de marcaje doble, usando el peso de GR del donante según se determinó mediante la medida de 99Tc.

La duración de la vida de circulación de los GR transfundidos supervivientes marcados con Cr se determinó mediante muestras tomadas a las 24 horas y después dos veces por semana durante hasta 5 semanas. Los niveles de radioactividad se corrigieron para una constante de elución del 1% al día. Los datos se ajustaron a una función lineal, con los días de post-transfusión como variable independiente (eje x) y los recuentos corregidos de Cr como variable dependiente (eje y). La duración de la vida de los GR se tomó entonces como la intersección de la línea ajustada con el eje x.

Análisis estadístico: se realizó una prueba de la t para datos emparejados o análisis estadístico no paramétrico rutinario sobre los datos de los ensayos in vivo e in vitro de las unidades, para determinar si había diferencias estadísticamente significativas (1-final) en las medias entre las unidades de ensayo y las de control. Se consideró que había significación estadística a valores de p inferiores a 0,05.

Diseño de estudio II

Estudios de captación de LC por eritrocitos y reacilación lipídica con almacenamiento de hasta 42 días

Química: esencialmente, los ácidos grasos libres de albúmina sérica bovina (ASB) se obtuvieron de Sigma Chemical Companuy, St. Louis, Mo. (Estados Unidos). El ácido [1-14C]palmítico (58 Ci/mol) se obtuvo de New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (Estados Unidos). Las placas de capa fina, Whatman LK6 (gel de sílice) (20 x 20 cm) con una capa pre-absorbente, se obtuvieron de Carlo Erba, Milán (Italia). La palmitoil-L-carnitina (PLC) y la LC fueron una amable donación de Sigma Tau, Pomezia (Italia). Todos los demás compuestos usados fueron de pureza analítica.

Análisis de carnitina en glóbulos rojos: se tomó una muestra de sangre de la unidad de CGR almacenada y se lavó una vez con 4 vol. de NaCl al 0,9% frío. Los GR se resuspendieron entonces en NaCl al 0,9% hasta un hematocrito final del 50%, y se desproteinizaron con ácido perclórico según se describe en Cooper y col., Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988). Se analizaron alícuotas del extracto final para el contenido de LC libre según el análisis radioquímico de Pace y col., Clin. Chem. 24: 32-35 (1978).

Análisis de la reacilación de los lípidos del complejo de membrana en GR almacenados: se tomó una muestra de sangre de la unidad de CGR almacenada a través de un conector del punto de muestreo con una jeringa, y la muestra se trató inmediatamente. Esto se realizó con una campana de flujo laminar bajo luz UV. Todas las manipulaciones ser realizaron a 0-5ºC, salvo indicación expresa. Los GR se lavaron dos veces con 4 vol. de NaCl al 0,9% frío. Los GR aislados se lavaron de nuevo una vez con tampón de incubación (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM, NaH2PO4 1mM, sacarosa 40 mM, glucosa 5 mM, Tris-HCl 10 mM, a pH 7,4) y se resuspendieron en el mismo tampón hasta un hematocrito final del 5%. Se usó un baño rotavapor agitador a 37ºC para las incubaciones. Los GR se incubaron con el ácido palmítico radioactivo (10 \mum) complejado con ácido graso libre de ASB (1,65 mg/ml). Las incubaciones finalizaron mediante el lavado de las células una vez con tampón de incubación frío, tres veces con ácido graso libre de ASB al 1% en tampón de incubación, y finalmente de nuevo una vez con tampón de incubación. Los lípidos de los GR se extrajeron de las células intactas con el procedimiento de Rose & Oaklander, J. Lipid Res. 6: 428-431 (1965). Con objeto de evitar la oxidación de los lípidos se añadió hidroxitolueno butilado al 0,1% a los extractos lipídicos. Se usaron alícuotas del extracto lípídico para la determinación del contenido en fósforo lípídico, y se analizó mediante cromatografía bidimensional en capa fina. En breve se desarrollaron los cromatogramas usando cloroformo-metanol-amoniaco al 28% (65:25:5) en las primera dimensión. Los cromatogramas se desarrollaron entonces usando cloroformo-acetona-metanol-ácido acético-agua (6:8:2:2:1) en la segunda dimensión. La fosfatidilcolina (PC), una fosfatidiletanolamina (PE), y la fosfatidilserina se visualizaron mediante una breve exposición de las placas a yodo, y se identificaron usando estándares como referencia. Las manchas de fosfolípidos individuales se rasparon y se introdujeron en viales que contenían fluido de centelleo, y se determinó la radioactividad mediante el recuento del líquido de centelleo. La identificación y el análisis de la PLC radioactiva se llevó a cabo según se describió recientemente, en Arduini y col., J. Biol. Chem., 267:12673-81 (1992). La eficacia del recuento se evaluó mediante un estándar externo. Los cálculos se basan en las actividades específicas del ácido palmítico radioactivo.

Estudio I

Características de la unidad de pre-almacenamiento de CGR con AS-3

Las propiedades de los productos CGR AS-3 fueron como se esperaban después del tratamiento de las unidades de sangre completa. No se observaron diferencias significativas entre las unidades de ensayo y las de control en las características de las unidades de GR con AS-3 medidas por volumen unitario, hematocrito, y contenido en GB, y las propiedades in vitro de los GR tales como niveles de ATP, hemoglobina sobrenadante y niveles de potasio, fragilidad osmótica (Tabla 1).

TABLA 1 Pre-almacenamiento de GR. Características de los concentrados de glóbulos rojos

	Control	Ensayo (L-carnitina)
Volumen de la unidad (ml)	305 \pm 38	295 \pm 41
Hematocrito de la unidad (%)	60 \pm 3	60 \pm 3
GB de la unidad (x 109)	2,6 \pm 1,1	2,4 \pm 1,1
ATP (\mumol/g Hb)	4,6 \pm 0,2	4,3 \pm 0,4
Hb sobrenadante (mg/dl)	34 \pm 15	26 \pm 8
K+ sobrenadante (mEq/l)	2,3 \pm 0,2	2,2 \pm 0,3
Fragilidad osmótica (%)	50 \pm 4	49 \pm 4

Características de los GR después de 42 días de almacenamiento

Metabólicas: las cantidades de glucosa consumida y de lactato producido durante los 42 días de almacenamiento fueron similares para las unidades de ensayo y de control (Tabla 2). Como se esperaba, se encontró una alta correlación inversa entre estos dos parámetros de la glucólisis (r = 0,76). Sin embargo, se encontró menos hemólisis y mayores niveles de ATP para las unidades de GR almacenadas con L-carnitina comparado con las de control. Según ilustra la Figura 1, este mayor nivel de ATP se observó en todas las parejas menos una (p < 0,01).

TABLA 2 Post-almacenamiento (42 días). Características de los concentrados de glóbulos rojos

	Control	Ensayo (L-carnitina)
Parámetros in vitro	208 \pm 33	193 \pm 40
Glucosa (mg/dl)	201 \pm 27	199 \pm 37
Lactato (mg/dl)	6,33 \pm 0,03	6,32 \pm 0,04
pH	3,01 \pm 0,42	3,24 \pm 0,38*
ATP (\mumol/g Hb)	0,47 \pm 0,41	0,30 \pm 0,22*
Hemólisis (%)	61 \pm 4	60 \pm 3
K+ sobrenadante (mEq/l)	51 \pm 3	50 \pm 4
Fragilidad osmótica (%)	69 \pm 8	68 \pm 15
Puntuación morfológica
Parámetros in vivo
% de recuperación en 24 h (etiqueta simple)	81,1 \pm 6,2	84,0 \pm 4,4
Recuperación en 24 h (etiqueta doble)	80,1 \pm 6,0	83,9 \pm 5,0*
Peso de los GR (ml)	1634 \pm 510	1591 \pm 534
Supervivencia (días)	85,9 \pm 14,3	96,1 \pm 11,2*
* (p < 0,05)

Membrana: el nivel de porcentaje de hemólisis al final del almacenamiento fue menor con las unidades de carnitina, según se muestra en la Figura 2. Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas con respecto a los niveles de potasio sobrenadante, la respuesta al shock osmótico y la puntuación morfológica, que estaban dentro del intervalo esperado al final de los 42 días de almacenamiento.

Viabilidad post-transfusión: la media del % de recuperación en 24 h para las unidades de control fue similar a lo que nosotros y otros habían encontrado previamente. Sin embargo, los % medios de recuperación para las células almacenadas con carnitina fueron mayores que en las células almacenadas con control (p < 0,05). Además, la duración de la vida de circulación media de los glóbulos rojos almacenados transfundidos también fue mayor para las células almacenadas con carnitina (Figura 1). Los pesos de los GR de los donantes, según se determinó en las dos ocasiones, fueron altamente similares (r = 0,98), y estadísticamente no diferentes.

Estudios de correlación: según lo esperado, el % de recuperación en 24 h mostró correlaciones significativas con los niveles de ATP (r = 0,63) y otras medidas de la integridad de la membrana de los GR, tales como hemólisis (r = 0,57), fragilidad osmótica (r = 0,71) y puntuación morfológica (r = 0,59). El porcentaje de hemólisis se correlacionaba altamente con los niveles de ATP (r = 0,83) y también con el contenido de GB de las unidades de GR (r = 0,83). La duración de la vida de circulación de los GR no mostró una correlación significativa con ningún parámetro in vitro.

Estudio II

Captación de carnitina en GR almacenados

Los GR almacenados en medio AS-3 solo no mostraron ninguna pérdida significativa en el contenido de LC a lo largo del almacenamiento (Figura 2). Esto está conforme con los hallazgos de Cooper y col., mostrando anteriormente que la LC de glóbulo rojo humano no se intercambia libremente con plasma o tampón isoosmótico. Cuando los glóbulos rojos se almacenaron en AS-3 complementado con LC se detectaron cantidades de LC intracelular mayores a las detectadas con AS-3 solo (Figura 2). El contenido de LC aumentó linealmente durante los periodos de almacenamiento, alcanzando un aumento de 4 veces a los 42 días.

Estudios de reacilación de los lípidos del complejo de membrana en GR almacenados

Sin carnitina presente, el palmitato radioactivo incorporado en la PLC disminuyó linealmente con el tiempo de almacenamiento (Figura 3). Por el contrario, los glóbulos rojos de la unidad de CGR almacenada en la disolución de AS-3 que contenía LC mostró un aumento inicial (con un mínimo en la semana 3), seguido de un rápido descenso del palmitato radioactivo incorporado en la PLC. En las mismas preparaciones de glóbulos rojos también se evaluó la incorporación de palmitato radioactivo en LOS fosfolípidos de membrana. La incorporación de palmitato radioactivo en la PE de membrana de los glóbulos rojos de las unidades de sangre almacenadas en la disolución de AS-3 sola mostró un aumento significativo y constante de la radioactividad en la PE a lo largo del periodo de almacenamiento (Fig. 4). Los glóbulos rojos almacenados en presencia de LC se caracterizaron por un aumento súbito de la reacilación de la PE hacia el final del almacenamiento, con un mínimo en la 6ª semana (Fig. 4). La tasa de incorporación de palmitato radioactivo en la PC de membrana disminuyó ligeramente a lo largo del almacenamiento, y no se observaron diferencias entre las dos preparaciones de glóbulos rojos (Fig. 4). Debería destacarse que, dado que en nuestros estudios de reacilación los glóbulos rojos se incubaron a 37ºC en un tampón de Krebs Ringer que contenía glucosa, los niveles de ATP al final de la incubación estaban próximos a los valores fisiológicos (no se muestran los datos).

Discusión

En este estudio, los ensayos in vitro e in vivo de las unidades de GR al final de los 42 días de almacenamiento mostraron diferencias significativas entre los GR almacenados con carnitina comparados con los GR almacenados con control. Varias propiedades in vitro de los GR, reflejo de la integridad metabólica y de la membrana, tales como ATP y % de hemólisis, así como una medida directa de la viabilidad celular (% de recuperación en 24 horas y duración de vida circulante), fueron significativamente superiores para los GR almacenados con carnitina. Es interesante la prolongación de la duración de vida media de los GR supervivientes circulantes a las 24 horas después de la infusión. Este hallazgo puede estar relacionado con la captación irreversible de LC durante el almacenamiento, un descubrimiento inesperado y sin precedentes. Los valores obtenidos en los estudios de control de diversas propiedades de los GR fueron como se esperaba y no difirieron de los estudios anteriores. En el momento de la recogida de sangre no se encontraron diferencias significativas en las características de la unidad o de los GR entre los ensayos y el control. Según se ilustra en las Figuras 1-3, los niveles de ATP de los GR, el % de hemólisis y la duración de vida en circulación estaban fuertemente relacionadas con el donante, y dado que el estudio tenía un diseño pareado aleatorio con cinco ensayos y cinco controles realizados tanto en la primera como en la segunda ocasión, es improbable que las diferencias observadas pudieran ser debidas al azar o a un diseño defectuoso del estudio. Por lo tanto, es más probable que las diferencias observadas encontradas en este estudio fueran debidas a la adición de carnitina a las unidades de ensayo. La posibilidad de que el aumento de la duración de vida se refleje en una elución disminuida de Cr no puede excluirse, pero no es coherente con las medidas in vitro mejoradas de los glóbulos rojos almacenados, que se ha encontrado que se correlacionan con la viabilidad in vivo.

Diversas investigaciones han encontrado que la LC y sus acil ésteres tienen un efecto citoprotector estabilizante de la membrana sobre diversas células, incluyendo los glóbulos rojos. Véase, por ejemplo, Snyder y col., Arch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). En este estudio se encontró que la LC era captada de forma irreversible por los GR durante el almacenamiento. Aunque la naturaleza de este proceso no está completamente clara, se podría excluir la participación de un portador específico para la captación de LC. Por lo que sabemos, el único portador conocido de LC opera en sistemas celulares en los que la concentración intracelular de LC es muchas veces mayor a la que normalmente hay en el entorno extracelular. La concentración de LC en el glóbulo rojo es similar a la del plasma. Así, sin tener en cuenta la baja temperatura, la depleción de ATP y otros posibles cambios metabólicos que se producen durante el almacenamiento, cuando los glóbulos rojos están almacenados en un medio que contiene cantidades relativamente altas de LC exógeno, parece establecerse una captación unidireccional de LC por parte de las células. Nada en la técnica parece predecir esto.

La naturaleza de la acción de la LC sobre GR almacenados podría considerarse tanto como una intervención biofísica como metabólica en el compartimento de la membrana. La supervivencia post-transfusional de los glóbulos rojos almacenados está relacionada con la integridad de la función de la membrana, según sugiere la significativa correlación entre la viabilidad in vivo de glóbulos rojos reinfundidos y sus medidas de cociente superficie-volumen. Un importante contribuyente a la estructura y función de la membrana de los GR está representado por la red del citoesqueleto, Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol.. 1: 531-536 (1985), una organización proteínica supramolecular que yace bajo la semihoja interior de la membrana del GR. Wolfe y col., en un estudio de investigación sobre la composición y función de la proteína de la membrana citoesquelética de glóbulos rojos almacenados, encontraron que el único cambio relevante era una capacidad disminuida de la espectrina para asociarse con actina tanto en presencia como en ausencia de proteína 4.1. Wolfe y col., J. Clin Invest. 78: 1681-1686 (1986). Hemos mostrado que la LC afecta a la deformabilidad de la membrana de GR de espectros resellados que contienen proteína 4.1 sometidos a un estrés de cizallamiento aumentado. Arduini y col., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Así, la LC podría ejercer un efecto estabilizante de la membrana a través de la interacción de espectrina con uno o más componentes citoesqueléticos. Un reciente estudio de resonancia paramagnética de electrón de Butterfield y Rangachari, Life Sci. 52: 297-303 (1992), sobre la interacción espectrina-actina del glóbulo rojo, mostró que la LC redujo significativamente el movimiento segmentario de zonas marcadas con espín de la espectrina, lo que confirma la sugerencia anterior de una implicación de la LC en la intensificación de la interacción entre la espectrina y la actina, Arduinai y col., supra.

Además de una potencial acción biofísica descrita anteriormente, las mejoras observadas en los glóbulos rojos almacenados con LC también pueden ser el resultado de un proceso metabólico favorable. Normalmente, el ciclo de desacilación-reacilación de los fosfolípidos de membrana requiere ATP para la producción de acil-CoA. La fracción acilo de la acil-CoA se transfiere entonces a los lisofosfolípidos mediante la lisofosfolípido acil-CoA* transferasa. Además, durante una prueba oxidativa, el proceso de reparación de la membrana de los fosfolípidos de los GR sigue la misma vía metabólica. Descubrimientos recientes han mostrado que la CPT afecta al proceso de reacilación de los fosfolípidos de membrana en glóbulos rojos y neuronas modulando el tamaño del conjunto acil-CoA entre la etapa de activación del ácido graso y su transferencia a los lisofosfolípidos. Arduini y col., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Además, estudios de búsqueda pulsátil y depleción de ATP han demostrado que el conjunto de acilcarnitina de glóbulos rojos sirve como reserva de grupos acilo activados sin coste de ATP. Arduini y col., Bioachem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994).

El incremento en la incorporación de palmitato radioactivo en la PE de membrana de los glóbulos rojos almacenados con AS-3 solo sugiere que el almacenamiento a largo plazo (con una progresiva depleción del ATP de los GR) provoca un aumento en la demanda de unidades acilo activadas para la reacilación de los fosfolípidos de membrana (Figura 4). Durante las primeras cinco semanas de almacenamiento, los glóbulos rojos conservados en AS-3 sin LC parecían incorporar más palmitato en la PE que los glóbulos rojos almacenados en AS-3 que contenía LC (Figura 4). Los glóbulos rojos almacenados en presencia de LC fueron capaces de incorporar más palmitato en la PE al final del almacenamiento. Este descubrimiento puede sugerir que una prueba oxidativa es de algún modo eficaz, dado que la exposición de glóbulos rojos a un oxidante estimula fuertemente el proceso de reacilación de la PE de membrana, pero no el de la PC de membrana. Dise y col., Biochem. Biophys. Acta 859: 69-78 (1986). Resulta interesante que, durante las primeras cinco semanas de almacenamiento, los glóbulos rojos conservados en AS-3 solo parecen incorporar más palmitato el la PE que los glóbulos rojos almacenados en AS-3 que contiene LC (Figura 4). Esto sugiere que en el último caso, la CPT puede competir con la enzima reacilante por la utilización de acil-CoA. Sin embargo, de acuerdo con este concepto, deberíamos haber observado una diferencia mucho mayor al final del periodo de almacenamiento, cuando los requerimientos de la acil-CoA para el proceso de reacilación son mayores. Este no era el caso. Los glóbulos rojos almacenados con o sin LC mostraron una tasa de incorporación similar al final del almacenamiento (Figura 4). Además, hemos mostrado que la CPT del glóbulo rojo, bajo una variedad de condiciones experimentales diferentes, no compite con la reacilación de los fosfolípidos de membrana. Arduini y col., Life Chem. Rep. 12: 49-54 (1994).

La formación de PLC radioactiva en los glóbulos rojos complementados con LC es mayor a la encontrada en glóbulos rojos almacenados sin LC (Figura 3). Además, la evolución temporal de la formación de PLC en glóbulos rojos almacenados con LC mostró una interesante curva de campana con un mínimo en la tercera semana de almacenamiento. La formación de PLC radioactiva es un reflejo del tamaño del conjunto de la cadena larga fría de acilcarnitina, y la dirección del flujo de acilo mediado por CPT en glóbulos rojos intactos. Durante las tres primeras semanas de almacenamiento, con una actividad glucolítica relativamente alta y disponibilidad de ATP, la CPT parece conducir el flujo de acilos hacia la acilcarnitina en glóbulos rojos almacenados en presencia de LC (Figura 5a). Tras la tercera semana de almacenamiento, cuando hay LC presente, el flujo se invierte. Estos cambios pueden reflejar esencialmente la capacidad de la CPT de tamponar las unidades acilo activadas: un requerimiento aumentado de acil-CoA para el proceso de reacilación resulta en una menor producción de PLC y viceversa, y puede representar un mecanismo en el que la CPT se usa para tamponar el aumento de la demanda de unidades acilo para el proceso de reacilación

\hbox{(Figura 5b)}

.

El mayor % de recuperación en 24 horas y la duración de vida circulante representan una mejora de aproximadamente el 15% en términos de potencia (cantidad de GR transfundidos circulantes disponibles frente a los tiempos de vida media de circulación del receptor). Este aumento de la potencia podría traducirse clínicamente en una reducción en los requerimientos de transfusión de pacientes transfundidos crónicamente tales como pacientes talasémicos o con fallo de la médula ósea. Alternativamente, puede ser posible prolongar la vida de almacenamiento de GR líquidos almacenados.

Nuestros hallazgos sugieren que la presencia de LC en el medio conservante durante el almacenamiento de GR puede tener una acción economizadora del conjunto de ATP usado para la reacilación de los fosfolípidos para la reparación de la membrana. Este proceso metabólico favorable, asociado con una posible acción biofísica beneficiosa, puede explicar así la hemólisis reducida, los mayores niveles de ATP y la recuperación y supervivencia in vitro mejoradas de los glóbulos rojos almacenados con LC.

Radiación

El problema de contaminación de los hemoderivados, incluyendo sangre completa, GR, CGR, CP y similares, puede reducirse mediante una cantidad considerable de radicación. Se han estudiado ampliamente los niveles de radiación necesarios para la esterilización, y considerablemente el 100% de mortalidad de los agentes microbiológicos. Adicionalmente, y más apreciablemente, los leucocitos pueden ser destruidos por una radiación similar. Puede usarse una variedad de tipos de radiación, incluyendo radiación gamma (Cobalto GG, aceleración de Van de Graf), radiación UV, radicación infrarroja, etc.. Es suficiente un equivalente cercano a aproximadamente 20-50 cG de radiación gamma.

En todo el mundo se recogen anualmente entre 60 y 80 millones de unidades de sangre completa, y se usan en el mantenimiento de transfusiones de una variedad de poblaciones de pacientes. En los países subdesarrollados, las tasas de recogida por 1.000 habitantes son menores, y la mayoría de las transfusiones se da en el tratamiento de casos obstétricos y pediátricos, especialmente anemia asociada a malaria. En los países desarrollados, las tasas de recogida por 1.000 habitantes son 50-10 veces superiores, y la mayoría de las transfusiones se da en cirugía (50%) o en el tratamiento de pacientes con anemia asociada a cáncer, transplante de médula ósea o hemorragia digestiva benigna (Figura 1). Hay muchos efectos adversos potenciales asociados con la transfusión de sangre alogénica. Una complicación en particular asociada negativamente con la transfusión de sangre es la poco común y habitualmente fatal entidad conocida como "enfermedad injerto contra huésped asociada a la transfusión" (EICH-AT), una complicación mediada por inmunocitos alogénicos viables.

La enfermedad EICH-AT es una complicación poco común de la transfusión de sangre potencialmente vista en dos tipos de poblaciones de paciente receptores de transfusiones de sangre. La EICHT-AT tiene una mortalidad próxima al 100%, y la prevención es la única medida efectiva actualmente. Primero, en pacientes inmunodeprimidos, tales como pacientes tras un transplante de médula ósea u otro órgano, la enfermedad de Hodgkin o deficiencias hereditarias en el sistema inmune. Segundo, en pacientes inmunodeprimidos, cuando existe similitud en el CMH entre la sangre del donante y la sangre del receptor. Esto se ve más a menudo en donaciones directas desde parientes cercanos o en poblaciones con polimorfismo del CMH más limitado, tales como en Japón o Israel. Teniendo esto en cuenta, es una práctica universal irradiar productos celulares sanguíneos con radiación gamma a una dosis intermedia de aproximadamente 25 centigray (cG) con objeto de destruir la capacidad de replicación de los inmunocitos viables. Debería destacarse que la EICHT-AT está asociada con productos celulares que son frescos, es decir, generalmente de menos de quince días. Sin embargo, el "envejecimiento" de la sangre no es todavía una práctica aceptada para prevenir esta complicación. Aunque los inmunocitos son parte de la población leucocítica alogénica, el grado de leucodepleción conseguido actualmente con los filtros de tercera generación no se considera adecuado actualmente para prevenir esta complicación. Así, la radiación gamma en este momento permanece como la única intervención profiláctica aceptada.

La dificultad de la radiación gamma de glóbulos rojos en particular es el potencial daño a la membrana celular. Está claro que la radiación a esta dosis produce una pérdida de potencia de aproximadamente 7-8% medida in vitro mediante una reducción del ATP de los glóbulos rojos, un aumento de la hemólisis y un aumento del potasio sobrenadante. Estos cambios son coherentes con un efecto dañino de la membrana. Estos cambios in vitro están asociados con una reducción de la recuperación en 24 horas de glóbulos rojos con radiación gamma. Con respecto a los productos plaquetarios, al menos una publicación ha sugerido cierta pérdida de la viabilidad.

Una considerable evidencia indica que la radiación gamma ejerce su efecto mediante la producción de especies de oxígeno activadas, tales como oxígeno singlete, radical hidroxi y anión superóxido. Estas especies inducen daños intracelulares en el ADN, y por tanto evitan la replicación celular, un pre-requisito de la EICHT-AT. Sin embargo, estas mismas especies de oxígeno pueden oxidar los lípidos de membrana del glóbulo rojo, y posiblemente de la membrana de la plaqueta, induciendo una lesión en la membrana que reduce la calidad (potencia) del producto celular.

Se sabe que la LC desempeña un papel clave en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana mitocondrial. Los desórdenes hereditarios en los que hay un fallo en el sistema de carnitina para transportar ácidos grasos de cadena larga conducen a un deterioro significativo de la función músculo-esquelética. Recientemente, ha habido un interés creciente sobre el papel de la LC en la membrana del glóbulo rojo. Sin embargo, lo que ha sido sorprendente es que los glóbulos rojos carecen de mitocondrias, y por tanto una considerable curiosidad rodea la presencia de LC y carnitina palmitoil transferasa, una enzima implicada en la acilación reversible de LC. Al principio no estaba claro el papel que estas podrían jugar dentro de los glóbulos rojos. El glóbulo rojo puede estar sometido a un estrés oxidante a lo largo de su largo ciclo de vida in vivo, y la reparación de los lípidos de membrana oxidados que implica la LC podría ser importante para la supervivencia normal de los glóbulos rojos.

Un aumento temprano de la carnitina acilada durante un periodo de disponibilidad de ATP aumentada puede funcionar como reserva de ácidos grasos activados. Lo que puede usarse posteriormente en un mecanismo de reparación de los lípidos oxidados de membranas dañadas. Tal explicación podría explicar bien la hemólisis reducida observada durante el almacenamiento in vitro de glóbulos rojos supra, y además podría explicar la mejora observada en la recuperación y supervivencia in vivo. El efecto neto de la adición de LC es un aumento aproximado del 17% en la potencia.

Como consecuencia, la LC puede usarse para impedir o evitar lesiones de la membrana inducidas por la radiación. Esto podría producirse por la capacidad de la carnitina almacenada en los glóbulos rojos para reparar in vitro los lípidos de membrana oxidados.

Para limitar la susceptibilidad de hemoderivados (CGR, CP y similares) ante lesiones de membrana y hemólisis el hemoderivado puede suspenderse inicialmente en una disolución que incluya LC en una cantidad de 0,25 mM - 50 mM, el mantenimiento de la membrana celular y la eliminación de la hemólisis se consigue en un grado suficiente de forma que el producto precintado puede irradiarse con fines esterilizantes, y consecuentemente pueda disfrutar de una vida de almacenamiento y una vida media de circulación prolongadas después de la transfusión. Puede conseguirse una viabilidad del orden de las viabilidades actuales, con materiales más próximamente cercanos a ser estériles e improbables para introducir EICHT-AT, debido a la radiación tras precintar la suspensión del hemoderivado. Debe enfatizarse que el término hemoderivado en este encadenamiento, debe interpretarse ampliamente, para incluir sangre completa, plasma sanguíneo, CGR, CP, mezclas y similares.

I. El uso de L-carnitina para suprimir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas de almacenamiento prolongado.

Antecedentes: la L-carnitina (LC) reduce la glucólisis en concentrados de plaquetas de almacenamiento prolongado (> 5 días) (Sweeny y col., 25º Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Noruega, 27 de junio - 2 de julio, 1998, en Vox Sanguninis, Vol. 74, supl. nº 1, pág. 1226; y Sweeny y col., The American Society of Hematology, 40º Annual Meeting, Miami Beach, FL, EE.UU., 4-8 de diciembre 1998). El efecto de la LC sobre el crecimiento bacteriano en concentrados de plaquetas es importante para evaluar si la LC puede usarse como un aditivo.

Procedimientos de estudio: dos concentrados idénticos de plaquetas leucodeplecionadas antes del almacenamiento ABO producidos por filtración en línea de plasma rico en plaquetas (MedSep Corp. Covina, CA) se agruparon, y después se dividieron de forma equitativa en dos bolsas CLX® (MedSep). Se añadió o bien LC, hasta una concentración final de 5 mM, o bien salino (control) a uno de cada par. A cada recipiente se le inyectó un 1 ml de una suspensión estafilocócica coagulasa negativa en el Día 0 hasta una concentración final entre 1 - 48 UFC/ml. Las muestras se extrajeron asépticamente de cada contendor en el Día 3, Día 6 y bien Día 7 o Día 8, para el recuento de colonias. Los datos se analizaron mediante pruebas de la t para datos emparejados.

Resultados: se estudiaron once pares de concentrados. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla a continuación. Sobre el Día 7/8, el crecimiento en los recipientes con L-carnitina era el 33% del de los controles.

Conclusión: la L-carnitina a 5 mM retrasa el crecimiento bacteriano de estafilococos coagulasa negativa en concentrados de plaquetas almacenados líquidos.

	Par	Control*	L-Carnitina	P
Día 0	11	1,12 \pm 0,7	1,12 \pm 0,7	N/P
Día 3	11	3,11 \pm 0,7	3,04 \pm 0,7	0,43
Día 6	8	4,28 \pm 1,3	3,88 \pm 1,0	0,05
Día 7/8	11	5,09 \pm 1,5	4,60 \pm 1,5	0,002
*Crecimiento bacteriano expresado en Log UFC/ml

II. El uso de L-carnitina para reducir la glucólisis durante el almacenamiento prolongado de plaquetas aleatorias leucodeplecionadas antes del almacenamiento.

Antecedentes: la L-carnitina reduce la glucólisis en concentrados de plaquetas estándar (no leucodeplecionadas) almacenadas durante cinco-diez días (Sweeny y col., 25º Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Noruega, 27 de junio - 2 de julio, 1998, en Vox Sanguninis, Vol. 74, supl. nº 1, pág. 1226; y Sweeny y col., The American Society of Hematology, 40º Annual Meeting, Miami Beach, FL, EE.UU., 4-8 de diciembre 1998).

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No ha podido demostrarse previamente un efecto similar en plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionadas antes del almacenamiento.

Diseño del estudio: dos concentrados idénticos de plaquetas leucodeplecionadas antes del almacenamiento ABO producidos por filtración en línea de plasma rico en plaquetas (MedSep Inc. Covina, CA) se agruparon, y después se dividieron de forma equitativa en dos bolsas CLX (MedSep). Se añadió o bien L-carnitina (concentración final 5 mM), o bien salino a una bolsa de cada par de plaquetas. Las plaquetas se almacenaron durante bien siete o bien ocho días a 22ºC en un agitador de lecho plano, y después se ensayaron. Los ensayos realizados fueron pH, recuento de plaquetas, glucosa sobrenadante y lactato, expresión de la p-selectina de superficie mediante citometría de flujo, magnitud del cambio de forma (MCF) y respuesta ante shock hipotónico (RSH). El consumo de glucosa y la producción de lactato se calcularon en mM/1012 plaquetas/día. Los datos se analizaron usando pruebas de la t para datos emparejados.

Resultados: se estudiaron siete (7) pares de concentrados de plaquetas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla a continuación.

Conclusión: la L-carnitina reduce la glucólisis en plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionadas antes del almacenamiento almacenadas.

	Control	L-Carnitina	P
PH	6,97 \pm 0,2	7,09 \pm 0,1	<0,01
Concentración
de glucosa	1,25 \pm 0,2	1,13 \pm 0,2	<0,01
Producción de
lactato	1,73 \pm 0,3	1,50 \pm 0,2	<0,01
P-selectina
(% positivo)	74 \pm 4	69 \pm 9	0,04
MCF (%)	11 \pm 5	12 \pm 4	0,35
RSH (%)	45 \pm 13	50 \pm 22	0,64

La invención de esta solicitud de patente se ha descrito tanto en términos genéricos como en referencia a ejemplos específicos. Aparecerán variaciones a aquellos habituados expertos en la materia sin el ejercicio de la facultad inventiva. En particular, pueden modificarse composiciones estabilizantes alternativas, hemoderivados, conservantes, inhibidores y similares, sin el ejercicio de capacidad inventiva. Adicionalmente, los niveles específicos, los periodos de viabilidad y las semividas de circulación variarán de un donante a otro, y de un receptor a otro. Tales variaciones permanecen dentro del alcance de la invención, salvo que se excluyan específicamente en la relación de reivindicaciones detallada a continuación.

Claims

1. Un procedimiento para suprimir el crecimiento bacteriano en sangre completa o una fracción de la misma, que comprende la adición a sangre completa o a una fracción sanguínea de un compuesto seleccionado del grupo constituido por L-carnitina, sales de L-carnitina, alcanoil L-carnitinas, sales de alcanoil L-carnitinas, y mezclas de las mismas, en una cantidad efectiva para suprimir el crecimiento bacteriano en dicha sangre completa o fracción sanguínea.

2. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que dicha fracción sanguínea se selecciona del grupo constituido por concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos, concentrados de plaquetas, plasma y derivados plasmáticos.

3. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dicha fracción sanguínea es un concentrado de glóbulos rojos, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de glóbulos rojos en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

4. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dicha fracción sanguínea es un concentrado de glóbulos blancos, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de glóbulos blancos en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

5. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dicha fracción sanguínea es un concentrado de plaquetas, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de plaquetas en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

6. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dicha fracción sanguínea es plasma o un derivado plasmático, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho plasma o derivado plasmático en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

7. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 0,25 a 50 mM.

8. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 1 a 30 mM.

9. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que dicho compuesto es L-carnitina.

10. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo constituido por acetil L-carnitina, propionil L-carnitina, butiril L-carnitina, isobutil L-carnitina, valleril L-carnitina e isovaleri L-carnitina.

11. Un procedimiento para reducir la glucólisis en sangre completa o en una fracción de la misma, seleccionándose dicha fracción del grupo constituido por concentrados de glóbulos rojos, concentrados de glóbulos blancos, plasma y derivados plasmáticos, comprendiendo la adición a sangre completa o a una fracción sanguínea de un compuesto seleccionado del grupo constituido por L-carnitina, sales de L-carnitina, alcanoil L-carnitinas, sales de alcanoil L-carnitinas, y mezclas de las mismas, en una cantidad efectiva para reducir la glucólisis en dicha sangre completa o fracción sanguínea.

12. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicha fracción sanguínea es un concentrado de glóbulos rojos, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de glóbulos rojos en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

13. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicha fracción sanguínea es un concentrado de glóbulos blancos, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de glóbulos blancos en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

14. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicha fracción sanguínea es plasma o un derivado plasmático, y en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho plasma o derivado plasmático en una disolución de mantenimiento que comprende dicho compuesto.

15. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 0,25 a 50 mM.

16. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 1 a 30 mM.

17. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicho compuesto es L-carnitina.

18. El procedimiento de la Reivindicación 11, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo constituido por acetil L-carnitina, propionil L-carnitina, butiril L-carnitina, isobutil L-carnitina, valeril L-carnitina e isovaleril L-carnitina.

19. Un procedimiento para reducir la glucólisis en un concentrado de plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionado antes del almacenamiento, en el que dicho procedimiento comprende la suspensión de dicho concentrado de plaquetas en una disolución de mantenimiento que comprende un compuesto seleccionado del grupo constituido por L-carnitina y sales de L-carnitina, en una cantidad efectiva para reducir la glucólisis en dicho concentrado de plaquetas de donantes aleatorios leucodeplecionado antes del almacenamiento.

20. El procedimiento de la Reivindicación 19, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 0,25 a 50 mM.

21. El procedimiento de la Reivindicación 19, en el que dicho compuesto está comprendido en dicha disolución de mantenimiento en una concentración de 1 a 30 mM.