SK16632001A3

SK16632001A3 - Zlepšené uskladnenie a zachovanie krvných výrobkov vrátane červených krviniek a krvných doštičiek

Info

Publication number: SK16632001A3
Application number: SK1663-2001A
Authority: SK
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S. P. A.
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2002-04-04
Also published as: HUP0201465A2; CZ301803B6; DK1187530T3; US6403124B1; AU774252B2; US7851142B2; CZ20014078A3; CA2374140A1; SK287562B6; MXPA01012645A; US20040146846A1; KR20020008412A; IL146517A; HUP0201465A3; US20020102529A1; HK1044099B; PL200250B1; EP1187530A1; KR100713140B1; IL146517A0

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu zlepšenia stability počas skladovania, vrátane odolnosti voči hemolýze, a zlepšenej životaschopnosti krvných výrobkov vrátane zhluknutých červených krviniek (RBC), krvných doštičiek a podobne. Spôsob sa týka predovšetkým predĺženia životaschopnosti týchto výrobkov, rovnako ako aj ich odolnosti voči látkam spôsobujúcich poškodenie membrán, napríklad ožiarení, dosiahne sa to uskladnením výrobkov v suspenzii obsahujúcej účinné množstvo L-karnitínu alebo alkanoyl karnitínu. Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobu potlačenia rastu baktérií v celej krvi a krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek (WBC), koncentrátov krvných doštičiek, plazmy a derivátov plazmy, ktoré sú skladované počas dlhého obdobia. Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu zníženia glykolýzy v celej krvi a v krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a v krvných derivátoch, ktoré sú skladované počas dlhého obdobia.

Súčasný stav techniky

Problém sa týka národných i svetových krvných zásob. Významnou sa stáva otázka integrity a spoľahlivosti existujúcich zásob, rovnako aj možnosti vytvárať väčšie zásoby pre dlhší čas. Jedným z dôvodov je relatívne krátka doba skladovania krvných výrobkov. Zhluknuté červené krvinky (koncentráty červených krviniek, RCC), ktoré predstavujú hlavnú formu krvných výrobkov pre transfúzie a podobne, môžu byť skladované len 42 dní. Po tomto čase podstatne klesajú hladiny ATP, nastáva pokles hodnoty pH, čo výrazne indikuje stratu životaschopnosti, alebo, v prípade životaschopnosti, po infúzii in vivo velmi krátku životnosť v cirkulácii. Celá krv sa neuskladňuje dlhodobo. Krvné doštičky sa bežne skladujú ešte kratšie, štandardne 5 dní pri teplote 22 °C. Rozdiel v stabilite počas skladovania koncentrátov krvných doštičiek je v kontraste s koncentrátom červených krviniek z dôvodu prebiehajúcich metabolických reakcií v krvných doštičkách, čiastočne pre prítomnosť mitochondrií v koncentrátoch krvných doštičiek, a ich neprítomnosť v koncentrátoch červených krviniek. Hoci oba krvné produkty vykazujú pokles ATP spolu s poklesom hodnoty pH a tvorbu kyseliny mliečnej v závislosti na dĺžke skladovania, prítomnosť mitochondrií v koncentráte krvných doštičiek pravdepodobne vyvoláva tento problém v dôsledku glykolýzy.

Narástli problémy týkajúce sa spoľahlivosti a integrity krvných zásob, ktoré sa týkajú predovšetkým opakovane zistených bakteriálnych kontaminácii, alebo iných mikrobiálnych kontaminácií krvných zásob. Takýto stav je ešte horší v krajinách bez moderných spôsobov odberu a skladovania. Hoci pre zníženie kontaminácie je možné pridať látky, tieto nie sú želateľné, nakoľko pri transfúzii sa dostávajú do tela pacienta. Jednou želateľnou alternatívou je ožiarenie výrobkov po ich zabalení, typicky do plastikového vinylového obalu. Takéto ožiarenie zhorší vlastnosti koncentrátu červených krviniek a koncentrátu krvných doštičiek v zmysle zníženia funkcie týchto krvných buniek.

r r *· e r P ľ“ ŕ f p f * r r ; : : ' ; s

Okrem toho existuje malá, ale narastajúca skupina populácie, u ktorej sa môže po transfúzii vyvinúť riziko všeobecne smrtelného stavu známeho ako potransfúzna reakcia „štep proti príjemcovi (TA-GVHD), spôsobené prítomnosťou živých alogénnych leukocytov. Tento syndróm sa zvyčajne vyvinie u pacienta s imunosupresiou, akou je rakovina a u pacientov s transplantovanou kostnou dreňou, ale môže sa vyvinúť tiež u ľudí s neporušenou imunitou ale s obmedzeným HLA polymorfizmom.

Veľká pozornosť sa venovala hľadaniu spôsobui pre zlepšenie stability počas skladovania. Jeden takýto spôsob týkajúci sa predĺženia životnosti počas skladovania koncentrátov krvných doštičiek je uvedený v U.S. patente 5,466,573. Tento patent sa týka preparátov koncentrátov krvných doštičiek so zdrojom octanových iónov, ktoré pôsobia ako substrát pre oxidačnú fosforyláciu a súčasne ako pufer pre úpravu zníženého pH spôsobeného tvorbou kyseliny mliečnej. Tento spôsob priamo neovplyvňuje hemolýzu a poškodenie membrány. Iný spôsob je popísaný v U.S. patente 5,496,821. V tomto patente je celá' krv skladovaná s prípravkom L-karnitínu (LC) alebo s jeho alkanoyl derivátmi. Patent však nepopisuje účinky na krvné produkty ako sú koncentráty krvných doštičiek alebo koncentráty červených krviniek a týka do určitej miery pôsobenia L-karnitínu na vlastnosti plazmy.

Ako je uvedené vyššie, mikrobiálna kontaminácia krvných zásob predstavuje ďalší problém, ktorému musí čeliť lekárska komunita. Jeden spôsob sterilizácie výrobku a zlepšenia spoľahlivosti v zmysle kontaminácie, je ožiarenie krvného výrobku. Všeobecne je vhodné gama ožiarenie 25 centigray (cG) , ožarujú sa výrobky po zatavení v plastickom obale, skle, alebo inom materiále. Ožiarenie však spôsobuje lézie v bunkových membránach a hemolýzu červených krviniek. Nevyriešeným problémom zostáva ožiarenie krvných výrobkov, vrátane celej krvi, zhluknutých červených krviniek a krvných doštičiek.

Okrem toho, doposiaľ nebol zaznamenaný účinok L-karnitínu na rast baktérií v krvných výrobkoch ako sú celá krv, koncentráty červených krviniek a koncentráty krvných doštičiek. Rovnako doposiaľ nebol zaznamenaný účinok L-karnitínu na glykolýzu v krvných výrobkoch ako sú celá krv, koncentráty červených krviniek a koncentráty krvných doštičiek.

Podstata vynálezu

Pre odborníkov je cielom poskytnúť spôsob predĺženia času životaschopnosti a obehového polčasu červených krviniek a krvných doštičiek po transfúzii, voči bežným maximálnym hodnotám.

Ďalším cielom pre odborníkov je nájsť spôsob, ktorým môžu byť ožiarením sterilizované krvné výrobky, vrátane celej krvi, zhluknutých červených krviniek a krvných doštičiek, bez toho, aby nastalo poškodenie a lézie membrán a hemolýza.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi, ktorá je skladovaná dlhší čas.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v krvných frakciách.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v krvných frakciách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých červených krvinkách.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých červených krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

* - f r .· r * f r r r r

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých bielych krvinkách.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v zhluknutých bielych krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v plazme alebo derivátoch plazmy.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob potlačenia rastu baktérií v plazme alebo derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v celej krvi.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v celej krvi, ktorá je skladovaná dlhší čas.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných frakciách.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných frakciách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých červených krvinkách.

Iným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v červených krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých bielych krvinkách.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v zhluknutých bielych krvinkách, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v koncentrátoch krvných doštičiek.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v koncentrátoch krvných doštičiek, ktoré sú skladované dlhší čas.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných doštičkách s redukciou leukocytov pred uskladnením.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v krvných doštičkách so zníženými leukocytmi pred uskladnením, ktoré sú skladované dlhší čas.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v plazme alebo derivátoch plazmy.

Iným cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob zníženia glykolýzy v plazme alebo derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Tieto a iné ciele, ktoré budú zjavné počas nasledujúceho podrobného popisu, sa dosiahli zistením vynálezcu, ako výsledok intenzívneho skúmania, že poškodenie membrány červených krviniek a krvných doštičiek pri skladovaní, alebo ako následok ožiarenia, môže byť podstatne oddialený a potlačený tým, že krvný produkt je suspendovaný v bežnom konzervačnom roztoku, ako AS-3, kde konzervačný roztok ďalej obsahuje Lkarnitín alebo jeho alkanoyl derivát, v koncentrácii 0,25 až 50 mM, alebo vyššej. Objav je založený na poznaní, že väčšina rozkladov krvných produktov, bežne spojená s poklesom hladín ATP a hodnoty pH, môže byť v skutočnosti označená ako poškodenie membrány a hemolýza. Intenzívnym výskumom sa zistilo, že zachovanie membrány a jej oprava môže byť účinná cez r r reacyláciu lipidov, čiastočne pôsobením L-karnitínu, ktorého nereverzibilné vychytávanie je prítomné v červených krvinkách a podobných krvných produktoch. Predkladatel tiež zistil, že L-karnitín potláča rast baktérií v celej krvi a v krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas. Predkladatel ďalej zistil, že L-karnitín znižuje glykolýzu v celej krvi a krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, zvlášť v krvných doštičkách s redukovanými leukocytmi pred skladovaním, a derivátoch plazmy, ktoré sú skladované dlhší čas.

Krátky popis obrázkov

Obrázok 1: Životnosť po infúzii 42 dní skladovaných červených krviniek v štandarných podmienkach (kontrola) a po uskladnení v prítomnosti L-karnitínu. Šípky označujú hodnoty priemeru ± SD pre kontrolné červené krvinky a červené krvinky skladované v prítomnosti L-karnitínu. Hore na grafe'sú zaznamenané presné, vypočítané hodnoty p.

Obrázok 2: Obsah karnitínu v červených krvinkách v rôznych týždňoch skladovania krvi. Karnitín bol stanovený tak, ako je popísané v časti Materiál a metódy. Hodnoty sú priemerom z troch pokusov uskutočnených v duplikátoch. Odchýlka medzi pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú zmeny pre červené krvinky skladované so samotným AS3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované v AS-3 plus L-karnitín (5 mM) .

Obrázok 3: Inkorporácia rádioaktívnej kyseliny palmitovej do červených krviniek L-karnitínu počas týždňov skladovania krvi. Časť červených krviniek z krvi skladovanej v AS-3 alebo v AS-3 plus L-karnitín bola inkubovaná pri 37 °C s (1¹⁴C) kyselinou palmitovou, ktorá bola naviazaná na BSA bez mastných kyselín. Na konci inkubácie boli červené krvinky spracované tak, ako je popísané v časti Materiál a metódy. Tvorba rádioaktívneho PLC bola hodnotená ako obsah fosforu prítomného v extrakte lipidov. Hodnoty sú priemernou hodnotou z troch pokusov, ktoré boli uskutočnené v duplikátoch. Odchýlka medzi pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované so samotným AS-3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky skladované v AS-3 plus L-karnitín (5 mM).

Obr. 4: Inkorporácia rádioaktívnej kyseliny palmitovej do fosfatidyletanolamínu (PE) a fosfatidylcholínu (PC) v membránach červených krviniek v rôznych týždňoch skladovania krvi. Časť červených krviniek z krvi skladovanej v AS-3 alebo v AS-3 plus L-karnitín bola inkubovaná pri 37 °C s (1-¹⁴C) kyselinou palmitovou naviazanou na BSA bez mastných kyselín. Na konci inkubácie boli červené krvinky spracované tak, ako je popísané v časti Materiál a metódy. Výsledky sú vyjadrené ako pmol (1- ¹⁴C) kyseliny palmitovej/pg lipidického fosforu prítomného v lipidickom extrakte. Hodnoty sú priemerom troch pokusov uskutočnených v duplikátoch. Odchýlka medzi pokusmi nebola vyššia ako 7 %. Otvorené symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky uskladnené so samotným AS-3; plné symboly zaznamenávajú hodnoty pre červené krvinky uskladnené v AS-3 plus L-karnitín (5 mM).

Obr. 5: Karnitínový systém a reakcia reacylácie membránových fosfolipidov. Tenšie šípky zaznamenávajú prednostný tok acylu. Plocha acylkarnitínového symbolu ukazuje pravdepodobnú veľkosť zásoby. Použité sú skratky: LPL - lyzofosfolipidy; PLP - fosfolipidy; Cn - karnitín; acyl-Cn - acylkarnitín; ACS - acyl-CoA syntetáza; LAT - lyzofosfolipid acyl Co A transferáza; CPT - karnitín palmytoyltransferáza.

* C ·· r - r p r r f r t r Podrobný popis vynálezu

Tento vynález používa L-karnitín a jeho alkanoyl deriváty, ako látku podporujúcu celistvosť bunkovej membrány a pre potlačenie hemolýzy v krvných výrobkoch. Tento vynález tiež poskytuje spôsob potlačenia rastu baktérií v celej krvi a krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátov krvných doštičiek, v plazme a v derivátoch plazmy. Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob pre zníženie glykolýzy v celej krvi a krvných frakciách, vrátane zhluknutých červených krviniek, zhluknutých bielych krviniek, v koncentrátoch krvných doštičiek, v plazme a v krvných derivátoch.

Vhodné alkanoyl L-karnitíny sú C₂-s-alkanoyl L-karnitíny a výhodne sú to alkanoyl L-karnitíny ako acetyl, butyryl, izobutyryl, valeryl, izovaleryl a predovšetkým propionyl Lkarnitín. Používame tu generickú rodinu označovanú ako Lkarnitíny, avšak namiesto L-karnitínu a jeho farmakologicky prijateľných solí môžu byť použité alkanoyl L-karnitíny.

Vhodné soli L-karnitínu sú, napríklad, L-karnitín chlorid, L-karnitín bromid, L-karnitín orotát, L-karnitín kyseliny asparátovej, L-karnitín kyseliny fosforečnej, L-karnitín fumarát, L-karnitín laktát, L-karnitín maleát, L-karnitín kyseliny maleinovej, L-karnitín kyseliny šťavelovej, L-karnitín kyseliny sírovej, L-karnitín glukózo fosfát, L-karnitín vínanu, L-karnitín kyseliny vínnej a L-karnitín kyseliny slížovej.

Vhodné soli alkanoyl L-karnitínu sú, napríklad, C₂_8-alkanoyl L-karnitín chloridy, C₂-8-alkanoyl L-karnitín bromidy, C₂-8-alkanoyl L-karnitin orotáty, C₂-8-alkanoyl L-karnitíny kyseliny asparátovej, C₂-8~alkanoyl L-karnitín fosforečnany, C₂-8-alkanoyl L-karnitín fumaráty, C₂-e-alkanoyl L-karnitín mliečnany, C₂_₈-alkanoyl L-karnitín maleinany, C₂__B-alkanoyl Lkarnitín šťavelany, C₂_₈-alkanoyl L-karnitín sírany, C₂_₈-alkanoyl L-karnitín glukózo fosforečnanov, C₂_8-alkanoyl L-karnitíny kyseliny vínnej, C₂_₈-alkanoyl L-karnitín vínany a C₂.₈alkanoyl L-karnitíny sliznanov.

Pridanie L-karnitínu k celej krvi alebo krvným frakciám, vrátane červených krviniek, bielych krviniek, krvných doštičiek, plazmy a derivátov plazmy, si vyžaduje prítomnosť Lkarnitínu v množstve účinnom pre zachovanie celistvosti membrány, pre potlačenie hemolýzy a/alebo pre potlačenie rastu baktérií a/alebo prezníženie glykolýzy. Výskum, vrátane príkladov uvedených ďalej, ukázal, že minimálny účinný rozsah vo výrobkoch od väčšiny darcov je 0,25 mM až 0,5 mM. Horný limit je viac praktický ako fyziologický. Koncentrácie vyššie ako 50 mM sú dobre tolerované. Toxikologické a osmologické hodnoty sú prijateľné. Výhodné rozsahy sú 1 až 30 mM. Rozsah 1 až 10 mM a viac je výhodnejší v rozsahu 4 až 6 mM. Účinky predkladaného vynálezu, vrátane predĺženia životaschopnosti, a predĺženia cirkulačného polčasu po transfúzii, môže byť závislý na darcovi. Všeobecne, účinná koncentrácia L-karnitínu je 0,5 až 50 mM, avšak odborníci môžu požadovať rozšírenie tohoto rozsahu v oboch smeroch, v závislosti od jednotlivých darcov. Takéto rozšírenie si však nevyžaduje vynálezecký krok.

L-karnitín je konzistentný v podporných roztokoch (stabilizačné roztoky), ktoré majú pufrovací účinok. Bežne sa používajú roztoky ako ACED (kyselina citrónová-citran sodnýdextróza), CPD (citrát-fosforečnan-dextróza) a ich modifikácie, vrátane CPD2/A-3 a podobné zmesi. Typicky zmesi obsahujú uhľovodík, ako je glukóza alebo manitol, a najmenej jednu fosforečnanovú soľ, a prípadne iné soli. L-karnitín je bežne rozpustný a môže byť pridaný k týmto zmesiam v rozsahu požadovaných koncentrácií. Vhodné roztoky sú popísané v U.S. patente 5,496,821, ktorý je tu zahrnutý v literárnych odkazoch. Treba poznamenať, že iné podporné roztoky, ako sa bežne používajú, vrátane umelej plazmy a iných fyziologicky prijateľných roztokov, môžu byť použité spolu s L-karnitínom, podlá vynálezu. Dôležitou zložkou podporného roztoku je Lkarnitín.

Schopnosť L-karnitínu, po pridaní k celej krvi alebo k suspenzii krvných frakcií, ako sú červené krvinky, biele krvinky a krvné doštičky, plazma a deriváty plazmy, predlžuje čas životnosti počas skladovania a cirkulačný čas po transfúzii príjemcovi, čo je nasledovne doložené v in vitro a in vivo pokusoch. V pokusoch bol použitý L-karnitín, môžu sa však používať aj alkanoyl L-karnitíny. Zvlášť významný je dôkaz uvedený nižšie, o zlepšenom účinku v zmysle zlepšeného zachovania (vrátane opravy) bunkovej membrány a potlačenia hemolýzy.

Materiál a metódy

Štúdia I:

In vivo a in vitro hodnotenie kvality červených krviniek skladovaných s- a bez- L-karnitínu

Subjekty - Populáciu subjektov tvorili muži alebo ženy vo veku 18 až 65 rokov bez známych mentálnych alebo fyzických porúch, bez užívania liekov, ktoré môžu pôsobiť na životaschopnosť červených krviniek. Jednotlivci spĺňali konvenčné kritéria pre alogénnych darcov podľa Kódexu Federálneho registra, Kapitola 2, Štandardy americkej asociácie krvných bánk, a Príkazov amerického národného červeného kríža pre krvné služby. Štúdia bola schválená Komisiou lekárskej fakulty Hampton Roads a jednotlivci vyjadrili súhlas s účasťou v štúdii.

Každý darca daroval krv dvakrát, druhý odber bol po 72 dňoch od prvého odberu. Pri prvom darovaní boli odbery z ramena randomizované buď ako skúšobné alebo kontrolné vzorky. Systém skladovania krvi - Bol použitý štandardný CP2D/AS-3 systém (Miles, Inc.) s použitím polyvinyl chloridového plastu (PVC) s dietyl-(n)hexyl-ftalátom (DEHP) ako zmäkčovadla. Do každej testovanej jednotky obsahujúcej AS-3 adičný roztok bolo pridaných 245 mg L-karnitínu (v 1,1 ml čistom, apyrogénnom roztoku do sterilnej sklenenej flaše), výsledná koncentrácia L-karnitínu bola 5 mM. Do kontrolných jednotiek obsahujúcich AS-3 roztok bolo za rovnakých podmienok pridaných 1,1 ml 0,9 % NaCl. Pridanie L-karnitínu alebo soľného roztoku sa uskutočnilo injekčné pomocou striekačky. Toto pridanie sa uskutočnilo v laminárnom boxe a pri UV ožiarení. Odber a spracovanie - Použila sa štandardná flebotómia a odber približne 450 ± 50 ml celej krvi. Celá krv bola pred spracovaním uskladnená počas 4 až 8 hodín pri izbovej teplote. Potom bola krv centrifugovaná za štandardných podmienok, po centrifugovaní bol supernatant plazmy odsatý a sediment zhluknutých červených krviniek bol resuspendovaný buď v štandardnom AS-3 roztoku (kontrola), alebo v AS-3 roztoku s obsahom L-karnitínu (skúška). Suspendované jednotky červených krviniek boli skladované pri teplote 4 °C počas 42 dní. In vivo merania - Merania sa uskutočnili pred (deň 0) a po 42 dňoch skladovania vzoriek. Hodnotil sa obsah ATP v červených krvinkách; celkový hemoglobín a hemoglobín v supernatante; hematokrit (Het); počet červených krviniek, bielych krviniek a krvných doštičiek; osmotické vlastnosti červených krviniek; morfológia červených krviniek; hladiny laktátu a glukózy; koncentrácia draslíka v supernatante. Tieto analýzy boli uskutočnené podlá štandardných postupov popísaných v minulosti, Heaton a spol., Vox Sang 57: 37 - 42, (1989).

In vivo merania po transfúzii - Po 42 dňoch skladovania bola odobratá vzorka a skladované bunky boli označené Cr štandardnou metódou. Súčasne pre stanovenie hmotnosti červených krviniek, bola odobratá krv darcu a červené krvinky boli označené s 99 Tc. Po označení bolo zmiešaných 15 pCi ⁵¹Croznačených skladovaných buniek s 15 pCi ⁹⁹Tc-označenými čerstvými bunkami a tieto boli zmiešané a infundované. Po infúzii boli odoberané vzorky krvi (5 ml) v rôznych časových intervaloch až do 35 dní, čo umožnilo vypočítať 24-hodinové % recovery a prežívanie. 24-hodinové % recovery bolo stanovené buď metódou jedného značenia, keď sa použila metóda loglineárnej regresie rádioaktivity vzoriek odobratých v 5, 7,5, 10 a 15 minuté, čím sa určila hodnota pre čas 0. Metóda dvojitého značenia hodnotí hmotnosť červených krviniek darcu meraním Tc.

Životnosť infundovanýh a prežívajúcich Cr-označených červených krviniek krvnom obehu bola stanovená odobratím vzoriek krvi po 24 hodinách a potom dvakrát týždenne počas 5 týždňov. Hodnoty rádioaktivity boli upravené pre konštantný 1 % pokles denne. Hodnoty boli vynesené do lineárnej krivky, kde os x zaznamenávala dni po transfúzii a na osi y boli hodnoty upravených Cr impulzov. Životnosť červených krviniek predstavoval priesečník krivky s osou x.

Štatistická analýza - Hodnoty boli spracované párovým t-testom, alebo bežnou neparametrickou štatistickou analýzou. Hodnotenie in vitro a in vivo skúšok malo poukázať na prítomnosť štatisticky významných rozdielov v priemeroch medzi kontrolami a testovanými skupinami. Štatisticky prierazný rozdiel bol vyjadrený hodnotou p nižšou ako 0,05.

ŕ P

Štúdia II:

Vychytávanie L-karnitínu červenými krvinkami a štúdie reacylácie lipidov pri skladovaní do 42 dní

Chemikálie - Hovädzí sérový albumín (BSA) bez esenciálnych mastných kyselín bol od SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo (USA). [ 1-¹⁴C] kyselina palmitová (58 Ci/mol) bola z New England Nuclear Corporation, Boston, Mass. (USA). Platne s tenkou vrstvou Whatman LK6 (silika gél) (20 x 20 cm) s preabsorbčnou vrstvou bola od Carlo Erba, Miláno (Taliansko). Palmitoyl-L-karnitín (PLC) a L-karnitín boli darom od Sigma Tau, Pomezia (Taliansko). Všetky ostatné chemikálie boli čistej kvality.

Stanovenie karnitínn v červených krvinkách - Z uskladnených jednotiek koncentrátu červených krviniek boli odobraté vzorky, ktoré boli jedenkrát premyté 4 objemami studeného roztoku 0,9 % NaCi. Červené krvinky boli potom resuspendované v 0,9 % roztoku NaCi, výsledný hematokrit bol 50 %, a pridaním kyseliny perchlórovej boli bunky deproteinizované tak, ako je popísané v Cooper a spol., Biochem. Biophys. Acta 959: 100- 105 (1988). Vo výslednom extrakte bol analyzovaný obsah voľného L-karnitínu podľa radiochemickej metódy autorov Pace a spol., Clin. Chem. 24: 32-35 (1978).

Analýza reacylácie lipidových komplexov v membránach skladovaných červených krviniek - Z koncentrátov skladovaných červených krviniek boli odobraté vzorky, a tieto boli okamžite spracované. Analýza sa uskutočnila v laminárnom boxe pod UV žiarením a pri teplote 0 až 5 °C. Červené krvinky boli premyté dvakrát so 4 objemami studeného roztoku 0,9 % NaCi. Izolované červené krvinky boli ešte raz premyté inkubačným pufrom (NaCi 120 mM, KC1 5 mM, MgSO₄ 1 mM, NaH2PO₄ 1 mM, sacharóza 40 mM, glukóza 5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH = 7,4) a resuspendované v rovnakom pufri tak, aby výsledný hematokrit

Γ f f · r r

	15	r r »· p p , * *· P P r r r r p I , • r - i
bol 5 %.	Pre inkubácie sa použil	kúpeľ	1 s teplotou 37 °C a
rotačným	pohybom. Červené 'krvinky	boli	inkubované s rádio-

aktívne označenou kyselinou palmitovou (10 μΜ) naviazanou na BSA bez mastných kyselín (1,65 mg/ml). Inkubácia bola ukončená pridaním chladného inkubačného média, potom boli bunky premyté trikrát inkubačným médiom s 1 % BSA a nakoniec opäť s inkubačným roztokom. Lipidy červených krviniek boli extrahované z intaktných buniek postupom podlá Rose, a Oaklander, J. Lipid Res. 6: 428-431 (1965). Pre zabránenie oxidácie lipidov bol do lipidických extraktov pridaný 0,1 % butylovaný hydroxytoluén. Lipidický extrakt bol analyzovaný na obsah fosforu dvojrozmernou tenkovrstvovou chromatografiou. Chromatogramy boli rozdelené v prvom smere pomocou zmesi chloroform-metanol-28 % amoniak (65:25:5). Pri rozdelení v druhom smere bola použitá zmes chloroform-acetón-metanol-kyselina octová-voda (6:8:2:2:1). Fosfatidylcholín (PC), fosfatidyletanolamín (PE) a fosfatidylserín (PS)boli zviditeľnené krátkou expozíciou platní jódom a tieto boli identifikované pomocou štandardných vzoriek. Jednotlivé fosfolipidové škvrny boli vyškrabané do nádobiek obsahujúcich scintilačný roztok a bola meraná rádioaktivita. Identifikácia a analýza rádioaktívnych palmitoyl L-karnitínov (PLC) bola uskutočnená podľa nedávno publikovanej metódy autorov Arduini a spol., J. Biol. Chem. 267: 12673-81 (1992). Pri meraní rádioaktivity bola použitá externá štandarda. Pri výpočte sa použila hodnota špecifickej aktivity rádioaktívnej kyseliny palmitovej.

VÝSLEDKY

Štúdia I

Vlastnosti koncentrátu červených krviniek pred uskladnením v AS-3

Po spracovaní celej krvi boli vlastnosti koncentrátov červených krviniek podľa očakávania. Nepozorovali sa žiadne významné rozdiely medzi jednotkami pre kontrolné a testované vzorky v objeme, Het, v obsahu bielych krviniek a in vivo vlastnostiach červených krviniek, ako je obsah ATP, obsah hemoglobínu v supernatante, koncentrácia draslíka, osmotická fragilita (Tabulka I).

Tabulka I: Vlastnosti koncentrátu červených krviniek pred uskladnením

	KONTROLY	L-KARNITÍN
Objem (ml)	305 ± 38	295 + 41
Hematokrit (%)	60 ± 3	60 ± 3
Biele krvinky (x 10⁹)	2,6 ± 1,1	2,4 ± 1,1
ATP (pmol/g Hb)	4,6 ± 0,2	4,3 ± 0,4
Hb v supernatante (mg/dl)	34 ± 15	26 ± 8
K+ v supernatante (mEkq/1)	2,3 ± 0,2	2,2 ± 0,3
Osmotická fragilita (%)	50 + 4	49 ± 4

Vlastnosti červených krviniek po 42 dňovom skladovaní Metabolické štúdie - Množstvo zmetabolizovanej glukózy a vytvoreného laktátu počas 42 dní skladovania bolo rovnaké v kontrolných a aj v testovaných jednotkách (Tabulka 2) . Podľa očakávania sa zistila významná obrátená korelácia medzi týmito dvoma hodnotami glykolýzy (r=0,76). Avšak nižšia hemolýza a vyššie koncentrácie ATP boli zistené v koncentrátoch červených krviniek skladovaných v prítomnosti karnitínu ako u kontrolných jednotiek. Ako ukazuje Obrázok 1, takáto vyššia hodnota ATP sa pozorovala u všetkých testovaných vzoriek s výnimkou jednej vzorky (p<0,01).

e f c r r a p p pre p r p p p p r p r

	Kontrola	L-karnitín
in vitro hodnoty	208 ± 33	193 ± 40
glukóza (mg/dl)	201 ± 27	199 ± 37
laktát (mg/dl)	6,33 ± 0,03	6,32 ± 0,04
pH	3,01 ± 0,42	3,24 ± 0,38*
ATP (pmol/g Hb)	0,47 ± 0,41	0,30 ± 0,22*
hemolýza (%)	61 ± 4	60 ± 3
supernatant K⁺ (mEkv/1)	51 ± 3	50 ± 4
osmotická fragilita (%)	69 ± 8	68 ± 15
morfológia
in vivo hodnoty
24 h % recovery (jedno značenie)	81,1 ± 6,2	84,0 ± 4,4
24 h % recovery (dvojité značenie)	80,1 ± 6,0	83,9 ± 5,0*
hmotnosť červených krviniek (ml)	1634 ± 510	1591 ± 534
prežívanie (dni)	85,9 ± 14,3	96,1 ± 11,2*

*(p<0,05)

Membrány - Na konci skladovania bolo percento hemolýzy nižšie v jednotkách s prítomným karnitínom, tak ako ukazuje Obrázok 2. Na druhej strane sa však nezistili významné rozdiely v koncentrácii draslíka v supernatante, v osmotickej odpovedi na šok a v morfológii, ktorých hodnoty boli na konci 42 dňového skladovania v očakávanom rozsahu.

Životaschopnosť po transfúzii - Priemerné 24-h % recovery pre kontrolné jednotky bolo rovnaké, ako sme zistili v minulosti my, a aj iní, avšak priemerné % recovery pre červené krvinky skladované v prítomnosti karnitínu bolo vyššie ako u kontrolných červených krviniek (p<0,05) . Okrem toho, priemerná životnosť skladovaných červených krviniek v cirkulácii bola tiež vyššia u buniek skladovaných v prítomnosti karnitínu (Obrázok 1) . Stanovená hmotnosť koncentrátu červených krviniek darcov bola velmi podobná (r=0,98) a nebola štatisticky rozdielna.

Korelačné štúdie - Ako sa očakávalo, 24-h % recovery vykazovalo významné korelácie s hladinami ATP (r=0,63) a inými hodnotami pre membránovú integritu červených krviniek, ako je hemolýza (r=0,57), osmotická fragilita (r=0,71), morfológia (r=0,59). Percento hemolýzy vysoko korelovalo s hladinami ATP (r=0,83) a tiež s obsahom bielych krviniek v jednotkách červených krviniek (r=0,83). Životnosť červených krviniek v cirkulácii ukázala, že táto nekorelovala so žiadnymi in vitro hodnotami.

Štúdia II

Vychytávanie karnitínu do skladovaných červených krviniek

Červené krvinky skladované v samotnom AS-3 médiu nevykazovali žiaden významný pokles obsahu L-karnitínu počas skladovania (Obrázok 2). Tieto nálezy sú v súhlase so zisteniami Cooper a spol., vyššie, že ľudské červené krvinky si voľne nevymieňajú L-karnitín s plazmou alebo izoosmotickým pufrom. Keď červené krvinky boli skladované v AS-3 médiu obohatenom o L-karnitín, zistilo sa vyššie množstvo L-karnitínu v červených krvinkách ako u buniek skladovaných len v samotnom AS-3 médiu (Obrázok 2). Obsah L-karnitínu lineárne narastal v závislosti na dobe skladovania a dosiahol 4-násobné zvýšenie po 42 dňoch skladovania.

Štúdie reacylácie lipidových komplexov v membránach skladovaných červených krviniek

Bez karnitínu klesala inkorporácia rádioaktívneho palmi19 tátu do palmitoyl L-karnitínu (PLC) lineárne s dobou skladovania (Obrázok 3) . Naproti tomu červené krvinky skladované v AS-3 roztoku s prítomným L-karnitínom vykazovali počiatočné zvýšenie (s dosiahnutím plato po 3 týždňoch), po ktorom nastal rýchly pokles inkorporácie rádioaktívneho palmitátu do PLC. V tých istých vzorkách červených krviniek bola tiež hodnotená inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránových fosfolipidov. Inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidyletanolamínu červených krviniek skladovaných len v samotnom AS-3 médiu vykazovala konštantný významný vzostup inkorporácie počas skladovacieho obdobia (Obrázok 4). Červené krvinky skladované v prítomnosti L-karnitínu charakterizoval náhly vzostup reacylácie fosfatidyletanolamínu ku koncu skladovania, keď plato sa dosiahlo v šiestom týždni (Obrázok 4). Inkorporácia rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidylcholínu mierne klesala v priebehu skladovania a nezistili sa žiadne rozdiely medzi kontrolnými a testovanými jednotkami (Obrázok 4) . Treba zdôrazniť, že v našich reacylačných štúdiách boli červené krvinky inkubované pri 37 °C v Krebs Ringer pufri s obsahom glukózy a obsah ATP na konci inkubácie bol takmer.na úrovni fyziologických hodnôt (hodnoty nie sú uvedené).

Diskusia

V tejto štúdii, in vitro a in vivo hodnotenie koncentrátov červených krviniek po 42 dňoch skladovania ukázalo významné rozdiely medzi červenými krvinkami skladovanými v prítomnosti L-karnitínu a kontrolnými bunkami. Rôzne in vitro vlastnosti červených krviniek hodnotiace metabolickú a membránovú integritu, ako sú ATP a % hemolýzy, rovnako ako aj priame meranie životaschopnosti buniek (24—h % recovery a životnosť v cirkulácii) boli významne vyššie pre červené krvinky skladované v prítomnosti karnitínu. Zaujímavé je predĺženie priemernej životnosti prežívajúcich červených krviniek v cirkulácii 24 hodín po infúzii. Tento nález sa môže vzťahovať k nereverzibilnému vychytávaniu L-karnitínu počas skladovania, je to neočakávaný objav, ktorý dosial nebol pozorovaný. Hodnoty rôznych vlastností kontrolných červených krviniek boli podľa očakávania a nelíšili sa od predchádzajúcich štúdií. Po odbere krvi neboli prítomné rozdiely vo vlastnostiach červených krviniek určených ako kontrolné alebo testované vzorky. Ako ukazujú Obrázky 1 až 3, hladiny ATP v červených krvinkách, % hemolýzy a životnosť v cirkulácii boli velmi závislé od darcu, a hoci štúdia bola náhodne randomizovaná, päť kontrolných a päť testovaných štúdií uskutočnené pri prvom a druhom odbere, je nepravdepodobné, že pozorované zmeny môžu byť výsledkom náhody alebo zlého plánu pokusu. Je preto veľmi pravdepodobné, že pozorované zmeny v tejto štúdii boli spôsobené pridaním karnitínu k testovaným jednotkám. Nie je možné vylúčiť možnosť, že predĺžená životnosť odzrkadľuje pokles vylúčenia Cr, ale nie je v súhlase so zlepšenými in vitro hodnotami skladovaných červených krviniek, čo sa zistilo, že koreluje s in vivo životaschopnosťou.

Mnohé štúdie zistili, že L-karnitín a jeho acyl estery majú cytoprotektívny účinok a stabilizujú membrány v rôznych bunkách, vrátane červených krviniek. Pozri napríklad, Snyder a spol., Árch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). V tejto štúdii sa zistilo, že L-karnitín je ireverzibilné vychytávaný červenými krvinkami počas skladovania. Hoci charakter tohoto procesu nie je úplne známy, treba vylúčiť účasť špecifických nosičov pre vychytávanie L-karnitínu. Podľa našich vedomostí, jediný známy nosič L-karnitínu pôsobí v bunkových systémoch, kde intracelulárna koncentrácia L-karnitínu je niekoľkonásobne vyššia ako je jeho normálna koncentrácia v extracelu21 lárnom priestore. Koncentrácia L-karnitínu v červených krvinkách je rovnaká ako v plazme. Takže, bez ohľadu na nízku teplotu, pokles ATP a iné možné metabolické zmeny počas skladovania, keď červené krvinky sú skladované v médiu s obsahom relatívne vysokých množstiev exogénneho L-karnitínu, je prítomné jednosmerné vychytávanie L-karnitínu týmito bunkami. V odbore neexistujú dôkazy o existencii takéhoto procesu.

Charakter pôsobenia L-karnitínu na skladované červené krvinky možno vysvetliť na úrovni biofyzikálneho a/alebo metabolického účinku na membránu. Prežívanie skladovaných červených krviniek po transfúzii závisí od integrity membrány, čo vyplýva z významnej korelácie medzi in vivo životaschopnosťou reinfundovaných červených krviniek a ich pomerom povrch : objem. Hlavnou zložkou prispievajúcou k štruktúre a funkcii membrány červených buniek je cytoskeleton, Marchesi, Ann. Rev. Celí Biol. 1:531-536 (1985), čo je supramolekulárna organizácia proteínov, ktoré sa nachádzajú pod vnútornou stranou membrány červených krviniek. Wolfe a spol. v prehľadnej štúdii o zložení a funkcii proteínov membránového cetoskeletonu v skladovaných červených krvinkách'zistili, že len jedinou zmenou bola znížená schopnosť spektrínu viazať sa s aktínom či už v prítomnosti, alebo neprítomnosti proteínu 4.1. Wolfe a spol., J. Clin. lnvest. 78: 1681-1686 (1986). Ukázali sme, že L-karnitín ovplyvňuje deformovatelnosť membrány červených krviniek na úrovni proteínu 4.1. Arduini a spol., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Takže Lkarnitín môže vykazovať stabilizačný účinok na membránu cez ovplyvnenie interakcie spektrínu s jednou, alebo viacerými zložkami cytoskeletonu. Nedávna štúdia

Rangachari, Life Sci. 52: 297-303 (1992) elektrónovej paramagnetickej rezonancie zameranej na interakciu spektrin-aktin v červených krvinkách, že L-karnitín výButterfielda a zistila pomocou znamne znižuje pohyb segmentov spin-označených sond v spektríne. Tieto výsledky potvrdili predchádzajúce predpoklady o účasti L-karnitínu pri spevnení interakcie medzi spektrínom a aktínom, Arduini a spol., vyššie.

Okrem možného biofyzikálneho účinku popísaného vyššie, zlepšenia pozorované u červených krviniek skladovaných v prítomnosti L-karnitínu môžu byť tiež výsledkom výhodného metabolického procesu. Normálne si deacylačno-reacylačný proces v membránových fosfolipidoch vyžaduje ATP pre tvorbu acylCoA. Acylový podiel z acyl-CoA je potom prenesený do lyzofosfolipidov pôsobením lyzofosfolipid acyl-CoA transferázy. Okrem toho, počas oxidácie, oprava fosfolipidov v červených krvinkách používa rovnaké metabolické cesty. Nedávne pozorovania ukázali, že CPT ovplyvňuje reacyláciu membránových fosfolipidov v červených krvinkách a neurónoch tým, že moduluje veľkosť acyl-CoA poolu, na úrovni kroku aktivácie mastnej kyseliny a jej prenosu do lyzofosfolipidov. Arduini a spol., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Okrem toho „pulse-chase pokusy a štúdie zamerané na depléciu ATP ukázali, že' acylkarnitínový pool červených krviniek je rezervoárom aktivovaných acylových skupín, bez účasti ATP. Arduini a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994) .

Zvýšenie inkorporácie rádioaktívneho palmitátu do membránového fosfatidyletanolamínu (PE) červených krviniek skladovaných v samotnom AS-3 predpokladá, že dlhodobé skladovanie (s progresívnou depléciou ATP v červených krvinkách) spôsobuje zvýšenú potrebu aktívnych acylových jednotiek pre reacyláciu membránových fosfolipidov (Obrázok 4). Zdá sa, že počas prvých piatich týždňov skladovania červené krvinky skladované v AS-3 médiu bez L-karnitínu inkorporujú viac palmitátu do PE ako červené krvinky skladované v AS-3 médiu s pridaným L-karr * nitínom (Obrázok 4). Červené krvinky skladované v prítomnosti L-karnitínu' boli schopné inkorporovať viac palmitátu do PE na konci skladovania. Toto zistenie môže predpokladať prítomnosť účinnej oxidácie, nakolko vystavenie červených krviniek oxidačnému činidlu veľmi stimuluje reacyláciu membránového .PE, ale nie membránového PC. Dise a spol., Biochem. Biophys. Acta 859: 69-78 (1986). Je zaujímavé, že počas prvých piatich týždňov skladovania, červené krvinky uskladnené v samotnom AS-3 médiu inkorporujú viac palmitátu do PE ako červené krvinky skladované v AS-3 roztoku + L-karnitín (Obrázok 4). Tieto zistenia predpokladajú, že v prípade karnitínu, CPT môže súťažiť s reacylačným enzýmom o utilizáciu acyl-CoA. V súhlase s touto koncepciou by sme však mali pozorovať oveľa väčší rozdiel .na konci skladovania, kedy požiadavka na acylCoA pre reacyláciu je najvyššia. Nebola to však pravda, červené krvinky skladované s- alebo bez- L-karnitínu vykazovali rovnakú rýchlosť inkorporácie na konci skladovania (Obrázok 4). Okrem toho sme ukázali, že CPT červených krviniek, v mnohých rôznych pokusných podmienkach, nekompetuje s reacyláciou membránových fosfolipidov. Arudini a spol., Life Chem. Rep. 12: 49-54 (1994).

Tvorba rádioaktívneho palmitoyl L-karnitíny (PLC) v červených krvinkách suplementovaných L-karnitínom je vyššia ako v tých červených krvinkách, ktoré boli skladované v neprítomnosti L-karnitínu (Obrázok 3). Časová závislosť tvorby PLC v červených krvinkách skladovaných v prítomnosti L-karnitínu ukázala zaujímavú krivku zvonovitého tvaru s vrcholom v treťom týždni skladovania. Tvorba rádioaktívneho PLC odzrkadľuje velkosť poolu rádioaktívne neoznačeného acylkarnitínu s dlhoreťazcovými mastnými kyselinami a smer CPT-sprostredkovaného toku acylu do intaktných červených krviniek. Počas prvých troch týždňov skladovania pri relatívne vysokej glyko24 lytickej aktivite a dostupnosti ATP, sa zdá, že CPT smeruje tok acylov smerom k acylkarnitinu v červených krvinkách skladovaných v prítomnosti L-karnitínu (Obrázok 5a) . Po treťom týždni skladovania sa v prítomnosti L-karnitínu obracia smer toku. Tieto zmeny môžu odzrkadľovať schopnosť CPT pufrovať aktívne acyl-jednotky: zvýšená požiadavka acyl-CoA pre reacyláciu vedie k nižšej tvorbe PLC a naopak, a môže predstavovať mechanizmus, v ktorom CPT pufruje zvýšenú požiadavku na acylové jednotky pre reacyláciu (Obrázok 5b).

Vyššie 24 hodinové % recovery a životnosť v cirkulácii znamená zlepšenie približne o 15 % v zmysle účinku (množstvo infundovaných cirkulujúcich červených krviniek podaných príjemcovi x(krát) priemerná životnosť). Toto zvýšenie účinnosti sa môže klinicky prejaviť v znížení počtu .transfúzií u pacientov vyžadujúcich chronické transfúzie, napríklad pri ochorení na tasémiu alebo poškodenie kostnej drene. Na druhej strane je však možné predĺžiť čas skladovania červených krviniek v roztoku.

Naše nálezy predpokladajú, že prítomnosť L-karnitínu v ochrannom médiu počas skladovania červených krviniek môže mať ochranný účinok na pool ATP, ktorý sa využíva pri reacylácii fosfolipidov na opravu membrány. Tento výhodný metabolický pochod, spojený s možným benefičným biofyzikálnym účinkom, môže vysvetľovať zníženie hemolýzy, vyššie hodnoty ATP a zlepšenie in vivo recovery a prežívanie červených krviniek skladovaných v prítomnosti L-karnitínu.

OŽIARENIE

Problém kontaminácie krvných výrobkov, vrátane celej krvi, červených krviniek, koncentrátu červených krviniek, krvných doštičiek a podobne, môže byť znížený pôsobením žiarenia. Intenzívnym štúdiom sa zistolo množstvo potrebného ožiarenia pre sterilizáciu a 100 % usmrtenie mikróbov. Velmi dôležitou je skutočnosť, že podobné· ožiarenie poškodzuje biele krvinky. Môžu byť použité rôzne typy ožiarenia, vrátane gama žiarenia (Kobalt GG, Van de Graf urýchlovač) , (JV ožiarenie, infračervené žiarenie atď. Dostatočným je ožiarenie v rozsahu 20 až 50 cG.

Ročne sa vo svete uskutoční asi 60 až 80 miliónov odberov krvi, ktoré sa použijú na transfúzie u rôznych populácií pacientov. V menej rozvinutých krajinách odber krvi na 1 000 obyvateľov je nižší a krvné transfúzie sú použité v pôrodníctve a pediatrii, predovšetkým u pacientov s anémiou vyvolanou maláriou. V rozvinutých krajinách počet odberov na 1 000 obyvateľov je 50 až 100 krát vyšší a väčšina transfúzií je použitá pri chirurgických zásahoch (50 %), alebo pre liečenie anemických pacientov na podklade rakoviny, pri transplantácii kostnej drene, pri nenádorovom krvácaní gastrointestinálneho traktu (Obrázok 1). Existuje veľa možných škodlivých účinkov pri transfúzii alogénnej krvi. Jednou takouto komplikáciou pri krvnej transfúzii je zriedkavá a nezvyčajne smrteľná entita, známa ako potransfúzna reakcia „štep proti príjemcovi (TA-GVHD), komplikácia spôsobená živými alogénnymi imunocytmi.

TA-GVHD ochorenie je zriedkavá komplikácia po infúzii krvi, ktorá sa vyskytuje u dvoch typov populácie pacientov príjemcov krvnej transfúzie. TA-GVHD má mortalitu približujúcu sa k 100 % a v súčasnosti je jediným účinným prístupom len prevencia. Po prvé, u pacientov s oslabeným imunitným systémom, ako sú pacienti po transplantácii kostnej drene alebo iných orgánov, pacienti chorí na Hodgkinsonovu chorobu alebo dedičnú nedostatočnosť imunitného systému. Po druhé, u pacientov s oslabeným imunitným systémom, keď je prítomná HLA podobnosť medzi darcom a príjemcom. Toto sa často stáva pri priamom darcovstve od blízkych príbuzných, alebo u populácii ľudí s obmedzenejším HLA polymorfizmom, ako v Japonsku a Izraeli. Z tohoto dôvodu je všeobecnou praxou ožiarenie bunkových krvných produktov gama žiarením v dávke približne 25 centigray (cG), aby sa tak zničila replikačná schopnosť živých imunocytov. Treba poznamenať, že TA-GVHD je spojená s bunkovými produktmi, ktoré sú čerstvé, to znamená, všeobecne menej ako 15 dní. Avšak „starnutie krvi nie je v súčasnosti akceptované pri predchádzaní tejto komplikácie. Imunocyty sú časťou alogénnej populácie leukocytov, stupeň odstránenia leukocytov pri použití filtrov tretej generácie nie je dostatočné, pre zabránenoe tejto komplikácie. Jediným prijateľným profylaktickým zásahom v súčasnosti zostáva gama ožiarenie.

Ťažkosti s gama ožiarením červených krviniek spočíva predovšetkým v tom, že môže nastať poškodenie bunkovej membrány. Je známe, že ožiarenie touto dávkou vyvoláva pokles účinnosti približne o 7 až 8 %, hodnotené in vitro poklesom obsahu ATP v červených krvinkách, zvýšenie hemolýzy a zvýšenie draslíka v supernatante. Tieto zmeny charakterizujú poškodenie membrány. Tieto in vitro zmeny sú spojené so znížením 24 hodinového recovery červených krviniek po gama ožiarení. Čo sa týka krvných doštičiek, jedna publikácia predpokladá určitý pokles životaschopnosti.

Pozoruhodné dôkazy naznačujú, že gama ožiarenie vykazuje účinok tak, že dochádza k tvorbe zlúčenín aktívneho kyslíka, ako je samotný kyslík, hydroxy, radikál a superoxidový anión. Tieto zlúčeniny indukujú vnútrobunkové poškodenie DNA a tak zabraňujú replikácií, čo je nevyhnutný predpoklad pre TAGVHD. Avšak tieto isté zlúčeniny kyslíka môžu oxidovať membránové lipidy červených krviniek a pravdepodobne aj lipidy v membránach krvných doštičiek, čo indukuje lézie v membránach a tak znižuje kvalitu a účinnosť buniek.

i“ r

L-karnitín je známy tým, že má kľúčovú úlohu pri transporte mastných kyselín s dlhým reťazcom cez mitochondriálnu membránu. Dedičné poruchy karnitínového systému na úrovni transportu mastných kyselín s dlhým reťazcom sa prejavujú vo významnom poškodení funkcie kostrových svalov. Nedávno sa zvýšil záujem o úlohu L-karnitínu v membráne červených krviniek. Prekvapivé je však to, že červené krvinky nemajú mitochondrie, avšak je prítomný L-karnitín a karnitín palmitoyl transferáza, enzým ktorý katalyzuje reverzibilnú acyláciu L-karnitínu. Spočiatku bolo nejasné, aké úlohy môžu mať tieto látky vo vnútri červených krviniek. Červené krvinky môžu byť počas svojho dlhého životného cyklu vystavené oxidačnému stresu in vivo a oprava oxidovaných membránových lipidov zahrňujúca L-karnitín môže byť dôležitá pre normálne prežívanie červených krviniek.

Rýchly vzostup acylovaného karnitínu počas zvýšenia dostupnosti ATP môže pôsobiť ako zásoba aktivovaných mastných kyselín, ktoré môžu byť následne použité v opravnom mechanizme oxidáciou poškodených membránových lipidov. Takéto vysvetlenie by dobre vysvetlilo zníženú hemolýzu pozorovanú počas in vitro skladovania červených krviniek a okrem toho by vysvetlilo zlepšenie in vivo recovery a prežívania. Čistý účinok pridania L-karnitínu predstavuje približne 17 % zvýšenie účinnosti.

Podobne môže byť L-karnitín použitý na zrušenie alebo prevenciu lézií vyvolaných ožiarením. Spôsobí toschopnosť karnitínu uskladneného v červených krvinkách opraviť oxidované membránové lipidy in vitro.

Aby sa obmedzila náchylnosť krvných produktov (červených krviniek, krvných doštičiek a podobne) na lézie v membránach a na hemolýzu, krvný produkt by mal byť najprv suspendovaný v roztoku s obsahom L-karnitínu v koncentrácii 0,25 mM až 50 mM, čím sa dosiahne dostatočný stupeň zachovania membrány a potlačenia hemolýzy, takže zatavený produkt môže byť ožiarený pre účely sterilizácie a následne môže mať predĺžený čas skladovania. Tiež po transfúzii môže mať predĺžený polčas v cirkulácii. Môže sa dosiahnuť životaschopnosť bežných hodnôt, v materiáloch temer s istotou sterilnými a malou pravdepodobnosťou, že vyvolajú TA-GVHD, v dôsledku ožiarenia po zatavení suspenzie krvného produktu. V tomto zmysle výraz krvný produkt možno interpretovať široko, zahrňuje celú krv, krvnú plazmu, koncentráty červených krviniek, koncentráty krvných doštičiek, zmesi a podobne.

I. Použitie L-karnitínu pre potlačenie rastu baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek s predĺženým skladovaním

Úvod - L-karnitín (LC) redukuje glykolýzu v koncentrátoch krvných doštičiek skladovaných viac ako 5 dní. (Sweeny a spol., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27-July 2, 1998, v Vox Sanguinis, zv. 74, č. Suppl. 1, str. 1226; a Sweeny a spol., The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, Dec. 4-8, 1998). Dôležité je vyhodnotiť účinok LC na rast baktérií v koncentrátoch krvných doštičiek, a tiež či LC môže byť použitý ako aditívum.

Metódy - Boli zmiešané dva ABO identické koncentráty krvných doštičiek, u ktorých bol pred skladovaním znížený obsah leukocytov. Koncentráty boli pripravené in line filtráciou plazmy bohatej na krvné doštičky (MedSep Corp. Covina, CA) . Zmiešané koncentráty boli potom rozdelené na dve rovnaké časti a vložené do dvoch CLX® (MedSep) sáčkov. Do jedného sáčku bol pridaný LC vo výslednej koncentrácii 5 mM, do druhého sáčku bol pridaný soľný roztok. V deň 0 bol do každého e r r r r ŕ kontajneru pridaná injekčnou ihlou na koagulázu negatívna stafylokoková suspenzia (1 ml), výsledná koncentrácia bola 1 až 48 CFU/ml. Pre počítanie kolónii boli vzorky aseptický odobraté tretí deň, šiesty deň a buď siedmy alebo ôsmy deň.

Výsledky boli analyzované párovým t-testom.

Výsledky - Hodnotilo sa jedenásť párov koncentrátov. Získané výsledky zaznamenáva Tabulka nižšie. Do 7/8 dňa rast v kontajneroch s L-karnitínom vykazoval 33 % kontrolných hodnôt. Závery - L-karnitín v koncentrácii 5 mM spomaľuje rast na koagulázu negatívnych stafylokokov v roztoku skladovaného koncentrátu krvných doštičiek.

	Pár	Kontrola*	L-karnitín*	P
Deň 0	11	1,12 ± 0,7	1,12 ± 0,7	N/A
Deň 3	11	3,11 ± 0,7	3,04 ± 0,7	0,43
Deň 6	8	4,28 ± 1,3	3,88 ± 1,0	0,05
Deň 7/8	11	5,09 ± 1,5	4,60 ± 1,5	0,002

*rast baktérií vyjadrený v log CFU/ml

II. Použitie L-karnitínu pre redukciu glykolýzy počas predĺženého skladovania krvných doštičiek so zníženým obsahom leukocytov pred uskladnením

Úvod - L-karnitín redukuje glykolýzu v štandardných (bez redukovaných leukocytov) koncentrátoch krvných doštičiek počas päť až desať dní skladovania (Sweeny a spol., 25^th Congress of the International Society of Blood Transfusion. Oslo, Norway, June 27-July 2, 1998, v Vox Sanguinis, zv. 74, č.

Suppl. 1, str. 1226; a Sweeny a spol., The American Society of Hematology, 40^th Annual Meeting, Miami Beach, FL, USA, (Dec. 4-8, 1998). Podobný účinok na krvné doštičky darcov s redukovanými leukocytmi nebol doteraz zaznamenaný.

r «· r t *· r

Metódy - Boli zmiešané dva ABO identické koncentráty krvných doštičiek, u ktorých bol pred skladovaním znížený obsah leukocytov. Koncentráty boli pripravené in line filtráciou plazmy bohatej na krvné doštičky (MedSep Corp. Covina, CA) . Zmiešané koncentráty boli potom rozdelené na dve rovnaké časti a vložené do dvoch CLX® (MedSep) sáčkov. Do jedného sáčku bol pridaný LC vo výslednej koncentrácii 5 mM, do druhého sáčku bol pridaný solný roztok. Krvné doštičky boli skladované buď sedem alebo osem dní pri teplote 22 °C v plochej trepačke a vzorky boli potom testované. Hodnotilo sa pH, počet krvných doštičiek, obsah glukózy a laktátu v supernatante, prietokovou cytometriou sa merala expresia povrchového p-selektinu, rozsah zmien tvaru (ESC) a odpoveď na hypotonický šok (HSR). Spotreba glukózy a tvorba laktátu bola vyjadrená ako mM/ΊΟ⁷ krvných doštičiek/deň. Výsledky boli vyhodnotené párovým t-testom.

Výsledky - Hodnotilo sa sedem párov koncentrátov krvných doštičiek. Získané výsledky zaznamenáva Tabuľka nižšie.

Závery - L-karnitín znižuje glykolýzu v skladovaných krvných doštičkách s redukovanými leukocytmi pred uskladnením.

	Kontrola	L-karnitín	P
PH	6,97 ± 0,2	7,09 ± 0,1	<0,01
koncentrácia glukózy	1,25 ± 0,2	1,13 ± 0,2	<0.01
Tvorba laktátu	1,73 ± 0,3	1,50 ± 0,2	<0.01
P-selektin (% pozitívne)	74 ± 4	69 ± 9	0,04
ESC (%)	11 + 5	12 ± 4	0, 35
HSC (%)	45 ± 13	50 ± 22	0, 64

r *

- r ·

Vynález tejto patentovej žiadosti bol popísaný generickými výrazmi a odkazmi na konkrétne príklady. Odborníkom sú známe obmeny bez účinku na podstatu vynálezu. Predovšetkým môžu byť modifikované stabilizačné kompozície, krvnýné produkty, ochranné látky, inhibítory a podobne. Okrem toho, špecifické hladiny, trvanie životaschopnosti a polčasy v cirkulácii sa budú meniť v závislosti od darcov a príjemcov. Takéto obmeny sú súčasťou predkladaného vynálezu, keď nie sú špecificky vylúčené citovaním v nárokoch, ktoré nasledujú.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy koncentrátu krvného produktu pre skladovanie, ktorý tvorí:

(1) suspendovanie uvedeného krvného produktu v podpornom roztoku, čím sa získa suspenzia koncentrátu uvedeného krvného produktu; a (2) ožiarenie uvedeného koncentrátu krvného produktu, čím sa dosiahne sterilita a inaktivácia leukocytov a získa sa ožiarený koncentrát suspenzie krvného produktu, kde:

uvedený koncentrát krvného produktu je vybratý zo skupiny .obsahujúcej koncentráty červených krviniek a koncentráty krvných doštičiek; a uvedený podporný roztok obsahuje zlúčeninu vybratú zo skupiny L-karnitín, soli L-karnitínu, alkanoyl L-karnitíny, soli alkanoyl L-karnitínov a ich zmesi, a uvedená zlúčenina je prítomná v uvedenom podpornom roztoku v množstve účinnom pre zachovanie membrány červených krviniek alebo krvných doštičiek prítomných v uvedenom, ožiarenom koncentráte krvného produktu.
2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že uvedená zlúčenina je prítomná v uvedenom podpornom roztoku v koncentrácii 0,25 až 50 mM.
3. Spôsob podlá nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že uvedená zlúčenina je L-karnitín.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je L-karnitín a kde uvedená zlúčenina je prítomná v uvedenom podpornom roztoku v koncentrácii 0,25 až 50 mM.
5. Spôsob podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo skupiny acetyl Lkarnitín, propionyl L-karnitín, butyryl L-karnitín, izobutyryl L-karnitín, valeryl L-karnitín a izovaleryl L-karnitín.

6. Spôsob podía nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo skupiny acetyl Lkarnitín, propionyl L-karnitín, butyryl L-karnitín, izobutyryl L-karnitín, valeryl L-karnitín a izovaleryl L-karnitín a kde uvedená zlúčenina je prítomná v uvedenom podpornom roztoku v koncentrácii 0,25 až 50 mM.

7. Spôsob podía nároku 1, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v uvedenom pod- pornom roztoku je 0,25 až 50 mM. 8. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v i uvedenom podpor- nom roztoku je 1 až 30 mM 9. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že uvedená zlúčenina je L-karnitín. 10. Spôsob podľa nároku 1/ v y z n a č u j ú c i s a

tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo skupiny L-karnitín, propionyl L-karnitín, butyryl L-karnitín, izobutyryl L-karnitín, valeryl L-karnitín a izovaleryl L-karnitín.

11. Spôsob redukcie glykolýzy v celej krvi alebo krvnej frakcii, uvedená krvná frakcia je vybratá zo skupiny zhluknuté červené krvinky, zhluknuté biele krvinky, plazma a deriváp e ty plazmy, pozostávajúca z pridania k celej krvi alebo ku krvným frakciám zlúčeniny vybratej zo skupiny L-karnitín, soli L-karnitínu, alkanoyl L-karnitíny, soli alkanoyl Lkarnitínov a ich zmesi, v množstve účinnom redukovať glykolýzu v uvedenej celej krvi alebo krvnej frakcii.
12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačuj úci sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté červené krvinky a kde spôsob tvorí suspendovanie uvedených zhluknutých červených krviniek v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.
13. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená krvná frakcia sú zhluknuté biele krvinky a uvedený spôsob tvorí suspendovanie uvedených zhluknutých bielych krviniek v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.
14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačuj úci sa tým, že uvedená krvná frakcia je plazma alebo derivát plazmy a uvedený spôsob tvorí suspendovanie uvedenej plazmy alebo derivátu plazmy v podpornom roztoku, ktorý obsahuje uvedenú zlúčeninu.
15. Spôsob podlá nároku 11, vyznačuj ú tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v uvedenom podpornom roztoku je 0,25 až 50 mM.

c i sa prítomnej
16. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny prítomnej v uvedenom podpornom roztoku je 1 až 30 mM.
17. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina je L-karnitín.

iT c i sa acetyl L
18. Spôsob podľa nároku 11, vyznačuj ú tým, že uvedená zlúčenina je vybratá zo skupiny karnitín,. propionyl L-karnitín, butyryl L-karnitín, izobutyryl L-karnitín, valeryl L-karnitín a izovaleryl L-karnitín.
19. Spôsob redukcie glykolýzy v koncentráte krvných doštičiek darcu, v ktorom boli redukované leukocyty . pred uskladnením, vy značujúci sa tým, že uvedený spôsob tvorí suspendovanie uvedeného koncentrátu krvných doštičiek v podpornom roztoku, ktorý obsahuje zlúčeninu vybratú zo skupiny L-karnitín a soli L-karnitínu, v množstve účinnom redukovať glykolýzu v uvedenom koncentráte krvných doštičiek s redukovanými leukocytmi pred uskladnením.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v uvedenom podpornom roztoku je 0,25 až 50 mM.
21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedenej zlúčeniny v uvedenom podpornom roztoku je 1 až 30 mM.