BR0011430B1 - método para a supressão de crescimento bacterial em sangue integral ou uma sua fração. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A SUPRESSÃO DE CRESCIMENTO BACTERIAL EM SANGUE IN- TEGRAL OU UMA SUA FRAÇÃO".

Este pedido de patente é uma continuação em parte de Pedido de Patente U.S. N0 de série 08/840 765, depositado em 16 de abril de 1997, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Fundamentos da Invenção Campo da Invenção:

Esta invenção refere-se a um método de aperfeiçoamento de estabilidade de estocagem, incluindo resistência a hemólise e aperfeiçoada viabilidade, de produtos de sangue incluindo células vermelhas de sangue empacotadas (RBCs), plaquetas e semelhantes. Especificamente, um méto- do para estender a viabilidade destes produtos, assim como sua resistência a agentes de dano de membrana tal como radiação, é provida através de estocagem de produtos em uma suspensão incluindo uma quantidade eficaz de L-carnitina ou uma alcanoil carnitina. A presente invenção também refere- se a um método para supressão de crescimento bacterial em sangue integral e frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue empacotadas, células brancas de sangue empacotadas (WBCs), concentrados de plaque- tas, plasma, e derivados de plasma, que são estocados por extensos perío- dos de tempo. A presente invenção ainda refere-se a um método e para re- dução de glicólise em sangue integral e frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue empacotadas, células brancas de sangue empacota- das (WBCs), concentrados de plaquetas, plasma, e derivados de plasma, que são estocados por extensos períodos de tempo. Discussão dos Fundamentos:

Conceito tem crescido estavelmente sobre ambos, os suprimen- tos nacional e mundial de sangue. Ambos, confiabilidade e integridade de suprimentos existentes, e a habilidade para desenvolvimento de maiores estoques com o tempo, foram postos em questão. Uma razão para tal é o período relativamente curto de estabilidade de estocagem de produtos de sangue. Correntemente, RBCs empacotados (concentrados de células ver- melhas de sangue, ou RCC), a forma dominante de produto de sangue para transfusões e semelhantes, são limitados a um período de estocagem de 42- dias. Após este tempo, níveis de ATP caem substancialmente, acoplados com uma significante perda de pH,indicando fortemente uma carência de viabilidade.ou se viável, uma vida de circulação extremamente curta com infusão, in vivo. Sangue integral não é estocado por períodos substanciais. Para plaquetas, o atual período de estocagem é mesmo mais curto, com o padrão sendo 5 dias a 22°C. A diferença em estabilidade de estocagem de concentrados de plaqueta (PC) oposta a RBC, é devida a existentes reações metabólicas em plaquetas, devido em parte à presença de mitocôndria em PC, e sua ausência em RBCs. Embora produtos de sangue mostrem uma queda em ATP, acoplada com uma queda em pH, com tempo, acompanha- das pela produção de ácido lático, a presença de mitocôndria em PC é pro- vável exacerbar o problema, devido a glicólise.

Simultaneamente, conceitos sobre a confiabilidade e integridade do suprimento de sangue foram elevados. Em particular, contaminação do suprimento de sangue com bactérias, ou outros agentes microbiológicos, tem sido detectada repetidamente. Uma tal situação é mesmo mais séria em países com métodos de coleta e estocagem menos sofisticados. Embora agentes possam ser adicionados a produtos coletados para reduzir contami- nação, estes não são desejados, dada a necessidade de transfusão dos produtos de volta em pacientes receptores. Uma alternativa desejável é tra- tamento dos produtos com radiação, após embalagem, tipicamente em reci- pientes plásticos de vinila plastificados.Tal tratamento com radiação pode agravar RBC e talvez durante estocagem PC, resultando em uma diminuída função destas células.

Adicionalmente, uma pequena mas crescente porção da popula- ção recebendo sangue está em risco de uma condição geralmente fatal co- fusão (TA-GVHD), que é devida à presença de leucócitos alogênicos viáveis. Esta síndrome está tipicamente associada com pacientes imunosuprimidos, tais como pacientes de câncer e transplante de medula óssea, mas também pode ocorrer em pessoas imunocompetentes no cenário de polimorfismo HLA restrito na população.

Substancial atenção tem sido devotada para encontrar-se méto- dos para estender estabilidade de estocagem. Um tal método, para extensão de tempo de vida de estocagem de PCs1 é recitado na patente US 5 466 .573. Esta patente é direcionada ao provimento de preparações PC com fontes de íons de acetato, que atuam como um substrato para fosforilação oxidativa e como um tampão para contrabalançar qualquer diminuição em pH devido a produção de ácido lático. Um tal método não atua diretamente sobre o problema de hemólise, e colapso de membrana. Um método alter- nativo é mostrado na patente US 5 496 821, pelo presente inventor e cedida em comum. Nesta patente, sangue integral é estocado em uma preparação incluindo L-carnitina (LC) ou seus derivados alcanoíla. A patente não des- creve, entretanto, os efeitos sobre produtos de sangue tais como suspen- sões de PC ou RBC, e baseia-se em pelo menos alguma extensão sobre o impacto de LC sobre caracteríticas de plasma.

Como notado acima, contaminação do suprimento de sangue com agentes microbiológicos é um outro problema a ser endereçado pela comunidade médica. Um método de esterilização de produto, e aperfeiçoa- mento de confiabilidade com relação a contaminação, é irradiar o produto de sangue. Em geral, valores de radiação gama de cerca de 25 centigray (cG), irradiando o produto após ele ser selado em um recipiente plástico, vidro ou outro, é desejável. Lamentavelmente, irradiação induz lesões de membrana de célula, com hemólise em RBCs. Irradiação de produtos de sangue, inclu- indo sangue integral, RBCs e PCs embaladas continua a possuir problemas.

Em adição, o efeito de L-carnitina sobre crescimento bacterial em produtos de sangue, tal como sangue integral, concentrados de célula vermelha de sangue, e concentrados de plaquetas, ainda não foi reportado. Similarmente, o efeito de L-carnitina sobre glicólise em produtos de sangue, tais como sangue integral, concentrados de células vermelhas de sangue, concentrados de plaquetas, particularmente plaquetas randômicas reduzi- das-leuco-pré-estocagem, ainda não foi demonstrado. Resumo da Invenção

Da mesma maneira, é um objetivo daqueles versados na técnica prover um método para estender o período de viabilidade, e a meia - vida de circulação de RBCs e PCs com transfusão, além dos máximos atuais.

É um outro objetivo daqueles versados na técnica encontrar um caminho através do qual produtos de sangue, incluindo sangue integral, RBCs e PCs embaladas possam ser esterilizadas por irradiação, sem subs- tanciais danos e lesões de membrana, e hemólise.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em sangue integral.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em sangue integral, que é estocado por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em frações de sangue.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em frações de sangue,que são es- tocadas por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em células vermelhas de sangue embaladas.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em células vermelhas de sangue embaladas, que são estocadas por extensos período de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em células brancas do sangue em- baladas.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em células brancas do sangue em- baladas, que são estocadas por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em concentrados de plaquetas. É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em concentrados de plaquetas, que são estocados por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em plasma ou derivados de plas- ma.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para supressão de crescimento bacterial em plasma ou derivados de plas- ma, que são estocados por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em sangue integral.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em sangue integral, que é estocado por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em frações de sangue.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em frações de sangue, que são estocadas por ex- tensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em células vermelhas de sangue embaladas.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em células vermelhas de sangue embaladas, que são estocadas por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em células brancas de sangue embaladas.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em células brancas de sangue embaladas, que são estocadas por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em concentrados de plaquetas.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em concentrados de plaquetas, que são estocados por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em plaquetas randômicas reduzidas-leuco-pré- estocagem.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em plaquetas randômicas reduzidas-leuco-pré- estocagem, que são estocadas por extensos períodos de tempo.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em plasma ou derivados de plasma.

É um outro objetivo da presente invenção prover um método para redução de glicólise em plasma ou derivados de plasma, que são esto- cados por extensos períodos de tempo.

Estes e outros objetivos, que tornar-se-ão aparentes durante a seguinte descrição detalhada, foram alcançados através da descoberta do inventor, através de extensa pesquisa, de que dano de membrana experi- mentado por RBCs e PCs com estocagem, ou face a radição, pode ser substancialmente retardado e suprimido, através de suspensão de produto de sangue em uma solução de preservação convencional, tal como AS-3, onde a solução de preservação ainda inclui L-carnitina ou um seu derivado alcanoíla, em uma concentração de 0,25-50 mM ou mais. A descoberta da requerente baseia-se no reconhecimento de que a maior parte da decompo- sição de produtos de sangue, convencionalmente associada com diminui- ções em níveis de ATP, e pH, pode ser de fato traçada para dano de mem- brana e hemólise. Manutenção e reparo de membranas podem ser efetua- dos através de reacilação de lipídeos, efetuada, em parte, por LC, a tomada irreversível da qual em RBC e similares produtos de sangue foi estabelecida através de pesquisa da invenção. O inventor também descobriu que L- carnitina suprime crescimento bacterial em sangue integral e frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue embaladas, células brancas de sangue embaladas (WBCs), concentrados de plaquetas, plasma, e deri- vados de plasma, que são estocados por períodos de tempo estendidos. O inventor ainda verificou que L-carnitina reduz glicólise em sangue integral ou frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue embaladas, cé- lulas brancas de sangue embaladas (WBCs), concentrados de plaquetas, particularmente plaquetas randômicas reduzidas-leuco-pré-estocagem, plasma, e derivados de plasma,que são estocados por períodos de tempo estendidos.

Breve Descrição dos Desenho Figura 1. Valores de amplitude de vida após infusão de RBC estocadas 42 dias como relacionados a doador e a controle e LC-estocadas. A seta indica média ± SD de controle e RBC estocado-LC, respectivamente. No alto do gráfico, o valor ρ calculado exato também é mostrado. Figura 2. Teor de carnitina de célula vermelha em diferentes se- manas de preservação de sangue. Carnitina foi ensaiada como descrito em Materiais e Métodos. Valores são a média de três experimentos feitos em duplicata. A variação entre experimentos não foi mais que 7%. Símbolos abertos, RBC estocada com AS-3 sozinho; símbolos fechados, RBC estoca- da em AS-3 suplementado com LC (5mM). Figura 3. Incorporação de ácido palmítico radioativo em RBC LC em diferentes semanas de conservação de sangue. Alíquotas de RBC reti- radas tanto de unidade de sangue estocada em AS-3 sozinho ou em AS-3 plus LC foram incubadas a 37°C com ácido [1-14C] palmítico complexado a BSA livre de ácido graxo. No final de incubação, RBC foram então proces- sadas como descrito em Materiais e Métodos. Formação de PLC radiorrotu- Iada foi referida ao teor de fósforo presente em extrato de lipídeo. Valores são a média de três experimentos feitos em duplicata. A variação entre ex- perimentos não foi mais que 7%. Símbolos abertos, RBC estocada com AS- .3 sozinho; símbolos fechados, RBC estocada em AS-3 suplementado com LC (5mM). Figura 4. Incorporação de ácido palmítico radioativo em mem- brana de célula vermelha de fosfatidil etanol amina (PE) e fosfatidil colina (PC) em diferentes semanas de conservação de sangue. Alíquotas de RBC retiradas tanto de unidade de sangue estocado em AS-3 sozinho ou em AS- .3 plus LC foram incubadas a 37°C com ácido [1-14C] palmítico complexadoa BSA livre de ácido graxo. No final de incubação, RBC foram então proces- sadas como descrito. Resultados são dados como pmol [1-14C] ácido palmí- tico^g de lipídeo fosforoso presente em extrato de lipídeo. Valores são a média de três experimentos feitos em duplicata. A variação entre experi- mentos não foi mais que 7%. Símbolos abertos, RBC estocada com AS-3 sozinho, símbolos fechados, RBC estocada em AS-3 suplementado com LC (5mM).

Figura 5. O sistema carnitina e reações de reacilação de fosfoli- pídeo de membrana. Setas mais espessas indicam o fluxo acila preferencial. A dimensão da caixa de acil carnitina mostra o provável tamanho de pool relacionado. Abreviaturas usadas são: LPL, lisofosfolipídeos; PLP, fosfolipí- deos; Cn, carnitina; acil-Cn, acil carnitina; ACS, acil-CoA sintetase; LAT, Ii- sofosfolipídeo acil-CoA transferase; CPT, carnitina palmitoil transferase.

Descrição Detalhada da Invenção

Esta invenção emprega L-carnitina, e seus derivados alcanoíla, como um agente suportando manutenção e reparo de membrana de célula, e supressão de hemólise, em produtos de sangue. A presente invenção também provê um método para supressão de crescimento bacterial em san- gue integral e frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue embaladas, células brancas de sangue embaladas, concentrados de pla- quetas, plasma, e derivados de plasma. A presente invenção ainda provê um método para redução de glicólise em sangue integral e frações de sangue, incluindo células vermelhas de sangue embaladas, células brancas de san- gue embaladas, concentrados de plaquetas, plasma, e derivados de plasma.

Alcanoil L-carnitinas apropriadas incluem C2-8 alcanoil L- carnitinas, e alcanoil L-carnitinas preferidas incluem acetila, butirila, isobuti- rila, valerila, isovalerila, e particularmente propionil L-carnitina. Aqui, é feita referência a esta família, genericamente, como LC, e exemplificação é em termos de L-carnitina. As alcanoil L-carnitinas descritas, e seus sais farma- cologicamente aceitáveis, entretanto, podem ser usadas em lugar de L- carnitina. Exemplos de sais apropriados de L-carnitina incluem por exem- plo,cloreto de L-carnitina, brometo de L-carnitina, orotato de L-carnitina, as- partato ácido de L-carnitina, fosfato ácido de L-carnitina, fumarato de L- carnitina, Iactato de L-carnitina, maleato de L-carnitina, maleato ácido de L- carnitina, oxalato ácido de L-carnitina, sulfato ácido de L-carnitina, fosfato glicose de L-carnitina, tartarato de L-carnitina, tartarato ácido de L-carnitina e mucato de L-carnitina.

Exemplos de sais apropriados de alcanoil L-carnitina incluem, por exemplo, cloretos de C2.8-alcanoil L-carnitina, brometos de C2-s alcanoil L-carnitina, orotatos de C2-s-alcanoil L-carnitina, aspartatos ácidos de C2.8- alcanoil L-carnitina, fosfatos ácidos de C2-s-alcanoil L-carnitina, fumaratos de C2.8-alcanoil L-carnitina, Iactatos de C2-8-alcanoil L-carnitina, maleatos de C2. s-alcanoil L-carnitina, maleatos ácidos de C2.8-alcanoil L-carnitina, oxalatos ácidos de C2-8-alcanoil L-carnitina, sulfatos ácidos de C2.8-alcanoil L- carnitina, fosfatos glicose C2-8-alcanoil L-carnitina, tartaratos de C2.8-alcanoil L-carnitina, tartaratos ácidos de C2.8-alcanoil L-carnitina, e mucatos de C2-8- alcanoil L-carnitina.

A adição de LC a sangue integral ou frações de sangue,incluindo RBCs, WBCs, PCs, plasma, e derivados de plasma requer que LC esteja presente em uma quantidade eficaz para permitir manutenção e reparo de membrana e supressão de hemólise e/ou para suprimir crescimento bacterial e/ou reduzir glicólise. A pesquisa empreendida incluindo os exemplos mos- trados abaixo, demonstrou uma faixa eficaz mínima para os produtos de maior parte de doadores de cerca de 0,25mM-0,5mM. O limite superior é mais prático que fisiológico. Concentrações tão altas como 50mM ou maio- res são facilmente toleradas. Valores que são consistentes com conceitos toxicológicos e osmológicos são aceitáveis. Faixas preferidas são 1-30mM. Uma faixa de 1-1 OmM ou mais é apropriada com valores entre 4-6mM fa- zendo uma acentuada diferença. Os efeitos desta invenção, incluindo a pro- longação de viabilidade, e a extensão de meia-vida de circulação com transfusão, podem ser altamente dependentes de doador. Da mesma manei- ra, falando genericamente, uma concentração eficaz de LC é 0,5-5,0 mM, entretanto, o versado comum no campo pode ser requerido estender esta faixa, em qualquer direção, dependendo das particularidades do doador. Tais extensões não requerem esforço da invenção.

LC é consistente com soluções suporte convencionais (soluções estabilizantes), que são tipicamente preparadas para provimento de um efeito tamponante. Soluções comumente empregadas incluem ACED (ácido cítrico - citrato de sódio - dextrose), CPD (citrato - fosfato - dextrose) e suas modificações, incluindo CPD2/A-3, e composições relacionadas. Tipica- mente, a composição inclui um carboidrato, tal como glicose ou manitol, pelo menos um sal de fosfato, um citrato, e outros sais de balanço. LC é conven- cionalmente solúvel e pode ser adicionada a estas composições livremente dentro da faixa requerida. Soluções apropriadas, são descritas na patente US 5 496 821, aqui incorporada por referência. Notar, entretanto, que solu- ções suporte outras que não aquelas convencionalmente usadas, incluindo plasma artificial e outras soluções fisiologicamente aceitáveis, podem ser usadas com LC na invenção. O componente importante da solução suporte é LC.

A habilidade de LC1 quando incluída em sangue integral ou a suspensão de frações de sangue, tais como RBCs, WBCs, PCs, plasma, e derivados de plasma para estender o tempo viável e por isso, tempo de prateleira, e o período de circulação com transfusão no indivíduo receptor, são exemplificados abaixo através de experimentação in vitro e in vivo. A experimentação emprega LC, mas alcanoil L-carnitinas podem ser emprega- das. De particular significância é a demonstração, abaixo, de que a aperfei- çoada performance é obtida através de aperfeiçoada manutenção (incluindo reparo) da membrana de célula, e supressão de hemólise. Materiais e Métodos Desenho estudo I:

Avaliação de qualidade in vivo e in vitro de RBC Estocadas Com e Sem LC

Sujeitos. A população de sujeitos foram sujeitos de pesquisa machos ou fêmeas entre as idades de 18 a 65 anos sem doença mental ou física conhecida, e não tomando drogas que possam afetar viabilidade de RBC. Indivíduos foram recrutados os quais satisfizeram os convencionais critérios de doador alogenéico como listados no Code of Federal Register, Chapter 2, the Standards of the American Association of Blood Banks, e Blo- od Services Directives of the American National Red Cross. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of the Medicai College of Hampton Roads e sujeitos cederam consentimento informado antes de participação no estudo.

Cada doador doou em duas ocasiões diferentes separadas por .72 dias, e foi randomizado para qualquer teste ou braço controle na primeira doação.

Sistema de Estocagem de Sangue. Sitema CP2D/AS-3 padrão (Miles, Inc.) usando plástico cloreto de polivinila (PVC) com n-hexil-ftalato de dietila (DEHP) como plastificante foi usado. Para cada unidade de teste, 245 mg de LC (em 1,1 ml de solução livre de pirogênio em uma garrafa de vidro esterilizada) foram adicionados ao recipiente contendo a solução aditiva AS- .3 para render uma concentração final de 5mM. Para as unidades controles, .1,1 ml de NaCL 0,9% foi adicionado à solução de AS-3 usando as mesmas condições. Adição de LC ou solução salina às bolsas foi realizada por inje- ção através de um acoplador de local de amostragem com uma seringa. Isto foi feito em uma capela de fluxo laminar sob luz UV.

Doação & Processamento. Flebotomia e métodos de retirada de sangue padrão foram usados com coleta de aproximadamente 450 ± 50 ml de sangue integral. A unidade de sangue integral foi mantida entre 4-8 horas em temperatura ambiente antes de processamento. A unidade foi centrifu- gada usando-se condições padrão e, após centrifugação, o plasma sobrena- dante foi expressado for a, e a RBC empacotada sedimentada ressuspensa tanto na solução AS-3 padrão (controle)como na solução AS-3 contendo carnitina (teste). As unidades RBC suspensas foram estocadas a 4°C por 42 dias.

Medições In Vitro: Medições realizadas em pré- (dia 0) e pós- (dia 42), amostras incluíram níveis ATP RBC; hemoglobina total e sobrena- dante; hematócritos (Hct); contagens de RBC, WBC e plaquetas; fragilidade osmótica de RBC; morfologia de RBC; níveis de Iactantoe glicose níveis de potássio de sobrenadante. Estas foram realizadas usando-se procedimentos padrão como descrito anteriormente, Heaton et al., Vox Sang 57:37-42 (1989).

Medições Pós-Transfusão In Vivo. Após 42 dias de estocagem, uma amostra foi retirada e as células estocadas rotuladas com Cr usando-se métodos padrão. Ao mesmo tempo, para determinar massa RBC, uma amostra nova foi coletada do doador para rotulação de RBC com 99 Tc. Após rotulação, células estocadas rotuladas com 15 μΟΐ 51Cr e células novas rotuladas com 15 μΟΐ 99Tc foram misturadas e simultaneamente infundidas. Amostras de sangue (5ml) foram tomadas após a infusão em vários interva- los de tempo por até 35 dias para se calcular % de recuperação em 24 horas e sobrevivência. A % de recuperação em 24 horas foi determinada usando- se tanto o método de rótulo simples onde regressão Iog-Iinear dos níveis de radioatividade das amostras tomadas em 5, 7,5, 10 e 15 minutos foi usada para determinar nível de tempo O, como através do método de rótulo duplo usando-se massa RBC de doador como determinada pela medição 99Tc.

Extensão de vida circulante de RBC rotulada-Cr sobrevivendo a transfusão foi determinada através de amostras tomadas em 24 horas e en- tão duas vezes semanalmente por até 5 semanas. Os níveis de radioativida- de foram corrigidos para uma constante de 1 % de eluição por dia. Os dados foram adaptados para uma função linear com dias pós-transfusão como va- riável independente (eixo-x) e as contagens Cr corrigidas como dependente variável (eixo-y). A extensão de vida de RBC foi então tomada como a inter- seção da linha adaptada com o eixo-x.

Análise Estatística. Teste-t emparelhado ou análise estatística não-paramétrica de rotina foi realizado sobre dados dos testes in vivo e in vitro das unidades para determinar se existiram quaisquer diferenças esta- tisticamente significantes (1-cauda) nas médias entre as unidades de teste e controles. Significância estatística foi considerada em um valor ρ de menos que 0,05. Desenho de estudo Il

Estudos de reacilação de lipídeos e tomada de LC de eritrócitos com esto- caqem de até 42 dias

Compostos Químicos. Albumina de soro bovino essencialmente livre de ácido graxo (BSA) foi obtida de SIGMA Chemical Company, St. Louis1 Mo. (USA). Ácido [1-14C] palmítico (58 Ci/mol) foi obtido de New En- gland Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Placas de camada fina, Whatman LK6 (sílica gel) (20x20cm) com uma camada pré-absorvente foram obtidas de Cario Erba, Milan (Itália). Palmitoil L-carnitina (PLC) e LC foram um gentil presente de Sigma Tau, Pomezia (Itália). Todos os outros com- postos usados foram grau reagente.

Ensaio de carnitina de célula vermelha. Amostra de sangue foi retirada da unidade de RCC estocada e lavada uma vez com NaCI 0,9% frio .4 vol. RBC foram então ressuspensas em NaCI 0,9% em um hematócrito final de 50%, e desproteinizada com ácido perclórico como descrito, Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta 959:100-105 (1988). Alíquotas do extrato final foram analisadas para teor de LC livre de acordo com o ensaio rádioquímico de Pace et al., Clin. Chem. 24:32-35 (1978).

Análise de reacilação de lipídeo de complexo de mebrana em RBC estocado. Amostra de sangue foi retirada de unidade RCC estocada através de um acoplador de sítio de amostragem com uma seringa, e a amostra imediatamente processada. Isto foi feito em uma capela de fluxo laminar sob luz UV. Todas as manipulações foram conduzidas a 0-5°C à menos que notado. RBC foram lavadas duas vezes com 4 vol. de NaCL .0,9% frio. RBC isoladas foram novamente lavadas com tampão de incuba- ção (NaCI 120 mM, KCI 5mM, MgSO4 1 mM, NaH2PO4 1mM, sacarose 40 mM, glicose 5mM, Tris-HCI 10mM, em pH 7,4) e ressuspensas no mesmo tampão em um hematócrito final de 5%. Um banho de agitação Rotabath a .37°C foi usado para as incubações. RBC foram incubadas com o ácido pal- mítico radioativo (10μΜ) complexado a BSA livre de ácido graxo (1,65 mg/ml). Incubações foram terminadas através de lavagem de células uma vez com tampão de incubação frio, três vezes com BSA livre de ácido graxo .1% em tampão de incubação, e finalmente uma vez novamente com tampão de incubação. Lipídeos RBC foram extraídos de células intactas como pro- cedimento Rose & Oaklander, J. Lipid Res. 6:428-431 (1965). De modo a evitar-se oxidação de lipídeo, hidroxi tolueno butilado 0,1% foi adicionado aos extratos de lipídeo. Alíquotas do extrato de lipídeo foram usadas para determinação de teor de fósforo lipídeo, e analisadas por cromatografia por duas camadas finas bidimensionais. Resumidamente, os cromatogramas foram desenvolvidos usando-se clorofórmio - metanol - amônia 28% (65:25:5) na primeira dimensão. Os cromatogramas foram então desenvolvi- dos usando-se clorofórmio - acetona - metanol - ácido acético - água (6:8:2:2:1) na segunda dimensão. Fosfatidil colina (PC), uma fosfatidil etanol amina (PE), e fosfatidil serina foram visualizadas através de breve exposição das placas a iodo e identificadas usando-se padrões como uma referência. Pontos de fosfolipídeos individuais foram raspados em frascos contendo flui- do de cintilação e radioatividade foi determinada por contagem de cintilação líquida. A identificação e análise de PLC radioativo foram realizadas como recentemente descrito, Arduini et al., J. Biol. Chem. 267:12673-81(1992). Eficiência de contagem foi avaliada através de um padrão externo. Cálculos são baseados nas atividades específicas de ácido palmítico radioativo. Estudo I

Características de pré-estocaaem de unidade AS-3 RCC

As propriedades dos produtos AS-3 RCC foram como esperadas após o processamento das unidades de sangue integral. Nenhuma diferença significante entre unidades de teste e controle nas características da unidade AS-3 RBC foi observada como medida por volume unitário, Hct, e teor WBC, e propriedades RBC in vitro tais como níveis ATP, níveis de hemoglobina sobrenadante e potássio, fragilidade osmótica (Tabela 1). Tabela 1. Características de pré-estocagem de RBC Ios concentrados de células vermelhas

<table>table see original document page 16</column></row><table> Características de RBC em estocaaem pós-42 dias

Metabólico. As quantidades de glicose consumidas e Iactato produzidos durante 42 dias de estocagem foram similares para unidades de teste e controle (Tabela 2). Como esperado, uma alta correlação inversa foi verificada entre estes dois parâmetros de glicólise (r = 0,76). Entretanto, me- nos hemólise e maiores níveis de ATP foram verificados para unidades RBC estocadas - carnitina como comparados a controle. Como ilustrado na Figura .1, este maior nível de ATP foi observado em todos menos em um par (P<0,01).

Tabela 2. Características pós-estocagem (42 dias) dos concentrados de cé- lula vermelha

<table>table see original document page 16</column></row><table> Continuação

<table>table see original document page 17</column></row><table>

* (Ρ < 0,05)

Membrana. Percentagem de hemólise no fim de níveis de esto- cagem foi menor com as unidades carnitina, como mostrado na Figura 2. Por outro lado, nenhuma diferença significante foi encontrada com relação a ní- veis de potássio de sobrenadante, resposta de choque osmótico, e classifi- cação de morfologia que estavam dentro da faixa esperada no final de 42 dias de estocagem.

Viabilidade Pós - Transfusão. A média de % de recuperação em .24 horas para as unidades controles foi similar àquela previamente encon- trada e encontrada por outros. Entretanto, % de recuperações médias para as células vermelhas estocadas - carnitina foram maiores que as células estocadas - controle (p<0,05). Em adição, a amplitude de vida circulante média das células vermelhas estocadas infundidas também foi maior para as células estocadas - carnitina (Figura 1).A massa RBC de doador como de- terminada nas duas ocasiões foi altamente similar (r = 0,98) e estatistica- mente não diferente.

Estudos de Correlação. Como Esperado, % de recuperação em .24 horas mostrou significantes correlações com níveis ATP (r = 0,63) e ou- tras medições de integridade de membrana RBC tais como hemólise (r = .0,57), fragilidade osmótica (r = 0,71), e classificação de morfologia (r = 0,59). Percentagem de hemólise correlacionou-se altamente com níveis de ATP (r = 0,83) e também com o teor WBC das unidades RBC (r = 0,83). A amplitu- de de vida circulante RBC não mostrou correlações significantes com qual- quer parâmetro in vitro. Estudo Il

Tomada de carnitina em RBC estocada

RBC estocada em meio AS-3 sozinho não mostra qualquer per- da significante do teor de LC por toda a estocagem (Figura 2). Isto está em concordância com verificações por Cooper et al., supra mostrando que LC de célula vermelha humana não troca livremente com plasma ou tampão isoosmótico. Quando células vermelhas foram estocadas em AS-3 suple- mentado com LC1 maiores quantidades de LC intracelular que AS-3 sozinho foram detectadas (Figura 2). O teor de LC aumentou linearmente durante tempos de estocagem, atingindo um aumento de 4 χ em 42 dias.

Estudos de reacilação de lipídeo complexo de membrana em RBC estocada Sem carnitina presente o palmitato radioativo incorporado em PLC diminuiu linearmente como tempo de estocagem (Figura 3). Em variân- cia, célula vermelha de unidade de RCC estocada na solução de AS-3 con- tendo LC mostrou um aumento inicial (com um ponto mais baixo em 3 se- manas) seguido por uma rápida diminuição do palmitato radioativo incorpo- rado em PLC. Nas mesmas preparações de célula vermelha, a incorporação de palmitato radioativo em fosfolipídeos de membrana também foi avaliada. Incorporação de palmitato radioativo em membrana PE de células vermelhas de unidade de sangue estocada na solução de AS-3 sozinha mostrou um aumento significante constante de radioatividade em PE por todo o período de estocagem (Fig. 4). Células vermelhas estocadas na presença de LC fo- ram caracterizadas por um súbito aumento de reacilação de PE na direção do final da estocagem, com um ponto mais baixo na 6a semana (Fig. 4). Ta- xas de incorporação de palmitato radioativo em membranas PC diminuíram levemente por toda a estocagem, e nenhuma diferença foi observada entre as duas preparações de células vermelhas (Fig. 4). Deve ser destacado que desde que os estudos de reacilação de células vermelhas foram incubadas a .37°C em um tampão de Krebs Ringer contendo glicose, níveis de ATP no final da incubação foram próximos de valores fisiológicos (dados não mos- trados). Discussão

Neste estudo, testes in vitro e in vivo de unidades RBC no fim de .42 dias de estocagem demonstraram significantes diferenças entre RBC estocada - carnitina comparada a RBC estocada - controle. Várias proprie- dades de RBC in vitro refletivas de integridade metabólica e de membrana tais como ATP e % de hemólise, assim como medição direta de viabilidade de célula (% de recuperação em 24 horas e amplitude de vida circulante) foram significantemente superiores para RBC estocada - carnitina. Um pro- longamento da amplitude de vida média da RBC sobrevivente circulando em .24 horas após infusão é de interesse. Esta verificação pode estar relaciona- da à irreversível tomada de LC durante estocagem, uma descoberta sem precedente e inesperada. Os valores obtidos nos estudos controles para vá- rias propriedades de RBC foram como esperados e não diferentes de estu- dos prévios. No momento de coleta de sangue, nenhuma diferença signifi- cante em características de RBC de unidade entre teste e controle foi en- contrada. Como ilustrado nas Figuras 1-3, níveis de ATP RBC1 % de hemóli- se, e amplitude de vida circulante foram fortemente relacionados - doador, e, uma vez que o estudo foi um desenho emparelhado randomicamente com estudos de cinco controles e cinco testes realizados sobre ambas, a primeira e segunda ocasiões, é improvável que as diferenças observadas possam ser devidas a mudança ou a qualquer falha em desenho de estudo. Por isso, é mais provável que as diferenças observadas encontradas neste estudo fo- ram causadas pela adição de carnitina às unidades teste. A possibilidade de que o aumento da amplitude de vida reflita diminuída eluição de Cr não pode ser excluída, mas não é consistente com as aperfeiçoadas medidas in vitro das células vermelhas estocadas que foram verificadas correlacionarem com viabilidade in vivo.

Várias investigações verificaram que LC e seus acilésteres têm células vermelhas. Ver, por exemplo, Snyder et al., Arch. Biochem. Biopys. .276:132-138 (1990). Neste estudo foi verificado que LC foi irreversivelmente tomada por RBC durante estocagem. Embora a natureza deste processo não seja inteiramente clara, pode-se excluir a participação de um veículo específico para a tomada de LC. Em nosso conhecimento, o único veículo de LC conhecido opera em sistemas celulares onde a concentração intra- clelular de LC é várias vezes maior que aquele normalmente presente no ambiente extracelular. Concentração de LC em célula vermelha é similar àquela do plasma. Assim, independente da baixa temperatura, esgotamento de APT, e outras possíveis alterações metabólicas ocorrendo durante a es- tocagem, quando células vermelhas são estocadas em um meio contendo quantidades relativamente altas de LC exógena, uma tomada unidirecional de LC pelas células parece ser estabelecida. Nada na técnica parece predi- zer isto.

A natureza da ação de LC sobre RBC estocada pode ser vista tanto como uma intervenção metabólica e/ou biofísica sobre o comparti- mento de membrana. Sobrevivência pós-transfusão de células vermelhas estocadas está relacionada com a integridade de função de membrana como sugerido pela significante correlação entre a viabilidade in vivo de células vermelhas reinfundidas e suas medidas de razão superfície para volume. Um maior contribuidor para estrutura e função de membrana de RBC é re- presentado pela rede citoesqueleto, Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol. 1:531-536 (1985), uma organização de proteína supra molecular estando abaixo do hemifolíolo interno de membrana de RBC.Wolfe et al. em um estudo de so- brevivência sobre a composição e função de proteína de membrana citoes- queletal de células vermelhas estocadas verificou que a única alteração re- levante foi uma diminuída capacidade de espectrina associar-se com actina tanto na presença como ausência de proteína 4.1. Wolfe et al., J. Clin. In- vest. 78: 1681-1686 (1986). Mostrou-se que LC afeta capacidade de defor- mação de membrana de RBC de proteína 4.1 contendo fantasmas liberados submetidos ao aumento da tensão de cisalhamento. Arduini et al., Life Sei. .47: 2395-2400 (1990). Assim, LC pode exercer um efeito estabilizante da membrana através de uma interação espectrina com um ou mais compo- nentes citoesqueletais. Um recente estudo de ressonância paramagnética de elétrons de Butterfield and Rangachari, Life Sei. 52:297-303 (1992), sobre a interação de espectrina - actina de célula vermelha mostrou que LC reduziu significantemente o movimento segmentai de sítios de spin-rotulado sobre espectrina,confirmando a anterior sugestão de um envolvimento de LC no reforço de interação entre espectrina e actina, Arduini et al., supra.

Em adição a um potencial de ação biofísica descrita acima, os aperfeiçoamentos observados nas células vermelhas estocadas-LC também podem ser o resultado de um processo metabólico favorável. Normalmente, o ciclo de desacilação - reacilação de fosfolipídeos de membrana requer ATP para geração de AciI-CoA. A porção acila de acil-CoA é então transferi- da em lisofosfolipídeos através de lisofosfolipídeo acil-CoA transferase. Em adição, durante um desafio oxidante, o processo de reparo de membrana de fosfolipídeos de RBC segue omesmo caminho metabólico. Recentes verifi- cações mostraram que CPT afeta o processo de reacilação de fosfolipídeos de membrana em células vermelhas e células neuronais através de modula- ção de tamanho da pool da acil-CoA entre a etapa de ativação do ácido gra- xo e sua transferência em lisofosfolipídeos. Arduini et al., J. Biol. Chem. 267: .12673-12681 (1992). Em adição, estudos de esgotamento de ATP e grava- ção de pulso ("pulse-chase study") demonstraram que a pool de acil carniti- na de célula vermelha serve como um reservatório de grupos acila ativados sem custo de ATP. Arduini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353- .358 (1994).

O aperfeiçoamento de incorporação de palmitato radioativo em- PE de membrana de células vermelhas estocadas em AS-3 sozinho sugere que estocagem de longo termo (com um progressivo esgotamento de ATP RBC) causa uma aumentada demanda de unidades acila ativadas para a reacilação de fosfolipídeos de membrana (Figura 4). Durantes as primeiras cinco semanas de estocagem, células vermelhas preservadas em AS-3 sem LC parecem incorporar mais palmitato em PE que células vermelhas estoca- das em AS-3 contendo LC (Figura 4). Células vermelhas estocadas na pre- sença de LC foram capazes de incorporar mais palmitato emPE no final da estocagem. Esta verificação pode sugerir que um desafio oxidativo é de al- gum modo operativo, uma vez que a exposição de células vermelhas a oxi- dante estimula fortemente o processo de reacilação de PE de membrana, mas não aquele de PC de membrana. Dise et al., Biochem. Biophys. Acta .859: 69-78 (1986). De interesse, durante as primeiras cinco semanas de estocagem, células vermelhas preservadas em AS-3 sozinho parecem in- corporar mais palmitato em PE que células vermelhas estocadas em AS-3 contendo LC (Figura 4). Isto sugere que no último caso CPT pode competir com a enzima reacilante para utilização de acil-CoA. Em concordância com este conceito, entretanto, nós devíamos ter observado uma diferença muito maior no fim do período de estocagem, quando o requisito de acil-CoA para o processo de reacilação é mais alto. Este não foi o caso. Células vermelhas estocadas com ou sem LC mostraram uma similar taxa de incorporação no final da estocagem (Figura 4). Em adição, nós mostramos que CPT de célula vermelha,sob uma variedade de diferentes condições experimentais, não compete com a reacilação de fosfolipídeos de membrana. Arduini et al., Life Chem. Rep. 12:49-54 (1994).

Formação de PLC radioativo nas células vermelhas suplementa- das - LC é maior que aquela encontrada em células vermelhas estocadas sem LC (Figura 5). Em adição, o curso de tempo de formação de PLC em células vermelhas estocadas com LC mostrou uma interessante curva com forma de sino com um ponto mais baixo na terceira semana de estocagem. A formação de PLC radioativo é refletiva do tamanho de pool de acil carniti- na de cadeia longa fria e a direção de fluxo de acila mediado-CPT em célu- las vermelhas intactas. Durante as primeiras três semanas de estocagem com atividade glicolítica e disponibilidade de APT relativamente altas, CPT parece dirigir o fluxoacila na direção e acil carnitina em células vermelhas estocadas na presença de LC (Figura 5a). Após a terceira semana e estoca- gem, com LC presente o fluxo é então revertido. Estas mudanças podem refletir essencialmente a habilidade de CPT tamponar unidades acila ativa- das: um requisito aumentado de acil-CoA para o processo de reacilação re- sulta em uma menor produção de PLC e vice versa, e pode representar um mecanismo onde CPT é usado para tamponar o aumento de demanda de unidades acila para o processo de reacilação (Figura 5b). A maior porcentagem de recuperação em 24 horas e amplitude de vida circulante representam um aperfeiçoamento de aporximadamente .15% em termos de potência (quantidade de RBC circulante de transfusão disponível para o receptor vezes amplitude de vida média). Este aumento em potência pode traduzir-se clinicamente em uma redução de requisitos de transfusão em pacientes cronicamente sofrendo transfusões tal como em talassêmicos ou em pacientes com falha de medula óssea. Alternativamente, pode ser possível estender-se a vida de prateleira de RBCs estocadas líqui- das.

Nossas verificações sugerem que a presença de LC no meio de preservação durante estocagem de RBC pode ter uma ação parcimoniosa sobre a pool de ATP usada pela reacilação de fosfolipídeos para reparo de membrana. Este processo metabólico favorável, associado com uma possí- vel ação biofísica benéfica, pode assim explicar a reduzida hemólise, maio- res níveis de ATP, e a aperfeiçoada recuperação in vivo e sobrevivência das células vermelhas estocadas-LC. Irradiação

O problema de contaminação de produtos de sangue, incluindo sangue integral, RBC1 RCC, PC e semelhantes, pode ser reduzido por substancial quantidade através de irradiação. Níveis de irradiação necessá- rios para esterilização, e substancialmente 100% de mortalidade de agentes microbiológicos, foram amplamente explorados. Adicionalmente, mais im- portantemente, leucócitos podem ser destruídos por similar irradiação. Uma variedade de tipos de iradiação, podem ser usadas, incluindo radiação gama (Cobalt GG, aceleração Van de Graf), irradiação UV1 irradiação infraverme- lha, etc. Um equivalente próximo a cerca de 20-50 cG irradiação gama é su- ficiente.

Em todo o mundo, entre 60 e 80 milhões de unidades de sangue integral são coletadas anualmente e usadas no suporte de transfusão de uma variedade de populações de pacientes. Nos países subdesenvolvidos taxas de coleta por população de 1000 são menores e mais transfusões de sangue são dadas no tratamento de casos obstétricos e pediátricos, parti- cularmente anemia associada com malária. Nos países desenvolvidos taxas de coleta por população de 1000 são 50-1 Ovezes maiores e mais transfu- sões são dadas em cirurgia (50%) ou no tratamento de pacientes com ane- mia associada com câner, transplante de medula óssea, sangramento gas- trointestinal não-maligno (Figura 1). Existem muitos potenciais efeitos adver- sos associados com a transfusão de sangue alogênico. Uma particular com- plicação adversamente associada com transfusão de sangue é a rara e usu- almente fatal entidade conhecida como doença de hospedeiro versus en- xerto associada com Transfusão (TA-GVHD),uma complicação mediada por imunócitos alogênicos viáveis.

Doença TA-GVHD é uma rara complicação de transfusão de sangue potencialmente vista em dois tipos de populações de pacientes re- ceptores de transfusão. TA-GVHD tem uma abordagem de mortalidade de .100% e prevenção é a única abordagem efetiva neste momento. Primeiro, em pacientes imuno - comprometidos, tais como pacientes após transplante de medula óssea ou outro órgão, doença de Hodgkins ou deficiências here- ditárias do sistema imuno. Segundo, em pacientes imuno - comprometidos, quando existe similaridade HLA entre doador de sangue e receptor de san- gue. Isto é mais freqüente em doações diretas de parentes próximos ou em populações de polimorfismo de HLA mais limitado tais como Japão e Israel. Por conta disto, é prática universal irradiar produtos de sangue celular com irradiação gama para uma dose de plano - médio de aproximadamente 25 centigray (cG) de modo a destruir-se a habilidade replicante de imunócitos viáveis. Deve ser notado que TA-GVHD está associada com produtos celula- res que são novos, isto é, genericamente menos que 15 dias. Entretanto, "envelhecimento" de sangue não é ainda uma prática aceita na prevenção desta complicação. Embora os imunócitos sejam parte da população de Ieu- cócitos alogênicos, o grau de Ieucoesgotamento correntemente obtido com terceira geração de filtros não é considerado correntemente adequado para prevenir esta complicação. Assim, radiação gama no momento permanece a única intervenção profilática aceita.

A dificuldade com irradiação gama de células vermelhas em par- ticular é o potencial dano de membrana de célula. E claro que irradiação nesta dose produz uma perda em potência de aproximadamente 7-8% como medida in vitro através de uma redução em ATP de célula vermelha, au- mentada hemólise, e aumentado potássio em sobrenadante. Estas mudan- ças são consistentes em um efeito de dano de membrana. Estas mudanças in vitro estão associadas com uma redução na recuperação de 24 horas de irradiação de células vermelhas de sangue. Com relação a produtos de pla- quetas, pelo menos uma publicação sugeriu alguma perda em viabilidade.

Considerável evidência indica que irradiação gama exerce seus efeitos através de geração de espécies oxigênio ativados, tais como oxigênio singleto, hidroxi, radical, e anion superóxido. Estas espécies induzem dano intracelular para DNA e, assim,evitam replicação de célula, um pré-requisito para TA-GVHD. Entretanto, estas mesmas espécies oxigênio podem oxidar lipídeos de membrana sobre célula vermelha e possivelmente membrana de plaqueta, induzindo uma lesão de membrana que reduz a qualidade (potên- cia) do produto celular.

LC é conhecida por desempenhar um papel chave no transporte de ácidos graxos de cadeia longa através de membrana de mitocôndria. De- sordens hereditárias nas quais há uma falha do sistema carnitina para trans- porte de ácidos graxos de cadeia longa resulta em significante prejuízo em função de músculo esqueletal. Recentemente, tem havido crescente interês- se no papel de LC em membrana de célula vermelha. O que foi surpeen- dente, entretanto, é que células vermelhas carecem de mitocôndria, e assim, considerável curiosidade circundando a presença de LC e carnitina palmi- toila transferase, uma enzima envolvida em acilação reversível de LC. Pri- meiro foi obscuro o papel que estas podem desempenhar dentro de células vermelhas. A célula vermelha pode ser submetida a tensão oxidante por todo seu longo ciclo de vida in vivo, e reparo de lipídeos de membrana oxi- dados envolvendo LC pode ser importante para a normal sobrevivência de células vermelhas.

Aumento inicial em carnitina acilada durante um tempo de au- mento da disponibilidade de ATP podendo funcionar como um reservatório de ácidos graxos ativados, que subseqüentemente podem ser usados em um mecanismo de reparo para lipídeos de membranas oxidados danificados. Uma tal explanação também pode explicar a reduzida hemólise observada durante a estocagem in vitro de células vermelhas do sangue supra e em adição, pode explicar o aperfeiçoamento observado com recuperação e so- brevivência in vivo. O efeito líquido de adição de LC é um aumento aproxi- mado de 17% em potência.

Da mesma maneira, LC pode ser usada para abolir ou prevenir lesões de membrana induzidas por radiação. Isto pode ocorrer através da habilidade de carnitina estocada células vermelhas para reparar Iipideos de membrana oxidados in vitro.

Para limitar suscetibilidade de produtos de sangue (RCC, PC e semelhantes) a lesões de membrana e hemólise, o produto de sangue pode ser primeiro suspenso em uma solução incluindo LC em uma quantidade de .0,25mM-50mM, manutenção de membrana de célula e supressão de hemó- lise são obtidas em um grau suficiente de modo que o produto selado pode ser irradiado para propósitos de esterilização, e subseqüentemente pode apreciar uma estendida vida de prateleira e meia-vida de circulação após transfusão. Viabilidade da ordem de viabilidades ciorrentes podem ser obti- das, com materiais mais proximamente certos de serem estéreis improváveis de intrduzirem TA-GVHD, devido a irradiação após selagem de suspensão de produto de sangue. É para ser enfatizado que o termo produto de san- gue, neste sentido, é para ser interpretado amplamente, para incluir sangue integral, RCCs, PCs,misturas e semelhantes. I. O uso de L-carnitina para suprimir crescimento bacterial em concentrados de plaquetas de estocagem - estendida

Fundamentos: L-carnitina (LC) reduz glicose em concentrados de plaquetas estocados estendidos (> 5 dias) (Sweeny et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norway, June 27-July .2, 1998, em Vox Sasnguinis, Vol. 74, No. Suppl. 1, p. 1226; e Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting1 Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998). O efeito de LC sobre crescimento bacterial em concentrados de plaquetas é importante para avaliar se LC é para ser usada como um aditivo.

Métodos de Estudo: Dois concentrados de plaquetas reduzido- leuco-pré-estocagem idênticos ABO produzidos através de filtração em linha de plasma rico em plaquetas (MedSep Corp., Covina, CA) foram reunidos, então igualmente divididos em duas bolsas CLX (MedSep). Tanto LC, para uma concentração final de 5mM, como solução salina (controle) foram adici- onadas a um de cada par. Cada recipiente foi perfurado com 1ml de uma suspensão staphylococal negativa coagulase no Dia 0 para uma concentra- ção final entre 1-48 CFU/ml. Amostras foram removidas de cada recipiente assepticamente no Dia 3, Dia 6 e tanto Dia 7 como Dia 8 para contagem da colônia. Dados foram analisados por testes t emparelhados.

Resultados: Onze pares de concentrados foram estudados. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela abaixo. No dia 7/8, crescimento nos recipientes de L-carnitina foi 33% aquele de controles.

Conclusão: L-carnitina em 5mM retarda o crescimento de sta- phylococci negativo coagulase em concentrados de plaquetas estocados líquidos.

Par Controle* L-carnitina* P Dia O 11 1,12±0,7 1,12±0,7 N/A Dia 3 11 3,11±0,7 3,04±0,7 0,43 Dia 6 8 4,28±1,3 3,88±1,0 0,05 Dia 7/8 11 5,09±1,5 4,60±1,5 0,002 * crescimentobacterial expresso em Log CFU/ml II. O uso de L-carnitina para reduzir qlicólise durante a estocaqem estendida de plaquetas randômicas reduzidas - Ieuco - pré-estocaqem

Fundamentos: L-carnitina reduz glicólise em concentrados de plaquetas padrões (não-leuco-reduzido) estocados por cinco - dez dias (Sweeny et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusi- on, Oslo, Norway, June 27-July 2, 1998, em Vox Sanguinis, vol. 74, No. Suppl. 1, p. 1226; e Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting, Miami Beach, Fl, USA, Dec. 4-8, 1998). Um efeito similar sobre plaquetas de doador randômicas reduzidas-leuco-pré-estocagem nãofoi anteriormente demonstrado.

Desenho de Estudo: Dois concentrados de plaquetas reduzido- leuco-pré-estocagem produzidos através de filtração em-linha de plasma rico em plaquetas (MedSep Inc., Corvina, CA) foram reunidos, então igualmente divididos em dois recipientes CLX (MedSep). Tanto L-carnitina (concentra- ção final de 5mM) como solução salina foi adicionada a uma bolsa de cada par de plaquetas. Plaquetas foram estocadas por sete ou oito dias a 22°C sobre um agitador de leito plano, então testadas. Testes realizados foram pH, contagem de plaquetas, glicose e Iactato em sobrenadante, expressão de p-selectina de superfície por citometria de fluxo,extensão de mudança de forma (ESC) e resposta de choque hipotônico (HSR). Consumo de glicose e produção de Iactato foram calculados como mM/1012plaquetas / dia. Dados foram analisados usando-se testes-t emparelhados.

Resultados: Sete (7) pares de concentrados de plaquetas foram estudados. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela abaixo.

Conclusão: L-carnitina reduz glicólise em plaquetas de doador randômicas reduzidas - Ieuco - pré-estocagem.

Controle L-carnitina P pH 6,97±0,2 7,09±0,1 <0,01 Concentração de glicose 1,25±0,2 1,13±0,2 <0,01 Produção Iactato 1,73±0,3 1,50±0,2 <0,01 P-selectina (% positiva) 74±4 69±9 0,04 ESC (%) 11±5 12±4 0,35 HSR (%) 45±13 50±22 0,64

A invenção deste pedido de patente foi mostrada em ambos, termos genéricos e através de referência a exemplos específicos. Variações ocorrerão àqueles versados na técnica sem o exercício de faculdade inventi- va. Em particular, composições estabilizantes alternativas, produtos de san- gue, preservativos, inibidores e semelhantes podem ser modificados, sem o exercício de conhecimento inventivo. Adicionalmente, níveis específicos, período de viabilidade e meias-vidas circulantes irão variar de doador para doador, e receptor para receptor. Tais variações permanecem dentro do es copo da invenção, à menos que especificamente excluídas pelas recitações nas reivindicações abaixo.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1.Método para supressão de crescimento bacterial em sangue integral ou uma sua fração, caracterizado pelo fato de que compreende adi- ção a sangue integral ou uma fração de sangue de um composto seleciona- do do grupo consistindo em L-carnitina, sais de L-carnitina, alcanoila L-carni- tinas, sais de alcanoila L-carnitinas e suas misturas, em uma quantidade de efetiva para suprimir crescimento bacterial no dito sangue integral ou fração de sangue.

2.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fração de sangue é selecionada do grupo consistindo em células vermelhas de sangue empacotadas, células brancas de sangue em- pacotadas, plasma e derivados de plasma.

3.Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita fração de sangue são células vermelhas de sangue empa- cotadas, em que o dito método compreende suspensão das ditas células vermelhas de sangue empacotadas em uma solução suporte que compre- ende o dito composto.

4.Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita fração de sangue são células brancas de sangue empaco- tadas, em que o dito método compreende suspensão das ditas células bran- cas de sangue empacotadas em uma solução suporte que compreende o dito composto.

5.Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita fração de sangue é um concentrado de plaquetas, em que o dito método compreende suspensão do dito concentrado de plaquetas em uma solução suporte que compreende o dito composto.

6.Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita fração de sangue é plasma ou um derivado de plasma, e em que o dito método compreende suspensão do dito plasma ou um deriva- do de plasma em uma solução suporte que compreende o dito composto.

7.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto é compreendido na dita solução suporte em uma concentração de 0,25 a 50 mM.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto é compreendido na dita solução suporte em uma concentração de 1 a 30 mM.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto é L-carnitina.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto é selecionado do grupo consistindo em acetila L-carnitina, propionila L-carnitina, butirila L-carnitina, isobutirila L-carnitina, valerila L-carnitina, e isovalerila L-carnitina.