CZ20014078A3

CZ20014078A3 - Způsob skladování a uchovávání krevních produktů včetně červených krvinek a krevních destiček

Info

Publication number: CZ20014078A3
Application number: CZ20014078A
Authority: CZ
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S. P. A.
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2002-03-13
Also published as: HK1044099A1; HK1044099B; BR0011430B1; HUP0201465A2; DE60005343D1; US7816073B2; HUP0201465A3; KR100713140B1; IL146517A; SK287562B6; SK16632001A3; CZ301803B6; CA2374140A1; BR0011430A; US20040146846A1; PT1187530E; DK1187530T3; US6403124B1; JP2003501364A; MXPA01012645A

Description

Oblast vynálezu

Tento vynález se týká způsobu vylepšené stability skladování zahrnující odolnost proti hemolýze a zlepšenou životnost krevních produktů včetně konzerv červených krvinek (RBC), krevních destiček a podobně. Způsob prodloužení životnosti těchto produktů, rovněž tak jako odolnosti proti činitelům poškozujícím jejich membránu, jako je například záření, se realizuje skladováním těchto produktů v suspenzi obsahující účinné množství L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu. Předložený vynález se také týká způsobu potlačení růstu bakterií v plné krvi i v krevních frakcích včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek (WBC), koncentrátů krevních destiček a plazmových derivátů, které se skladují delší dobu. Předložený vynález se dále týká postupu a omezení glykolýzy plné krve i krevních frakcí včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek (WBC), koncentrátů krevních destiček, plazmy a plazmových derivátů, které se skladují po delší dobu.

Tato přihláška je částečným pokračováním patentové přihlášky s pořadovým číslem 08/840,765 podané 16. dubna 1997, která je zde pro úplnost uvedena jako odkaz.

Dosavadní stav techniky

Trvale vzrůstá úsilí o zvyšování dodávek krve, a to jak v národním měřítku, tak celosvětově. Vyvstala otázka jak komplexnosti, tak spolehlivosti současných dodávek, tak možnost budování větších zásob • · · · · ·

- 2 na delší dobu. Jednou z příčin tohoto stavu je poměrně krátká doba stability krevních produktů při skladování. Běžně jsou konzervy RBC (koncentráty červených krvinek, neboli RCC) - převažující forma krevních produktů pro transfúze a podobně - omezeny 42 denním skladovacím obdobím. Po této době značně klesá hladina ATP, což je spojeno s významným poklesem pH ukazujícím na nedostatečnou životaschopnost červených krvinek nebo pokud jsou životaschopné, pak jen s extrémně krátkou cirkulační dobou při infúzi in vivo. U krevních destiček je běžná skladovací doba ještě kratší; standardní doba je 5 dnů při 22 °C. Rozdíl ve stabilitě při skladování koncentrátů krevních destiček (PC) oproti RBC tkví v probíhajících metabolických reakcích krevních destiček - částečně pro přítomnost mitochondrií v PC a jejich nepřítomnost v RBC. Zatímco oba krevní produkty vykazují pokles ATP, který je ve spojení s poklesem pH během času, a je doprovázen tvorbou kyseliny mléčné, je přítomnost mitochondrií v PC spíše vyprovokováním tohoto problému z důvodu glykolýzy.

Současně se zvyšuje zájem o spolehlivost a integritu dodávek krve. Opakovaně je zjišťována zvláště kontaminace dodávek krve bakteriemi či dalšími mikrobielními činiteli. Taková situace je o to vážnější v zemích s méně náročnými způsoby odběru a skladování. I když mohou být k odebraným produktům přidávány látky k omezení kontaminace, není tento způsob žádoucí, protože při transfúzi se tyto látky dostávají příjemcům nazpět. Jednou z doporučitelných metod je ozařování produktu po jeho zakonzervování většinou do plastových vinylových zásobníků. Takový postup ozařování poškozuje RBC a při skladování snad i PC, čímž se snižuje funkčnost těchto buněk.

- 3 9 9 9 9 9

9999999 99 999

Vedle toho je malá, ale stále rostoucí část populace dostávající krev v riziku obecně fatálního stavu známého jako odmítnutí štěpu hostitelem při transplantaci (Transfusion associated graft versus host disease) (TAGVHD) pro přítomnost životaschopných allogenních leukocytů. Tento syndrom je typicky spojován s imunosupresními pacienty, jako jsou například pacienti s nádory a transplantovanou kostní dření, avšak může také nastat u imunokompetentních osob v populaci při nastaveném omezeném polymorfizmu HLA.

Velká pozornost byla věnována hledání způsobů k prodloužení stability ph skladování. Jedním z takových způsobů k prodloužení života skladování PC je opět citovaný US patent 5,466,573. Tento patent je směrován na zabezpečení preparátů PC zdrojem octanových iontů, které působí jak jako substrát pro oxidativní fosforylaci, tak jako ústojný roztok působící proti snižování pH způsobeného kyselinou mléčnou. Taková metoda nepůsobí přímo na problém hemolýzy a poškození membrány. Alternativní způsob je uveden v US patentu 5,496,821 od zde i obecně uváděného vynálezce. V tomto patentu se skladuje plná krev v preparátu obsahujícího L-karnitin (LC) nebo jeho alkanoylové deriváty. Patent přesto nepopisuje účinky krevních produktů jako jsou suspenze PC nebo RBC a vztahuje se alespoň v určité míře na dopad LC na vlastnosti plazmy.

Jak je poznamenáno výše, kontaminace dodávek krve mikrobiálními činiteli je dalším problémem, který je nutno lékařské společnosti adresovat. Jedním ze způsobů sterilizace produktu a zlepšení spolehlivosti vzhledem ke kontaminaci je ozařování krevního produktu. Obecně to vyžaduje hodnoty záření okolo 25 centigray (cG), kterými se produkt ozáří po zakonzervování do plastových, skleněných nebo jiných zásobníků. Ozáření bohužel vyvolá léze buněčných membrán a hemolýzu

RBC. Ozářením krevních produktů včetně plné krve, konzerv RBC a PC problém nekončí.

Navíc doposud nebyl zveřejněno působení L-karnitinu na růst bakterií v takových krevních produktech jako je například plná krev, koncentráty červených krvinek a krevních destiček. Podobně nebylo demonstrováno ani působení L-karnitinu na glykolýzu krevních produktů jako je plná krev, koncentráty červených krvinek a krevních destiček, zvláště nestandardisovaných destičkách s redukovanými leukocyty.

Shrnutí vynálezu

Jedním z předmětů zájmu odborníků v této oblasti je tedy zajištění způsobu prodloužení doby životnosti a cirkulačního poločasu životnosti RBC a PC během transfúze nad běžné maximum.

Jiným předmětem těchto odborníků je nalezení způsobu, kterým by mohly být krevní produkty včetně plné krve, konzerv RBC a PC sterilizovány ozařováním bez významného poškození membrány, lézí a hemolýzy.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v plné krvi.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v plné krvi, která je skladována delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v krevních frakcích.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v krevních frakcích, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v konzervách červených krvinek.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v konzervách červených krvinek, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v konzervách bílých krvinek.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v konzervách bílých krvinek, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v koncentrátech krevních destiček.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v koncentrátech krevních destiček, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v plazmě a plazmových derivátech.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu potlačení růstu bakterií v plazmě a plazmových derivátech, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v plné krvi.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v plné krvi, která je skladována delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v krevních frakcích.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v krevních frakcích, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v konzervách červených krvinek.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy bakterií v konzervách červených krvinek, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v konzervách bílých krvinek.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v konzervách bílých krvinek, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v koncentrátech krevních destiček.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v koncentrátech krevních destiček, které jsou skladovány delší dobu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy nestandardisovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením při delším skladování.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v plazmě a plazmových derivátech.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu zmírnění glykolýzy v plazmě a plazmových derivátech, které jsou skladovány delší dobu.

Těchto a dalších předmětů, které budou zřejmé během následujícího podrobného popisu, je dosaženo vynálezcovým objevem během dlouhého výzkumu, že poškození membrány RBC a PC skladováním nebo ozařováním lze podstatně zmírnit a potlačit suspendováním krevních produktů v běžném ochranném roztoku jako je například AS-3, kde tento ochranný roztok ještě dále obsahuje L-karnitin nebo jeho alkanoylový derivát v koncentraci 0,25 až 50 mM nebo vyšší. Přihlašovatelův objev tkví v poznání, že rozklad krevních produktů běžně spojovaný s poklesem hladiny ATP a pH lze většinou vystopovat při poškození membrány a hemolýze. Zachování membrány a její obnova mohou být ovlivněny lipidovou reacylací ovlivněnou LC, jehož irreverzibilní absorbce na RBC a podobné krevní produkty byla zjištěna tvořivým výzkumem. Vynálezce také objevil, že L-karnitin potlačuje růst bakterií v plné krvi i v krevních frakcích, včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek (WBC), koncentrátech krevních destiček, plazmě a plazmových ·♦ ··

4 4 4 4

4 4

- 8 derivátech, které se skladují po delší dobu. Vynálezce dále objevil, že Lkarnitin omezuje glykolýzu v plné krvi i v krevních frakcích, včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek (WBC), koncentrátech krevních destiček, nestandardisovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením, plazmě a plazmových derivátech, které se skladují po delší dobu.

Stručný popis výkresů

Obrázek 1. Hodnoty životnosti RBC po 42 denním skladování po infuzi v porovnání s dárcovými a kontrolními a skladovanými s LC. Šipky ukazují na hodnoty standardní odchylky kontrolních RBC a RBC skladovaných s LC. V horní části diagramu je také uvedena přesně vypočítaná hodnota p. Obrázek 2. Obsah karnitinu v červených krvinkách při různé době uchovávání. Karnitin byl hodnocen podle popisu uvedeného v odstavci Materiály a postupy. Hodnoty jsou průměrem ze tří pokusů prováděných dvojmo. Odchylky mezi pokusy nebyly větší než 7 %. Kružnice platí pro RBS skladované se samotným AS-3; plné kroužky platí pro RBC skladované s AS-3 s přídavkem LC (5 mM).

Obrázek 3. Radioaktivní kyselina palmitová inkorporovaná do RBC LC při různé době uchovávání. Alikvotní podíly RBC odebrané buď z krevních jednotek skladovaných v samotném AS-3 nebo v AS-3 s LC byly inkubovány při 37 °C s [1 -¹⁴C] kyselinou palmitovou zakomplexovanou na mastnou kyselinu prostou BSA. Na konci inkubace byly potom RBC zpracovány podle popisu uvedeného v odstavci Materiály a postupy. U vytvořené PLC označené radionuklidem se odkazuje na obsah fosforu přítomného v lipidovém extraktu. Hodnoty jsou průměrem ze tří pokusů prováděných dvojmo. Odchylky mezi pokusy nebyly větší než 7 %.

·* 0··· * 0* • 0 · 0··0

0· 0 0

- 9 00

0 ·

0 0 0 • 000 0 0000000

Kružnice platí pro RBS skladované se samotným AS-3; plné kroužky platí pro RBC skladované s AS-3 s přídavkem LC (5 mM).

Obrázek 4. Inkorporace radioaktivní kyseliny palmitové do fosfatidylethanolaminu (PE) a fosfatidylcholinu (PC) membrán červených krvinek při různé době skladování. Alikvotní podíly RBC odebrané buď z krevních jednotek skladovaných v samotném AS-3 nebo v AS-3 s LC byly inkubovány při 37 °C s [1-¹⁴C] kyselinou palmitovou zakomplexovanou na mastnou kyselinu prostou BSA. Na konci inkubace byly potom RBC zpracovány podle uvedeného popisu. Výsledky jsou uvedeny v pmol [1-¹⁴C] kyseliny palmitové.pig’¹ lipidového fosforu přítomného v lipidovém extraktu. Hodnoty jsou průměrem ze tří pokusů prováděných dvojmo. Odchylky mezi pokusy nebyly větší než 7 %. Kružnice platí pro RBS skladované se samotným AS-3; plné kroužky platí pro RBC skladované s AS-3 s přídavkem LC (5 mM).

Obrázek 5. Karnitinový systém a reacylační reakce membránového fosfolipidu. Tlustší šipky označují preferenční přísun acylu. Rozměry acylkarnitinového rámečku znázorňují poměrnou velikost zásoby. Zde použité zkratky: LPL = lysofosfolipidy; PLP = fosfolipidy; Cn = karnitin; acyl-Cn = acylkarnitin; ACS = acyl-KoA-syntetáza; LAT = lysofosfolipid acyl-KoA transferáza; CPT = karnitinpalmitoyltransferáza.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález využívá L-karnitin a jeho alkanoylové deriváty jako látky podporující udržení a obnovu buněčné membrány a potlačení hemolýzy v krevních produktech. Předložený vynález zabezpečuje také způsob potlačení růstu bakterií v plné krvi a krevních frakcích včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek, koncentrátů krevních destiček,

ΦΦ » · « Φ

9 « · · * « · • · 9 9 9 9 9

9 9 · ΦΦΦ·· • Φ Φ · Φ » · • φφφ · ·99 Φ*·· ·· ·*«

- 10 plazmy a plazmových derivátů. Předložený vynález zabezpečuje dále postup k omezení glykolýzy v plné krvi a krevních frakcích včetně konzerv červených krvinek, konzerv bílých krvinek, koncentrátů krevních destiček, plazmy a plazmových derivátů.

Mezi vhodné L-karnitiny patří C₂-8-alkanoyl-L-karnitiny a mezi tyto alkanoyl-L-karnitiny, kterým se dává přednost, patří acetyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl a zvláště propionyl-L-karnitin. Zde jsou odkazy uváděny genericky na třídu LC a u příkladů jsou uváděny jako Lkarnitin. Namísto L-karnitinu mohou být použity popsané alkanoyl-Lkarnitiny a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Mezi příklady vhodných solí L-karnitinu patří např. L-karnitin chlorid, Lkarnitin bromid, L-karnitin orotát, kyselý L-karnitin aspartát, kyselý Lkarnitin fosfát, L-karnitin fumarát, L-karnitin mléčnan, L-karnitin maleinát, kyselý L-karnitin maleinát, kyselý L-karnitin šťavelan, kyselý L-karnitin síran, L-karnitin glukofosfát, L-karnitin vínan, kyselý L-karnitin vínan a Lkarnitin mukát.

Mezi příklady vhodných solí alkanoyl-L-karnitinu patří např. C₂-8-alkanoylL-karnitin chloridy, C₂-8-alkanoyl-L-kamitin bromidy, C₂-8-alkanoyl-Lkarnitin orotáty, kyselé C₂-8-alkanoyl L-karnitin aspartáty, kyselé C₂-8alkanoyl-L-karnitin fosfáty, C₂-8-alkanoyl-L-karnitin fumaráty, C₂-₈-alkanoylL-karnitin mléčnany, C₂-8-alkanoyl-L-karnitin maleináty, kyselé C₂-8alkanoyl-L-karnitin maleináty, kyselé C₂-8-alkanoyl-L-karnitin šťavelany, kyselé C₂-8-alkanoyl-L-kamitin sírany, C₂-8-alkanoyl-L-karnitin glukofosfáty, C₂-8-alkanoyl-L-karnitin vínany, kyselé C₂-8-alkanoyl-L-kamitin vínany a C₂. s-alkanoyl-L-karnitin mukáty.

Přídavek LC k plné krví nebo krevním frakcím včetně RBC, WBC, PC, plazmě a plazmovým derivátům vyžaduje, aby byl LC přítomen v účinném množství, aby se umožnila výživa membrány a její obnova a potlačila hemolýza a/nebo růst bakterií a/nebo omezila glykolýza. Provedený výzkum příkladů dále uvedených ukázal na minimální účinnou koncentraci v produktech většiny dárců v rozsahu od 0,25 mM do 0,5 mM. Horní hranice je spíše praktická než fyziologická. Koncentrace až 50 mM či vyšší lze snadno tolerovat. Přijatelné jsou hodnoty, které jsou v souladu s toxikologickými a osmotickými hodnotami. Přednost se dává rozmezí od 1 do 30 mM. Vhodné je rozmezí od 1 do 10 mM či ještě vhodnější s hodnotami mezi 4 až 6 mM, které dává významné rozdíly. Účinek tohoto vynálezu včetně prodloužení životaschopnosti a prodloužení cirkulačního poločasu při transfúzi může silně záviset na příjemci. Obecně řečeno, účinná koncentrace LC je 0,5 až 50 mM, avšak obyčejný lékař v terénu může žádat i o rozšíření tohoto rozsahu v obou směrech v závislosti na vlastnostech příjemce. Takové rozšíření nevyžaduje žádné vynálezecké úsilí.

LC se snáší s běžnými podpůrnými roztoky (stabilizační roztoky), které se běžně připravují k zajištění pufrovacího účinku. Mezi obecně používané roztoky patří ACED (kyselina citrónová - citran sodný - dextrosa), CPD (citran - fosforečnan - dextrosa) a jejich modifikace, včetně CPD2/A-3 a příbuzné přípravky. Přípravek obvykle obsahuje cukr jako například glukosu nebo manitol, alespoň jednu sůl kyseliny fosforečné, citran a další vyvažující sole. LC je běžně rozpustný a může se k těmto přípravkům volně přidávat v potřebném množství. Vhodné roztoky jsou popsány v US patentu 5,496,821 uvedeném zde jako odkaz. Poznamenejme však, že v tomto vynálezu lze s LC použít i jiné podpůrné roztoky než běžně používané, a to včetně umělé plazmy a dalších fyziologicky přijatelných roztoků. Důležitou složkou podpůrného roztoku je LC.

• ···· · ·· • · ftft·· • · · ·

Schopnost LC obsaženého ve vlastní krvi nebo suspenzi krevních frakcí jako je RBC, WBC, PC, plazma a plazmové deriváty prodloužit dobu životnosti a tudíž skladovatelnost a cirkulační dobu při transfúzi příjemci je dále doložena příklady pokusů in vitro a in vivo. Pokusy využívají LC, avšak lze použít i alkanoyl-L-karnitiny. Zvláštní pozornost je dále věnována demonstraci, že zlepšením je docíleno lepšího udržení (včetně obnovy) buněčné membrány a potlačení hemolýzy.

Materiály a postupy

Studijní plán I:

Hodnocení kvality RBC skladovaných s LC a bez LC in vivo a in vitro

Pokusný výběr. Ve výběru pro výzkum populace byly muži a ženy mezi 18 a 65 lety bez známého mentálního nebo fyzického postižení a neužívající léčiva, která by ovlivňovala životaschopnost RBC. Jedinci byli vybíráni tak, aby splnili běžná allogenní kriteria pro dárce uvedená ve Sbírce federálních zákonů, kapitola 2, normy Americké společnosti krevních bank a služebních směrnic národního Amerického Červeného kříže. Studie byla schválena Institutional Review of the Medical College of Hampton Roads a subjekty daly předběžný souhlas účasti v této studii.

Každý dárce věnoval odběr ze dvou různých příležitostí v časovém rozmezí 72 dnů; první odběr byl náhodně použit buď ke zkoušce nebo kontrolní zkoušce.

• ·

- 13 Systém při skladování krve. Byl použit normalizovaný systém CP2D/AS-3 (Miles, lne.) s polyvinylchloridového (PVC) plastu s diethyl-n-hexylftalátem (DEHP) jako plastifitátorem. Do každé zkušební jednotky bylo přidáno do zásobníku obsahujícího přídavný roztok AS-3 245 mg LC (v 1,1 ml čistého apyrogenního roztoku ve sterilizované skleněné lahvi) na výslednou koncentraci 5 mM. Ke kontrolní jednotce bylo k roztoku AS-3 přidáno za stejných podmínek 1,1 ml 0,9 % NaCl. Přídavek LC nebo soli do sáčku byl proveden injikováním stříkačkou přes spojku na vzorkovací straně. To bylo provedeno v boxu s laminárním prouděním pod UV zářičem.

Odběry a zpracování. Při odběru přibližně 450 ± 50 ml krve bylo použito standardní flebotomie a způsobu odběru plné krve. Celá krevní jednotka byla před zpracováním uchovávána po dobu 4 až 8 hodin při laboratorní teplotě. Jednotka byla zcentrifugována za normalizovaných podmínek a po zcentrifugování supernatantová plazma oddělena a sedimentované RBC resuspendovány bud’ v standardním roztoku AS-3 (kontrolní) nebo roztoku AS-3 obsahujícího karnitin (zkouška). Jednotky se suspendovanými RBC byly skladovány při 4 °C po dobu 42 dnů.

Měření in vitro. Měření hladiny ATP v RBC, celkového hemoglobinu a hemoglobinu v supernatantu, hematokrytu (Htc), RBC, WBC a počtu krevních destiček, osmotické fragility RBC, morfologie RBC, hladiny mléčnanu a glukózy a hladiny draslíku v supernatantu byla provedena na vzorcích před (0. den) a po (42. den) odběru. Tato měření byla provedena normalizovanými postupy popsanými již dříve (Heaton, et al., Vox Sang, 57, 37-42 1989).

• · ·· • · · «····«· • · · · · ·

- 14 Měření po transfúzi in vivo. Po 42 dnech skladování byly vzorky vyjmuty a uskladněné buňky normalizovanými postupy označeny Cr. Současně ke stanovení hmotnosti RBC byl od dárce odebrán čerstvý vzorek k označení RBC Tc. Po označení byly tyto skladované buňky označené 15 piCi ⁵¹Cr a čerstvé buňky označené 15 μθϊ Tc smíseny a současně zavedeny infuzi. Po infuzi byly v různých časových intervalech odebírány vzorky krve (5 ml) až do 35. dne za účelem výpočtu procentní denní obnovy a přežití. Denní procentní obnova byla stanovena za použití jednoduchého označovacího postupu, kde se využilo logaritmicko-lineární regrese úrovně radioaktivity vzorků odebíraných v 5., 7,5., 10. a 15. minutě ke stanovení úrovně v čase 0, nebo způsobu dvojího značení s použitím hmoty dárcových RBC tak, jak byly stanoveny měřením Tc.

Cirkulační životnost dodaných RBC označených Cr a přeživších po transfúzi byla stanovena na vzorcích odebraných ve 24. hodině a potom dvakrát týdně po dobu 5 týdnů. Úroveň radioaktivity byla korigována na konstantní 1 % eluci denně. Hodnoty byly vyneseny jako lineární funkce pro dny po transfúzi jako nezávislá proměnná (osa X) a korigované pulzy Cr jako závislá proměnná (osa Y). Životnost RBC byla potom vzata jako průsečík vynesené křivky s osou X.

Statistická analýza. S daty ze zkoušek jednotek in vivo a in vitro byl proveden párový t-test nebo rutinní neparametrická statistická analýza ke stanovení, zda se vyskytly nějaké statisticky významné rozdíly (1-tail) mezí zkušebními a kontrolními jednotkami. Statistická významnost byla uvažována pro hodnotu p menší než 0,05.

Studijní plán II:

··«··· * ·* ·♦ • · · ··»··♦ • « · · · · • · · · · · · · • · · · · · ···· « ······♦ · ·

- 15 Studie absorbce LC na erythrocyty a lipidové reacylace při skladování do 42 dnů

Chemikálie. Bovinní sérumalbumin (BSA)prostý esenciálních mastných kyselin byl získán od SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. (USA). [1-¹⁴C] kyselina palmitová (58 Ci.mol·¹) byla získána od New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Destičky pro tenkovrstvou chromatografii Whatman LK6 (silikagel) (20 x 20 cm) s vrstvou preabsorbentu byly získány od Carlo Erba, Milano, (Itálie). Palmitoyl-Lkarnitin (PLC) a LC byly laskavým darem Sigma Tau, Pomezia, (Itálie). Všechny ostatní použité sloučeniny byly kvality „čisté“ (reagent grade).

Hodnocení červených krvinek s karnitinem. Vzorky krve byly odebrány ze skladovaných jednotek RCC a jednou promyty 4 objemy studeného 0,9 % roztoku NaCl. RBC byly potom resuspendovány v 0,9 % NaCl při výsledném hematokrytu 50 % a deproteinovány kyselinou chloristou podle popisu Coopera, et al., Biochem. Biophys, Acta, 959, 100 - 105, (1988). Alikvotní podíly výsledného extraktu byly analyzovány radiochemickou zkouškou na obsah volného LC podle Páce, et al., Clin. Chem., 24, 32 35, (1978).

Analýza reacylace komplexního membránového lipidu ve skladovaných RBC. Vzorky krve byly odebrány ze skladovaných jednotek RBC postranní vzorkovací spojkou stříkačkou a ihned zpracovány. Bylo to provedeno v boxu s laminárním prouděním pod UV zářením. Všechny manipulace byly prováděny ph 0 až 5 °C, pokud není uváděno jinak. RBC byly dvakrát promyty 4 objemy studeného 0,9 % roztoku NaCl. Izolované RBC byly opět promyty inkubačním ústojným roztokem (120 mM NaCl, 5

• « mM KCI, 1 mM MgSC>4, 1 mM NaH₂PO₄, 40 mM sacharosa, 5 mM glukosa, 10 mM Tris-HCl, při pH 7,4) a resuspendovány ve stejném ústojném roztoku na výsledný hematokryt 5 %. K inkubaci byla použita míchaná lázeň Rotabath nařízená na 37 °C. RBC byly inkubovány s radioaktivní kyselinou palmitovou (10 μΜ) v komplexu s mastnou kyselinou prostou BSA (1,65 mg.ml·¹). Inkubace se zakončily jedním promytím buněk studeným inkubačním ústojným roztokem a trojnásobným promytím 1 % mastnou kyselinou prostou BSA v inkubačním ústojném roztok a nakonec opět inkubačním ústojným roztokem. RBC lipidy byly odděleny extrakcí od neporušených buněk postupem podle Rose a Oaklandera, J. Lipid Res., 6, 428 -431, 1965. K zabránění oxidace lipidů byl klipidovému extraktu přidán 0,1 % butylovaný hydroxytoluen. Ke stanovení obsahu lipidového fosforu byly použity alikvotní podíly lipidových extraktů a analyzovány dvoufázovou tenkovrstvou chromatografií. Chromatogramy byly v první fázi vyvolány směsí chloroform - methanol - 28 % amoniak (65 : 25 : 5). Potom byly chromatogramy vyvolány ve druhém směru směsí chloroform - aceton methanol - kyselina octová - voda (6 : 8 : 2 : 2 : 1). Fosfatidylcholin (PC), fosfatidylethanolamin (PE) a fosfatidylserin byly vizualizovány krátkou expozicí desek jodem a identifikovány pomocí standardů jako referenčních látek. Jednotlivé fosfolipidové skvrny byly seškrábnuty do ampulí obsahujících scintilační kapalinu a byla stanovena radioaktivita čítáním scintilací v kapalině. Identifikace a analýza radioaktivního PLC byla provedena podle postupu popsaného dříve Arduinim, et al., J. Biol. Chem., 267, 12673 - 81, 1992. Počet pulzů byl vyhodnocen na externí standard. Výpočty byly založeny na specifické aktivitě radioaktivní kyseliny palmitové.

- 17 Výsledky

Studie I

Charakteristiky RCC v AS-3 před skladováním

Vlastnosti RCC produktů v AS-3 po zpracování všech krevních jednotek byly podle očekávání. U charakteristik RBC AS-3 nebyly pozorovány žádné významné odchylky mezi zkušebními a kontrolními jednotkami co se týká objemu, obsahu Hct a WBC a vlastnostmi RBC in vitro jako například v hladině ATP, supernatantovém hemoglobinu a hladině draslíku a osmotické fragilitě (Tabulka 1).

• ·· · ·

Tabulka 1. Charakteristiky koncentrátů červených krvinek před uložením RBC

Objem jednotky (ml)	Kontrolní 305 ± 38	Zkouška (L-karnitin) 295 ± 41
Htc (%) v jednotce	60 ± 3	60 ± 3
WBC (x10⁹) v jednotce	2,6 ±1,1	2,4 ± 1,1
ATP (pmol.g'¹ Hb)	4,6 ±0,2	4,3 ±0,4
Hb v supernatantu (mg.dl'¹)	34 ± 15	26 ± 8
K⁺ v supernatantu (mekv.l·¹)	2,3 ± 0,2	2,2 ±0,3
Osmotická fragilita (%)	50 ± 4	49 ±4

Charakteristiky RBC po 42 denním skladování

Metabolické. Množství spotřebované glukózy a vytvořeného mléčnanu během 42 dnů skladování bylo podobné u zkoušených i kontrolních jednotek (Tabulka 2). Jak se očekávalo, mezi těmito dvěma parametry glykolýzy byla zjištěna inverzní korelace (r = 0,76). U jednotek RBC skladovaných s karnitinem byla zjištěna nižší hemolýza a vyšší hladina ATP. Jak je vidět na obrázku 1, tato vyšší hladina ATP byla pozorována u všech kromě jednoho páru (p < 0,01).

- 19 »Μ·

Tabulka 2. Charakteristiky koncentrátů červených krvinek po 42 denním skladování

	Kontrolní	Zkouška (L-karnitin)
Parametry in vitro
Glukóza (mg.dl·¹)	208 ± 33	193 ±40
Mléčnan (mg.dl·¹)	201 ± 27	199 ± 37
PH	6,33 ± 0.03	6,32 ± 0,04
ATP (pmol.g'¹Hb)	3,01 ±0,42	3,24 ± 0,38*
Hemolýza (%)	0,47 ±0,41	0,30 ± 0,22*
K⁺ v supernatantu (mekv.l·¹)	61 ±4	60 ± 3
Osmotická fragilita (%)	51 ± 3	50 ±4
Morfologické skóre	69 ± 8	68 ± 15
Parametry in vivo
Denní obnova (%) (jednou značené)	81,1 ± 6,2	84,0 ±4,4
Denní obnova (dvakrát značené)	80,1 ± 6,0	83,9 ± 5,0*
Objem RBC (ml)	1634 ± 510	1591 ± 534
Přežití (dnů)	85,9 ± 14,3	96,1 ±11,2*

* ( p < 0,05)

Membrána. Jak je zřejmé z obrázku 2, procento hemolýzy na konci skladování bylo nižší u jednotek s karnitinem. Na druhé straně se neobjevily žádné významné rozdíly v hladině draslíku v supernatantu,

- 20 šokové osmotické odezvě a morfologickém skóre, které byly na konci 42. dne skladování v očekávaném rozmezí.

Životnost po transfúzi. Střední hodnota denní procentní obnova u kontrolních jednotek byla podobná s předešle námi i jinými zjištěnou. Střední procentní hodnota obnovy červených krvinek skladovaných s karnitinem byla přesto vyšší než u kontrolních (p < 0,05). Střední cirkulační životnost červených krvinek podaných v infuzi byla navíc také vyšší u buněk skladovaných s karnitinem (obrázek 1). Objem dárcovských RBC podle stanovení u dvou případů byla velmi podobná (r = 0,98) a statisticky se nelišila.

Korelační studie. Jak se očekávalo, denní procentní obnova vykázala významnou korelaci s hladinou ATP (r = 0,63) a dalšími měřeními integrity RBC membrán jako je hemolýza (r = 0,57), osmotická fragilita (r = 0,71) a morfologické skóre (r = 0,59). Procento hemolýzy u jednotek RBC vysoce korelovalo s hladinami ATP (r = 0,83) a také s obsahem WBC (r = 0,83). Cirkulační životnost RBC nevykázala žádnou významnou korelaci s kterýmkoliv parametrem in vitro.

Studie II

Absorbce karnitinu ve skladovaných RBC

RBC skladované v samotném médiu AS-3 nevykázaly během skladování žádnou významnou ztrátu obsahu LC (obrázek 2). To je v souhlasu se zjištěním Coopera, et al., supra, ukazujícího na to, že lidské červené krvinky volně nevyměňují LC ani s plazmou, ani s isoosmotickým ústojným roztokem. Pokud se červené krvinky skladovaly v AS-3 s přidaným LC, bylo zjištěno vyšší množství intracelulárního LC než u • •00

·

0 0 0 ·

- 21 samotného AS-3 (obrázek 2). Obsah LC se během skladování zvyšoval lineárně a ve 42. dni dosáhl čtyřnásobku.

Studie reacylace komplexu membránového lipidu ve skladovaných RBC

Bez karnitinu se s dobou skladování obsah přítomného radioaktivního palmitanu inkorporovaného do PLC snižoval (obrázek 3). Naproti tomu červené krvinky z jednotky RCC skladované v roztoku AS-3 obsahujícího LC vykázaly počáteční vzrůst (s minimem ve třetím týdnu) následovaný výrazným poklesem radioaktivního palmitanu inkorporovaného do PLC. Ve stejných preparátech červených krvinek byla také vyhodnocena inkorporace radioaktivního palmitanu do membránových lipidů. Radioaktivní palmitan inkorporovaný do membrány PE červených krvinek z krevní jednotky skladované v roztoku samotného AS-3 vykazuje během skladování trvalý významný vzrůst radioaktivity v PE (obrázek 4). Červené krvinky skladované v přítomnosti LC byly charakterizovány náhlým zvýšením reacylace PE oproti konci skladování s minimem v 6. týdnu (obrázek 4). Hodnota inkorporace radioaktivního palmitanu do membrány PC se během skladování mírně snižuje avšak rozdíly mezi dvěma preparáty červených krvinek nebyly pozorovány žádné (obrázek 4). Je nutno poukázat na to, že i když v naší reacylační studii byly červené krvinky inkubovány při 37 °C v Krebsově-Ringerově ústojném roztoku obsahujícím glukosu, byla hladina ATP na konci inkubace blízko fyziologických hodnot (hodnoty neuvedeny).

Diskuse

V této studii zkoušení jednotek RBC skladovaných s karnitinem in vitro a in vivo vykázaly tyto jednotky na konci 42 denního skladování

- 22 v porovnání s kontrolní skupinou jednotek RBC významné rozdíly. Různé vlastnosti RBC ve zkouškách in vitro, které odrážejí metabolickou a membránovou integritu jako například ATP a % hemolýzy, rovněž tak jako přímo měřená životaschopnost buněk (denní procentní obnova a cirkulační životnost) byly významně lepší u RBC skladovaných s karnitinem. Zajímavé je prodloužení středního života přeživších cirkulujících RBC 24 hodin po infuzi. Tato zjištění mohou mít vztah k irreverzibilní absorbci LC během skladování, což je bezprecedentní a neočekávaný objev. Hodnoty získané při kontrolních studiích pro různé vlastnosti RBC byly podle očekávání a nelišily se od předchozích studií. V době odběru nebyly zjištěny žádné významné rozdíly mezi charakteristikami zkoumaných a kontrolních jednotek RBC. Jak je znázorněno na obrázcích 1 až 3, byly hladina ATP RBC, % hemolýzy a cirkulační životnost silně závislé na dárci, a protože bylo ve studii pět zkoušek a pět kontrol náhodně párováno jak u prvého, tak i druhého případu, není pravděpodobné, že by se pozorovaly rozdíly v důsledku špatného studijního schématu. Je tedy pravděpodobnější, že rozdíly pozorované v této studii byly způsobeny přídavkem karnitinu ke zkoušeným jednotkám. Možnost, že by zvyšující se životnost odrážela klesající eluci Cr nelze vyloučit, avšak není to konzistentní se zlepšenými hodnotami skladovaných červených krvinek získanými in vitro, které byly zjištěny u životnosti in vivo.

Mnoho výzkumů zjistilo, že LC a jeho acylestery mají na různé buňky včetně červených krvinek cytoprotektivní účinky a působí i na stabilizaci membrány. Viz např. Snyder, et al., Arch. Biochem. Biophys., 276, 132 138, 1990. V této studii bylo zjištěno, že během skladování RBC byl LC irreverzibilně absorbován. I když povaha tohoto procesu není zcela jasná, • · · · * · » » · · ·♦·· • · · · · · ···· · »·· ·**· ·· ·

- 23 při absorbci LC lze vyloučit účast specifického nosiče. Podle našich znalostí jediný známý nosič LC pracuje v buněčných systémech, kde jsou nitrobuněčné koncentrace LC mnohonásobně vyšší než jsou běžné v mimobuněčném prostředí. Koncentrace LC v červených krvinkách je podobná jako v plazmě. A tak i přes nízkou teplotu vyčerpání ATP a další metabolické změny nastávající během skladování pokud jsou červené krvinky skladovány v prostředí obsahující poměrně vysoké množství exogenního LC, ustavuje se neřízená absorbce LC buňkami. V tomto oboru se neobjevilo nic, co by to předpovídalo.

Na povahu působení LC na skladovaný RBC lze nahlížet ať už jako na biofyzikální nebo metabolickou intervenci na membránu. Potransfúzní výzkum skladovaných červených krvinek se týká integrity funkce membrány, jak to nabízí významná korelace mezi životností červených krvinek podaných opětnou infuzí in vivo, tak hodnotou jejich poměru povrchu ku objemu. Hlavní přispěvatel k membránové struktuře a funkci RBC je představován cytoskeletární sítí - Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol.,

1, 531 - 536, 1985 - supramolekulární proteinovou organizací ležící pod vnitřní hemisférou membrány RBC. Volf, et al., ve výzkumné studii o složení a funkci cytoskeletárního membránového proteinu zjistil u skladovaných červených krvinek, že jedinou relevantní změnou byl pokles schopnosti spektrinu associovat se s aktinem, a to ať už v přítomnosti nebo v nepřítomnosti proteinu 4.1. Wolfe, et al., J. Clin. Invest., 78, 1681 - 1686, 1986. Ukázali jsme, že LC ovlivňují deformabilitu membrány proteinu 4.1 RBC obsahující opravenou membránu vystavenou zvýšenému střihovému napětí. Arduini, et al., Life Sci., 47, 2395 - 2400, 1990. LC tak může uplatňovat stabilizační účinek na membránu interakcí spektrinu s jednou nebo více cytoskeletálními složkami. Nedávné studie elektronové paramagnetické rezonance Butterfielda a Rangachariho, Life • · ♦ A Α· t · • A • « · · • A · ·♦· A A

- 24 Sci., 52, 297 - 303, 1992 o interakci spektrinu a aktinu červených krvinek ukázaly, že LC významně posiluje interakce mezi spektrinem a aktinem Arduini, et al., supra.

Vedle potenciálního biofyzikálního působení popsaného výše mohou být pozorovaná zlepšení červených krvinek skladovaných s LC také výsledkem příznivých metabolických procesů. Deacylačně-reacylační cyklus membránových lipidů vyžaduje k vytvoření acyl-KoA normálně ATP. Acylový fragment acyl-KoA je potom převeden do lysofosfolipidů lysofosfolipid acyl-KoA transferázou. Během oxidativního čelenžování probíhá navíc proces obnovy fosfolipidů v RBC stejnou metabolickou cestou. Poslední zjištění ukazují, že CPT ovlivňuje v červených krvinkách a neuronálních buňkách reacylační proces membránových lipidů modulací velikosti zásoby acyl-KoA mezi aktivačním stupněm mastné kyseliny a jeho převodem na lysofosfolipidy. Arduini, et al., J. Biol. Chem., 267, 12673 - 12681, 1992. Studie puůzování a vyčerpání ATP ukázaly, že obsah acylkarnitinu v červených krvinkách slouží jako zásobník acylových skupin, v žádném případě však na úkor ATP. Arduini, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 353 - 358, 1994.

Zlepšení inkorporace radioaktivního palmitanu do membrány PE červených krvinek skladovaných v samotném AS-3 naznačuje, že dlouhodobé skladování (s progresivním vyčerpáním ATP v RBC) způsobuje vzrůstání úbytku aktivovaných acylových jednotek pro reacylaci membránových lipidů (obrázek 4). Během prvních pěti týdnů skladování se zdálo, že červené krvinky chráněné v AS-3 inkorporují více palmitanu do PE než červené krvinky skladované v AS-3 obsahujícím LC (obrázek 4). Červené krvinky skladované v přítomnosti LC byly schopné inkorporovat více palmitanu do PE na konci skladovacího období. Tato • · ♦ · ·*«»

- 25 zjištění může naznačovat, že oxidativní čelenžování je poněkud operativní, protože vystavení červených krvinek oxidačním činidlům silně stimuluje proces reacylace PE membrány, avšak ne PC membrány. Dise, et al., Biochem. Biophys. Acta, 859, 69 - 78, 1986. Je zajímavé, že se během prvních pěti týdnů zdálo, že skladované červené krvinky uchovávané v samotném AS-3 inkorporují více palmitanu do PE než červené krvinky skladované v AS-3 obsahujícího LC (obrázek 4).To dává představu, že v tomto posledním případě mohou CPT konkurovat reacylaci enzymu ve využívání acyl-KoA. Proto jsme měli v souladu s touto představou pozorovat mnohem větší rozdíly na konci skladovacího období, kdy je požadavek na acyl-KoA pro reacylační proces nejvyšší. To však nebyl tento případ. Červené krvinky skladované s LC nebo bez něho vykazují konci skladování podobné hodnoty inkorporace (obrázek 4). Vedle toho jsme ukázali, že CPT červených krvivek za různých pokusných podmínek nekonkuruje reacylaci membránových fosfolipidů. Arudini, et al., Life Chem. Rep., 12, 49 - 54, 1994.

Vytváření radioaktivního PLC v červených krvinkách s přídavkem LC je větší než radioaktivita zjištěná v těchto červených krvinkách skladovaných bez LC (obrázek 3). Časový průběh tvorby PLC v buňkách červených krvinek skladovaných s LC navíc vykazuje zajímavý zvonovitý tvar křivky s minimem ve třetím týdnu skladování. Tvorba radioaktivního PLC je odrazem velikosti zásoby acylkarnitinů s dlouhým řetězcem a směr toku acylu do neporušených červených krvinek zprostředkovaného CPT. Zdá se, že během prvních tří týdnů skladování s relativně vysokou glykolytickou aktivitou a dostupností ATP směřuje CPT tok acylu směrem k acylkarnitinů v červených krvinkách skladovaných v přítomnosti LC (obrázek 5a). Po třetím týdnu skladování se v přítomnosti LC tok obrací. Tyto změny mohou odrážet schopnost CPT tlumit aktivované acylové • · · ft ft··» ftft · · · · ftftftft * ftftft ftftft· ftft ·

- 26 jednotky: zvýšený požadavek acyl-KoA na reacylační proces vyústí v nižší produkci PLC a naopak a může představovat mechanismus, kde je CPT použit k tlumení zvyšujícího se úbytku acylových jednotek požadovaných pro reacylační proces (obrázek 5a).

Vyšší denní procentní obnova a cirkulační životnost představuje zlepšení přibližně o 15 % (množství cirkulujících RBC dodaných transfuzí, které jsou k dispozici příjemci za dobu průměrné životnosti). Tento vzestup potence lze klinicky reprodukovat jako snížení požadavku na transfúze u pacientů, kteří musejí transfúze dostávat chronicky, jako je tomu u thalasemiků nebo pacientů s poruchami tvorby kostí dřeně. Alternativně je možné prodloužit skladovatelnost RBC skladovaných v kapalném stavu. Naše zjištění naznačují, že přítomnost LC v ochranném prostředí během skladování RBC může mít úsporné působení na zásobu ATP využívaného k reacylaci fosfolipidů při obnově membrány. Tento příznivý metabolický proces spojený s možným prospěšným biofyzikálním působením tak může vysvětlovat snížení hemolýzy, vyšší hladinu ATP a zlepšenou obnovu a přežívání červených krvinek uchovávaných s LC in vivo.

Ozařování

Problém kontaminace krevních produktů včetně plné krve, RBC, RCC, PC a podobných lze omezit dostatečným ozářením. Úroveň ozařování nezbytná ke sterilizaci a úplné 100 % mortalitě mikrobiálních činitelů již byla široce zkoumána. Důležitější však je, že vedle toho mohou být podobným ozařováním zničeny i leukocyty. Používat je možné mnoho typů ozařování včetně gama záření (Kobaltová bomba (GG), van der Graafův urychlovač), UV záření, infračerveného záření, atd. Ekvivalent okolo 20 až 50 cG gama záření je postačující.

- 27 Celosvětově je ročně odebráno něco mezi 60 a 80 miliony krevních jednotek a jsou použity k transfúzní podpoře různých populací pacientů. V zaostalých zemích jsou odběry v přepočtu na 1000 obyvatel nižší a většina transfúzí krve se používá při porodnických a dětských případů a zvláště na anemii spojenou s malárií. V rozvinutých zemích jsou odběry v přepočtu na 1000 obyvatel 50 až 10 krát vyšší a většina transfúzí se spotřebovává na chirurgické zákroky (50 %) nebo léčbu pacientů s anemii spojenou s nádory, transplantace kostní dřeně a nezhoubné gastrointestinální krvácení (obrázek 1). S transfúzí allogenní krve je spojeno mnoho potenciálních nepříznivých účinků. Jednou ze zvláště nepříznivých komplikací spojených s transfúzí krve je vzácný a obvykle fatální jev známý jako odpor k přijmutí dárcovského štěpu (TA-GVHD), tedy komplikace zprostředkovaná životaschopnými allogenními imunocyty.

TA-GVHD porucha je vzácnou komplikací transfúze krve objevující se potenciálně u dvou typů příjemců krevní transfúze. TA-GVHD má mortalitu blížící se 100 % a prevencí je pouze okamžitý účinný zásah. První skupinou jsou imunokompromisní pacienti jako jsou například pacienti po implantaci kostní dřeně nebo dalších transplantovaných orgánů, pacienti s Hodgkinsovou chorobou nebo dědičnou nedostatečností imunitního systému. Druhou skupinou jsou neimunokompromisní pacienti, u kterých má dárce i příjemce podobné HLA. To je často vidět u přímých dárců blízkých příbuzných nebo u populace s omezenějším polymorfismem HLA jako je tomu v Japonsku a Izraeli. Na tomto podkladu je univerzálně zavedeno ozařování krevních produktů gama zářením střední dávkou 25 centigray (cG) za účelem zničení replikační schopnosti životaschopných imunocytů. Je však nutno poznamenat, že TA-GVHD je spojena s čerstvými buněčnými produkty, tj. obecně méně než 15 denními.

• · · A A A A A

A A · · · · ···· « *·· A··· ··

- 28 „Stárnutí“ krve však není dosud přijatou praxí v prevenci této komplikace. Přes to, že imunocyty jsou součástí allogenních leukocytů, není ochuzení o leukocyty běžně dosahované filtry třetí generace takového stupně, aby se této komplikaci zabránilo. Gama záření tedy v současné době zůstává jedinou přijatelnou profylaktickou intervencí.

Potíží při ozařování zvláště červených krvinek gama zářením je potenciální možnost poškození buněčné membrány. Při měření in vitro je zřejmé, že ozařování těmito dávkami se způsobí přibližně 7 až 8 % ztráta jejich potence snížením hladiny ATP v červených krvinkách, zvýšená hemolýza a zvýšení obsahu draslíku v supernatantu. Tyto změny jsou odpovídající poškození membrány. Tyto změny in vitro jsou u červených krvinek ozařovaných gama zářením spojeny se snížením denní obnovy. Co se týká produktů krevních destiček, alespoň jedna publikace se zmiňuje o určité ztrátě životaschopnosti.

Významným důkazem je, že gama ozařování vykonává svůj účinek vytvářením skupin s aktivovaným kyslíkem, jako jsou atomární kyslík, hydroxylový radikál a peroxidový radikál. Tyto skupiny vyvolávají nitrobuněčné poškození DNA a tím i zabraňují buněčné replikaci předcházející TA-GVHD. Ty samé kyslíkové skupiny však mohou oxidovat membránové lipidy červených krvinek a snad i membrány krevních destiček včetně vyvolávání lézí, které snižují kvalitu (potenci) buněčného produktu.

O LC je známo, že hraje klíčovou úlohu ph transportu mastných kyselin s dlouhým řetězcem mitochondriální membránou. Dědičné poruchy, u kterých nastalo selhání karnitinového systému ph transportu mastných kyselin s dlouhým řetězcem vyúsťuje ve významné oslabení funkcí ·· ·· • · · · · ©·♦ • · « ·

- 29 kosterního svalstva. V poslední době se zvýšil zájem o úlohu LC v membráně červených krvinek. Překvapujícím bylo, že červené krvinky postrádají mitichondrie a tak i značnou kuriozitu v přítomnosti LC a karnitin-palmitoyl transferázy, tedy enzymu týkajícího se reverzibilní acylace LC. To nebylo zpočátku jasné, kvůli úloze, kterou snad v červených krvinkách hrají. Červené krvinky mohou být vystaveny oxidačnímu stresu během svého dlouhého životního cyklu in vivo a obnovování oxidovaných membránových lipidů vyžadující LC, může být pro normální přežívání červených krvinek důležité.

Počáteční růst acylovaného karnitinu během zvyšující se dostupnosti ATP může fungovat jako zásobník aktivovaných mastných kyselin, které mohou být následně využity v mechanismu obnovy poškozených oxidovaných membránových lipidů. Takovéto vysvětlení dobře vysvětluje omezení hemolýzy pozorované během skladování výše uvedených červených krvinek in vitro a navíc by vysvětlovalo zlepšení pozorované při obnově a přežívání in vivo. Čistým výsledkem přídavku LC je přibližně 17 % zvýšení potence.

LC může být tedy použit k odstranění nebo prevenci membránových lézí vyvolaných ozařováním. K tomu dochází schopností karnitinu obnovovat oxidované membránové lipidy in vitro ve skladovaných červených krvinkách.

K omezení citlivosti produktů (RCC, PC a podobných) k membránovým lézím a hemolýze, může být krevní produkt nejprve suspendován v roztoku obsahujícím karnitin v koncentraci 0,25 mM až 50 mM k výživě a potlačení hemolýzy buněčné membrány, které je dosaženo v dostatečné míře tak, aby se mohl konzervovaný produkt ozařovat za účelem sterilizace a následně mu byla prodloužena skladovací doba a poločas

- 30 cirkulace po transfúzi. U materiálů tak lze tak dosáhnout životnosti řádu běžné životnosti se zajištěním sterility a nepravděpodobností zavlečení TA-GVHD, a to z důvodu ozáření po zakonzervování suspenze krevního produktu. Je třeba zdůraznit, že v tomto spojení je nutno termín krevní produkt brát siřeji, čímž se míní plná krev, krevní plazma, RCC, PC, směsi a podobně.

I. Využití L-karnitinu k potlačení bakteriálního růstu při prodlouženém skladování koncentrátů krevních destiček

Dosavadní stav: L-karnitin (LC) omezuje glykolýzu u koncentrátů krevních destiček skladovaných po prodlouženou dobu (> 5 dnů) (Sweeny, et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norsko, 27. červen - 2. červenec 1998, ve Vox Sanguinis, sv. 74, dodatek č. 1, s. 1226; a Sweeny, et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting, Miami Beach, Fl, USA, 4. - 8. prosinec 1998). Pokud se LC používá jako přídavek do koncentrátů krevních destiček, je důležité hodnotit jeho účinek na růst bakterií.

Studijní postupy: Byly odebrány dva identické ABO koncentráty nestandardisovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením připravené spřaženou filtrací plazmy bohaté na destičky (MedSep Corp. Covina, CA) a potom stejnoměrně rozděleny do dvou sáčků CLX® (MedSep). K jednomu sáčku z každého páru byl přidán buď LC na výslednou koncentraci 5 mM, nebo fyziologický roztok (kontrolní). Do každého zásobníku byl v 0. dni napíchnut 1 ml stafylokokové suspenze s negativní koagulázou na koncentraci mezi 1 až 48 CFU.ml·¹. Vzorky z každého zásobníku asepticky odebrány 3. den, 6. den a buď 7. den • t « « »··* · ·

- 31 nebo 8. den pro zjištění počtu kolonií. Hodnoty byly analyzovány párovými t-testy.

Výsledky: Studováno bylo jedenáct párů. Získané výsledky jsou v tabulce uvedené níže. V 7. či 8. dni byl růst v L-karnitinových zásobnících 33 % proti kontrolním.

Závěry: L-karnitin v koncentraci 5 mM zpomaluje v kapalných koncentrátech krevních destiček růst stafylokoků s negativní koagulázou.

	Pár	Kontrolní*	L-karnitin*	P
den	11	1,12 ± 0,7	1,12 ± 0,7	nestanoveno
den	11	3,11 ± 0,7	3,04 ± 0,7	0,43
den	8	4,28 ± 1,3	3,88 ± 1,0	0,05
či 8. den	11	5,09 ± 1,5	4,60 ± 1,5	0,002

* růst bakterií vyjádřený v logaritmech CFU.ml^-1

II. Použití L-karnitinu k omezení glykolýzy během prodlouženého skladování nestandardních destiček s redukovanými leukocyty před skladováním

Dosavadní stav: L-karnitin omezuje glykolýzu u koncentrátů standardních (s neredukovanými leukocyty) krevních destiček skladovaných po dobu pěti až deseti dnů (Sweeny, et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Oslo, Norsko, 27. červen - 2. červenec 1998, ve Vox Sanguinis, sv. 74, dodatek č. 1, s. 1226; a Sweeny, et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting, Miami Beach, Fl, USA, 4. - 8. prosinec 1998). Podobný účinek na nestandardizované destičky s redukovanými leukocyty před uložením nebyl dosud popsán.

Studijní schéma: Byly odebrány dva identické ABO koncentráty nestandardisovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením připravené spřaženou filtrací plazmy bohaté na destičky (MedSep Corp. Covina, CA) a potom stejnoměrně rozděleny do dvou zásobníků CLX (MedSep). K jednomu sáčku z každého páru byl přidán buď LC (výsledná koncentrace 5 mM), nebo fyziologický roztok (kontrolní). Krevní destičky byly potom ponechány po dobu sedm nebo osm dní při 22 °C na ploché třepačce; potom byly zkoušeny. Mezi provedenými zkouškami bylo stanovení pH, počet destiček, glukóza a mléčnan v supernatantu, povrchový p-selektin zjištěný průtokovou cytometrií, rozsah změny tvaru (ESC) a odezva na hypotonický šok (HSR). Spotřeba glukosy a tvorba mléčnanu byly vypočteny jako mM.10'¹² destiček za den. Hodnoty byly analyzovány párovými t-testy.

Výsledky: Bylo studováno sedm (7) párů koncentrátů destiček. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Závěry: L-karnitin omezuje v nestandardních destičkách s redukovanými leukocyty před uložením glykolýzu .

	Kontrolní	L-karnitin	P
PH	6,97 ± 0,2	7,09 ± 0,1	<0,01
Koncentrace glukózy	1,25 ± 0,2	1,13 ± 0,2	<0,01
Tvorba mléčnanu	1,73 ± 0,3	1,50 ±0,2	<0,01
p-selektin (% pozitivního)	74 ± 4	69 ± 9	0,04
ESC (%)	11 ± 5	12 ± 4	0,35
HSR (%)	45 ± 13	50 ± 22	0,64

- 33 Vynález této patentové přihlášky byl uveden jak generickým způsobem, tak odkazy na specifické příklady. Nezacvičeným odborníkům mohou bez zkoušení vzniknout rozdíly. Bez zácviku se mohou upravovat zvláště stabilizační přípravky, krevní produkty, ochranné látky, inhibitory a podobné. Specifické hladiny, životnost a cirkulační poločasy se budou měnit od dárce k dárci a od příjemce k příjemci. Takovéto odchylky však zůstávají v rozsahu vynálezu, pokud nejsou zvláště vyjmuty v nárocích uvedených dále.

~ Ι/θϊ-1

- 34 £oo4

Claims

Patentové nároky

1. Způsob potlačení růstu bakterií v plné krvi nebo jejích frakcích spočívající v přidávání ktéto plné krvi nebo jejím frakcím sloučeniny vybírané ze skupiny obsahující L-karnitin, sole L-karnitinu, alkanoyl-Lkarnitiny, sole alkanoyl-L-karnitinů a jejich směsi v účinném množství k potlačení růstu bakterií ve jmenované plné krvi nebo krevních frakcích.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované krevní frakce se vybírají ze skupiny obsahující konzervy červených krvinek, konzervy bílých krvinek, koncentráty krevních destiček, plazmu a plazmové deriváty.
3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí je konzerva červených krvinek a vyznačující se dále tím, že tento způsob spočívá v suspendování jmenovaných konzerv červených krvinek v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
4. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí je konzerva bílých krvinek a vyznačující se dále tím, že tento způsob spočívá v suspendování jmenovaných konzerv bílých krvinek v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
5. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí je koncentrát krevních destiček a vyznačující se dále tím, že tento způsob spočívá v suspendování jmenovaného koncentrátu krevních destiček v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
6. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí je plazma nebo plazmový derivát a vyznačující se dále tím, že tento způsob spočívá v suspendování jmenované plazmy nebo plazmového derivátu v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.

• ·

- 35
7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovaná sloučenina je obsažena ve jmenovaném podpůrném roztoku v koncentraci od 0,25 do 50 mM.
8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovaná sloučenina je obsažena ve jmenovaném podpůrném roztoku v koncentraci od 1 do 30 mM.
9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovanou sloučeninou je L-karnitin.
10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se jmenovaná sloučenina vybírá ze skupiny obsahující acetyl-L-karnitin, propionyl-Lkarnitin, butyryl-L-karnitin, isobutyryl-L-karnitin, valeryl-L-karnitin a isovaleryl-L-karnitin.
11. Způsob omezení glykolýzy v plné krvi nebo jejích frakcích, kde se jmenované frakce vybírají ze skupiny obsahující konzervy červených krvinek, konzervy bílých krvinek, plazmu a plazmové deriváty spočívající vtom, že se kplné krvi nebo krevním frakcím přidává sloučenina vybíraná ze skupiny obsahující L-karnitin, sole L-karnitinu, alkanoyl-L-karnitiny, sole alkanoyl-L-karnitinů a jejich směsi v množství účinném k potlačení glykolýzy ve jmenované plné krvi nebo krevních frakcích.
12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí jsou konzervy červených krvinek a vyznačující se dále tím, že tento jmenovaný způsob sestává ze suspendování jmenovaných konzerv červených krvinek v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
13. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí jsou konzervy bílých krvinek a vyznačující se dále tím, že tento jmenovaný způsob sestává ze suspendování jmenovaných konzerv • · · ·

- 36 bílých krvinek v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
14. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovanou krevní frakcí je plazma nebo plazmový derivát a vyznačující se dále tím, že tento jmenovaný způsob sestává ze suspendování jmenované plazmy nebo plazmového derivátu v podpůrném roztoku obsahujícím jmenovanou sloučeninu.
15. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovaná sloučenina je ve jmenovaném podpůrném roztoku obsažena v koncentraci od 0,25 do 50 mM.
16. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovaná sloučenina je ve jmenovaném podpůrném roztoku obsažena v koncentraci od 1 do 30 mM.
17. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že jmenovanou sloučeninou je L-karnitin.
18. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že se jmenovaná sloučenina vybírá ze skupiny obsahující acetyl-L-karnitin, propionyl-Lkarnitin, butyryl-L-karnitin, isobutyryl-L-karnitin, valeryl-L-karnitin a isovaleryl-L-karnitin.
19. Způsob omezení glykolýzy v koncentrátech nestandardizovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením, vyznačující se dále tím, že tento jmenovaný způsob spočívá v suspendování jmenovaného koncentrátu krevních destiček v podpůrném roztoku obsahujícím sloučeninu vybíranou ze skupiny obsahující L-karnitin a sole L-karnitinu v účinném množství k omezení glykolýzy ve jmenovaných koncentrátech nestandardizovaných destiček s redukovanými leukocyty před uložením.

• · · ·

- 37
20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že jmenovaná sloučenina je ve jmenovaném podpůrném roztoku obsažena v koncentraci od 0,25 do 50 mM.
21. Způsob podle nároku 19 vyznačující setím, že jmenovaná sloučenina je ve jmenovaném podpůrném roztoku obsažena v koncentraci od 1 do 30 mM.