KR100713140B1 - 적혈구와 혈소판을 포함하는 혈액 제품의 개선된 보관 및보존 방법 - Google Patents

Abstract

L-카르니틴 및 유도체 1 mM 내지 10 mM을 첨가함으로써 적혈구 및 혈소판 농축물의 세포막 보존을 개선시킨다. 이러한 개선은 농축 적혈구 및 혈소판 농축물의 생육 기간을 현행 기간 이상으로 연장시킨다. 또한, 상기와 같이 처리된 물질은 환자에게 수혈 시 연장된 순환 반감기를 나타낸다. 상기 방법에 의해 성취된 막 보존의 개선은 혈액 제품 중의 백혈구를 실질적으로 멸균시키고 파괴하기 위한 상기 혈액 제품의 밀봉된 용기에 대한 방사선 조사를 허용한다. 또한 L-카르니틴 및 유도체의 첨가는 전혈 및 혈액 분획물에서 세균 증식을 억제하고 해당작용을 감소시킨다.

Description

적혈구와 혈소판을 포함하는 혈액 제품의 개선된 보관 및 보존 방법 {Improved storage and maintenance of blood products including red blood cells and platelets}

본 발명은 농축 적혈구(RBC), 혈소판 등을 포함하는 혈액 제품의, 용혈 내성 및 개선된 생육성을 포함한 보관 안정성의 개선 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 이들 제품을 유효량의 L-카르니틴 또는 알카노일 카르니틴을 포함하는 현탁액에서 보관함으로써 상기 제품의 생육성뿐만 아니라 방사선 조사와 같은 막 손상 인자에 대한 내성을 연장시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 연장된 기간동안 보관되는 전혈 및 혈액 분획물, 예를 들어 농축 적혈구, 농축 백혈구(WBC), 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체에서 세균 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연장된 기간동안 보관되는 전혈 및 혈액 분획물, 예를 들어 농축 적혈구, 농축 백혈구(WBC), 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체에서 해당작용을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 원은 본 발명에 참고로 인용된, 1997년 4월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제 08/840,765 호의 일부 계속 출원이다.

혈액 공급에 대한 관심은 국가적으로 및 세계적으로 꾸준히 증가하고 있다. 기존 공급의 보전과 신뢰성, 및 시간에 따라 보다 많은 저장물을 축적시키는 능력은 모두 의구심을 가져왔다. 이에 대한 한 가지 이유는 비교적 짧은 혈액 제품 보관 안정성이다. 현재, 수혈 등을 위한 혈액 제품의 지배적인 형태인 농축 RBC(적혈구 농축물 또는 RCC)의 보관 기간은 42일로 제한된다. 이 시간 후에, ATP 수준은 상당히 떨어지고 현저한 pH 손실과 연결되며, 이는 생육성의 부족, 또는 생체 내에서 생육가능한 경우, 주입 시 극단적으로 짧은 순환 수명을 강하게 나타낸다. 전혈은 상당 기간동안 보관되지 않는다. 혈소판에 대해서는 현행 보관 기간이 훨씬 더 짧아 표준적으로 22 ℃에서 5일이다. 혈소판 농축물(PC)의 보관 안정성에서 다른 점은 부분적으로, PC 중의 미토콘드리아의 존재(RBC에는 부재함)에 기인하여 혈소판에서 대사 반응들이 진행된다는 점으로 인해 RBC와 상반된다. 상기 두 혈액 제품은 모두 시간에 따라 ATP의 강하를 보이고, 젖산 생산에 의해 수반되는 pH 강하와 연결되지만, PC 중의 미토콘드리아의 존재는 해당작용으로 인해 상기 문제를 더욱 악화시키는 듯 하다.

동시에, 혈액 공급의 신뢰성과 보전에 대한 관심도 증가하였다. 특히, 세균 또는 다른 미생물 인자에 의한 혈액 공급물의 오염은 반복적으로 발견되었다. 이러한 상황은 채혈 및 보관 방법이 덜 정교한 국가들에서 훨씬 더 심각하다. 오염을 감소시키기 위해서 수거된 제품에 약제들을 가할 수도 있지만, 이는 바람직하지 못하며 상기 제품을 수혈 환자에게 다시 수혈해야할 필요성을 제공한다. 한 가지 바람직한 대안은 상기 제품을 전형적으로 가소화된 비닐 플라스틱 용기로 포장한 후에 방사선 처리하는 것이다. 이러한 방사선 처리는 RBC 및 추정 상 보관 중의 PC를 악화시켜 이들 세포의 기능을 감소시킬 것이다.

또한, 소수지만 그 수가 증가하고 있는 일부 수혈 집단은 생육성 동종이형 백혈구의 존재로 인한 수혈 관련된 이식편 대 숙주병(TA-GVHD)이라 일반적으로 알려진 치명적인 증상의 위험이 있다. 이러한 증후군은 전형적으로는 면역억제된 환자, 예를 들어 암 및 골수 이식 환자와 관련 있으나, 제한된 HLA 다형성 환경의 면역능력 집단에서도 발생한다.

보관 안정성을 연장시키는 방법의 발견에 상당히 주목하고 있다. PC의 보관 수명을 연장시키기 위한 하나의 방법이 미국 특허 제 5,466,573 호에 인용되어 있다. 상기 특허는 산화적 인산화에 대한 기질로서 작용하고 젖산 생산으로 인한 임의의 pH 감소를 중화시키는 완충제로서도 작용하는 아세테이트 이온 공급원을 갖는 PC 제제를 제공하는 것에 관한 것이다. 이러한 방법은 해당작용의 문제 및 막 파괴에 대해 직접적으로 작용하는 것이 아니다. 또 다른 방법이 본 발명의 발명자에 의해 발명되고 통상적으로 양도된 미국 특허 제 5,496,821 호에 개시되어 있다. 상기 특허에서는 전혈을 L-카르니틴(LC) 또는 그의 알카노일 유도체를 포함하는 제제로 보관한다. 그러나, 상기 특허는 PC 또는 RBC 현탁액과 같은 혈액 제품에 대한 효과를 개시하고 있지 않으며, 혈장 특성에 대한 LC의 영향에 적어도 어느 정도 의지한다.

상기 나타낸 바와 같이, 미생물 인자에 의한 혈액 공급물의 오염은 의료계에 서 다루어지고 있는 또 다른 문제이다. 상기 제품을 멸균시키고 오염에 대한 신뢰성을 개선시키는 하나의 방법은 혈액 제품에 방사선을 조사하는 것이다. 일반적으로는, 약 25 센티그레이(cG)의 감마선을 플라스틱, 유리 또는 다른 용기로 밀봉된 제품에 조사하는 것이 바람직하다. 유감스럽게도, 방사선 조사는 RBC가 용혈된 세포막 손상을 유발시킨다. 전혈, 농축 RBC 및 PC를 포함한 혈액 제품의 방사선 조사는 계속해서 문제점을 안고 있다.

또한, 전혈, 적혈구 농축물 및 혈소판 농축물과 같은 혈액 제품에서 세균 증식에 대한 L-카르니틴의 효과는 아직 보고되지 않았다. 유사하게, 전혈, 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 특히 보관전-백혈구 감소된 랜덤 혈소판과 같은 혈액 제품에서 해당작용에 대한 L-카르니틴의 효과도 입증되지 않았다.

발명의 요약

따라서, 당해 분야 숙련가들의 목적 중 하나는 생육 기간, 및 수혈 시 RBC 및 PC의 순환 반감기를 현재의 최대값 이상으로 연장시키는 방법을 제공하는 것이다.

당해 분야 숙련가들의 또 다른 목적은 전혈, 농축 RBC 및 PC를 포함한 혈액 제품을 방사선 조사에 의해, 실질적인 막 손상과 병변 및 용혈없이 멸균시킬 수 있는 방법을 찾는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전혈에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 전혈에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈액 분획물에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈액 분획물에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 농축 적혈구에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 농축 적혈구에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 농축 백혈구에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 농축 백혈구에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈소판 농축물에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈소판 농축물에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈장 또는 혈장 유도체에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈장 또는 혈장 유도체에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전혈에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 전혈에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈액 분획물에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈액 분획물에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 농축 적혈구에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 농축 적혈구에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 농축 백혈구에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 농축 백혈구에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈소판 농축물에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈소판 농축물에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보관전-백혈구 감소된 랜덤 혈소판에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 보관전-백혈구 감소된 랜덤 혈소판에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈장 또는 혈장 유도체에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 기간 동안 보관되는 혈장 또는 혈장 유도체에서 해당작용을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 및 다른 목적들은 하기의 상세한 설명에서 자명해질 것이며, 연장된 연구를 통해 보관 시 또는 방사선 조사에도 불구하고 RBC 및 PC가 경험하는 막 손상이, L-카르니틴 또는 그의 알카노일 유도체를 0.25 내지 50 mM 이상의 농도로 추가로 포함하는 통상적인 보존 용액, 예를 들어 AS-3에 혈액 제품을 현탁시킴으로써 실질적으로 지연되고 억제될 수 있다는 발명자의 발견에 의해 성취되었다. 출원인의 발견은 ATP 수준 및 pH의 감소와 통상적으로 관련되는 혈액 제품 분해의 대부분이 실제로 막 손상과 용혈에서 원인을 찾을 수 있다는 인식에 놓여있다. 막의 보존 및 보수는 지질 재 아실화에 의해 수행될 수 있으며, 부분적으로 RBC 및 유사한 혈액 제품 중의 LC의 비 가역적인 흡수를 통해 수행될 수 있음이 본 발명의 연구를 통해 확립되었다. 본 발명자는 또한 L-카르니틴이 연장된 기간 동안 보 관되는 농축 적혈구, 농축 백혈구(WBC), 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체를 포함한 혈액 분획물 및 전혈에서 세균 증식을 억제한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 L-카르니틴이 연장된 기간 동안 보관되는 농축 적혈구, 농축 백혈구(WBC), 혈소판 농축물, 특히 보관전-백혈구-감소된 랜덤 혈소판, 혈장 및 혈장 유도체를 포함한 혈액 분획물 및 전혈에서 해당작용을 감소시킨다는 것을 추가로 발견하였다.

도 1은 헌혈자, 대조군 및 LC-보관과 관련된 42 일 보관된 RBC의 주입 후 수명 값을 나타낸다. 화살표는 각각 대조군과 LC-보관된 RBC의 평균±SD를 가리킨다. 그래프의 상단에 정확하게 계산된 p 값을 또한 나타낸다.

도 2는 다양한 혈액 보존 주 수에서의 적혈구 카르니틴 함량을 나타낸다. 카르니틴은 문헌[Materials and Methods]에 개시된 바와 같이 분석하였다. 값들은 중복 수행된 3 회 실험의 평균이다. 실험들간의 편차는 7% 이하였다. 개방 기호는 AS-3만으로 보관된 RBC를 나타내고; 매워진 기호는 LC(5 mM)가 보충된 AS-3에서 보관된 RBC를 나타낸다.

도 3은 다양한 혈액 보존 주 수에서 RBC LC에 결합된 방사성 팔미트산을 나타낸다. AS-3 단독 또는 AS-3 + LC에서 보관된 혈액 유니트로부터 회수된 RBC 분액들을 37 ℃에서 지방산 비 함유 BSA에 착화된 [1-¹⁴C]팔미트산과 배양하였다. 배양의 끝에서, RBC를 문헌[Materials and Methods]에 개시된 바와 같이 처리하였다. 방사성 표지된 PLC의 형성은 지질 추출물 중에 존재하는 인 함량과 관련된다. 값들은 중복 수행된 3 회 실험의 평균이다. 실험들간의 편차는 7% 이하였다. 개방 기호는 AS-3만으로 보관된 RBC를 나타내고; 매워진 기호는 LC(5 mM)가 보충된 AS-3에서 보관된 RBC를 나타낸다.

도 4는 다양한 혈액 보존 주 수에서 포스파티딜에탄올아민(PE)과 포스파티딜콜린(PC)의 적혈구 막에 결합된 방사성 팔미트산을 나타낸다. AS-3 단독 또는 AS-3 + LC에서 보관된 혈액 유니트로부터 회수된 RBC 분액들을 37 ℃에서 지방산 비 함유 BSA에 착화된 [1-¹⁴C]팔미트산과 배양하였다. 배양의 끝에서, RBC를 개시된 바와 같이 처리하였다. 결과는 지질 추출물 중에 존재하는 [1-¹⁴C]팔미트산 pmol/지질 인 ㎍으로서 나타낸다. 값들은 중복 수행된 3 회 실험의 평균이다. 실험들 간의 편차는 7% 이하였다. 개방 기호는 AS-3만으로 보관된 RBC를 나타내고; 매워진 기호는 LC(5 mM)가 보충된 AS-3에서 보관된 RBC를 나타낸다.

도 5는 카르니틴 시스템 및 막 인지질 재 아실화 반응을 나타낸다. 두꺼운 화살표는 우선적인 아실 흐름을 가리킨다. 아실카르니틴 상자의 크기는 있음직한 관련 풀의 크기를 가리킨다. 사용된 약어들은 다음과 같다: LPL, 리소인지질; PLP, 인지질; Cn, 카르니틴; 아실-Cn, 아실-카르니틴; ACS, 아실-CoA 신타제; LAT, 리소인지질 아실-CoA 트랜스퍼라제; CPT, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제.

본 발명은 혈액 제품에서 세포막 보존 및 보수를 지원하고 용혈을 억제하는 작용제로서 L-카르니틴 및 그의 알카노일 유도체를 사용한다. 본 발명은 또한 농축 적혈구, 농축 백혈구, 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체를 포함한 혈액 분획물 및 전혈에서 세균 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 농축 적혈구, 농축 백혈구, 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체를 포함한 혈액 분획물 및 전혈에서 해당작용을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.

적합한 알카노일 L-카르니틴에는 C_2-8-알카노일 L-카르니틴이 포함되며, 바람직한 알카노일 L-카르니틴으로는 아세틸, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 이소발레릴 및 특히 프로피오닐 L-카르니틴이 있다. 본 원에서는 이 군을 일반적으로 LC라 나타내며, L-카르니틴이 그 범례이다. 그러나, 개시된 알카노일 L-카르니틴 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염을 L-카르니틴 대신에 사용할 수도 있다.

L-카르니틴의 적합한 염으로는 예를 들어 L-카르니틴 클로라이드, L-카르니틴 브로마이드, L-카르니틴 오로테이트, L-카르니틴 산 아스파테이트, L-카르니틴 산 포스페이트, L-카르니틴 푸마레이트, L-카르니틴 락테이트, L-카르니틴 말리에이트, L-카르니틴 산 말리에이트, L-카르니틴 산 옥살레이트, L-카르니틴 산 설페이트, L-카르니틴 글루코스 포스페이트, L-카르니틴 타르트레이트, L-카르니틴 산 타르트레이트 및 L-카르니틴 뮤케이트가 있다.

알카노일 L-카르니틴의 적합한 염으로는 예를 들어 C_2-8-알카노일 L-카르니틴 클로라이드, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 브로마이드, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 오로테이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 산 아스파테이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 산 포스페이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 푸마레이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 락테이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 말리에이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 산 말리에이트, C _2-8-알카노일 L-카르니틴 산 옥살레이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 산 설페이트, C_2-8 -알카노일 L-카르니틴 글루코스 포스페이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 타르트레이트, C_2-8-알카노일 L-카르니틴 산 타르트레이트 및 C_2-8-알카노일 L-카르니틴 뮤케이트가 있다.

RBC, WBC, PC, 혈장 및 혈장 유도체를 포함한 혈액 분획물 또는 전혈에 LC를 첨가하는 것은 LC가 막의 보존, 보수 및 용혈 억제를 허용하고/하거나 세균 증식을 억제하고/하거나 해당작용을 감소시키기에 유효한 양으로 존재할 것을 요한다. 하기 개시된 실시예들을 포함하여 수행된 연구는 대부분의 헌혈자의 제품에 대해 최소 유효 범위가 약 0.25 mM 내지 0.5 mM임을 입증하였다. 상한은 생리학적 값보다 더 실용적이다. 50 mM 이상으로 높은 농도는 쉽게 내성이 생긴다. 독물학적 및 삼투압적 관심사와 일치하는 값이 허용된다. 바람직한 범위는 1 내지 30 mM이다. 1 내지 10 mM 또는 그 이상의 범위가 적합하며 4 내지 6 mM의 값은 현저한 효과가 있다. 생육성의 연장 및 수혈 시 순환 반감기의 연장을 포 함한 본 발명의 효과들은 헌혈자에 대단히 의존적일 수 있다. 따라서, 일반적으로 말하면, LC의 유효 농도는 0.5 내지 50 mM이나, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 범위를 헌혈자의 특수성에 따라 어느 한 방향으로 연장시켜야 할 필요가 있을 수 있다. 이러한 연장은 독창적인 노력을 요하지 않는다.

LC는 전형적으로 완충 효과를 제공하도록 제조된 통상적인 지지 용액(안정화 용액)과 일치한다. 통상적으로 사용되는 용액에는 ACED(시트르산-나트륨 시트레이트-덱스트로즈), CPD(시트레이트-포스페이트-덱스트로즈) 및 그의 변형물, 예를 들어 CPD2/A-3, 및 관련 조성물이 포함된다. 전형적으로, 조성물은 탄수화물, 예를 들어 글루코스 또는 만니톨, 하나 이상의 포스페이트 염, 시트레이트 및 다른 잔여 염들을 포함한다. LC는 통상적으로 수용성이며 요구되는 범위 내에서 상기 조성물에 자유롭게 첨가될 수 있다. 적합한 용액들이 미국 특허 제 5,496,821 호에 개시되어 있으며, 상기 특허는 본 발명에 참고로 인용되어 있다. 그러나, 통상적으로 사용되는 것들 이외에 인공 혈장 및 다른 생리학적으로 허용가능한 용액들을 포함하는 지지 용액들을 본 발명에서 LC와 함께 사용할 수 있다. 상기 지지 용액의 중요 성분은 LC이다.

LC가 RBC, WBC, PC, 혈장 및 혈장 유도체와 같은 혈액 분획들의 현탁액 또는 전혈에 포함될 때 생육 시간 및 따라서 보관 기간, 및 수혈자에게 수혈 시의 순환 기간을 연장시키는 능력을 하기에 생체 외 및 생체 내 실험에 의해 예시한다. 이들 실험은 LC를 사용하지만, 알카노일 L-카르니틴을 사용할 수 있다. 특히 중요한 것은 하기에서 세포막의 개선된 보존(보수 포함) 및 용혈의 억제를 통해 개 선된 성능이 얻어짐을 입증한 것이다.

물질 및 방법

연구 계획안 I:

LC와 함께 및 LC 없이 보관된 RBC의 생체 내 및 생체 외 품질 평가

대상자. 대상 집단은 알려진 정신적 또는 육체적 장애가 없고 RBC 생육성에 영향을 미칠 수 있는 약물을 복용하지 않은 18 세에서 65 세까지의 남성 또는 여성인 연구 대상자였다. 연방 등록 규약 2 장, 미국 혈액 은행 연합회 기준 및 미국 적십자의 혈액 부 지령에 열거된 통상적인 동종이형 헌혈자 기준에 만족되는 개인들을 모집하였다. 상기 연구는 햄튼 로드 의과 대학의 공공 고찰 게시판(the Institutional Review Board of the Medical College of Hamton Roads)에 의해 승인되었으며 대상자들에게 연구에 참여하기 전에 동의를 구했다.

각각의 헌혈자들은 72일까지 별도로 2 개의 상이한 경우로 헌혈하였으며 처음 헌혈 시 시험 또는 대조용 팔을 무작위 분류하였다.

혈액 보관 시스템. 표준 CP2D/AS-3 시스템(Miles, Inc.). 가소제로서 디에틸-(n)-헥실-프탈레이트(DEHP)를 사용한 폴리비닐 클로라이드(PVC) 플라스틱을 사용하였다. 각각의 시험 유니트에 대해서, AS-3 첨가 용액을 함유하는 용기에 LC(멸균된 유리병 중의 발열물질이 없는 순수 용액 1.1 ㎖ 중의 것) 245 ㎎을 가하여 최종 농도 5 mM을 얻었다. 대조용 유니트에 대해서, 0.9% NaCl 1.1 ㎖을 동 일한 조건을 사용하여 상기 AS-3 용액에 가하였다. 상기 백에 LC 또는 염수를 첨가하는 것은 샘플링 사이트 커플러를 통해 주사기로 주입하여 수행하였다. 이를 UV 광 하에 라미나 기류 후드에서 수행하였다.

헌혈 & 처리. 표준 정맥 절개 및 채혈 방법을 사용하여 대략 450±50 ㎖의 전혈을 수거하였다. 상기 전혈 유니트를 처리 전에 실온에서 4 내지 8 시간 동안 유지하였다. 상기 유니트를 표준 조건을 사용하여 원심분리하고, 원심분리 후에 표면층 혈장을 짜내고, 침강된 농축 RBC를 표준 AS-3 용액(대조군) 또는 카르니틴-함유 AS-3 용액(시험)에 재 현탁시켰다. 현탁된 RBC 유니트를 4 ℃에서 42일간 보관하였다.

생체 외 측정: 처리 전(0 일) 및 처리 후(42 일) 샘플에 대해 수행된 측정에는 RBC ATP 수준; 전체 및 표면층 헤모글로빈; 적혈구 용적률(Hct); RBC, WBC 및 혈소판 수; RBC 삼투 취약성; RBC 형태; 락테이트 및 글루코스 수준; 표면층 칼륨 수준이 포함된다. 이들 측정을 앞서 문헌[Heaton et al., Vox Sang 57:37-42(1989)]에 개시된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행하였다.

생체 내 수혈 후 측정. 보관 42 일 후에, 샘플을 회수하고 보관된 세포를 표준 방법을 사용하여 Cr로 표지하였다. 동시에, RBC 질량을 측정하기 위해서, 새로운 샘플을 헌혈자로부터 수거하여 RBC를 99Tc로 표지하였다. 표지 후에, 15 μCi ⁵¹Cr-표지된 보관된 세포와 15 μCi ⁹⁹Tc-표지된 새로운 세포를 혼합하고 동시에 주입하였다. 35 일까지 다양한 시간 간격으로 주입한 후에 혈액 샘플(5 ㎖)을 취하여 24 시간 회수율%과 생존율을 계산하였다. 24-시간 회수율%은 5, 7.5, 10 및 15 분에 취한 샘플들의 방사능 수준의 로그-1차 회귀를 사용하여 0 시간째 수준을 측정하는 단일 표지 방법을 사용하거나, 또는 ⁹⁹Tc 측정에 의해 측정된 헌혈자 RBC 질량을 사용하는 이중 표지 방법에 의해 측정하였다.

수혈된 생존 Cr-표지된 RBC의 순환 수명을 24 시간째 및 5 주까지 매주 2 회 취한 샘플에 의해 측정하였다. 상기 방사능 수준을 하루에 일정한 1% 용출로 보정하였다. 데이터를 독립 변수로서 수혈 후 일수(x-축)와 종속 변수로서 보정된 Cr 수(y-축)를 갖는 1 차 함수에 적용시켰다. 이어서 RBC의 수명을 x-축과 일치하는 선의 교점으로서 취하였다.

통계학적 분석. 시험 유니트와 대조군 유니트의 평균 간에 임의의 통계학적 유의수준 차(1-테일)가 있는지를 측정하기 위해서 상기 유니트들의 생체 내 및 생체 외 시험 데이터에 대해 짝을 이룬 t-시험 또는 통상적인 비-파라메트릭 통계 분석을 수행하였다. 통계학적 유의수준을 0.05 미만의 p 값에서 고려하였다.

연구 계획안 II

42 일까지 보관된 적혈구 LC 흡수 및 지질 재 아실화 연구

화학물질. 필수적으로 지방산이 없는 소 혈청 알부민(BSA)을 시그마 케미칼 캄파니(St. Louis, Mo, USA)로부터 입수하였다. [1-¹⁴C]팔미트산(58 Ci/몰)을 뉴 잉글랜드 뉴클리어 코포레이션(New England Nuclear Corporation, Boston, Mass., USA)으로부터 입수하였다. 예비-흡수제 층을 갖는 박층 플레이트인 와 트만(Whatman) LK6(실리카겔)(20x20 ㎝)을 카를로 엘바(Carlo Erba, Milan, Italy)로부터 입수하였다. 팔미토일-L-카르니틴(PLC) 및 LC는 시그마 타우(Sigma Tau, Pomezia, Italy)로부터 받았다. 사용된 다른 모든 화합물들은 시약 등급이었다.

적혈구 카르니틴 분석. 혈액 샘플을 보관된 RCC 유니트로부터 회수하고 4 부피의 냉 0.9% NaCl로 1 회 세척하였다. 이어서 RBC를 50%의 최종 적혈구 용적률로 0.9% NaCl에 재 현탁시키고, 문헌[Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta 959:100-105(1988)]에 개시된 바와 같이 과염소산으로 단백질을 제거하였다. 최종 추출물의 분액들을 문헌[Pace et al., Clin. Chem. 24:32-35(1978)]의 방사능화학 분석에 따라 유리 LC 함량에 대해 분석하였다.

보관된 RBC에서 막 착화 지질의 재 아실화에 대한 분석. 혈액 샘플을 보관된 RCC 유니트로부터 샘플링 사이트 커플러를 통해 주사기로 회수하여 이를 바로 처리하였다. 이를 UV 광 하에 라미나 기류 후드에서 수행하였다. 모든 조작은 달리 나타내지 않는 한 0 내지 5 ℃에서 수행하였다. RBC를 4 부피의 냉 0.9% NaCl로 2 회 세척하였다. 단리된 RBC를 다시 한번 배양 완충액(NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgSO₄ 1 mM, NaH₂PO₄ 1mM, 사카로즈 40 mM, 글루코즈 5 mM, 트리스 HCl 10mM, pH 7.4)으로 세척하고, 동일한 완충액에 5%의 최종 적혈구 용적률로 재 현탁시켰다. 37 ℃에서 로타배쓰 진탕 욕을 배양에 사용하였다. RBC를 지방산 비 함유 BSA(1.65 ㎎/㎖)에 착화된 방사성 팔미트산(10 μM)과 함께 배양하였 다. 세포를 냉 배양 완충액으로 1 회, 배양 완충액 중의 1% 지방산 비 함유 BSA로 3 회, 마지막으로 배양 완충액으로 다시 한번 세척하여 배양을 마쳤다. RBC 지질을 문헌[Rose & Oaklander procedure, J. Lipid Res. 6:428-431(1965)]에 따라 완전한 세포로부터 추출하였다. 지질 산화를 방지하기 위해서, 0.1% 부틸화된 하이드록시톨루엔을 상기 지질 추출물에 가하였다. 지질 추출물의 분액들을 지질 인 함량의 측정에 사용하였으며 2 차원 박층 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 간단히, 크로마토그램을 클로로포름-메탄올-28% 암모니아(65:25:5)를 사용하여 1 차원으로 현상하였다. 이어서 상기 크로마토그램을 클로로포름-아세톤-메탄올-아세트산-물(6:8:2:2:1)을 사용하여 2 차원으로 현상하였다. 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 포스파티딜세린을 요오드에 플레이트들을 간단히 노출시킴으로써 가시화하고 기준으로서 표준물을 사용하여 확인하였다. 개별적인 인지질 점들을 섬광 유체를 함유하는 바이알내로 긁어내어 액체 섬광 카운팅에 의해 방사능을 측정하였다. 방사성 PLC의 확인 및 분석은 최근에 문헌[Arduini et al., J. Biol. Chem. 267:12673-81(1992)]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 카운팅 효율을 외부 표준에 의해 평가하였다. 계산은 방사성 팔미트산의 특이적인 활성을 기준으로 한다.

연구 I

보관 전 AS-3 RCC 유니트 특징

AS-3 RCC 제품의 성질은 전혈 유니트 처리 후에 예상되는 바와 같았다. 유니트 부피, Hct 및 WBC 함량, 및 생체 외에서 ATP 수준, 표면층 헤모글로빈 및 칼륨 수준, 삼투 취약성과 같은 RBC 성질에 의해 측정 시 AS-3 RBC 유니트의 특징에서 시험 유니트와 대조군 유니트 간에 유의수준 차는 없었다(표 1).

42 일 보관 후 RBC 특징

대사. 42 일간 보관하는 동안 소비된 글루코스와 생성된 락테이트의 양은 시험 유니트와 대조군 유니트에 대해 유사하였다(표 2). 예상된 바와 같이, 이들 2 개의 해당작용 변수들 간에는 높은 역수 관계가 발견되었다(r=0.76). 그러나, 대조군에 비해 카르니틴 보관된 RBC 유니트에 대해서 보다 적은 용혈과 보다 높은 ATP 수준이 발견되었다. 도 1에 예시된 바와 같이, 이러한 보다 높은 ATP 수준은 한 쌍을 제외한 모든 쌍에서 관찰되었다(p<0.01).

막. 보관 수준의 끝에서 용혈율%은 도 2에 나타낸 바와 같이 카르니틴 유니트에서 적었다. 다른 한편, 42일 보관의 끝에서 예상 범위 내에 있었던 표면층 칼륨 수준, 삼투 쇼크 반응 및 형태 점수에 대해서는 유의수준 차이가 없었다.

수혈 후 생육성. 대조용 유니트에 대해서 평균 24 시간 회수율%은 이전에 본 발명자 및 다른 발명자들에 의해 발견된 것과 유사하였다. 그러나, 카르니틴- 보관된 적혈구에 대한 평균 회수율%은 상기 대조군-보관된 세포보다 더 높았다(p<0.05). 또한, 주입된 보관된 적혈구의 평균 순환 수명도 또한 카르니틴-보관된 세포에서 더욱 높았다(도 1). 상기 두 경우에 측정된 헌혈자의 RBC 질량은 매우 유사하였으며(r=0.98) 통계학적으로도 차이가 없었다.

상관성 연구. 예상된 바와 같이, 24 시간 회수율%은 ATP 수준(r=0.63) 및 RBC 막 보전에 대한 다른 측정치들, 예를 들어 용혈(r=0.57), 삼투 취약성(r=0.71) 및 형태 점수(r=0.59)와 상당한 상관성을 나타내었다. 용혈율은 ATP 수준과 매우 상관되며(r=0.83), 또한 RBC 유니트의 WBC 함량과도 상관되었다(r=0.83). RBC 순환 수명은 어떠한 생체 외 변수와도 현저한 상관성을 보이지 않았다.

연구 II

보관된 RBC의 카르니틴 흡수

AS-3 배지에서만 보관된 RBC는 보관 기간 전체를 통해 LC 함량의 임의의 현저한 손실을 나타내지 않았다(도 2). 이는 인간 적혈구 LC가 혈장이나 등삼투성 완충액과 자유롭게 교환되지 않음을 보이는 상기 쿠퍼(Cooper) 등에 의한 발견과 일치한다. 적혈구를 LC 보충된 AS-3에서 보관한 경우, AS-3 단독보다는 세포 내 LC가 보다 많은 양으로 검출되었다(도 2). LC 함량은 보관 기간동안 1차적으로 증가하여 42 일째에는 4 배 증가하였다.

보관된 RBC에서 막 착화 지질의 재 아실화 연구

카르니틴 없이는 PLC에 결합된 방사성 팔미테이트가 보관 시간에 따라 1차적으로 감소하였다(도 3). 이와 다르게, LC-함유 AS-3 용액에서 보관된 RCC 유니 트로부터의 적혈구는 초기 증가(3 주 째에 최저)에 이어서 PLC에 결합된 방사성 팔미테이트가 급속히 감소함을 나타내었다. 동일한 적혈구 제제에서, 막 인지질에의 방사성 팔미테이트의 결합을 또한 평가하였다. AS-3 용액에서만 보관된 혈액 유니트로부터의 적혈구의 막 PE에 대한 방사성 팔미테이트의 결합은 보관 기간 전체를 통해 PE로의 방사성이 일정하게 상당히 증가하였다(도 4). LC의 존재 하에서 보관된 적혈구는 6 주 째에 최저로 하여, 보관 기간의 끝을 향해 PE 재 아실화의 갑작스런 증가를 특징으로 하였다(도 4). 막 PC로의 방사성 팔미테이트 결합율은 보관 기간 전체를 통해 약간 감소하였으며, 상기 두 적혈구 제제 간에 차이는 관찰되지 않았다(도 4). 본 발명의 재 아실화 연구에서 적혈구를 글루코스를 함유하는 크렙스(Krebs) 링거 완충액 중에서 37 ℃에서 배양하였으므로, 배양의 끝에서 ATP 수준은 생리적인 값(도시 안됨)에 가까움이 지적되어야 한다.

논의

본 연구에서, 42 일의 보관 기간의 끝에서 RBC 유니트의 생체 외 및 생체 내 시험은 대조군-보관된 RBC에 대한 카르니틴-보관된 RBC 간의 현저한 차이를 입증하였다. 대사 및 막 보전을 반영하는 다양한 생체 외 RBC 성질들, 예를 들어 ATP 및 용혈율%뿐만 아니라 세포 생육성(24 시간 회수율% 및 순환 수명)의 직접적인 측정은 카르니틴-보관된 RBC에서 현저하게 우수하였다. 주입 후 24 시간째에 생존 RBC의 평균 순환 수명의 연장이 흥미를 끈다. 이러한 발견은 전례가 없는 뜻밖의 발견으로, 보관 중의 LC의 비 가역적인 흡수와 관련이 있을 수 있다. 다양한 RBC 성질들에 대한 대조군 연구에서 얻어진 값들은 예상된 것이었으며 선행 연구들과 다르지 않았다. 혈액 수거 시에, 시험과 대조군 간의 유니트 또는 RBC 특징들에 현저한 차이는 발견되지 않았다. 도 1 내지 3에 예시된 바와 같이, RBC ATP 수준, 용혈율% 및 순환 수명은 헌혈자와 강한 관련이 있으며, 연구는 상기 첫 번째 및 두 번째 경우 모두에 대해 수행된 5 개의 시험 및 5 개의 대조군 연구를 사용하여 랜덤하게 짝을 지은 계획안이었기 때문에, 관찰된 차이점들은 우연이나 어떠한 잘못된 연구 계획안으로 인한 것일 수는 없는 듯 하다. 따라서, 상기 연구에서 발견된 관찰된 차이점들은 거의 시험 유니트에 카르니틴을 첨가하여 발생한 것일 것이다. 증가된 수명이 Cr의 감소된 유출을 반영한다는 가능성을 배제할 수 없지만, 이는 생체 내 생육성과 상관되는 것으로 밝혀진 보관된 적혈구의 개선된 생체 외 측정치와 일치하지 않는다.

다수의 연구들은 LC 및 그의 아실-에스테르가 적혈구를 포함한 각종 세포에 대해 세포보호/막 안정화 효과를 가짐을 밝혔다. 예를 들어 문헌[Snyder et al., Arch. Biochem. Biophys. 276:132-138(1990)]을 참조하시오. 상기 연구에서, LC는 보관 기간 동안 RBC에 의해 비 가역적으로 흡수되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 과정의 성질이 전적으로 명확한 것은 아니지만, LC 흡수에 대한 특정 담체의 관여는 배제될 것이다. 알고 있는 바로는, 유일하게 알려진 LC 담체는 LC의 세포 내 농도가 세포 외 환경에 통상적으로 존재하는 것보다 수 배 높은 세포 시스템에서 작동한다. 적혈구 LC 농도는 혈장의 농도와 유사하다. 따라서, 저온, APT 고갈, 및 보관 기간 동안 발생하는 다른 가능한 대사적 변화들과 관계없이, 적혈구를 비교적 다량의 외래 LC를 함유하는 매질에서 보관하는 경우 상기 적 혈구에 의한 LC의 단일 방향 흡수가 이루어지는 듯 하다. 당해 분야의 어느 것도 이를 예견하는 것으로 보이지 않는다.

보관된 RBC에 대한 LC의 작용 특성을 막 구획에 대한 생물 물리학적 및/또는 대사적 중재로 볼 수 있다. 보관된 적혈구의 수혈 후 생존은 재 주입된 적혈구의 생체 내 생육성과 그의 표면 대 부피 비 측정치간의 중요한 상관관계에 의해 제시되는 바와 같이 막 기능의 보전과 관련된다. RBC 막 구조와 기능에 주요 기여인자는 RBC 막의 반내엽 바로 아래에 놓여있는 초분자 단백질 구조인 세포골격 망상조직으로 대표된다(Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol. 1:531-536(1985)). 울페(Wolfe) 등은 보관된 적혈구의 세포골격 막 단백질의 조성과 기능에 대한 조사 연구에서 유일한 관련 변화가 단백질 4.1의 존재 또는 부재 하에서 액틴과 결합하는 스펙트린 능력의 감소임을 밝혔다(Wolfe et al., J. Clin. Invest. 78:1681-1686(1986)). 본 발명자는 LC가 증가된 전단 응력에 지배되는 재 봉인된 고스트 함유 단백질 4.1의 RBC 막 변형성에 영향을 미침을 입증하였다(Arduini et al., Life Sci. 47:2395-2400(1990)). 따라서, LC는 하나 이상의 세포골격 성분들과의 스펙트린 상호작용을 통해 막의 안정화 효과를 발휘할 수 있다. 적혈구 스펙트린-액틴 상호작용에 대한 최근의 버터필드와 랭거채리(Butterfield and Rangachari, Life Sci. 52:297-303(1992))의 전자 상자성체 공명 연구는 LC가 스펙트린 상의 스핀-표지된 부위의 분절 움직임을 현저하게 감소시킴을 입증하였으며, 이는 상기 알뒤니(Arduini) 등의, 스펙트린과 액틴간의 상호작용 강화에 대한 LC의 개입에 대한 선행의 제안을 확증하는 것이다.

상술한 잠재적인 생물 물리학적 작용 이외에, LC-보관된 적혈구에서 관찰된 개선점은 또한 유리한 대사 과정의 결과일 수 있다. 통상적으로, 막 인지질의 탈 아실화-재 아실화 주기는 아실-CoA의 생성을 위해 ATP를 필요로 한다. 이어서 아실-CoA의 아실 잔기는 리소인지질 아실-CoA 트랜스퍼라제에 의해 리소인지질로 전달된다. 또한, 산화성 도전 중에, RBC 인지질의 막 보수 과정은 동일한 대사 경로를 따른다. 최근의 발견은 CPT가 지방산의 활성화 단계와 그의 리소인지질로의 전달 사이에 아실-CoA 풀의 크기를 조절함으로써 적혈구와 신경 세포의 막 인지질의 재 아실화 과정에 영향을 미침을 입증하였다(Arduini et al., J. Biol. Chem. 267:12673-12681(1992)). 또한, 펄스-추적 및 ATP 고갈 연구는 적혈구 아실카르니틴 풀이 ATP의 희생 없이 활성화된 아실 그룹의 저장소로서 작용함을 입증하였다(Arduini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:353-358(1994)).

AS-3에서만 보관된 적혈구의 막 PE 내로의 방사성 팔미테이트 결합의 향상은 장기간 보관(RBC ATP가 점진적으로 고갈됨)이 막 인지질의 재 아실화를 위한 아실화된 아실 유니트의 요구를 증가시킴을 시사한다(도 4). 처음 5 주의 보관 기간 동안, LC가 없는 AS-3에서 보존된 적혈구는 LC를 함유하는 AS-3에서 보관된 적혈구보다 더 많은 팔미테이트를 PE에 결합시키는 것으로 보인다(도 4). LC의 존재 하에서 보관된 적혈구는 보관 기간의 끝에서 보다 많은 팔미테이트를 PE에 결합시킬 수 있었다. 이러한 발견은 산화성 도전이 어쨌든 작용함을 시사할 수 있는데, 이는 산화체에 대한 적혈구의 노출이 막 PC는 아닌, 막 PE의 재 아실화 과 정을 강하게 자극하기 때문이다(Dise et al., Biochem. Biophys. Acta 859:69-78(1986)). 흥미 있게도, 처음 5 주의 보관 기간 동안 AS-3에서만 보존된 적혈구가 LC를 함유하는 AS-3에서 보관된 적혈구보다 많은 팔미테이트를 PE에 결합시키는 듯 하다(도 4). 이는 후자의 경우 CPT가 아실-CoA 이용에 대해 재 아실화 효소와 경쟁할 수도 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 개념과 일치되게 본 발명자는 재 아실화 공정에 대한 아실-CoA 요구가 가장 높은 보관 기간의 끝에서 훨씬 큰 차이가 관찰되어야 했으나, 그렇지가 않았다. LC와 함께 또는 상기 없이 보관된 적혈구는 보관 기간의 끝에서 유사한 결합률을 보였다(도 4). 또한, 본 발명자는 다양한 상이한 실험 조건 하에서 적혈구 CPT가 막 인지질의 재 아실화와 경쟁하지 않음을 입증하였다(Arudini et al., Life Chem. Rep. 12:49-54(1994)).

LC-보충된 적혈구에서 방사성 PLC의 형성은 LC 없이 보관된 적혈구에서 발견된 것보다 훨씬 크다(도 3). 또한, LC와 함께 보관된 적혈구에서 PLC 형성의 시간 경과는 보관 셋째 주에서 최하점을 갖는 흥미있는 종형 곡선을 나타내었다. 방사성 PLC 형성은 저온 장쇄 아실카르니틴의 풀 크기와 완전한 적혈구에서 CPT-매개된 아실 유출 방향을 반영한다. 비교적 높은 해당 활성과 APT 유용성을 갖는 처음 3 주의 보관 기간 동안, CPT는 LC의 존재 하에서 보관된 적혈구에서 아실 흐름을 아실카르니틴을 향해 구동시키는 것으로 보인다(도 5a). 보관 셋째 주 후에, LC가 제공하는 상기 흐름은 역전된다. 이러한 변화는 본질적으로 활성화된 아실-유니트를 완충시키는 CPT의 능력을 반영할 수 있다, 즉 재 아실화 과정에 대한 아실-CoA의 필요량 증가로 PLC의 생산이 적어지고(이와 역의 관계도 성립함), 이는 재 아실화 과정의 아실 유니트에 대한 요구 증가를 완충시키는데 CPT가 사용되는 기전을 나타낼 수 있다(도 5b).

보다 큰 24 시간 회수율%과 순환 수명은 효능(수혈자 시간 평균 수명에 이용할 수 있는 수혈된 순환 RBC의 양)의 측면에서 대략 15% 개선됨을 나타낸다. 이러한 효능의 증가는 탈라세미아 또는 골수 부족 환자와 같이 만성적인 수혈 환자에서 수혈 필요성의 임상적인 감소로 해석될 수 있다. 한편으로, 액체 보관된 RBC의 저장 수명을 연장시킬 수도 있다.

본 발명의 발견은 RBC 보관 기간 동안 보존 매질 중의 LC의 존재가 막 보수를 위한 인지질의 재 아실화에 의해 사용되는 ATP 풀에 대해 절약 작용을 할 수도 있음을 제시한다. 이러한 유리한 대사 과정은 가능한 이로운 생물 물리학적 작용과 연합하여 감소된 용혈, 보다 높은 ATP 수준, 및 LC-보관된 적혈구의 개선된 생체 내 회수 및 생존을 설명할 수 있다.

방사선 조사

전혈, RBC, RCC, PC 등을 포함한 혈액 제품의 오염 문제를 상당량의 방사선 조사에 의해 감소시킬 수 있다. 멸균에 필요한 조사 수준 및 미생물 작용제에 대한 실질적인 100% 치사율은 광범위하게 탐구되었다. 또한, 보다 중요하게는, 백혈구가 유사한 조사에 의해 파괴될 수도 있다. 감마선 조사(코발트 GG, 밴더그래프 가속), UV 조사, 적외선 조사 등을 포함한 각종 유형의 방사선 조사가 사용될 수 있다. 약 20 내지 50 cG 감마선 조사에 가까운 값이면 충분하다.

세계적으로, 매년 6 천만 내지 8 천만 유니트의 전혈이 수거되어 다양한 환 자 집단의 수혈 지원에 사용되고 있다. 개발도상국가들의 인구 1000 명 당 수거율은 보다 낮으며 대부분의 수혈은 산과와 소아과의 경우, 특히 말라리아 관련 빈혈증의 치료에 제공된다. 선진국에서는 인구 1000 명 당 수거율이 50 내지 10 배 더 높으며 대부분의 수혈은 수술(50%)이나 암 관련 빈혈증, 골수 이식, 비-악성 위장 출혈 환자들의 치료에 제공된다(도 1). 동종이형 혈액의 수혈과 관련되어 다수의 잠재적인 부작용들이 존재한다. 수혈과 불리하게 관련되는 하나의 특정한 합병증이 생육성 동종이형 면역세포에 의해 매개되는 합병증인 수혈 관련된 이식편 대 숙주 병(TA-GVHD)으로서 알려진, 희귀하면서 대개는 불치인 존재이다.

TA-GVHD 병은 2 가지 유형의 수혈 환자 집단에서 잠재적으로 나타나는 희귀한 수혈 합병증이다. TA-GVHD는 100%에 달하는 치사율을 가지며 현재 유일하게 효과적인 접근법은 예방이다. 첫 번째 환자 유형은 면역타협된 환자, 예를 들어 골수 또는 다른 기관 이식 후 환자, 호지킨병 또는 면역계의 유전적 결함을 갖는 환자이다. 두 번째 유형은 비 면역타협된 환자로, 헌혈자와 수혈자 간에 HLA 유사성이 존재하는 경우이다. 이는 일본이나 이스라엘과 같이 보다 제한된 HLA 다형성을 갖는 집단이나 가까운 친척들로부터 직접 수혈받는 경우 가장 흔하게 나타난다. 이 때문에, 생육성 면역세포의 복제 능력을 파괴하기 위해서 세포성 혈액 제품을 감마 선으로 대략 25 센티그레이(cG)의 중간 수준 용량으로 조사하는 것이 보편적으로 실시된다. TA-GVHD는 신선한, 즉 일반적으로 15 일 미만인 세포 제품과 관련됨을 알아야 한다. 그러나, 혈액의 “숙성”은 아직 이 합병증 의 예방에 승인되는 실행이 아니다. 면역세포가 동종이형 백혈구 집단의 일부이지만, 일반적으로 제 3 세대 필터에 의해 성취되는 백혈구 고갈 정도가 현재 상기 합병증의 예방에 적합한 것으로 간주되고 있지 않다. 따라서, 현재 감마선 조사가 유일하게 허용되는 예방학적 중재로 남아있다.

적혈구의 감마선 조사에 따른 어려움은 특히 세포막을 손상시킬 가능성이다. 상기 용량의 조사는 적혈구 ATP의 감소, 증가된 용혈 및 증가된 표면층 칼륨에 의해 생체 외에서 측정 시 대략 7 내지 8%의 효능 손실을 일으킴이 분명하다. 이러한 변화는 막 손상 효과와 일치한다. 이러한 생체 외 변화는 감마선 조사된 적혈구의 24 시간 회수율 감소와 관련된다. 혈소판 제품에 대해서, 하나이상의 간행물이 약간의 생육성 손실을 제시하였다.

상당한 증거에 의해 감마선 조사가 활성화된 산성 종들, 예를 들어 활성 산소, 하이드록시, 라디칼 및 과산화 음이온을 발생시킴으로써 그의 효과가 발휘됨이 지적되었다. 이러한 종들은 DNA에 대한 세포내 손상을 유발시키며, 따라서 TA-GVHD에 전제가 되는 세포 복제를 방지한다. 그러나, 이러한 동일한 산소 종들은 적혈구 및 가능하게는 혈소판 막 상의 막 지질을 산화시키며, 이는 세포 생성물의 특성(효능)을 감소시키는 막 손상을 유발시킬 수 있다.

LC는 미토콘드리아 막을 횡단하는 장쇄 지방산의 운반에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 장쇄 지방산의 운반을 위한 카르니틴 시스템에 장애가 있는 유전적 질환은 골격 근 기능에 현저한 손상을 발생시킨다. 최근에, 적혈구 막에서의 LC의 역할에 대한 관심이 증가하고 있다. 그러나, 놀라운 것은 적 혈구에 미토콘드리아가 부족하다는 것이며, 따라서 LC의 존재와 LC의 가역적인 아실화와 관련된 효소인 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제의 존재를 둘러싸고 상당한 호기심이 일고 있다. 처음에 이들이 적혈구 내에서 작용하는 역할은 불분명하였다. 적혈구는 생체 내에서 그의 긴 생활사 전체를 통해 산화체 압박을 받기 쉬울 수 있으며, LC와 관련된 산화된 막 지질의 보수는 적혈구의 정상적인 생존에 중요할 수 있다.

증가된 ATP 유용성의 시기 동안 아실화된 카르니틴의 초기 증가는 손상된 산화된 막 지질의 보수 기전에 후속적으로 사용될 수 있는 활성화된 지방산의 저장소로서 기능할 수 있다. 상기와 같은 설명은 상기 적혈구의 생체 외 보관 기간 동안 관찰된 감소된 용혈을 잘 설명하는 것이며, 또한 생체 내 회수 및 생존에서 관찰된 개선을 설명하는 것이다. LC 첨가의 순 효과는 약 17%의 효능 증가이다.

따라서, LC를 사용하여 방사선 조사에 의해 유발된 막 손상을 폐하거나 또는 예방할 수 있다. 이는 생체 외에서 산화된 막 지질을 보수하는 적혈구 중에 저장된 카르니틴의 능력을 통해 일어날 수 있다.

막 손상 및 용혈에 대한 혈액 제품(RCC, PC 등)의 감염성을 제한하기 위해서, 상기 혈액 제품을 먼저 0.25 내지 50 mM의 양으로 LC를 포함하는 용액에 현탁시켜, 밀봉된 생성물을 멸균을 목적으로 방사선 조사하고 후속적으로 수혈 후 연장된 저장 수명과 순환 반감기를 누릴 수 있을 정도로 충분한 세포막 보존 및 용혈 억제를 이룬다. 혈액 제품 현탁액을 밀봉한 후에 방사선 조사함으로 인해 보다 거의 정확하게 멸균되고 TA-GVHD를 도입시키지 않을 듯한 물질에 의해 현재의 생육성과 비슷한 생육성을 이룰 수 있다. 이와 관련하여 혈액 제품이란 용어는 전혈, 혈장, RCC, PC, 혼합물 등을 포함하는 것으로 광범위하게 해석됨을 강조한다.

I. 연장 보관된 혈소판 농축물에서 세균 증식을 억제하기 위한 L-카르니틴의 용도

배경: L-카르니틴(LC)은 연장(5 일 이상) 보관된 혈소판 농축물에서 해당작용을 감소시킨다(Sweeny et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27-July 2, 1998, in Vox Sanguinis, vol. 74, No. Suppl. 1, p. 1226; and Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998). 혈소판 농축물에서 세균 증식에 대한 LC의 효과는 LC가 첨가제로서 사용되는 경우를 평가하는데 중요하다.

연구 방법: 혈소판 풍부 혈장의 여과에 의해 생성된 동일한 2 개의 ABO 보관전-백혈구 감소된 혈소판 농축물(MedSep Corp. Covina, CA)을 모으고, 이어서 2 개의 CLX(등록상표)(MedSep) 백에 동등하게 분할하였다. 최종 농도 5 mM의 LC, 또는 염수(대조군)를 각 쌍 중 하나에 가하였다. 각각의 용기에 0 일 째에 응고 효소 음성 스타필로코커스 현탁액 1 ㎖을 1 내지 48 CFU/㎖의 최종 농도로 탔다. 각각의 용기로부터 3 일, 6 일, 및 7 일이나 8 일째에 샘플을 무균적으로 취하여 콜로니를 세었다. 데이터를 짝을 이룬 t 시험에 의해 분석하였다.

결과: 11 쌍의 농축물을 연구하였다. 얻은 결과를 하기 표에 나타낸다. 7/8일 까지 L-카르니틴 용기에서의 증식율은 대조군의 33%이었다.

결론: L-카르니틴은 5 mM에서 액체 보관된 혈소판 농축물에서의 응고효소 음성 스타필로코커스의 생육을 지연시킨다.

II. 보관전 백혈구 감소된 랜덤 혈소판의 연장된 보관 기간 동안 해당작용을 감소시키기 위한 L-카르니틴의 용도

배경: L-카르니틴은 5 내지 10 일 동안 보관된 표준(비-백혈구-감소된) 혈소판 농축물에서 해당작용을 감소시킨다(Sweeny et al., 25th Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27-July 2, 1998, in Vox Sanguinis, vol. 74, No. Suppl. 1, p. 1226; and Sweeny et al., The American Society of Hematology, 40th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998). 보관전 백혈구 감소된 랜덤한 공여 혈소판에 대한 유사 효과는 이전에 입증되지 않았다.

연구 계획안: 혈소판 풍부 혈장의 일렬 여과에 의해 생성된 동일한 2 개의 ABO 보관전-백혈구 감소된 혈소판 농축물(MedSep Inc., Corvina, CA)을 모으고, 이어서 2 개의 CLX(MedSep) 용기에 동등하게 분할하였다. L-카르니틴(최종 농도 5 mM) 또는 염수를 각 쌍의 혈소판 백 중 하나에 가하였다. 혈소판들을 평상형 교반기 상에서 22 ℃에서 7 일 또는 8 일간 보관한 다음 시험하였다. 수행된 시험은 pH, 혈소판 수, 표면층 글루코스 및 락테이트, 유식 세포 측정기에 의한 표면 p-셀렉틴 발현, 형상 변화의 정도(ESC) 및 저장성 쇼크 반응(HSR)이었다. 글루코스 소비 및 락테이트 생산을 mM/10¹² 혈소판/일로서 계산하였다. 데이터를 짝을 이룬 t-시험을 사용하여 분석하였다.

결과: 7 쌍의 혈소판 농축물을 연구하였다. 얻어진 결과를 하기 표에 나타낸다.

결론: L-카르니틴은 보관된 보관전 백혈구 감소된 랜덤한 공여 혈소판에서 해당작용을 감소시킨다.

본 특허 출원의 발명을 일반적인 용어와 특정한 실시예를 참고로 개시하였다. 통상적인 숙련가들은 독창적인 기능을 발휘하지 않고서도 변화를 수행할 것이다. 특히, 또 다른 안정화 조성물, 혈액 제품, 보존제, 억제제 등을 독창적인 기술의 발휘 없이 변형시킬 수 있다. 또한, 특정한 수준, 생육성 기간 및 순환 수명은 헌혈자 및 수혈자에 따라 다양할 것이다. 이러한 변화들은 다음에 나타내는 청구 범위의 상술에 의해 특정하게 제외되지 않는 한 본 발명의 범위 내에 있다.

Claims (56)

1. 전혈 또는 혈액 분획물에 L-카르니틴, L-카르니틴의 염, 알카노일 L-카르니틴, 알카노일 L-카르니틴의 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 가함을 포함하는, 상기 전혈 또는 혈액 분획물에서 세균 증식을 억제하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 혈액 분획물을 농축 적혈구, 농축 백혈구, 혈소판 농축물, 혈장 및 혈장 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 혈액 분획물이 농축 적혈구이고, 상기 농축 적혈구를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 혈액 분획물이 농축 백혈구이고, 상기 농축 백혈구를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 혈액 분획물이 혈소판 농축물이고, 상기 혈소판 농축물을 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
6. 제 2 항에 있어서, 혈액 분획물이 혈장 또는 혈장 유도체이고, 상기 혈장 또는 혈장 유도체를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 0.25 내지 50 mM의 농도로 포함시키는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 1 내지 30 mM의 농도로 포함시키는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 화합물이 L-카르니틴인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 화합물이 아세틸 L-카르니틴, 프로피오닐 L-카르니틴, 부티릴 L-카르니틴, 이소부틸 L-카르니틴, 발레릴 L-카르니틴 및 이소발레릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
11. 전혈, 또는 농축 적혈구, 농축 백혈구, 혈장 및 혈장 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 혈액 분획물에 L-카르니틴, L-카르니틴의 염, 알카노일 L-카르니틴, 알카노일 L-카르니틴의 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 가함을 포함하는, 상기 전혈 또는 혈액 분획물에서 해당작용을 감소시키는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 혈액 분획물이 농축 적혈구이고, 상기 농축 적혈구를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 혈액 분획물이 농축 백혈구이고, 상기 농축 백혈구를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
14. 제 11 항에 있어서, 혈액 분획물이 혈장 또는 혈장 유도체이고, 상기 혈장 또는 혈장 유도체를 화합물을 포함하는 지지 용액에 현탁시킴을 포함하는 방법.
15. 제 11 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 0.25 내지 50 mM의 농도로 포함시키는 방법.
16. 제 11 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 1 내지 30 mM의 농도로 포함시키는 방법.
17. 제 11 항에 있어서, 화합물이 L-카르니틴인 방법.
18. 제 11 항에 있어서, 화합물이 아세틸 L-카르니틴, 프로피오닐 L-카르니틴, 부티릴 L-카르니틴, 이소부틸 L-카르니틴, 발레릴 L-카르니틴 및 이소발레릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
19. 보관전-백혈구-감소된 랜덤 공여 혈소판 농축물을, L-카르니틴 및 L-카르니틴의 염들로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 포함하는 지지 용액에 포함하는, 상기 보관전-백혈구-감소된 랜덤 공여 혈소판 농축물에서 해당작용을 감소시키는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 0.25 내지 50 mM의 농도로 포함시키는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 화합물을 지지 용액에 1 내지 30 mM의 농도로 포함시키는 방법.
22. 제 19 항에 있어서, 화합물이 L-카르니틴이고 상기 화합물을 지지 용액 중에 0.25 내지 50 mM의 농도로 포함하는 방법.
23. 제 19 항에 있어서, 화합물이 아세틸 L-카르니틴, 프로피오닐 L-카르니틴, 부티릴 L-카르니틴, 이소부티릴 L-카르니틴, 발레릴 L-카르니틴 및 이소발레릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
24. 제 19 항에 있어서, 화합물이 아세틸 L-카르니틴, 프로피오닐 L-카르니틴, 부티릴 L-카르니틴, 이소부티릴 L-카르니틴, 발레릴 L-카르니틴 및 이소발레릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 상기 화합물을 지지 용액 중에 0.25 내지 50 mM의 농도로 포함하는 방법.
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