PL200250B1

PL200250B1 - Sposób hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi lub jej frakcji oraz sposób zmniejszania glikolizy

Info

Publication number: PL200250B1
Application number: PL352208A
Authority: PL
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2008-12-31
Also published as: HUP0201465A2; CZ301803B6; DK1187530T3; US6403124B1; AU774252B2; US7851142B2; CZ20014078A3; CA2374140A1; SK287562B6; SK16632001A3; MXPA01012645A; US20040146846A1; KR20020008412A; IL146517A; HUP0201465A3; US20020102529A1; HK1044099B; EP1187530A1; KR100713140B1; IL146517A0

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania wzrostu bakterii w pe lnej krwi lub jej frakcji obejmuj acy dodawanie do pe lnej krwi lub frakcji krwi zwi azku wybranego z grupy obejmuj acej L-karnityne, sole L-karnityny, alkanoilokarnityny, sole alkanoilokarnityn, i ich mieszaniny. Przedmiotem wynalazku jest równie z sposób zmniejszania glikolizy w pe lnej krwi lub jej frakcji obejmuj acy dodawa- nie do pe lnej krwi lub frakcji krwi zwi azku wybranego z grupy obejmuj acej L-karnityn e, sole L-karnityny, alkanoilokarnityny, sole alkanoilokarnityn, i ich mieszaniny. Przedmiotem wynalazku jest tak ze sposób zmniejszania glikolizy w koncentracie p lytek krwi od przypadkowych dawców o zmniej- szonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem obejmuj acy zawieszenie koncentratu p lytek krwi w roztworze podtrzymuj acym zawieraj acym zwi azek wybrany z grupy obejmuj acej L-karnityn e i sole L-karnityny. PL PL PL PL

Description

Zakres wynalazku:

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie krwinek czerwonych, koncentracie krwinek białych (WBC), koncentracie płytek krwi, osoczu i pochodnych osocza, które przechowuje się przez dłuższy czas. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób zmniejszania glikolizy w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie krwinek czerwonych, koncentracie krwinek białych (WBC), koncentracie płytek krwi, osoczu i pochodnych osocza, które przechowuje się przez dłuższy czas. Przedmiotem wynalazku jest również sposób zmniejszania glikolizy w koncentracie płytek krwi od przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem.

Dyskusja tła wynalazku:

Rośnie zaniepokojenie zarówno krajowymi, jak i światowymi zapasami krwi. Zakwestionowano integralność i pewność istniejących zasobów, oraz zdolność do stworzenia większych zapasów z czasem. Jednym z powodów tego jest względnie krótki okres trwałości przy przechowywaniu produktów krwiopochodnych. Obecnie, koncentraty RBC (koncentraty czerwonych krwinek, lub RCC), dominująca forma produktu krwiopochodnego do transfuzji i tym podobnych, są ograniczone do 42 dni przechowywania. Po tym czasie poziomy ATP spadają znacząco, co łączy się ze znaczącym spadkiem pH, silnie wskazującym na brak żywotności, lub, jeśli zachowuje się żywotność, na skrajnie krótki czas życia w krążeniu po infuzji, in vivo. Pełnej krwi nie przechowuje się przez znaczące okresy. Dla płytek krwi, obecny okres przechowywania jest jeszcze krótszy, przy czym normą jest 5 dni w temperaturze 22°C. Różnica w trwałości przy przechowywaniu koncentratu płytek krwi (PC), w przeciwieństwie do RBC, jest spowodowana przebiegiem metabolicznych reakcji w płytkach krwi, częściowo wskutek obecności mitochondriów w PC i ich nieobecności w RBC. Chociaż oba produkty krwiopochodne wykazują spadek ATP, sprzężony ze spadkiem pH, ponadto z towarzyszeniem wytwarzania kwasu mlekowego, obecność mitochondriów w PC prawdopodobnie wzmacnia problem, wskutek glikolizy.

Równocześnie nasila się troska o pewność i integralność zapasów krwi. W szczególności, zanieczyszczenie zapasów krwi bakteriami, lub innymi mikrobiologicznymi środkami, wykrywano wielokrotnie. Taka sytuacja występuje jeszcze bardziej ostro w krajach z mniej wyszukanymi sposobami zbierania i przechowywania.

Chociaż można dodawać różne środki do zbieranych produktów dla zmniejszenia skażenia, nie są one pożądane, jeśli trzeba przetaczać produkty z powrotem pacjentom.

Jedną z pożądanych alternatyw jest traktowanie promieniowaniem produktów, po opakowaniu, typowo w pojemnikach z plastyfikowanego tworzywa winylowego. Takie traktowanie promieniowaniem pogorszy RBC i być może PC przy przechowywaniu, co powoduje pogorszenie funkcjonowania tych komórek.

Dodatkowo, mała, lecz rosnąca część populacji otrzymującej krew jest zagrożona zwykle śmiertelnym stanem znanym jako związana z transfuzją choroba przeszczepu przeciw gospodarzowi (TA-GVHD), powodowana obecnością żywych alogenicznych leukocytów.

Ten syndrom jest zwykle związany z immunosupresyjnymi pacjentami, takimi jak pacjenci z rakiem i przeszczepem szpiku kostnego, lecz może również zachodzić u immunokompetentnych osób w warunkach ograniczonego polimorfizmu HLA w populacji .

Wiele uwagi poświęcono znalezieniu sposobów podwyższania trwałości przy przechowywaniu. Jeden taki sposób, dla wydłużania czasu przechowywania PC, omówiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5466573. Przedmiotem tego patentu jest dostarczenie preparatów PC ze źródłem jonu octanowego, który działa jako substrat do utleniającego fosforylowania i jako bufor przeciwdziałający wszelkiemu spadkowi pH wskutek wytwarzania kwasu mlekowego. Taki sposób nie działa bezpośrednio na problem hemolizy i rozpad błon.

Alternatywny sposób ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5496821, autorstwa wynalazcy niniejszego i wspólnie scedowanym. W tym opisie patentowym, pełną krew przechowuje się w preparacie zawierającym L-karnitynę (LC) lub jej alkanoilowe pochodne. Opis patentowy nie opisuje jednak wpływu na produkty krwiopochodne, takie jak zawiesiny PC lub RBC, i polega co najmniej w pewnym stopniu na wpływie LC na charakterystykę osocza.

Jak wspomniano powyżej, zakażenie zapasu krwi środkami mikrobiologicznymi jest kolejnym problemem stawianym przez społeczność medyczną. Jednym ze sposobów sterylizacji produktu

PL 200 250 B1 i polepszania jego niezawodnoś ci w odniesieniu do zakaż enia jest napromieniowanie produktu krwiopochodnego. W ogólności pożądane jest napromieniowanie promieniami gamma przy wartości około 25 centygrejów (cG) produktu po szczelnym opakowaniu w plastykowy, szklany lub inny pojemnik. Niestety, napromieniowanie wywołuje uszkodzenia błony komórkowej, z hemolizą RBC. Napromieniowanie produktów krwiopochodnych, w tym pełnej krwi, koncentratów RBC i PC, nadal powoduje problemy.

Opis patentowy W087/03484 ujawnia roztwór do stabilizacji czerwonych krwinek nie przytaczając L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny.

Opis patentowy WO97/16967 odnosi się do kompozycji minimalizującej uszkodzenia składników krwi, takich jak czerwone krwinki, płytki i granulocyty, w wyniku stresu utleniającego. Opis patentowy WO97/16967 nie przytacza L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny.

Opis patentowy WO98/46073 odnosi się do kompozycji, L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityn do konserwacji czerwonych krwinek lub koncentratów płytek. Opis patentowy WO98/46073 nigdzie nie ujawnia zastosowania L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny w zakresie wynalazku.

Opis patentowy EP 0272551 ujawnia chinolonowe pochodne kwasów karboksylowych przydatne do zapobiegania intensywnego wzrostu bakterii w przechowywanej krwi lub składnikach krwi. Opis patentowy EP 0272551 nie przytacza L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny.

Opis patentowy EP 0552137 ujawnia szczególne pochodne (estry) acylowanych karnityn z długołańcuchowymi alkoholami alifatycznymi, które posiadają silne właściwości antybakteryjne. Opis patentowy EP 0552137 nie przytacza L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny.

Żaden z dokumentów wymienionych powyżej nie ujawnia ani nie sugeruje sposobu hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi lub jej frakcji za pomocą L-karnityny, lub alkanoilo-L-karnityny, lub ich mieszaniny.

Ponadto, wpływ L-karnityny na wzrost bakterii w produktach krwiopochodnych, takich jak pełna krew, koncentraty czerwonych krwinek i koncentraty płytek krwi, nie został jak dotąd opisany. Podobnie nie wykazano wpływu L-karnityny na glikolizę produktów krwiopochodnych, takich jak pełna krew, koncentraty czerwonych krwinek, koncentraty płytek krwi, szczególnie płytek krwi przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi lub jej frakcji, obejmujący dodawanie do pełnej krwi lub frakcji krwi związku wybranego z grupy obejmującej L-karnitynę, sole L-karnityny, alkanoilokarnityny, sole alkanoilokarnityn, i ich mieszaniny, w ilości skutecznej do tłumienia wzrostu bakterii w pełnej krwi lub frakcji krwi.

Frakcję krwi wybiera się z grupy obejmującej koncentrat czerwonych krwinek, koncentrat białych krwinek, koncentraty płytek krwi, osocze, i pochodne osocza.

Korzystnie frakcja krwi jest koncentratem czerwonych krwinek, a sposób według wynalazku obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu czerwonych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

Frakcja krwi korzystnie jest koncentratem białych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu białych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

Korzystnie frakcja krwi jest koncentratem płytek krwi, a sposób według wynalazku obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu płytek krwi w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

Frakcja krwi korzystnie jest osoczem lub pochodną osocza, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny osocza lub pochodnej osocza w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

Korzystnie w sposobie według wynalazku, związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM. Szczególnie korzystnie związek jest zawarty w roztworze podtrzymują cym w stężeniu od 1 do 30 mM.

W sposobie według wynalazku korzystnie związkiem jest L-karnityna.

Korzystnie w sposobie według wynalazku związek wybiera się z grupy obejmującej acetylo-L-karnitynę, propionylo-L-karnitynę, butyrylo-L-karnitynę, izobutylo-L-karnitynę, walerylo-L-karnitynę i izowalerylo-L-karnitynę.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób zmniejszania glikolizy w pełnej krwi lub jej frakcji wybranej z grupy obejmującej koncentrat czerwonych krwinek, koncentrat białych krwinek, osocze i pochodne osocza, obejmujący dodawanie do pełnej krwi lub frakcji krwi związku wybranego z grupy obejmującej L-karnitynę, sole L-karnityny, alkanoilokarnityny, sole alkanoilokarnityn i ich mieszaniny, w iloś ci skutecznej do zmniejszania glikolizy w peł nej krwi lub frakcji krwi.

PL 200 250 B1

Korzystnie w sposobie według wynalazku frakcja krwi jest koncentratem czerwonych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu czerwonych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

W sposobie wedł ug wynalazku korzystnie frakcja krwi jest koncentratem bia ł ych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu białych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

Korzystnie w sposobie według wynalazku frakcja krwi jest pochodną osocza, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny osocza lub pochodnej osocza w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.

W sposobie według wynalazku korzystnie związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM. Zwłaszcza korzystnie związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 1 do 30 mM.

Korzystnie w sposobie według wynalazku związkiem jest L-karnityna.

W sposobie według wynalazku korzystnie związek wybiera się z grupy obejmującej acetylo-L-karnitynę, propionylo-L-karnitynę, butyrylo-L-karnitynę, izobutylo-L-karnitynę, walerylo-L-karnitynę i izowalerylo-L-karnitynę.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest również sposób zmniejszania glikolizy w koncentracie płytek krwi od przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem, obejmujący zawieszanie koncentratu płytek w roztworze podtrzymującym zawierającym związek wybrany z grupy obejmującej L-karnitynę i sole L-karnityny w ilości skutecznej do zmniejszania glikolizy w koncentracie pł ytek krwi od przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem.

Korzystnie w sposobie według wynalazku związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM. Szczególnie korzystnie w sposobie wedł ug wynalazku zwią zek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 1 do 30 mM.

Te i inne cele, które staną się oczywiste z dalszego szczegółowego opisu, można osiągnąć dzięki odkryciu zgłaszającego, po dłuższych badaniach, że uszkodzenia błon doznawane przez RBC i PC podczas przechowywania, lub wskutek napromieniowania, mo ż na zasadniczo opó ź nić i stł umi ć , przez zawieszenie produktu krwiopochodnego w konwencjonalnym roztworze konserwującym, takim jak AS-3, gdzie roztwór konserwujący zawiera ponadto L-karnitynę lub jej alkanoilową pochodną, w stężeniu 0,25-50 mM lub większym. Odkrycie zgłaszającego polega na spostrzeżeniu, że większość produktów rozkładu krwi, zwyczajowo związanych ze spadkiem poziomów ATP i pH, można w istocie prześledzić do uszkodzenia błony i hemolizy. Konserwację i naprawę błon można prowadzić przez reacylowanie lipidów, dokonywane częściowo przez LC, którego nieodwracalny pobór w RBC i podobnych produktach krwiopochodnych stwierdzono w badania związanych z wynalazkiem. Wynalazca odkrył również, że L-karnityna hamuje wzrost bakterii w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie czerwonych krwinek, koncentracię białych krwinek (WBC), koncentracie płytek krwi, osoczu, i pochodnych osocza, które przechowuje się przez dłuższy czas. Wynalazca odkrył również, że L-karnityna redukuje glikolizę w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie czerwonych krwinek, koncentracie białych krwinek (WBC), koncentracie płytek krwi, szczególnie płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przypadkowych dawców przed przechowywaniem, osoczu, i pochodnych osocza, które przechowuje się przez dłuższy czas.

Krótki opis rysunków

Figura 1. Wartości czasu życia po infuzji przechowywanego 42 dni RBC w odniesieniu do dawcy oraz kontrolnego i przechowywanego w LC. Strzałki wskazują średnią ± odchylenie standardowe odpowiednio RBC kontrolnego i przechowywanego w LC. Na górze wykresu pokazano również dokładną obliczoną wartość p.

Figura 2. Zawartość karnityny w czerwonych krwinkach w różnych tygodniach przechowywania krwi. Karnitynę testowano jak opisano w materiałach i sposobach. Wartości są średnimi z trzech doświadczeń wykonywanych podwójnie. Zmienność pomiędzy doświadczeniami nie przekraczała 7%. Otwarte symbole, RBC przechowywany z samym AS-3; zamknięte symbole, RBC przechowywany w AS-3 z dodatkiem LC (5 mM).

Figura 3. Włączanie radioaktywnego kwasu palmitynowego do RBC LC w różnych tygodniach przechowywania krwi. Porcje RBC pobrane z jednostki krwi przechowywanej w samym AS-3 lub AS-3 z dodatkiem LC inkubowano w temperaturze 37°C z kwasem [1-¹⁴C]palmitynowym skompleksowanym z wolnym od kwasu tłuszczowego BSA. Na koniec inkubacji, RBC przetworzono jak opisano w

PL 200 250 B1 materiałach i sposobach. Tworzenie radioznakowanego PLC miało związek z zawartością fosforu obecnego w ekstrakcie lipidów. Wartości są średnimi z trzech doświadczeń wykonywanych podwójnie. Zmienność pomiędzy doświadczeniami nie przekraczała 7%. Otwarte symbole, RBC przechowywany z samym AS-3; zamknięte symbole, RBC przechowywany w AS-3 z dodatkiem LC (5 mM).

Figura 4. Włączanie radioaktywnego kwasu palmitynowego do fosfatydyloetanoloaminy (PE) i fosfatydylocholiny (PC) błony czerwonych krwinek w róż nych tygodniach przechowywania krwi. Porcje RBC pobrane z jednostki krwi przechowywanej w samym AS-3 lub AS-3 z dodatkiem LC inkubowano w temperaturze 37°C z kwasem [1-¹⁴C]palmitynowym skompleksowanym z wolnym od kwasu tłuszczowego BSA. Na koniec inkubacji, RBC przetworzono jak opisano. Wyniki podano jako pmol kwasu [1-¹⁴C]palmitynowego/j.g fosforu obecnego w ekstrakcie lipidów. Wartości są średnimi z trzech doświadczeń wykonywanych podwójnie. Zmienność pomiędzy doświadczeniami nie przekraczała 7%. Otwarte symbole, RBC przechowywany z samym AS-3; zamknięte symbole, RBC przechowywany w AS-3 z dodatkiem LC (5 mM).

Figura 5. Układ karnityny i reakcje reacylowania fosfolipidów błony. Grubsze strzałki wskazują na preferencyjny przepływ acylu. Wymiary prostokąta acylokarnityny pokazują prawdopodobnie odnośne rozmiary puli. Skrótami użytymi są: LPL, lizofosfolipidy; PLP, fosfolipidy; Cn, karnityna; acylo-Cn, acylo-karnityna; ACS, syntetaza acylo-CoA; LAT, lizofosfolipid transferazy acylo-CoA; CPT, palmitoilotransferaza karnityny.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek ten wykorzystuje L-karnitynę i jej pochodne alkanoilowe, jako środki wspierające przechowywanie i naprawę błony komórkowej, oraz tłumienie hemolizy, w produktach krwiopochodnych. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także sposób hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie czerwonych krwinek, koncentracie białych krwinek, koncentracie płytek krwi, osoczu i pochodnych osocza. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także sposób zmniejszania glikolizy w pełnej krwi i frakcjach krwi, w tym koncentracie czerwonych krwinek, koncentracie białych krwinek, koncentracie płytek krwi, osoczu i pochodnych osocza.

Odpowiednie alkanoilo-L-karnityny obejmują C2-8-alkanoilo-L-karnityny, a korzystne alkanoilo-L-karnityny obejmują acetylo-, butyrylo-, izobutyrylo-, walerylo-, izowalerylo- i szczególnie propionylo-L-karnitynę. W wynalazku o rodzinie tej mówi się rodzajowo jako o LC, a przykłady podaje w kategoriach L-karnityny. Opisane alkanoilo-L-karnityny i ich farmakologicznie dopuszczalne sole można jednak stosować w miejsce L-karnityny.

Przykłady odpowiednich soli L-karnityny obejmują, np., chlorek L-karnityny, bromek L-karnityny, orotanian L-karnityny, kwaśny asparaginian L-karnityny, kwaśny fosforan L-karnityny, fumaran L-karnityny, mleczan L-karnityny, maleinian L-karnityny, kwaśny maleinian L-karnityny, kwaśny szczawian L-karnityny, kwaśny siarczan L-karnityny, glukozofosforan L-karnityny, winian L-karnityny, kwaśny winian L-karnityny, i śluzian L-karnityny.

Przykłady odpowiednich soli alkanoilo-L-karnityny obejmują, np., chlorki C2-8-alkanoilo-L-karnityny, bromki C2-8-alkanoilo-L-karnityny, orotaniany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, kwaśne asparaginiany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, kwaśne fosforany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, fumarany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, mleczany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, maleiniany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, kwaśne maleiniany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, kwaśne szczawiany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, C2-8-alkanoilo-L-karnityny, glukozofosforany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, winiany C2-8-alkanoilo-L-karnityny, kwaśne winiany C2-8-alkanoilo-L-karnityny i śluziany C2-8-alkanoilo-L-karnityny.

Dodatek LC do pełnej krwi lub frakcji krwi, w tym RBC, WBC, PC, osocza i pochodnych osocza wymaga obecności LC w ilości skutecznej do umożliwienia konserwacji i naprawy błony, oraz tłumienia hemolizy i/lub tłumienia wzrostu bakterii i/lub zmniejszania glikolizy. Przedsięwzięte badania, w tym przykłady podane poniżej, wykazały minimalny skuteczny zakres dla produktów większości donorów około 0,25 mM - 0,5 mM. Górna granica jest bardziej praktyczna niż fizjologiczna. Stężenia tak wysokie jak 50 mM lub większe są łatwo tolerowane. Wartości spójne z kwestiami toksykologicznymi i osmologicznymi są dopuszczalne. Korzystne zakresy wynoszą 1-30 mM. Zakres 1-10 mM lub wyżej jest odpowiedni, z wartościami pomiędzy 4-6 mM dającymi wyraźną różnicę. Efekty według niniejszego wynalazku, w tym przedłużenie żywotności i przedłużenie czasu półtrwania w obiegu po transfuzji, mogą silnie zależeć od donora. Odpowiednio, mówiąc ogólnie, skuteczne stężenie LC wynosi 0,5-50 mM, jednak zwykły fachowiec w dziedzinie może poszerzyć ten zakres, w obu kierunkach, w zależności od osobliwości donoru. Takie rozszerzenia nie wymagają działań wynalazczych.

PL 200 250 B1

LC jest zgodna z konwencjonalnymi roztworami podtrzymującymi (roztworami stabilizującymi), które typowo wytwarza się dla uzyskania efektu buforowania. Pospolicie stosowane roztwory obejmują ACED (kwas cytrynowy - cytrynian sodu - dekstroza), CPD (cytrynian - fosforan - dekstroza) i ich modyfikacje, w tym CPD2/A-3, i pokrewne kompozycje.

Typowo, kompozycja obejmuje węglowodan, taki jak glukoza lub mannitol, co najmniej jedną sól fosforanową, cytrynian, i resztę innych soli. LC jest zwyczajowo rozpuszczalny i można go dodawać do tych kompozycji swobodnie w żądanym zakresie.

Odpowiednie roztwory opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5496821. Należy jednak zauważyć, że roztwory podtrzymujące inne niż te stosowane zwyczajowo, obejmujące sztuczne osocze i inne fizjologicznie dopuszczalne roztwory, można stosować z LC w wynalazku. Ważnym składnikiem roztworu podtrzymującego jest LC.

Zdolność LC, po włączeniu do pełnej krwi lub zawiesiny frakcji krwi, takich jak RBC, WBC, PC, osocza i pochodnych osocza, do przedłużania żywotności, a więc przechowalności, oraz okresu cyrkulowania po transfuzji otrzymującej osobie, zilustrowano poniżej w doświadczeniach in vitro i in vivo.

Doświadczenia wykorzystują LC, lecz można też stosować alkanoilo-L-karnitynę. Szczególne znaczenia ma wykazanie poniżej, że polepszone działania uzyskuje się dzięki polepszonej konserwacji (w tym naprawie) błony komórkowej, oraz tłumieniu hemolizy.

Materiały i sposoby

Projekt badania I:

Ocena jakości in vivo i in vitro RBC przechowywanego z LC i bez LC.

Pacjenci. Badaną populacją byli mężczyźni lub kobiety w wieku 18 do 65 lat bez znanych braków umysłowych lub fizycznych i nie biorący leków wpływający ewentualnie na żywotność RBC. Wybierano osoby spełniające konwencjonalne alogeniczne kryteria dawców wymienione w Code of Federal Register, rozdz. 2, the Standards of the American Association of Blood Banks, oraz the Blood Services Directives Amerykańskiego Krajowego Czerwonego Krzyża. Badanie zaaprobował Institutional Review Board z Medical College w Hampton Roads i pacjenci dali po objaśnieniu zgodę przed przystąpieniem do badania.

Każdy dawca dawał dwa razy w odstępie 72 dni i był losowo przydzielany do grupy testowej lub kontrolnej przy pierwszym pobieraniu.

System przechowywania krwi. Użyto standardowego systemu CP2D/AS-3 (Miles, Inc.) stosując poli(chlorek winylu) (PVC) z dietylo-(n)heksylo-ftalanem (DEHP) jako plastyfikatorem. Do każdej jednostki testowej dodano 245 mg LC (w 1,1 ml czystego, apirogennego roztworu w sterylizowanej szklanej butelce) do pojemnika zawierającego roztwór dodatku AS-3 otrzymując końcowe stężenie 5 mM. Do jednostek kontrolnych dodano 1,1 ml 0,9% NaCl do roztworu AS-3 stosując te same warunki. Dodawanie LC lub solanki do torebek przeprowadzono przez wstrzykiwanie strzykawką przez złączkę miejsca próbkowania. Dokonano tego w kołpaku do przepływu laminarnego pod światłem UV.

Pobieranie i przetwarzanie. Standardowych sposobów nacięcia żyły i pobierania krwi użyto do zebrania w przybliżeniu 450±50 ml pełnej krwi. Jednostkę pełnej krwi trzymano 4-8 godzin w temperaturze pokojowej przed przetwarzaniem. Jednostkę odwirowano stosując standardowe warunki i po odwirowaniu supernatant osocza oddzielono, i strącone koncentraty RBC ponownie zawieszono albo w standardowym roztworze AS-3 (kontroInym) lub zawierają cym karnitynę roztworze AS-3 (testowym).

Zawieszone jednostki RBC przechowywano w temperaturze 4°C przez 42 dni.

Pomiary in vitro: Pomiary przeprowadzone na próbkach wcześniejszych (0 dzień) i późniejszych (42 dzień) obejmowały poziomy ATP w RBC; hemoglobinę łączną i supernatantu; hematokryt (Hct); RBC, WBC, oraz zliczenie płytek krwi; osmotyczną kruchość RBC; morfologię RBC; poziomy mleczanu i glukozy; poziomy potasu w supernatancie. Przeprowadzono je stosując standardowe procedury, jak opisano poprzednio, Heaton i in., Vox Sang 57: 37-42 (1989).

Pomiary in vivo po transfuzji. Po 42 dniach przechowywania próbkę wydobywano i przechowywane komórki znakowano Cr stosując standardowe sposoby. Jednocześnie, dla określenia masy

RBC, świeżą próbkę pobrano od dawcy dla znakowania RBC 99 Tc. Po znakowaniu, 15 μ Ci znakowanych ⁵¹Cr przechowywanych komórek i 15 ąCi znakowanych ⁹⁹Tc świeżych komórek zmieszano i wstrzyknięto równocześnie. Próbki krwi (5 ml) pobrano po infuzji w różnych odstępach czasu przez okres do 35 dni dla obliczenia 24-godzinnego % odzyskania i przeżycia. 24-godzinny % odzyskania określono stosując albo sposób pojedynczego znakowania, w którym logarytmicznej-liniowej regresji poziomów radioaktywności próbek pobranych w czasie 5, 7,5, 10 i 15 minut użyto dla

PL 200 250 B1 określenia 0 poziomu czasowego, lub sposobem podwójnego znakowania stosując masę RBC dawcy określoną pomiarem ⁹⁹Tc.

Czas życia w obiegu wprowadzonych przeżywających znakowanych Cr RBC określono próbkami pobranymi po 24 godzinach i następnie dwukrotnie w tygodniu przez do 5 tygodni.

Poziomy radioaktywności korygowano dla stałej 1% elucji dziennie. Dane dopasowano do liniowej funkcji z dniami po transfuzji jako zmienną niezależną (oś x) i skorygowanymi zliczeniami Cr jako zmienną zależną (oś y). Czas życia RBC przyjęto jako przecięcie dopasowanej linii z osią x.

Analiza statystyczna. Sparowany test t lub rutynową nieparametryczną statystyczną analizę przeprowadzono na danych z testów in vivo i in vitro jednostek dla określenia, czy występują jakiekolwiek statystycznie znaczące różnice (1-ogonowe) w średnich pomiędzy jednostkami testowymi i kontrolnymi. Statystyczną istotność przyjmowano przy wartości p mniejszej niż 0,05.

Projekt badania II

Badania poboru erytrocytów LC i reacylowania lipidów przy przechowywaniu do 42 dni.

Chemikalia. Zasadniczo wolną od kwasu tłuszczowego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) otrzymano z SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. (USA). Kwas [1-¹⁴C]palmitynowy (58 Ci/mol) otrzymano z New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Cienkowarstwowe płytki, Whatman LK6 (żel krzemionkowy) (20x20 cm) z warstwą absorbentu otrzymano od Carlo Erba, Milan (Włochy). Palmitoilo-L-karnitynę (PLC) i LC były darem od Sigma Tau, Pomezia (Włochy). Wszystkie inne użyte związki były czystości chemicznej.

Test karnityny czerwonych krwinek. Próbkę krwi odzyskano z przechowywanej jednostki RCC i przemyto raz 4 obję toś ciami zimnego 0,9% NaCl. RBC umieszczono nastę pnie w zawiesinie w 0,9% NaCl przy końcowym hematokrycie 50%, i odbiałkowano kwasem nadchlorowym jak opisuje Cooper i in. , Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988). Porcje koń cowego ekstraktu zanalizowano na zawartość wolnego LC według radiochemicznego testu Pace'a i in., Clin. Chem. 24: 32-35 (1978).

Analiza reacylowania kompleksowych lipidów błony w przechowywanym RBC. Próbkę krwi pobrano z przechowywanej jednostki RCC przez złączkę miejsca próbkowania strzykawką, i próbkę przetworzono natychmiast. Dokonano tego w kołpaku do przepływu laminarnego pod światłem UV. Wszystkie manipulacje prowadzono w temperaturze 0-5°C, jeśli nie podano inaczej. RBC przemyto dwa razy 4 objętościami zimnego 0,9% NaCl. Wydzielony RBC ponownie raz przemyto buforem inkubacji (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM, NaH2PO4 1 mM, sacharoza 40 mM, 5 mM glukozy, Tris-HCl 10 mM, przy pH 7,4) i umieszczono w zawiesinie w tym samym buforze przy końcowym hematokrycie 5%. Łaźni wytrząsającej Rotabath w temperaturze 37°C użyto do inkubacji. RBC inkubowano z radioaktywnym kwasem palmitynowym (10 μΜ) skompleksowanym z wolną od kwasu tłuszczowego BSA (1,65 mg/ml). Inkubacje zakończono przemywając komórki raz zimnym buforem inkubacji, trzy razy wolną od kwasu tłuszczowego BSA 1% w buforze inkubacji, i na koniec raz ponownie buforem inkubacji. Lipidy RBC ekstrahowano z nietkniętych komórek w procedurze Rose & Oaklandera, J. Lipid Res. 6: 428-431 (1965). W celu zapobiegania utlenianiu lipidów dodano do ekstraktu lipidów 0,1% butylowanego hydroksytoluenu. Porcje ekstraktu lipidów użyto do określania zawartości fosforu w lipidach, i analizowano metodą dwuwymiarowej cienkowarstowej chromatografii. W skrócie, chromatogramy rozwinięto stosując chloroform-metanol-28% amoniak (65:25:5) w pierwszym wymiarze. Chromatogramy rozwinięto stosując chloroform-aceton-metanol-kwas octowy-wodę (6:8:2:2:1) w drugim wymiarze. Fosfatydylocholinę (PC), fosfatydyloetanoloaminę (PE) i fosfatydyloserynę uwidoczniono przez szybkie wystawienie płytek na działanie jodyny i zidentyfikowano stosując wzorce jako odnośniki. Indywidualne plamy fosfolipidów zdrapano do fiolek zawierających płyn scyntylacyjny i radioaktywność określono metodą zliczania scyntylacji w cieczy. Identyfikację i analizę radioaktywnego PLC przeprowadzono jak opisano wcześniej, Arduini i in., J. Biol. Chem. 267: 12673-81 (1992). Skuteczność zliczania oceniono zewnętrznym wzorcem. Obliczenia oparto na aktywnościach właściwych readioaktywnego kwasu palmitynowego.

Wyniki

Badanie I

Charakterystyka jednostek AS-3 RCC przed przechowywaniem

Właściwości produktów AS-3 RCC były takie, jak się spodziewano po przetworzeniu jednostek pełnej krwi. Nie zauważono znaczących różnic pomiędzy testowymi i kontrolnymi jednostkami w charakterystyce jednostki AS-3 RBC w pomiarze na jednostkową objętość, Hct, i zawartość WBC, oraz właściwości RBC in vitro takie jak poziomy ATP, hemoglobina w supernatancie i poziomy potasu, kruchość osmotyczna (Tabela I).

PL 200 250 B1

T a b e l a 1

Charakterystyka przed przechowywaniem RBC koncentratów czerwonych krwinek

	Kontrola	Test (L-karnityna)
Objętość jednostki (ml)	305±38	295±41
Hct jednostki (%)	60±3	60±3
WBC jednostki (x10⁹)	2,6±1,1	2,4+1,1
ATP ^mol/g Hb)	4,6+0,2	4,3±0,4
Hb supernatantu (mg/dl)	34±15	26±8
K+ supernatantu (mEq/l)	2,3±0,2	2,2±0,3
Kruchość osmotyczna (%)	50±4	49±4

Charakterystyka RBC po przechowywaniu 42 dni

Metabolizm. Ilości glukozy zużytej i mleczanu wytworzonego podczas 42 dni przechowywanie były podobne dla testowych i kontrolnych jednostek (tabela 2). Jak można oczekiwać, znaleziono silną odwrotną korelację pomiędzy tymi dwoma parametrami glikolizy (r=0,76). Jednakże słabszą hemolizę i wyż sze poziomy ATP znaleziono dla przechowywanych z karnityną jednostek RBC w porównaniu z kontrolą . Jak pokazano na fig. 1, ten wyż szy pozioma ATP zaobserwowano we wszystkich poza jedną parą (p < 0,01) .

T a b e l a 2

Charakterystyki koncentratów czerwonych krwinek po przechowywaniu (42) dni

	Kontrola	Test (L-karnityna)
Parametry in vitro	208±33	193±40
Glukoza (mg/dl)	201±27	199+37
Mleczan (mg/dl)	6,33±0,03	6,32+0,04
PH	3,01+0,42	3,24+0,38*
ATP ^mol/g Hb)	0,47±0,41	0,30±0,22*
Hemoliza (%)	61±4	60±3
K+ supernatantu (mEq/l)	51±3	50±4
Kruchość osmotyczna (%)	69±8	68±15
Ocena morfologiczna
Parametry in vivo
Odzysk 24 godziny % (pojedyncze znakowanie)	81,1±6,2	84,0+4,4
Odzysk 24 godziny (podwójne znakowanie)	80,1±6, 0	83,9±5,0*
Masa RBC (ml)	1634± 510	1591±534
Przeżywalność (dni)	85, 9±14,3	96,1±11,2*

* (p < 0,05)

Błona. Procentowe poziomy hemolizy na koniec przechowywania były mniejsze dla jednostek karnityny, jak pokazano na fig. 2. Z drugiej strony, nie stwierdzono znaczących różnic w odniesieniu do poziomów potasu w supernatancie, reakcji szoku osmotycznego i oceny morfologii, mieszczących się w spodziewanym zakresie na koniec 42 dni przechowywania.

Żywotność po transfuzji. Średni 24 godzinny % odzysk kontrolnych jednostek był podobny do odkrytego przez nas i innych poprzednio. Jednak średnie % odzysku dla przechowywanych w karnitynie czerwonych krwinek były wyższe niż dla kontrolnych przechowywanych komórek (p < 0,05). Ponadto, średni czas życia w obiegu wprowadzanych przechowywanych czerwonych krwinek był również

PL 200 250 B1 wyższy dla przechowywanych w karnitynie komórek (fig. 1). Masa RBC dawców określona przy dwu okazjach była silnie podobna (r=0,98) i statystycznie nie różna.

Badania korelacji. Jak można oczekiwać, 24-godzinny % odzysk wykazał znaczące korelacje z poziomami ATP (r=0,63) i innymi pomiarami integralnoś ci bł ony RBC takimi jak hemoliza (r=0,57), kruchość osmotyczna (r=0,71), i ocena morfologii (r=0,59). Procentowa hemoliza korelowała silnie z poziomami ATP (r=0,83), jak również z zawartością WBC jednostek RBC (r=0,83). Czas w życia RBC w obiegu nie wykazuje znaczącej korelacji z żadnym parametrem in vitro.

Badanie II

Pobór karnityny w przechowywanym RBC

RBC przechowywany w samym medium AS-3 nie wykazuje żadnej znaczącej utraty zawartości LC przez czas przechowywania (fig. 2). Jest to zgodne z odkryciami Coopera i in., supra, pokazującymi, że LC ludzkich czerwonych krwinek nie wymienia się swobodnie ani z osoczem lub buforem izoosmotycznym. Gdy czerwone krwinki przechowywano w AS-3 z dodatkiem LC, wykrywano wyższe ilości wewnątrzkomórkowego LC niż dla samego AS-3 (fig. 2). Zawartość LC wzrastała liniowo podczas okresu przechowywania, osiągając 4-krotny wzrost w czasie 42 dni.

Badania reacylowania kompleksowych lipidów błony w przechowywanym RBC

W nieobecnoś ci karnityny radioaktywny palmitynian włączony w PLC obniża ł się liniowo z czasem przechowywania (fig. 3). Przeciwnie, czerwone krwinki z jednostki RCC przechowywanej w zawierającym LC roztworu AS-3 wykazywał początkowy wzrost (z maksimum w 3 tygodniu), a następnie szybki spadek ilości radioaktywnego palmitynianu włączonego w PLC. W tych samych preparatach czerwonych krwinek oceniono także włączanie radioaktywnego palmitynianu do fosfolipidów błony. Włączanie radioaktywnego palmitynianu do błony PE czerwonych krwinek z jednostki krwi przechowywanej w roztworze samego AS-3 wykazywało stały znaczący wzrost radioaktywności do PE przez czas przechowywania (fig. 4). Czerwone krwinki przechowywane w obecności LC cechowały się gwałtownym wzrostem reacylowania PE pod koniec przechowywania, z maksimum w 6 tygodniu (fig. 4). Szybkości włączania radioaktywnego palmitynianu do błony PC spadały nieco przez czas przechowywania, i nie było widać różnic pomiędzy dwoma preparatami czerwonych krwinek (fig. 4). Należy wskazać, że ponieważ w naszych badaniach reacylowania czerwone krwinki były inkubowane w temperaturze 37°C w buforze Krebsa Ringera zawierającym glukozę, poziomy ATP na koniec inkubacji były bliskie wartościom fizjologicznym (dane nie pokazane).

Dyskusja

W tym badaniu, testy in vitro i in vivo jednostek RBC na koniec 42 dni przechowywania wykazały znaczące różnice pomiędzy przechowywanymi w karnitynie RBC w porównaniu z kontrolnie przechowywanymi RBC. Różne właściwości RBC in vitro odzwierciedlające integralność metaboliczną i bł ony, takie jak ATP i % hemolizy, jak też bezpo ś rednia miara ż ywotnoś ci komórki (24-godzinny % odzysku i czas życia w obiegu) były znacznie lepsze dla przechowywanych w karnitynie RBC. Ważne jest przedłużenie średniego czasu życia przeżywających RBC w obiegu 24 godziny po infuzji. To odkrycie może być związane z nieodwracalnym poborem LC podczas przechowywania, co jest bezprecedensowym i niespodziewanym odkryciem. Wartości otrzymane w badaniach kontrolnych dla różnych właściwości RBC były takie, jak można oczekiwać i nie różne od wyników poprzednich badań. W czasie pobierania krwi, nie stwierdzono znaczących różnic w charakterystyce jednostki lub RBC pomiędzy próbkami testowymi i kontrolnymi. Jak pokazano na fig. 1-3, poziomy ATP RBC, % hemolizy i czas ż ycia w obiegu był y silnie zależ ne od dawcy i, ponieważ badanie miał o losowo sparowany ukł ad z 5 testowymi i 5 kontrolnymi badaniami przeprowadzonymi w pierwszym i drugim przypadku, jest nieprawdopodobne, aby obserwowane różnice były spowodowane przypadkiem lub wadliwym projektem badania. Jest więc bardzo prawdopodobne, że obserwowane różnice w tym badaniu były spowodowane dodatkiem karnityny do jednostek testowych. Możliwości, że zwiększony czas życia oddaje zmniejszoną elucję Cr, nie można wykluczyć, lecz nie jest to spójne z polepszonymi in vitro miarami przechowywanych czerwonych krwinek, które okazały się korelować z żywotnością in vivo.

Kilka badań pozwoliło stwierdzić, że LC i jego estry acylowe mają cytoochronne/stabilizujące błonę działanie na różne komórki, w tym czerwone krwinki. Patrz, np., Snyder i in., Arch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). W tym badaniu stwierdzono, że LC była nieodwracalnie rozpuszczana przez RBC podczas przechowywania. Chociaż natura procesu nie jest całkowicie jasna, można wykluczyć udział specyficznego nośnika dla poboru LC. Zgodnie z naszą wiedzą, jedynym znanym nośnikiem LC działającym w układach komórkowych, gdzie wewnątrzkomórkowe stężenie LC jest kilkakrotnie wyższe niż normalnie obecne w otoczeniu pozakomórkowym. Stężenie LC w czerwonych

PL 200 250 B1 krwinkach jest podobne do stężenia w osoczu. Tak więc, niezależnie od niskiej temperatury, utraty APT i innych możliwych zmian metabolicznych zachodzących podczas przechowywania, gdy czerwone krwinki przechowuje się w medium zawierającym względnie wysokie ilości egzogennego LC, jednokierunkowy pobór LC przez komórki wydaje się być ustalony. Nic w dziedzinie nie wydaje się tego przewidywać.

Natura działania LC na przechowywany RBC może być rozpatrywana jako biofizyczna i/lub metaboliczna interwencja w przedziale błony. Potransfuzyjna przeżywalność przechowywanych czerwonych krwinek jest związana z integralnością funkcji błony, jak sugeruje znacząca korelacja pomiędzy żywotnością in vivo ponownie wprowadzonych czerwonych krwinek i miarą stosunku powierzchni do objętości. Główny wkład do struktury i funkcji błony RBC jest reprezentowany przez sieć cytoszkieletową, Marches, Ann. Rev. Cell Biol. 1: 531-536 (1985), nadcząsteczkową białkową organizację leżącą poniżej wewnętrznej półwarstwy błony RBC. Wolfe i in. w przeglądowym badaniu składu i funkcji białka błony cytoszkieletowej przechowywanych czerwonych krwinek stwierdził, że jedyną powiązaną zmianą była zmniejszona zdolność spektryny do wiązania się z aktyną albo w obecności lub nieobecności białka 4.1. Wolfe i in., J. Clin. Invest. 78: 1681-1686 (1986). Wykazaliśmy, że LC wpływa na deformację w błonie RBC białka 4.1 zawierającego uwolnione cienie komórek poddane rosnącemu naprężeniu ścinającemu. Arduini i in., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Tak więc LC może wywierać działanie stabilizujące błonę przez oddziaływanie spektryny z jednym lub kilkoma cytoszkieletowymi składnikami. Ostatnie badania elektronowego rezonansu paramagnetycznego Butterfielda i Rangachari, Life Sci. 52: 297-303 (1992), na oddziaływanie spektryna-aktyna czerwonych krwinek wykazała, że LC znacznie redukuje segmentowy ruch znakowanych spinowo jęczmieni na spektrynie, potwierdzając wcześniejszą sugestię o zaangażowaniu LC we wzmacnianie oddziaływania pomiędzy spektryną i aktyną, Arduini i in., supra.

Poza potencjalnym biofizycznym działaniem opisanym powyżej, polepszenie obserwowane w przechowywanych w LC czerwonych krwinkach może również być wynikiem korzystnych metabolicznych procesów. Normalnie cykl deacylowania-reacylowania fosfolipidów błony wymaga ATP do generowania acylo-CoA. Ugrupowanie acylowe acylo-CoA przenosi się następnie do lizofosfolipidów przez lizofosfolipidową transferazę acylo-CoA. Ponadto, podczas prowokacji utleniającej, proces naprawy błony fosfolipidów RBC przechodzi tym samym szlakiem metabolicznym. Ostatnie odkrycia pokazały, że CPT wpływa na proces reacylowania fosfolipidów błony w czerwonych krwinkach i komórkach neuronów przez modulację rozmiarów puli acylo-CoA pomiędzy etapem aktywacji kwasu tłuszczowego i jego przeniesieniem do lizofosfolipidów. Arduini i in., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Ponadto, badania metodą znakowania pulsacyjnego i zubożenia w ATP wykazały, że pula acylo-karnityny czerwonych krwinek służy jako zbiornik aktywowanych grup acylowych bez kosztów dla ATP. Arduini i in., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994).

Polepszenie wprowadzania radioaktywnego palmitynianu do PE błony czerwonych krwinek przechowywanych w samym AS-3 sugeruje, że długoterminowe przechowywanie (z postępującym zubożaniem RBC w ATP) powoduje zwiększone zapotrzebowanie na aktywowane acylowe jednostki do reacylowania fosfolipidów błony (fig. 4). Podczas pierwszych 5 tygodni przechowywania, czerwone krwinki przechowywane w AS-3 bez LC wydają się włączać więcej palmitynianu do PE niż czerwone krwinki przechowywane w AS-3 zawierającym LC (fig. 4). Czerwone krwinki przechowywane w obecności LC były w stanie włączać więcej palmitynianu do PE na koniec przechowywania. To odkrycie może sugerować, że prowokacja utleniająca działa w jakiś sposób, ponieważ wystawienie czerwonych krwinek na działanie utleniacza silnie stymuluje proces reacylowania PE błony, lecz nie PC błony. Dise i in., Biochem. Biophys. Acta 859: 69-78 (1986). Co ciekawe, podczas pierwszych 5 tygodni przechowywania, czerwone krwinki przechowywane w samym AS-3 wydają się włączać więcej palmitynianu do PE niż czerwone krwinki przechowywane w AS-3 zawierającym LC (fig. 4). To sugeruje, że w tym ostatnim przypadku CPT może współzawodniczyć z reacylującym enzymem o wykorzystanie acylo-CoA. Jednak zgodnie z tą koncepcją, powinniśmy obserwować znacznie większą różnicę na koniec okresu przechowywania, gdy zapotrzebowanie acylo-CoA na proces reacylowania jest najwyższe. Jednak tak się nie działo. Czerwone krwinki przechowywane z lub bez LC wykazywały podobne szybkości włączania na koniec przechowywania (fig. 4). Ponadto wykazaliśmy, że czerwone krwinki CPT, w wielu różnych doświadczalnych warunkach, nie współzawodniczą z reacylowaniem fosfolipidów błony. Arudini i in., Life Chem. Rep. 12: 49-54 (1994).

Tworzenie radioaktywnego PLC w uzupełnionych LC czerwonych krwinkach jest wyższe niż stwierdzane w czerwonych krwinkach przechowywanych bez LC (fig. 3). Ponadto, czas tworzenia PLC

PL 200 250 B1 w czerwonych krwinkach przechowywanych z LC utworzył interesującą dzwonową krzywą z maksimum w trzecim tygodniu przechowywania. Tworzenie radioaktywnego PLC odzwierciedla rozmiar puli zimnej długołańcuchowej acylokarnityny i kierunek mediowanego CPT przepływu acylu w nietkniętych czerwonych krwinkach. Podczas pierwszych trzech tygodni przechowywania ze względnie wysoką glikolityczną aktywnością i dostępnością APT, CPT wydaje się prowadzić przepływ acylu w kierunku acylokarnityny w czerwonych krwinkach przechowywanych w obecności LC (fig. 5a). Po trzecim tygodniu przechowywania z obecnością LC przepływ odwraca się. Te zmiany mogą odzwierciedlać zasadniczą zdolność CPT do buforowania aktywowanych jednostek acylu: zwiększone zapotrzebowanie na acylo-CoA dla procesu reacylowania powoduje niższe wytwarzanie PLC i na odwrót, i może reprezentować mechanizm, w którym CPT stosuje się do buforowania wzrostu zapotrzebowania na jednostki acylowe dla procesu reacylowania (fig. 5b).

Wyższy 24-godzinny % odzysk i czas życia w obiegu oznacza polepszenie w przybliżeniu 15% w kategoriach siły (ilości poddanych transfuzji cyrkulujących RBC dostępnych dla pobierającego razy przeciętny czas życia). Ten wzrost siły powinien przekładać się klinicznie na zmniejszenie zapotrzebowania na transfuzję u przewlekle poddawanych transfuzji pacjentów, takich jak pacjentów z talasemią lub pacjentów z niewydolnością szpiku kostnego. Alternatywnie, może być możliwe przedłużenie przechowalności ciekłych przechowywanych RBC.

Nasze odkrycia sugerują, że obecność LC w płynie konserwującym podczas przechowywania RBC może mieć działanie oszczędzające na pulę ATP użytą przez reacylowanie fosfolipidów dla naprawy błony. Ten korzystny metaboliczny proces, związany z możliwym korzystnym biofizycznym działaniem, może więc wyjaśnić zmniejszoną hemolizę, wyższe poziomy ATP i polepszony odzysk i przeżywalność in vivo przechowywanych z LC czerwonych krwinek.

Napromieniowanie

Problem zakażania produktów krwiopochodnych, w tym pełnej krwi, RBC, RCC, PC i tym podobnych, można zmniejszyć znacznie przez napromieniowanie. Poziomy napromieniowania konieczne do sterylizacji, i zasadniczo 100% śmiertelności środków mikrobiologicznych, są szeroko stosowane. Dodatkowo, co ważniejsze, leukocyty mogą być niszczone przez podobne napromieniowanie. Można stosować wiele typów promieniowania, w tym promieniowanie gamma (Kobalt GG, akceleracja Van de Graafa), promieniowanie UV, promieniowanie podczerwone, itp. Bliski równoważnik około 20-50 cG promieniowania gamma jest dostateczny.

Na świecie pobiera się rocznie pomiędzy 60 i 80 milionów jednostek pełnej krwi i stosuje w transfuzyjnym podtrzymaniu różnych populacji pacjentów. W krajach słabiej rozwiniętych ilości zbierane na 1000 osób są niższe i większość transfuzji krwi dokonuje się w terapii przypadków położniczych i pediatrycznych, szczególnie anemii związanej z malarią. W krajach rozwiniętych, ilości zbierane na 1000 osób są 50-10 razy wyższe i większość transfuzji zachodzi w chirurgii (50%) lub w terapii pacjentów z anemią związaną z rakiem, przeszczepem szpiku kostnego, niezłośliwym krwawieniem żołądkowo-jelitowym (fig. 1). Istnieje wiele potencjalnie szkodliwych efektów związanych z transfuzją alogenicznej krwi. Jedną z konkretnych komplikacji szkodliwie związanych z transfuzją krwi jest rzadka i zwykle śmiertelna jednostka znana jako związana z transfuzją choroba przeszczepu przeciw gospodarzowi (TA-GVHD), komplikacja mediowana przez żywotne alogeniczne immunocyty.

Choroba TA-GVHD jest rzadką komplikacją transfuzji krwi potencjalnie spotykaną w dwu typach populacji odbiorców transfuzji krwi. TA-GVHD wykazuje śmiertelność bliską 100% i zapobieganie jest obecnie jedynym skutecznym podejściem. Pierwsza, u mających obniżoną odporność pacjentów, takich jak pacjenci po przeszczepie szpiku kostnego lub innego narządu, z chorobą Hodgkinsa lub dziedzicznymi niedoborami układu immunologicznego. Druga, u nie mających obniżonej odporności pacjentów, gdy istnieje podobieństwo HLA pomiędzy dawcą krwi i biorcą krwi. Często spotyka się ją w bezpośrednich pobieraniach od bliskich krewnych lub w populacjach o bardziej ograniczonym polimorfizmie HLA, jak w Japonii i Izraelu. Z tego powodu jest ogólną praktyką napromieniowanie komórkowych produktów krwiopochodnych promieniowaniem gamma pośrednią dawką w przybliżeniu 25 centygrejów (cG) w celu zniszczenia zdolności replikacji żywych immunocytów. Należy zauważyć, TA-GVHD jest związana z komórkowymi produktami, które są świeże, to jest ogólnie nowsze niż 15-dniowe. Jednakże „starzenie” krwi nie jest jeszcze akceptowaną praktyką w zapobieganiu tej komplikacji. Chociaż immunocyty są częścią alogenicznej populacji leukocytów, stopień zubożenia w leukocyty obecnie uzyskiwany z trzecią generacją filtrów nie jest uważany obecnie za adekwatny w zapobieganiu tej komplikacji. Tak więc promieniowanie gamma pozostaje obecnie jedyną akceptowaną interwencją zapobiegawczą.

PL 200 250 B1

Trudności związane z napromieniowaniem gamma czerwonych krwinek to w szczególności potencjał uszkadzania błony komórkowej. Oczywistym jest, że napromieniowanie przy takiej dawce powoduje utratę siły w przybliżeniu 7-8% w pomiarze in vitro przez zmniejszanie ilości ATP czerwonych krwinek, zwiększanie hemolizy i zwiększanie ilości potasu w supernatancie. Te zmiany są spójne z efektem uszkadzania błon. Takie zmiany in vitro są związane z redukcją w czasie 24 godzin odzysku napromieniowanych promieniowaniem gamma czerwonych krwinek. W odniesieniu do produktów krwiopochodnych z płytek, co najmniej jedna publikacja sugeruje pewną utratę żywotności.

Znaczące dowody wskazują, że promieniowanie gamma wywiera działanie przez generowanie aktywnych cząsteczek tlenowych, takich jak atomowy tlen, hydroksyl, rodnik i anion nadtlenkowy. Te cząsteczki indukują wewnątrzkomórkowe uszkodzenia DNA, a więc zapobiegają replikacji komórek, wstępnemu warunkowi TA-GVHD. Jednak, te same cząsteczki tlenowe mogą utleniać lipidy błony na czerwonych krwinkach i ewentualnie błony płytek krwi, indukują uszkodzenia błony, które zmniejszają jakość (siłę) produktu komórkowego.

Wiadomo, ze LC gra kluczową rolę w transporcie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez błonę mitochondrialną. Dziedziczne zaburzenia, w których istnieje niewydolność systemu karnityny w transportowaniu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, powodują znaczące upośledzenie funkcji mięśni szkieletowych. Ostatnio występuje zwiększone zainteresowanie rolą LC w błonach czerwonych krwinek. Zaskakujące jest jednak to, że czerwone krwinki nie mają mitochondriów, stąd znaczne zainteresowanie związane z obecnością LC i transferazy palmitoilu karnityny, enzymu związanego z odwracalnym acylowaniem LC. Nie było jasne, jaką rolę mogą one odgrywać w czerwonych krwinkach. Czerwone krwinki mogą być poddawane stresowi utleniającemu przez czas długiego cyklu życiowego in vivo, i naprawa utlenionych lipidów błony angażująca LC może być ważna dla normalnej przeżywalności czerwonych krwinek.

Wczesny wzrost poziomu acylowanej karnityny w czasie zwiększonej dostępności ATP może działać jako zbiornik aktywowanych kwasów tłuszczowych, który może z kolei być stosowany w mechanizmie naprawy uszkodzonych utlenionych lipidów błony. Takie wyjaśnienie dobrze wyjaśni zmniejszoną hemolizę obserwowaną podczas przechowywania in vitro czerwonych krwinek supra, i ponadto wyjaśni polepszenie obserwowane w odzysku i przeżywalności in vivo. Końcowym efektem dodania LC jest około 17% wzrost siły.

Odpowiednio, LC można stosować do usuwania lub zapobiegania uszkodzeniu błony indukowanemu przez napromieniowanie.

Będzie się tak działo dzięki zdolności karnityny przechowywanej w czerwonych krwinkach do naprawy utlenionych lipidów błony in vitro.

Dla ograniczenia podatności produktów krwiopochodnych (RCC, PC i tym podobnych) na uszkodzenia błony i hemolizę, produkt krwiopochodny można najpierw umieścić w zawiesinie w roztworze zawierającym LC w ilości 0,25 mM-50 mM. Zachowanie błony komórkowej i tłumienie hemolizy osiąga się w dostatecznym stopniu, aby szczelnie zamknięty produkt poddać napromieniowaniu dla celów sterylizacji, i mógł on uzyskać zwiększoną przechowalność i czas półtrwania w obiegu po transfuzji. Można uzyskać żywotność rzędu obecnych żywotności, mając pewność, że materiały są praktycznie sterylne i najprawdopodobniej nie spowodują TA-GVHD, dzięki napromieniowaniu po szczelnym zamknięciu zawiesiny produktu krwiopochodnego. Należy podkreślić, że termin „produkt krwiopochodny”, w tym kontekście, może być interpretowany szeroko, obejmując pełną krew, osocze krwi, RCC, PC, mieszaniny i tym podobne.

I. Zastosowanie L-karnityny do tłumienia wzrostu bakterii w koncentratach płytek krwi o zwiększonej przechowalności

Tło: L-karnityna (LC) redukuje glikolizę w dłużej (> 5 dni) przechowywanych koncentratach płytek krwi (Sweeny i in., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norwegia, 27 czerwca - 2 lipca 1998, w Vox Sanguinis, tom 74, nr supl. 1, str. 1226; oraz Sweeny i in., The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, 4-8 grudnia 1998). Wpływ LC na wzrost bakterii w koncentracie płytek krwi jest ważny dla oceny, czy LC można stosować jako dodatek.

Metody badań: Dwa identyczne koncentraty płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem ABO wytworzone przez ciągłą filtrację bogatego w płytki krwi osocza (MedSep Corp. Covina, CA) połączono, następnie równo rozdzielono do dwu torebek CLX^® (MedSep). Albo LC do końcowego stężenia 5 mM, lub solankę (kontrolną) dodano do jednej próbki z każ dej pary. Każ dy pojemnik uzupeł niono 1 ml negatywnej wobec koagulazy zawiesiny gronkowców

PL 200 250 B1 w dniu 0 do końcowego stężenia pomiędzy 1-48 CFU/ml. Próbki pobrano z każdego pojemnika aseptycznie w dniu 3, dniu 6 i albo dniu 7 lub dniu 8 dla zliczenia kolonii. Dane zanalizowano metodą sparowanego testu t.

Wyniki: Zbadano 11 par koncentratów. Wyniki otrzymane pokazano w tablicy poniżej. W dniu 7/8, wzrost w pojemnikach z L-karnityną wynosił 33% w porównaniu z kontrolnymi.

Wnioski: L-karnityna przy 5 mM opóźnia wzrost negatywnych wobec koagulazy gronkowców w ciekłym przechowywanym koncentracie płytek krwi.

	Para	Kontrola*	L-karnityna*	^p
dzień 0	11	1,12±0,7	1,12±0,7	brak
dzień 3	11	3,11±0,7	3,04±0,7	0,43
dzień 6	8	4,28±1,3	3,88±1,0	0,05
dzień 7/8	11	5,09+1,5	4,60±1,5	0,002

* Wzrost bakterii wyraż ony w log CFU/ml

II. Zastosowanie L-karnityny do zmniejszania glikolizy podczas przedłużonego przechowywania koncentratów płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem od przypadkowych dawców.

Tło: L-karnityna redukuje glikolizę w standardowym (o nie zmniejszonej liczbie leukocytów) koncentracie płytek krwi przechowywanym przez 5-10 dni (Sweeny i in., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norwegia, 27 czerwca - 2 lipca 1998, w Vox Sanguinis, tom 74, nr supl. 1, str. 1226; i Sweeny i in, The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, 4-8 grudnia 1998). Podobnego działania na koncentraty płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem od przypadkowych dawców nie wykazywano wcześniej. Projekt badania: Dwa identyczne koncentraty płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem ABO wytworzone przez ciągłą filtrację bogatego w płytki krwi osocza (MedSep Corp. Covina, CA) połączono, następnie równo rozdzielono do dwu pojemników CLX (MedSep). Albo L-karnitynę (końcowe stężenie 5mM) lub solankę dodano do jednej próbki z każdej pary płytek krwi. Płytki krwi przechowywano przez 7 lub 8 dni w temperaturze 22°C na płaskim mieszalniku, następnie przetestowano. Testami przeprowadzonymi był pomiar pH, zliczenie płytek krwi, pomiar glukozy i mleczanu w supernatancie, ekspresja powierzchniowej p-selektyny metodą cytometrii przepływowej, zakres zmiany kształtu (ESC) i reakcja szoku hipotonicznego (HSR). Zużycie glukozy i wytwarzanie mleczanu obliczono w mM/10¹² płytek krwi dziennie. Dane zanalizowano stosując sparowane testy t.

Wyniki: Zbadano siedem (7) par koncentratów płytek krwi. Otrzymane wyniki pokazano w tablicy poniżej.

Wniosek: L-karnityna redukuje glikolizę w przechowywanych koncentratach płytek krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem od przypadkowych dawców.

	Kontrola	L-karnityna	^p
pH	6,97±0,2	7,09+0,1	<0,01
Stężenie glukozy	1,25±0,2	1,13±0,2	<0,01
Wytwarzanie mleczanu	1,73±0,3	1,50±0,2	<0,01
P-selektyna (% pozytywnych)	74±4	69±9	0,04
ESC (%)	11±5	12±4	0,35
HSR (%)	45±13	50±22	0,64

Wynalazku według zgłoszenia patentowego ujawniono w sensie ogólnym i w odniesieniu do konkretnych przykładów. Zmiany będą zrozumiałe dla fachowców w dziedzinie bez wykorzystywania zdolności wynalazczych. W szczególności, alternatywne stabilizujące kompozycje, produkty krwiopochodne, konserwanty, inhibitory i tym podobne można modyfikować, bez wykorzystywania zdolności wynalazczych. Ponadto, konkretne poziomy, okresy żywotności i czasy półtrwania w obiegu będą się zmieniały wraz z dawcami oraz biorcami. Takie odmiany pozostają w zakresie wynalazku, jeśli nie wykluczono ich konkretnie w treści zastrzeżeń patentowych przedstawionych poniżej.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób hamowania wzrostu bakterii w pełnej krwi lub jej frakcji, znamienny tym, że dodaje się do pełnej krwi lub frakcji krwi związek wybrany z grupy obejmującej L-karnitynę, sole L-karnityny, alkanoilo-L-karnityny, sole alkanoilo-L-karnityn, i ich mieszaniny, w ilości skutecznej do tłumienia wzrostu bakterii w pełnej krwi lub frakcji krwi.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcję krwi wybiera się z grupy obejmującej koncentrat czerwonych krwinek, koncentrat białych krwinek, koncentraty płytek krwi, osocze, i pochodne osocza.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że frakcja krwi jest koncentratem czerwonych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu czerwonych krwinek w roztworze podtrzymującym zawierającym związek.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że frakcja krwi jest koncentratem białych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu białych krwinek w roztworze podtrzymującym zawierającym związek.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że frakcja krwi jest koncentratem płytek krwi, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu płytek krwi w roztworze podtrzymującym zawierającym związek.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że frakcja krwi jest osoczem lub pochodna osocza, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny osocza lub pochodnej osocza w roztworze podtrzymującym zawierającym związek.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 1 do 30 mM.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związkiem jest L-karnityna.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek wybiera się z grupy obejmującej acetylo-L-karnitynę, propionylo-L-karnitynę, butyrylo-L-karnitynę, izobutylo-L-karnitynę, walerylo-L-karnitynę i izowalerylo-L-karnitynę.
11. Sposób zmniejszania glikolizy w pełnej krwi lub jej frakcji wybranej z grupy obejmującej koncentrat czerwonych krwinek, koncentrat białych krwinek, osocze i pochodne osocza, znamienny tym, że dodaje się do pełnej krwi lub frakcji krwi związek wybrany z grupy obejmującej L-karnitynę, solę L-karnityny, alkanoilo-L-karnityny, solę alkanoilo-L-karnityn i ich mieszaniny, w ilości skutecznej do zmniejszania glikolizy w pełnej krwi lub frakcji krwi.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że frakcja krwi jest koncentratem czerwonych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu czerwonych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że frakcja krwi jest koncentratem białych krwinek, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny koncentratu białych krwinek w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.
14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że frakcja krwi jest pochodną osocza, a sposób obejmuje wytwarzanie zawiesiny osocza lub pochodnej osocza w roztworze podtrzymującym obejmującym związek.
15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM.
16. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 1 do 30 mM.
17. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że związkiem jest L-karnityna.
18. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że związek wybiera się z grupy obejmującej acetylo-L-karnitynę, propionylo-L-karnitynę, butyrylo-L-karnitynę, izobutylo-L-karnitynę, walerylo-L-karnitynę i izowalerylo-L-karnitynę.
19. Sposób zmniejszania glikolizy w koncentracie płytek krwi od przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem, znamienny tym, że zawiesza się koncentrat płytek w roztworze podtrzymującym zawierającym związek wybrany z grupy obejmującej L-karnitynę i sole L-karnityny w ilości skutecznej do zmniejszania glikolizy w koncentracie płytek krwi od przypadkowych dawców o zmniejszonej liczbie leukocytów przed przechowywaniem.

PL 200 250 B1
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 0,25 do 50 mM.
21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że związek jest zawarty w roztworze podtrzymującym w stężeniu od 1 do 30 mM.