BRPI0618815A2 - método para tratamento e armazenamento de sangue e derivados sanguìneos usando aloxazinas endógenas e acetato - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA TRATAMENTO E ARMAZENAMENTO DE SANGUE E DERIVADOS SANGUìNEOS USANDO ALOXAZINAS ENDóGENAS E ACETATO. São proporcionados métodos para o tratamento e armazenamento de sangue e derivados sanguíneos usando pelo menos aloxazinas endógenas e acetato. Os métodos incluem adicionar uma solução de aditivos de componente sanguíneo, compreendendo pelo menos uma aloxazina endógena e acetato, a um fluido compreendendo pelo menos um componente sanguíneo coletado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA TRATAMENTO E ARMAZENAMENTO DE SANGUE E DERIVADOS SANGÜÍNEOS USANDO ALOXAZINAS ENDÓGENAS E ACETATO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido é uma continuação em parte do pedido US N- 10/377.524, depositado em 28 de fevereiro de 2003, que é uma continuação do pedido US N- 09/586.147, depositado em 2 de junho de 2000, atualmente abandonado, que é uma continuação em parte do pedido US N- 09/357.188, sendo agora a Patente US N2 6.277.337, depositada em 20 de julho de 1999, que é uma continuação em parte do pedido US Na 09/119.666, sendo agora a Patente US Na 6.258.577, depositada em 21 de Julho de 1998. O presente pedido também reivindica a prioridade do pedido US provisório Na 60/597.506, depositado em 6 de dezembro de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO Esta invenção refere-se, em geral, a meios sintéticos para uso na coleta e/ou armazenamento de plaquetas destinadas a uso in vivo, incluindo meios sintéticos usados conjuntamente com a redução de patógenos em plaquetas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O sangue total coletado de doadores voluntários para recipientes de transfusão é geralmente separado em seus componentes: glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, plaquetas e plasma, utilizando-se diversos métodos conhecidos. Cada uma dessas frações é armazenada separadamente sob condições específicas a cada componente sangüíneo e usada para tratar diversas condições específicas e estados de doenças. Por exemplo, o componente glóbulos vermelhos é usado para tratar anemia, o componente plaquetas concentradas é usado para controlar sangramentos e o componente plasma é freqüentemente usado como uma fonte de proteínas do sangue, tais como fatores de coagulação.

No segmento de bancos de sangue, a contaminação de suprimentos sangüíneos com microorganismos contagiosos, como o HIV, a hepatite e outros vírus e bactérias expõe os receptores de transfusões de sangue total ou de administração de vários componentes sangüíneos a sérios riscos à saúde. Os procedimentos de triagem de sangue podem não perceber a presença de contaminantes, e até o momento não há procedimentos de esterilização disponíveis que não danifiquem os componentes sangüíneos celulares e ao mesmo tempo inativem todos os vírus contagiosos e outros microorganismos.

Outra questão relevante no armazenamento em bancos de sangue consiste na perda da função dos componentes sangüíneos durante o armazenamento. As plaquetas, em especial, precisam ser suspensas novamente após a separação dos outros componentes sangüíneos, seja em uma solução de armazenamento adequada ou em plasma, para melhorar ou pelo menos preservar a qualidade das plaquetas durante o armazenamento.

Se as plaquetas forem armazenadas em plasma, elas são geralmente armazenadas a concentrações de cerca de 900-2100 x 10/µL. Um dos efeitos colaterais da transfusão de plaquetas com plasma é que o recipiente de transfusão pode desenvolver reações alérgicas aos componentes no plasma do doador e/ou TRALI (lesão pulmonar aguda causada por transfusão). Outro fator a ser levado em conta é o custo. O próprio plasma pode ser usado ou vendido com o intuito de fracionar as proteínas do plasma em fatores de coagulação ou similares.

Portanto, é necessário armazenar as plaquetas em soluções de armazenamento sintéticas. Se as plaquetas forem armazenadas em soluções de armazenamento sintéticas, elas também são geralmente armazenadas a concentrações de cerca de 900-2100 x 10/µL. As várias soluções disponíveis no mercado incluem PAS III (comercializada pela MacoPharma), PASII (comercializada pela Baxter) e CompoSol (comercializada pela Fresenius). As soluções de armazenamento de plaquetas disponíveis no mercado contêm aditivos, como fosfato, glicose, sódio, potássio, citrato, magnésio, sulfato e acetato; acredita-se que esses aditivos melhorem o metabolismo das plaquetas durante o armazenamento.

Para manter a viabilidade, as plaquetas devem gerar continuamente trifosfato de adenosina (ATP) suficiente para satisfazer as suas necessidades energéticas. Normalmente, duas vias estão disponíveis para gerar ATP: a via glicolítica e a via de fosforilação oxidativa. Na glicólise, uma molécula de glicose é convertida em duas moléculas de ácido láctico para gerar duas moléculas de ATP. Na fosforilação oxidativa, glicose, ácidos graxos ou aminoácidos entram no ciclo de ácido cítrico e são convertidos em CO2 e água. Essa via exige a presença de um suprimento adequado de oxigênio para aceitar os prótons produzidos pela decomposição da glicose. É muito mais eficiente do que a glicólise. O metabolismo oxidativo de substratos para CO2 e água produz 36 moléculas de ATP.

Reconhece-se que as plaquetas irão satisfazer as suas necessidades energéticas de uma forma que não condiz necessariamente com seu armazenamento a longo prazo em uma condição viável. Quando supridas com oxigênio adequado, as plaquetas produzem grande parte de sua ATP através de oxidação, mas continuam a produzir ácido láctico em vez de desviar toda a glicose metabolizada através da via oxidativa. Durante o armazenamento das plaquetas em plasma, as concentrações de ácido láctico aumentam em aproximadamente 2,5 mM por dia. Consulte Murphy e colaboradores; "Platelet Storage at 22 °C, Blood, 46(2):209-218 (1975); Murphy, "Platelet Storage for Transfusion", Seminars in Hematology, 22(3): 165-177 (1985) Isso acarreta queda gradual do pH. Conforme explicado nos artigos de Murphy, quando o ácido láctico atinge aproximadamente 20 mM, o pH que começou em 7.2 pode chegar a 6.0. Visto que a viabilidade plaquetária é perdida de forma irreversível se o pH cair a 6.1 ou abaixo, a principal variável limitante para o armazenamento de plaquetas é o pH.

Portanto, o ajuste do pH é um fator importante no armazenamento de plaquetas a longo prazo. Praticamente todas as unidades de plaquetas apresentam diminuição no pH a partir de seu valor inicial ,de aproximadamente 7.0. Essa redução deve-se principalmente à produção de ácido láctico pela glicólise das plaquetas e, em menor grau, ao acúmulo de CO2 da fosforilação oxidativa. A medida que o pH diminui, as plaquetas mudam sua forma de discos para esferas. Se o pH cair por volta de 6.0, alterações irreversíveis na morfologia e fisiologia das plaquetas tornam-nas inviáveis após a transfusão. Portanto, uma importante meta na conservação de plaquetas é a de impedir essa redução no pH.

Em associação à redução no pH, foram

observadas reduções na quantidade total de ATP produzida por plaqueta. A depleção da ATP metabolicamente disponível afeta a função das plaquetas, pois a ATP é essencial para funções como adesão plaquetária e agregação plaquetária. Foi descoberto que a capacidade das plaquetas em manter a ATP total próxima aos níveis normais está associada à viabilidade plaquetária durante o armazenamento.

Ao projetar um meio de armazenamento de plaquetas, uma solução para os problemas anteriores foi a de incluir um aditivo que age tanto como um substrato para a fosforilação oxidativa quanto como um tampão para neutralizar o efeito acidificante do ácido láctico que as plaquetas produzem durante o armazenamento. Descobriu-se que o acetato é um substrato adequado. Além disso, sua oxidação produz bicarbonato:

CH3 COOO+2O2 = CO2 +HCO3 +H2O Sendo assim, o uso do acetato serve para duas finalidades: como substrato para a fosforilação oxidativa e como tampão. Tais soluções de armazenamento de plaquetas são reveladas nas Patentes US N° 5.344.752 e 5.376.524.

Outro aditivo, que é um substrato útil no armazenamento de sangue e componentes sangüíneos, inclui um composto que estimula a atividade mitocondrial. Um exemplo de composto adequado é a 7,8-dimetil-10-ribitil-isoaloxazina (riboflavina), seus metabólitos e precursores. Esse composto de estimulação mitocondrial pode incluir derivados baseados de forma endógena, que são análogos e homólogos sinteticamente derivados da riboflavina, que podem conter ou carecer dos substituintes halogênio ou alquila inferior (1-5), e que preservam a função e ausência de toxicidade substancial dos mesmos. Isso é revelado no Pedido US N° 10/430.896.

Acredita-se que esses agentes mantenham a viabilidade plaquetária durante o armazenamento através da estimulação da atividade mitocondrial. O FMN e FAD produzidos pelo metabolismo da riboflavina são elementos essenciais para a atividade de transporte de elétrons. Essa atividade está altamente envolvida na respiração mitocondrial. Ao proporcionar níveis elevados de riboflavina às células, é possível melhorar a respiração mitocondrial e, assim, promover a produção de ATP via fosforilação oxidativa em vez de pela glicólise.

Entretanto, até hoje não existe nenhuma solução de armazenamento ou aditivos que mantenha a viabilidade plaquetária durante o armazenamento ou durante um tratamento de redução de patógenos usando um substrato que atue como um substrato para fosforilação oxidativa e como um tampão, em combinação com um substrato que estimule a atividade mitocondrial. E para a solução desse problema que a presente invenção está voltada.

SUMÁRIO

Esta invenção direciona-se a uma solução de armazenamento ou aditivos de componentes sangüíneos contendo pelo menos um aditivo do tipo fotossensibilizador e acetato, que pode ser usado para coletar, tratar e/ou armazenar plaquetas.

A presente invenção também está voltada para um método para redução de patógenos de sangue ou de um componente sangüíneo coletado que inclui as etapas de adicionar, ao sangue ou componente sangüíneo a sofrer redução de patógenos, uma quantidade não-tóxica e eficaz de uma mistura de um fotossensibilizador endógeno ou fotossensibilizador derivado baseado de forma endógena e acetato; e expor o fluido misturado à fotorradiação suficiente para ativar o fotossensibilizador, por meio do que pelo menos parte dos patógenos é inativada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um gráfico comparando a taxa de consumo de glicose de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por cinco e sete dias.

A FIG. 2 é um gráfico comparando a taxa de produção de lactato de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por cinco e sete dias.

A FIG. 3 é um gráfico comparando a alteração do pH de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por cinco e sete dias.

A FIG. 4 é um gráfico comparando a taxa de consumo de CO2 de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por um período de sete dias.

A FIG. 5 é um gráfico comparando a taxa de produção de CO2 de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por um período de sete dias.

A FIG. 6 é um gráfico comparando a taxa de neutralização de bicarbonato de plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por um período de sete dias.

A FIG. 7 é um gráfico comparando o nível de alteração do formato das plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por um período de sete dias.

A FIG. 8 é um gráfico comparando a taxa de consumo de glicose de plaquetas armazenadas por 12 dias em uma solução contendo riboflavina e acetato com plaquetas armazenadas em solução salina. A FIG. 9 é um gráfico comparando a taxa de produção de lactato de plaquetas armazenadas por 12 dias em uma solução contendo riboflavina e acetato com plaquetas armazenadas em solução salina.

A FIG. 10 é um gráfico comparando as contagens de células de plaquetas armazenadas por 12 dias em uma solução contendo riboflavina e acetato com plaquetas armazenadas em solução salina.

A FIG. 11 ilustra uma concretização da presente invenção, usando uma série de bolsas para fazer circular o fotossensibilizador e o aditivo nos componentes sangüíneos a sofrerem redução de patógenos.

A FIG. 12 ilustra uma concretização da presente invenção usando uma bolsa de sangue para conter o fluido que está sofrendo redução de patógenos enquanto o fluido é exposto à fotorradiação a partir de uma fonte de luz.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção refere-se, em geral, a uma solução de armazenamento e tratamento para uso com componentes sangüíneos destinada a uso in vivo.

Conforme discutido acima, uma solução de armazenamento de plaquetas que contém acetato e riboflavina pode aumentar consideravelmente a viabilidade plaquetária durante o armazenamento a longo prazo. O pH dessa solução está, de preferência, entre cerca de 5.0 e 7.4. Essa solução pode ser útil como um veículo para concentrados plaquetários com o intuito de permitir a manutenção da qualidade e do metabolismo das células durante o armazenamento. Essas soluções também permitem que o plasma residual em concentrados plaquetários seja reduzido para cerca de 20 a 60 mLs/1011 células se comparado a um nível padrão de cerca de 75 a 100 mLs/1011 células.

Existem outros fatores além do armazenamento a longo prazo que podem fazer com que as plaquetas ingressem na glicólise e, com isso, acumulem ácido láctico. Um exemplo de tratamento externo que pode induzir as plaquetas a acumular lactato é um procedimento para inativar ou reduzir quaisquer patógenos que possam estar contidos nas ou ao redor das células transfundidas para um recipiente. Os atuais métodos utilizados para reduzir contaminantes patogênicos que podem estar presentes nos componentes sangüíneos podem causar danos às mitocôndrias das células sendo tratadas. Por exemplo, foi demonstrado que a luz ultravioleta causa danos às mitocôndrias. Se as mitocôndrias forem danificadas, as células só podem produzir a ATP pela via glicolítica, gerando um acúmulo de ácido láctico na célula e uma queda subseqüente no pH durante o armazenamento.

Portanto, a presente invenção também contempla uma solução que pode ser usada em um procedimento para reduzir quaisquer patógenos que possam estar contidos no sangue total ou nos componentes sangüíneos coletados. Nesta concretização, um aditivo que se comporta como um fotossensibilizador, se exposto à luz, é empregado seletivamente para ajudar a eliminar patógenos contaminantes. A solução de redução de patógenos também pode conter um aditivo, tal como acetato, que age como um substrato para fosforilação oxidativa, para ajudar a manter a viabilidade das células durante e/ou após o procedimento de redução de patógenos.

Caso seja desejada a redução de patógenos do sangue e/ou dos componentes sangüíneos, aditivos que agem como fotossensibilizadores quando da exposição à luz são úteis nesta invenção. Tais aditivos incluem fotossensibilizadores endógenos. Exemplos de tais fotossensibilizadores endógenos são as aloxazinas, tal como 7,8-dimetil-10-ribitil isoaloxazina (riboflavina), 7,8,10-trimetilisoaloxazina (lumiflavina), 7,8- dimetilaloxazina (lumicromo), dinucleotídeo isoaloxazina- adenina (dinucleotídeo flavina-adenina [FAD]) e mononucleotídeo aloxazina (também conhecido como mononucleotídeo flavina [FMN] e riboflavina-5-fosfato), seus metabólitos e precursores. Quando se utilizam fotossensibilizadores endógenos, em especial quando tais fotossensibilizadores não são inerentemente tóxicos ou não produzem fotoprodutos tóxicos após a fotorradiação, não é necessária nenhuma etapa de remoção ou purificação após a descontaminação, e o produto tratado pode ser devolvido diretamente ao corpo do paciente ou administrado a um paciente que necessita de seu efeito terapêutico. Portanto, o fluido submetido à redução de patógenos irá conter os fotoprodutos do aditivo tipo fotossenbilizador. O sangue ou componentes sangüíneos a sofrerem redução de patógeno ou serem armazenados incluem sangue total, ou glóbulos vermelhos, plaquetas e/ou plasma que foram separados em componentes a partir do sangue total.

O uso da riboflavina e de derivados da riboflavina como fotossensibilizadores para reduzir microorganismos em derivados sangüíneos é descrito em diversas Patente US, incluindo 6.277.337, 6.258.577, 6,268120 e 6.828.323.

Os patógenos que podem ser reduzidos ou inativados usando a solução da presente invenção incluem qualquer substância que seja indesejada no sangue ou componentes sangüíneos, quer originalmente de uma fonte externa ou interna. As substâncias podem incluir, sem a isto se limitar, vírus (tanto extracelulares como intracelulares), bactérias, bacteriófagos, fungos, parasitas transmitidos pelo sangue, príons e protozoários.

Os patógenos também podem incluir células sangüíneas caso seja desejada a supressão da resposta imune ou auto-imune, por exemplo, em processos envolvendo a transfusão de glóbulos vermelhos, plaquetas ou plasma quando glóbulos brancos do doador estiverem presentes.

Materiais que podem ser tratados e/ou armazenados usando os métodos desta invenção incluem sangue total ou componentes sangüíneos separados contendo mitocôndrias, como plaquetas, por exemplo. O método da presente invenção para armazenar o sangue total ou componentes sangüíneos separados requer misturar o aditivo de riboflavina e o acetato com o componente sangüíneo a ser armazenado. A mistura pode ser feita simplesmente adicionando-se a riboflavina e o acetato, na forma aquosa ou seca, ao sangue total ou componente sangüíneo, ou adicionando-se uma solução que contenha pelo menos a riboflavina e o acetato ao sangue total ou componente sangüíneo a ser armazenado. A riboflavina e o acetato podem ser adicionados juntos ou cada um pode ser adicionado separadamente.

O aditivo riboflavina pode ser usado a uma concentração entre cerca de 500 μΜ por 35 ± 5 mLs de solução. A concentração de acetato pode ser entre cerca de 140 ± 50 mM por 35 ± 5 mLs de solução, embora sejam possíveis faixas mais extensas. Uma solução salina contendo aproximadamente 0,9% de cloreto de sódio também pode ser adicionada.

Caso seja desejado tratamento para reduzir ou inativar patógenos, o sangue total ou componente sangüíneo coletado contendo pelo menos o fotossensibilizador e, possivelmente, acetato, é exposto à fotorradiação de comprimento de onda apropriada para ativar o fotossensibilizador, usando uma quantidade de fotorradiação suficiente para ativar o fotossensibilizador conforme descrito acima, mas inferior à que causaria danos não específicos significativos aos componentes sangüíneos sendo iluminados ou que interferiria substancialmente na atividade biológica de outras proteínas presentes. Caso seja desejado submeter as plaquetas à redução de patógenos, preferencialmente a fonte de luz usada para ativar o aditivo tipo fotossensibilizador é uma fonte de luz UV de amplo espectro fornecendo luz de aproximadamente 320 nm.

Quando exposta à luz, a riboflavina é capaz de inativar os patógenos possivelmente presentes interferindo na replicação dos patógenos ou eliminando diretamente os patógenos. A ação do fotossensibilizador pode ser conferida pela formação de oxigênio singleto, bem como pela estreita proximidade do fotossenbilizador com o ácido nucléico do patógeno, e isso pode advir da ligação do fotossensibilizador ao ácido nucléico dos patógenos. "Ácido nucléico" inclui ácido ribonucléico (RNA) e ácido desoxirribonucléico (DNA). Acredita-se que a reação química que entre a 7„8-dimetii-Í0- ribitil-isoaloxazina e os ácidos nucléicos não ocorra somente via processos dependentes de oxigênio singleto (isto é, mecanismo do Tipo II), mas em vez disso, por interações diretas entre o sensibilizador e o substrato (mecanismos do Tipo I). Cadet e colaboradores [J. Chem., 23:420-429 (1983)] demonstra claramente que os efeitos da 7,8-dimetil-10-ribitil isoaloxazina são provocados pela oxidação de oxigênio não-singleto de resíduos de guanosina. Além disso, as bases da adenosina parecem ser sensíveis aos efeitos da 7,8-dimetil-10-ribitil isoaloxazina acrescentada de luz UV. Isso é importante, já que os resíduos de adenosina são relativamente insensíveis aos processos dependentes de oxigênio singleto. A 7,8-dimetil-10-ribitil isoaloxazina parece não produzir grandes quantidades de oxigênio singleto quando da exposição à luz UV, mas em vez disso, exerce seus efeitos através de interações diretas com o substrato (por exemplo, ácidos nucléicos) através de reações de transferência de elétrons com espécies sensibilizadoras em estado excitado. Uma vez que o dano indiscriminado às células e proteínas advém principalmente de fontes de oxigênio singleto, essa via mecanicista para a ação da 7,8-dimetil-10-ribitil isoaloxazina permite maior seletividade em sua ação do que no caso de outros compostos fotossensibilizadores, tais como psoralenos que possuem química Tipo II significativa.

O aditivo tipo fotossensibilizador e o acetato podem ser adicionados ou colocados em circulação no recipiente de iluminação ou armazenamento antes de o componente sangüíneo ser adicionado ao recipiente ou pode ser adicionado ao componente sangüíneo que já está no recipiente. Conforme observado acima, o aditivo tipo fotossensibilizador e o acetato também podem ser adicionados ao componente sangüíneo como uma solução de armazenamento após um procedimento de redução de patógenos.

Para os procedimentos de redução de patógenos, o componente sangüíneo a ser submetido à redução de patógenos e a solução de aditivos contendo pelo menos a riboflavina são colocados em bolsas que são permeáveis à fotorradiação, ou pelo menos suficientemente permeáveis à fotorradiação para permitir que uma radiação suficiente atinja seu conteúdo para ativar o fotossensibilizador. O termo "permeável à fotorradiação" significa que o material do recipiente é adequadamente transparente à fotorradiação de comprimento de onda apropriado para ativar o aditivo tipo fotossensibilizador. Na solução de aditivos contendo pelo menos riboflavina, a riboflavina é adicionada a uma concentração de pelo menos 500 μΜ.

A bolsa contendo o componente sangüíneo e riboflavina é iluminada, de preferência a cerca de 1 a cerca de 120 J/cm2 por um período entre cerca de 6 e 10 minutos, dependendo da capacidade de absorção do componente sangüíneo sendo irradiado para assegurar a exposição de essencialmente todo o fluido à radiação.

Pode-se adicionar acetato ao derivado sangüíneo a ser iluminado antes de a riboflavina ser adicionada, à riboflavina ou após o procedimento de iluminação. O acetato é adicionado a uma concentração de pelo menos cerca de 106 mM por 35 mL de solução. A solução de aditivos também pode conter solução salina fisiológica contendo cerca de 0,9% de cloreto de sódio.

A FIG. 11 representa uma concretização da presente invenção, em que o componente sangüíneo a ser submetido à redução de patógenos é inicialmente coletado em uma bolsa de sangue 280. Em seguida, o componente sangüíneo é escoado para fora da bolsa de coleta 280 para uma bolsa de iluminação permeável à fotorradiação 284 equipada com uma porta de entrada 282, através da qual a riboflavina e/ou acetato podem ser adicionados a partir da bolsa 286 via a linha de entrada 288. A bolsa 284 pode então ser exposta a uma fonte de fotorradiação 260, conforme ilustrado na FIG. 12.

Como alternativa, o acetato pode ser adicionado ao derivado sangüíneo submetido à redução de patógenos após o procedimento de iluminação, e o derivado submetido à redução de patógenos pode ser ou transfundido imediatamente ou armazenado para uso futuro. A bolsa 284 também poderia ser pré- embalada contendo o fotossensibilizador e acetato, e o fluido da bolsa 280 pode ser adicionado posteriormente à bolsa.

A solução de armazenamento da presente invenção também usa os aditivos riboflavina e acetato, conforme descrito acima.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Para medir o efeito que a adição do acetato tem sobre as ρlaquetas que foram sujeitas ao procedimento de redução de patógenos, as plaquetas foram suspensas em soluções contendo riboflavina separada, ou riboflavina e acetato, e expostas à luz.

Esses experimentos incluem dois controles, uma amostra controle com alta concentração de plaquetas (150 mLs contendo 3-4 χ IO11 plaquetas e 40 mL de plasma por 1 χ IO11 células) (denominada armazenamento de alta concentração (de plaquetas) nas Figuras), e um controle de armazenamento convencional (250 mLs contendo 3-4 χ IOn plaquetas e 62-83 mLs de plasma /3-4 χ IOn plaquetas) (denominado controle de armazenamento convencional (ou não tratado) nas Figuras). Os experimentos também incluíram duas amostras de plaquetas submetidas à redução de patógenos (denominadas tratamentos (ou tratadas) nas Figuras). Uma amostra tratada inclui 3-4 χ 10^11 plaquetas suspensas em 150 mL de uma solução de redução de patógenos/armazenamento contendo 50 μΜ de riboflavina e 40 mL de plasma por 1 χ 10^11 células (denominada tratamento, riboflavina nas Figuras) e uma amostra incluindo 3-4 χ 10^11 plaquetas suspensas em 150 mL de uma solução de redução de patógenos/armazenamento contendo 50 μΜ de riboflavina e 20 mM de acetato e 40 mL de plasma por 1 χ 10^11 células (denominada tratamento, riboflavina + acetato nas Figuras). Ambas as amostras tratadas foram expostas a 6,24 J/mL de luz, e armazenadas por 7 dias sob condições padrão de armazenamento de plaquetas.

As FIGS. 1 a 7 abaixo ilustram medições diretas e indiretas do metabolismo das plaquetas tratadas e não tratadas.

A FIG. 1 compara o consumo de glicose das plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por 5 e 7 dias. Como se pode observar, especialmente após 7 dias de armazenamento, as plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato consumiram menos glicose do que as plaquetas tratadas com a riboflavina separadamente.

A FIG. 2 compara a produção de lactato das plaquetas tratadas e não tratadas armazenadas por 5 e 7 dias. As plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato produziram menos ácido láctico, especialmente após 7 dias de armazenamento, do que as plaquetas tratadas com a riboflavina separadamente.

A FIG. 3 compara a alteração do pH das soluções de redução de patógenos/armazenamento por um período de armazenamento de 7 dias. As plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato experimentaram uma alteração (ou queda) muito mais lenta no pH da solução de redução de patógenos/armazenamento durante o período de armazenamento de 7 dias. No T dia, o pH médio ficou acima de 7.0. Para as plaquetas na solução de redução de patógenos/armazenamento sem acetato, o pH ficou abaixo de 6.8.

A FIG. 4 compara o consumo de oxigênio das plaquetas submetidas à redução de patógenos por um período de armazenamento de 7 dias. O consumo de oxigênio aumentou durante o período de armazenamento de 7 duas nas plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato, bem como riboflavina isoladamente, em comparação com ambos os conjuntos de plaquetas controle. O consumo de oxigênio indica a respiração mitocondrial. Valores inferiores de p02 refletem o maior consumo de oxigênio e melhor atividade mitocondrial.

A FIG. 5 compara a produção de dióxido de carbono das plaquetas durante 7 dias de armazenamento. A produção de dióxido de carbono é uma medida da respiração mitocondrial: as plaquetas em respiração consomem oxigênio e produzem dióxido de carbono. Mais dióxido de carbono é produzido pelas plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato do que pelas plaquetas controle não tratadas.

A FIG. 6 compara a neutralização do bicarbonato pelas plaquetas em 40 mL de transferência de plasma nas soluções de redução de patógenos/armazenamento durante 7 dias de armazenamento. As plaquetas metabolizam o bicarbonato para manter constante o pH. Se o pH sofrer uma redução devido à produção de ácido láctico, mais bicarbonato será neutralizado. As plaquetas submetidas à redução de patógenos tratadas com riboflavina e acetato neutralizaram menos bicarbonato do que as plaquetas controle não tratadas.

A FIG. 7 compara a porcentagem de mudança de forma estendida das plaquetas entre 5 e 7 dias de armazenamento. Novamente, as plaquetas tratadas com riboflavina e acetato apresentaram menos alteração de formato após 7 dias em armazenamento do que as plaquetas tratadas sem acetato.

Como se pode observar nas FIGS. 1 a 3, a adição de acetato produz aperfeiçoamentos significativos no consumo de glicose, na produção de ácido láctico e no pH, que são os indicadores mais preditivos da recuperação e sobrevivência de plaquetas in vitro. Esse efeito corresponde ao acetato em combinação com a riboflavina, promovendo a respiração mitocondrial. Esses dados também mostram que uma solução de aditivos contendo riboflavina e acetato permite o armazenamento e/ou redução de patógenos de elevadas concentrações de plaquetas, reduzindo, ao mesmo tempo, a concentração plasmática. Isso permite que mais plasma seja coletado em um procedimento de separação de sangue e diminui os níveis de exposição do plasma em um recipiente de transfusão.

Exemplo 2

Foi realizado um estudo comparativo com o intuito de examinar o efeito do acetato sobre plaquetas armazenadas pelo período de 12 dias. As plaquetas não foram expostas à luz.

Um conjunto de amostras, contendo 250 mL de plaquetas a uma concentração de 900-2100 x 10 /μL, foi suspenso em 35 mL de uma solução de armazenamento contendo solução salina com 1,85 M de acetato de sódio e 500 μΜ de riboflavina.

A outra amostra, contendo 250 mL de plaquetas a uma concentração de 900-2100 x 10 /μL, foi suspensa em 37 mL de uma solução de armazenamento contendo apenas solução salina.

A FIG. 8 compara a taxa de consumo de glicose entre plaquetas armazenadas em uma solução contendo riboflavina e acetato, e plaquetas armazenadas em uma solução sem riboflavina e acetato. Após 12 dias de armazenamento, as plaquetas na solução contendo riboflavina e acetato consumiram menos glicose que as plaquetas armazenadas na solução sem riboflavina e acetato.

A FIG. 9 compara a taxa de produção de lactato das plaquetas após 12 dias de armazenamento. . Após 12 dias de armazenamento, as plaquetas na solução contendo riboflavina e acetato produziram menos ácido láctico que as plaquetas armazenadas na solução sem riboflavina e acetato.

A FIG. 10 compara a contagem de células das plaquetas armazenadas em uma solução de armazenamento contendo riboflavina e acetato com a contagem de células das plaquetas armazenadas em uma solução sem riboflavina e acetato. No decorrer de 12 dias de armazenamento, não pareceu haver nenhum efeito notável sobre a contagem de células das plaquetas armazenadas na solução contendo riboflavina e acetato vs. plaquetas armazenadas na solução sem riboflavina e acetato.

Os resultados indicam o benefício da utilização de uma solução de armazenamento contendo riboflavina e acetato. Como é possível observar nas FIGS. 8 a 10, o armazenamento das plaquetas em uma solução contendo acetato e riboflavina possibilita o armazenamento de plaquetas por pelo menos 12 dias, se comparado às plaquetas armazenadas em soluções sem riboflavina e acetato.

Claims (32)

1. Fluido, caracterizado por compreender: pelo menos um componente sangüíneo coletado; e uma solução de aditivos de componente sangüíneo compreendendo uma aloxazina endógena; e acetato.

2. Fluido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a aloxazina endógena é a riboflavina.

3. Fluido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente sangüíneo coletado compreende plaquetas.

4. Fluido, de acordo com a reivmdicaçao 1, caracterizado pelo fato de que a solução de aditivos de componente sangüíneo compreende ainda solução salina fisiológica.

5. Fluido, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução salina fisiológica é cloreto de sódio a 0,9%.

6. Fluido, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por adicionalmente compreender plasma.

7. Fluido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o volume de plasma está entre 20- -80 mL por IOn plaquetas coletadas.

8. - Fluido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o volume de plasma está entre 30- -60 mL por IO11 plaquetas coletadas.

9. - Fluido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente sangüíneo coletado foi submetido à redução de patógenos.

10. - Solução de armazenamento ou aditivos, caracterizada por compreender: uma aloxazina endógena; e acetato.

11. - Fluido, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a aloxazina endógena é a riboflavina.

12. - Solução de armazenamento ou aditivos, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por adicionalmente compreender solução salina fisiológica.

13. - Solução de armazenamento ou aditivos, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a solução salina fisiológica é cloreto de sódio a 0,9%.

14. - Solução de armazenamento ou aditivos, caracterizada por consistir essencialmente de: uma aloxazina endógena; e acetato.

15. - Solução de armazenamento ou aditivos, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a aloxazina endógena é a riboflavina.

16. - Solução de armazenamento ou aditivos, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a riboflavina está a uma concentração de aproximadamente 500 μΜ por 35 ± 5 mLs de solução.

17. - Solução de armazenamento ou aditivos, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o acetato está a uma concentração de aproximadamente 140 ± 50 mM por 35 ± 5 mLs de solução.

18. - Solução de armazenamento ou aditivos, caracterizada por consistir de: riboflavina; acetato; e solução salina.

19. - Fluido que foi submetido à redução de patógenos, caracterizado por consistir essencialmente de: sangue ou componentes sangüíneos coletados; e uma solução de redução de patógenos consistindo essencialmente de fotoprodutos de um aditivo do tipo fotossensibilizador; acetato; e solução salina.

20. - Fluido, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sangue ou componentes sangüíneos coletados adicionalmente consistem de plaquetas e plasma.

21. Fluido, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o plasma está entre 20-80 mL por IOn plaquetas coletadas.

22. Fluido, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o plasma está entre 30-60 mL por IOn plaquetas coletadas.

23. Fluido, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os fotoprodutos de um aditivo tipo fotossensibilizador são fotoprodutos de um fotossensibilizador endógeno.

24. Solução de redução de patógenos, caracterizada por compreender: uma aloxazina endógena; e acetato.

25. Solução de redução de patógenos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por adicionalmente compreender solução salina.

26. Solução de redução de patógenos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a aloxazina endógena adicionalmente compreende riboflavina.

27. Solução de redução de patógenos, caracterizada por consistir de: riboflavina; acetato; e solução salina.

28. Método de redução de patógenos em sangue ou componentes sangüíneos coletados que podem conter patógenos, caracterizado por compreender: (a) misturar uma quantidade não-tóxica eficaz de uma mistura consistindo essencialmente de um fotossensibilizador endógeno e acetato com o sangue ou componente sangüíneo coletado para formar um fluido misturado; e (b) expor o fluido misturado à fotorradiação suficiente para ativar o fotossensibilizador, por meio do que pelo menos parte dos patógenos é reduzida.

29. Método, de acordo com a reivindicação -28, caracterizado pelo fato de que o componente sangüíneo coletado compreende plaquetas.

30. Método, de acordo com a reivindicação -28, caracterizado por adicionalmente compreender a adição de solução salina fisiológica ao fluido misturado.

31. Método, de acordo com a reivindicação -29, caracterizado pelo fato de que o fluido misturado adicionalmente compreende plasma a uma quantidade entre 20-80 mL por 10^11 plaquetas coletadas.

32. Método, de acordo com a reivindicação -29, caracterizado pelo fato de que o fluido misturado adicionalmente compreende plasma a uma quantidade entre 30-60 mL por 10^11 plaquetas coletadas.