EA024520B1

EA024520B1 - Композиции, предназначенные для хранения эритроцитов

Info

Publication number: EA024520B1
Application number: EA200701660A
Authority: EA
Inventors: Джон Р. Хесс; Тибор Г. Гринуолт
Original assignee: Юниверсити Оф Цинциннати
Priority date: 2005-02-17
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2016-09-30
Also published as: AU2005327576C1; JP2008529550A; EP2420140A1; MX2007009885A; CN101166420A; EP1863342A1; BRPI0520102A2; CA2598366A1; WO2006088455A1; AU2005327576B2; EA200701660A1; CN101166420B; AU2005327576A1; CA2598366C

Abstract

Изобретение описывает водные композиции, предназначенные для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°C, где композиции свободны от ионов хлора, экзогенного происхождения и состоят из: аденина; декстрозы; неметаболизируемого защищающего мембрану сахара; бикарбоната натрия и вторичного кислого фосфата натрия, т.е. из конкретной pH-забуферивающей системы.

Description

Настоящее изобретение относится в целом к композициям и способам, связанным с хранением эритроцитов (красных кровяных клеток (геб Ь1ооб се11к, ВВС)). В частности, оно относится к улучшенной композиции для хранения ВВС и способам и вариантам ее применения.

Возможность сохранять и консервировать эритроциты (ВВС) для последующей реинфузии пациентам представляет собой относительно новую технологическую разработку, которая явилась предпосылкой для современной хирургической практики. Такая консервация является сложной с научной точки зрения, и продолжают предприниматься шаги для достижения более длительного хранения и более высокого качества эритроцитов, предназначенных для реинфузии. Сразу после получения из организма донора эритроциты начинают погибать из-за коагуляции, голодания, снижения уровня АТФ, 2,3-ДФГ (2,3-дифосфоглицерат), площади и целостности мембранной поверхности и гемоглобина (НЬ). Воик и Тигпег в 1916 г. и КоЬеПкоп в 1917 г. впервые продемонстрировали, что можно успешно хранить цельную кровь. Позднее для 21-дневного хранения цельной крови были одобрено применение цитратнодекстрозного раствора (АС'Н. 1943), содержащего лимонную кислоту в качестве антикоагулянта и декстрозу в качестве в единственного питательного вещества, используемого эритроцитами, и цитрат-фосфатдекстрозного раствора (цитроглюкофосфат, ЦФД, 1957), в который был добавлен фосфат в качестве важного для метаболизма источника и для сохранения мембран. Позднее был разработан ЦФД с аденином (ЦФДА-1, 1979), и его начали применять для удлинения срока хранения цельной крови и эритроцитарной массы вплоть до 5 недель.

Первоначально предназначенные для хранения композиции создавали кислотными с целью предупреждения карамелизации глюкозы в процессе тепловой стерилизации, которую осуществляли на конечной стадии получения. В 50-х гг. было установлено, что можно применять аденин в качестве добавки и для восполнения потери аденина в результате деаминирования. В 1970-е гг. возникла необходимость в отделении плазмы от собранной цельной крови для получения тромбоцитов и производства получения плазмы. Однако это привело к снижению процента выхода эритроцитарной массы.

Для решения этой проблемы были разработаны композиции, известные в данной области в качестве аддитивных растворов (Αδ), предназначенные для восстановления объема, питательных веществ, и другие ценные для ВВС стабилизаторы. Композиции аддитивных растворов, предназначенных для консервации эритроцитов (ВВС) после их выделения из цельной крови, должны быть специально подобраны для ВВС. В 1981 г. были разработаны некоторые аддитивные растворы, которые позволили удлинять срок хранения ВВС до 6 недель. Однако эритроциты (ВВС), хранившиеся в этих растворах, подвергались постоянной деградации после примерно 6-недельного хранения, что установлено по отсутствию способности у 75% таких клеток выживать в кровотоке в течение 24 после реинфузии в организм человекадонора. Было установлено, что во время продолжительного хранения в холодильнике скорость поглощения глюкозы снижалась, а концентрация отходов метаболизма, т.е. молочной кислоты и ионов водорода, возрастала. Такое снижение скорости метаболизма глюкозы приводит к истощению аденозинтрифосфата (АТФ), что прямо коррелирует с восстановлением ВВС при возвращении клеток в кровоток. Были разработаны аддитивные растворы, такие как А6ко1.ВТМ (Αδ-Ι), №Ппсе1 ВТМ (Αδ-3), Орйко1 ВТМ (Αδ-5) и Егу1Ьто8о1 ВТМ, для удлинения срока хранения ВВС при 1-6°С. Все три Αδ, которые в настоящее время лицензированы в США, а именно Αδ-Ι, Αδ-3 и Αδ-5, содержат физиологический раствор, аденин, глюкозу и некоторое количество цитрата и/или маннита в качестве защитных агентов для мембраны. Αδ-3 содержит также первичный кислый фосфат натрия. Каждый из лицензированных в США Αδ удовлетворяет требованиям лицензирования, предъявляемым к хранению ВВС в течение 6 недель, но при их использовании не хранятся в течение 7 недель. Получившие к настоящему времени лицензию композиции аддитивных растворов для ВВС были созданы до того, как было установлено, что повреждение ВВС при хранении (которое рассматривается в настоящем описании как сумма ограничивающих выживание и/или функцию воздействий на ВВС) связано с процессом апоптоза.

В настоящее время почти всю собранную цельную кровь разделяют на компоненты и ВВС-фракцию хранят в виде эритроцитарной массы. Для образцов крови, которые собирают в системы аддитивных растворов, эритроцитарную массу получают из ВВС путем центрифугирования, удаляют плазму так, чтобы на долю ВВС приходилось вплоть до 80% объема, а затем в стерильных условиях добавляют 100 мл аддитивного раствора. В образовавшихся суспензиях объем фракции ВВС составляет примерно 55%. ВВС, которые хранят в общепринятых утвержденных ΡΌΑ аддитивных растворах, можно хранить только в течение 6 недель при сохранении приемлемого уровня восстановления в течение 24 ч ίη У1Уо.

Для увеличения времени приемлемого уровня восстановления ίη У1уо ВВС в организме пациентов после реинфузии после периода хранения были предприняты попытки улучшения аддитивных растворов и процессов хранения.

- 1 024520

В статье Сгееп^аИ и др., §1иФе8 Ιη Кеб Βίοοά Се11 Рте8егуаИоп-7. Ιη νίνο апб ίη νίίτο δΐιιύίοδ \νί!ΐι Α ΜούίΠού РЬο8рЬаΐе-Αттοн^ит АббПке δοϊηίίοη, νοχ. 8ап§, 65, 1993, с. 87-94, авторы представили данные о том, что экспериментальный аддитивный раствор (обозначенный как ΕΑδ-2), который содержит: 20 мМ ΝΗ₄Ο, 30 мМ Ыа₂НРО₄, 2 мМ аденин, 100 мМ декстрозу, 55 мМ маннит, изготовленный при рН 7,15, можно применять для удлинения срока хранения человеческих КВС от действующего в настоящее время стандартного срока 5-6 недель до улучшенного стандартного срока 8-9 недель. Однако при хранении эритроцитарной массы в ΕΑδ-2 ее нельзя непосредственно использовать для инфузии, перед трансфузией требуется удаление супернатанта с использованием стадии промывки из-за присутствия аммония в аддитивном растворе.

В статье, озаглавленной '^1иб1е8 ίη Кеб Β1οο6 Се11 Р^е8е^νаΐ^οη-8; Ыцшб δΐο^аде οΓ Кеб Се1к ίη С1усе^ο1-Сοηΐа^тηд ЛббЩуе δο1ιιΙίοη. νοχ. δηηβ. 67, 1994, сс. 139-143, СтееиетаИ с соавторами описали аддитивный раствор (обозначенный как ΕΑδ-25), который позволяет достигать 73%-ного восстановления эритроцитарной массы после хранения в течение 9 недель. Однако полученные в результате образцы КВС, содержавшие примерно 1% глицерина, не были безопасны при трансфузии людям в большом количестве.

В статье Мегутаг! и др., Εχφ^ίη^ 1Ье δΐο^аде οΓ Кеб Се1к а! 4.бедгее. С, ТгащГщ. δα. 15, 1994, с. 105-115, было продемонстрировано, что приемлемая жизнеспособность КВС при хранении в очень разбавленных суспензиях при низком гематокритном числе сохранялась в течение 27 недель. Однако при таком хранении суспензии КВС нельзя применять для непосредственной инфузии из-за высокого содержания калия и аммиака и низкого объема фракции КВС. Тот факт, что для 200 мл КВС требуется 5 л раствора для достижения установленного авторами благоприятного воздействия, делает невозможным применение такой суспензии для клинической практики.

Касательно одобренных и коммерчески приемлемых продуктов, аддитивные растворы, которые в настоящее время лицензированы в США, работают в течение только 6 недель, при этом обеспечивают усредненный уровень восстановления примерно 80%. Два аддитивных раствора, которые в настоящее время лицензированы в Европе, работают в течение примерно 7 недель, обеспечивая усредненный уровень восстановления 77% (ΕΐΎΐ1ιΐΌδο1 фирмы Вах!ег НеаИЬсате, Ла-Шатр, Франция) и 75% (РΑССδ-маннит фирмы Масо РЬагта). Вероятно, новые растворы, описанные в последнее время Кигир с соавторами (νοχ δаηд. 85, 2003, с. 253-261), должны иметь более короткое время хранения из-за присутствия в них более низких концентраций АТФ.

С учетом недостатка этих известных в данной области разработок, при создании настоящего изобретения были разработаны применяемые в меньших объемах щелочные экспериментальные аддитивные растворы (ΕΑδ), содержащие вторичный кислый фосфат натрия, которые частично нейтрализуют эффекты, возникающие при сборе крови в кислотные антикоагулянтные растворы, такие как ЦФД (цитрат-фосфат-декстроза (цитроглюкофосфат)), и, как было установлено, эти ΕΑδ повышают концентрации АТФ в КВС, снижают гемолиз и, вероятно, снижают морфологические изменения и потерю мембран КВС (см. υδ 6150085 и 6447987 на имя Не88 и СтееиетаИ, полное содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки). Установлено, что различные ΕΑδ позволяют осуществлять хранение в течение от 9 до 12 недель. Хотя эти ΕΑδ обеспечивают улучшенные характеристики, они содержат хлорид натрия, и такую форму можно применять только в виде больших объемов, что приводит к большему разведению хранящихся КВС и в результате повышает риск гемодилюции у пациентов, которых подвергают нескольким трансфузиям. Кроме того, присутствие хлорида натрия создает предел растворимого количества забуферивающих солей и фосфатов, которое может поддерживаться в требуемых объемах системы.

Увеличение продолжительности хранения КВС сохраняет свою важность в периоды времени, когда потребность является высокой, но непостоянной, таких как военное время, и в географических зонах, в которых потребность в предназначенной для трансфузии крови является непостоянной и спорадической. Фактически с учетом известных из современного уровня техники данных об убытках, связанных с окончанием безопасного периода хранения до реализации, в целом существует насущная потребность в увеличении времени хранения, в течение которого КВС остаются безопасными.

Таким образом, существует необходимость в предназначенных для хранения КВС композициях, созданных с целью сохранения или увеличения преимуществ, касающихся восстановления и характеристик, которые связаны с использованием общепринятых аддитивных растворов в меньших объемах. В области хранения крови и трансфузии продолжает сохраняться необходимость в улучшенных методах хранения КВС, обеспечивающих более продолжительное хранение, более высокий процент восстановления и улучшенные физиологические характеристики КВС после трансфузии. Следовательно, сохраняется необходимость в улучшенных композициях, предназначенных для хранения КВС, и методах их получения. Сохраняется также необходимость в аддитивных композициях, обеспечивающих возможность непосредственной инфузии людям суспензии КВС, к которой добавлена композиция, и обеспечивающих приемлемую способность к восстановлению после инфузии жизнеспособных КВС, которые обладают улучшенными характеристиками с точки зрения физиологических функций и пониженной скоростью клиренса из кровотока пациента, подвергнутого инфузии.

- 2 024520

Краткое изложение сущности изобретения

Предложена водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С, где композиция свободна от ионов хлора, экзогенного происхождения, и состоит из аденина в количестве примерно 2 мМ, декстрозы в количестве примерно 80 мМ, неметаболизируемого защищающего мембрану сахара в количестве примерно 55 мМ, бикарбоната натрия в количестве примерно 26 мМ и вторичного кислого фосфата натрия в количестве примерно 12 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения значение рН этой композиции составляет примерно 8,5. При этом осмолярность ее может равняться от примерно 200 до примерно 310 мОсм.

В предпочтительном варианте - от примерно 221 до примерно 280 мОсм, а в наиболее предпочтительном - примерно 270 мОсм.

Еще одним объектом данного изобретения является водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С, где композиция свободна от ионов хлора, экзогенного происхождения, и состоит из

1-3 мМ аденина;

20-115 мМ декстрозы;

15-60 мМ неметаболизируемого защищающего мембрану сахара;

4-60 мМ вторичного кислого фосфата натрия.

Значение рН этой композиции может составлять примерно 8,5, а осмолярность ее может равняться от примерно 200 до примерно 310 мОсм.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения - от примерно 221 до примерно 280 мОсм, а в наиболее предпочтительном - примерно 270 мОсм

Эти объекты настоящего изобретения станут более очевидными после ознакомления с кратким описанием чертежей, подробным описанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения и примеров, которые представлены ниже.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - графическое изображение результатов обобщенного исследования по оценке воздействия на хранение РВС в зависимости от времени (в неделях) 4 различных композиций аддитивных растворов: 1) Αδ-3, объем 110 мл (·0·); ΕΑδ-61, объем 170 мл (-♦-);ΕΑδ-78, 170 мл, (-«-);и ΕΆδ-81, 110 мл(-о-). Содержащие бикарбонат композиции, обозначенные кружками, приводят к получению более высоких концентраций АТФ, что проиллюстрировано на панели А, по сравнению с эквивалентными объемами композиций без бикарбоната, которые обозначены ромбами. С этими композициями связаны также более высокие концентрации лактата (панель Г), более высокие внеклеточные и внутриклеточные значения рН (панели Д и Е) и более высокие концентрации бикарбоната и РСО₂ (панель Д и Е). При использовании больших объемов композиций, обозначенных закрашенными символами, выявлен пониженный гемолиз и пониженное гематокритное число при хранении, что проиллюстрировано на панелях Б и В соответственно;

на фиг. 2 - данные о восстановлении ίη νίνο эритроцитов, собранных через 24 ч после реинфузии в организм индивидуума, при использовании РВС, которые хранили в ΕΑδ-81 в течение 6 недель (η=6), ΕΑδ-81 в течение 8 недель (η=6), по сравнению с известным контролем, а именно с данными, которые были получены при лицензионном исследовании Αδ-3, опубликованном δίιηοη с соавторами в 1985 г. В обоих исследованиях применяли метод, основанный на использовании одной метки ⁵¹Сг.

Подробное изложение предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Изобретение относится в целом к композициям и способам, связанным с хранением эритроцитов (РВС). В частности, оно относится к новым композициям аддитивных растворов и связанным с ними способам хранения РВС, которые отделены от цельной крови, собранной в цитрат-фосфат-декстрозный (ЦФД) раствор, в его разновидность раствор цитрат-фосфат-двойная декстроза (ЦФ2Д), или при афарезе (выделение цельной крови из организма пациента или донора) в цитратно-декстрозный (АСИ) или аналогичные растворы.

Для целей настоящего изобретения понятие восстановление в контексте настоящего описания относится к фракции хранившихся РВС, которая сохранилась в кровотоке в течение 24 ч после реинфузии в организм исходного донора (человека), В контексте настоящего описания понятие хлорид относится к хлоридному аниону. Так, понятие хлорид включает хлоридный анион и его формы соли, например которые можно получать из хлоридного(ых) аниона(ов) и физиологические приемлемого(ых) катиона(ов). Подразумевается, что понятие хлорид не включает соединения, в которых атом хлора ковалентно связан, например, с атомом углерода в органической молекуле.

В контексте настоящего описания фраза физиологически приемлемый забуферивающий агент относится к забуферивающим агентам, которые являются источником катионов и анионов, либо встречающихся в естественных условиях в крови, плазме или сыворотке человека, либо тех, к которым человек при их введении обладает толерантностью. Приемлемые катионы представляют собой протоны, ка- 3 024520 тионы аммония и катионы металлов. Приемлемые катионы металлов включают (но, не ограничиваясь ими) катионные формы натрия, калия, кальция и магния, причем натрий и калий являются предпочтительными, а натрий более предпочтительным. Катион аммония, т.е. соединение формулы Κ.,|Ν'. в которой К обозначает водород или органическую группу, можно использовать в случае, если оно является физиологически приемлемым. В предпочтительном варианте осуществления изобретения катион выбирают из водорода (т.е. протона), натрия, калия, кальция, магния и их комбинации. В контексте настоящего описания понятие забуферивающий агент относится к агенту, который устанавливает и регулирует значение рН композиции.

Описанные композиции, предлагаемые в изобретении, являются водными, что означают, что их приготавливают в воде. Предпочтительную воду, предлагаемую в изобретении, обрабатывают для того, чтобы она была практически свободна от пирогенов (т.е. была стерильной).

В контексте настоящего описания мЭкв/л означает присутствующую концентрацию конкретного компонента (растворенное вещество) относительно количества присутствующей воды. Более конкретно мЭкв/л означает количество миллиэквивалентов растворенного вещества на 1 л воды. Количество миллиэквивалентов на литр рассчитывают путем умножения молей на литр растворенного вещества на количество заряженных частиц (групп) на молекулу растворенного вещества, полученную величину затем умножают на 1000.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С. Композиция в основном состоит из: аденина; декстрозы; по меньшей мере одного неметаболизируемого защищающего мембрану сахара; и рН-забуферивающей системы. рН-забуферивающая система содержит комбинацию физиологически приемлемых забуферивающих агентов и должна включать по меньшей мере один агент, который является источником анионов бикарбоната, по меньшей мере один агент, который является источником фосфата, и по меньшей мере один агент, который является источником катионов натрия. Согласно изобретению одна забуферивающая соль может удовлетворять более чем одному из указанных требований. В области консервации эритроцитов хорошо известно, что концентрация АТФ в суспензионной системе эритроцитов наиболее хорошо коррелирует со здоровьем системы. Эритроциты образуют АТФ посредством гликолиза через гликолитическую конверсию ά-глюкозы (декстрозы) с получением в качестве конечного продукта лактата. Следовательно, концентрационная кривая лактата является хорошим индикатором также синтеза АТФ. Вне зависимости от способности системы к консервации, эритроциты имеют конечное время жизни и для собранных эритроцитов характерны нормальное распределение эритроцитов по возрасту и смертность, близкая к естественной. Если новые КВС не вносят в предназначенную для консервации систему, то существует предел максимального периода хранения, который должен определять требуемый процент восстановления после реинфузии. Таким образом, способность системы в целом производить АТФ должна снижаться со временем; хотя, как правило, обнаружено начальное повышение после добавления аддитивной жидкости, которая является источником питательных веществ в более высоких по сравнению со встречающимися в естественных условиях концентрациях, и КВС первоначально подвергаются разбуханию, связанному также с пониженной утилизацией АТФ.

Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что при хранении в аддитивном растворе, предлагаемом в изобретении, увеличенный объем питательного раствора позволяет повышать массу субстрата, которая должна вноситься в приемлемых концентрациях, обеспечивая в растворенном веществе разбавление отходов метаболизма, что снижает тем самым посредством обратной связи ингибирование метаболизма глюкозы. Вероятно также, что другой особенностью аддитивных растворов, предлагаемых в изобретении, является их способность вызывать первичное разбухание КВС с последующем постепенным снижением объема эритроцитов в процессе хранения. Такой процесс можно обозначать как регулируемое снижение объема. В качестве гипотезы можно предположить, что во время этого процесса либо подавляется активность тирозинфосфатазы, присутствующей в КВС, либо активируется тирозинкиназа. Было установлено, что оба этих фермента присутствуют в значительных количествах в мембранах указанных клеток (ΖίρδβΓ Υ. и Коко\уег N. 8., Вюсйет. I. 314, 1996, с. 881; Μαΐΐοζζί С. и др., РА8ЕВ I. 11, 1997, с. 1281). Можно ожидать, что чистое фосфорилирование белка, которому соответствует полоса 3, в мембране КВС будет приводить к высвобождению фосфофруктокиназы, альдолазы и глицеральдегид-3фосфат-дегидрогеназы в цитоплазму из их состояния, соответствующего полосе 3 (Наткой Μ. Ь. и др., I. ΒίοΙ. Сйет. 266, 1991, с. 4106; С’окктк А. К. и ОШкои I. 8., I. Ехрег. ΒίοΙ. 200, 1997, с 343; Ьоте Р. 8. и др., I. Вю1. Сйет. 268, 1993, с 14627; Ьоте Р. 8. и др., Рго!ор1акта 184, 1995, с. 1961). Можно ожидать, что доступность этих трех ферментов в гликолитическом пути (гликолизе) должна приводить к повышению метаболизма глюкозы в КВС, что приводит к повышению уровней синтеза АТФ и концентрации АТФ в КВС. Таким образом, задачей при создании композиций аддитивных растворов является поддержание синтеза АТФ на максимально высоком уровне в течение максимально возможного периода времени.

При создании изобретения было установлено, что имеющим решающее значение для повышения до максимума синтеза АТФ системы является поддержание внутриклеточного значения рН КВС на уровне, максимально близком к 7,2, но не достигающем точно этого значения. В процессе хранения характерная концентрация АТФ сохраняется на уровне или даже повышается в период времени, близкий к началу

- 4 024520 хранения, а затем снижается. Когда концентрация АТФ в КВС падает до уровня ниже 2 мкмоля/г НЬ, восстановление КБС, как правило, составляет менее 75%. КБС теряют 2,3-ДФГ на ранней стадии хранения. Исходная характерная концентрация составляет примерно 15 мкмолей/г НЬ или примерно 1,1 моля/моль НЬ. Как правило, концентрация, снижается до 1/10 от исходного уровня через 7-10 дней. Скорость синтеза 2,3-ДФГ является функцией рН, она избыточна при значениях рН выше 7,2, но при значения рН ниже этого значения снижается до приемлемого уровня. Попытки увеличить синтез 2,3-ДФГ путем повышения значения рН системы, предназначенной для хранения, ограничены тем, что при образовании 1 моля каждой молекулы 2,3-ДФГ теряется 1 моль получаемого в процессе синтеза АТФ. Таким образом, повышение концентраций 2,3-ДФГ в КВС, что ранее считалось желательным, фактически может снижать время хранения КВС.

Более кислая среда снижает метаболизм КВС. Значение рН, равное 7,2, представляет собой точку, в которой запускается механизм, известный как шунт Раппопорта (см. Некк и др. А1ка1ше СРИ аий 1кс ргекегуайоп οί гей Ь1оой се11 2,3-ИРО ТгаикГикюи, 42, 2002, с.747-752, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки), при этом происходит синтез 2,3-ДФГ из 1,3-ДФГ с поглощением фосфатата, необходимого для синтеза АТФ, и кроме того, происходит обращение стадии гликолиза, в процессе которой гликолитически создаются 2 молекулы АТФ. Общим действием системы является снижение уровня АТФ. Если внутриклеточное значение рН можно поддерживать на уровне ниже 7,2, то шунт эффективно закрывается, и синтез АТФ является максимальным. В естественном состоянии шунт функционирует в определенной степени и производство и поддержание определенного уровня 2,3-ДФГ является важным для других происходящих в клетке событий. Однако при создании настоящего изобретения установлено, что для целей консервации эритроцитов в процессе хранения вне окружения ίη νίνο желательным является минимизация действия шунта.

Таким образом, варианты композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, обеспечивают, что рН-забуферивающая система присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы композиция обладала способностью поддерживать значение рН суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавляют композицию, на уровне, достаточном для создания и поддержания в процессе периода хранения равновесной реакции, которая более благоприятна для гликолиза по сравнению с синтезом 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) из 1,3-ДФГ, что создает тем самым чистый прирост синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) при реакции равновесия в течение периода хранения. Конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения являются композиции, удовлетворяющие условию, что при композиция обладает способностью поддерживать значения рН суспензии КВС, к которой добавлена композиция, на уровне примерно 6,47,4. В более конкретных вариантах осуществления изобретения композиция обладает способностью поддерживать значения рН суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавлена композиция, на уровне от 7,0 до менее чем примерно 7,2. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция обладает способностью поддерживать значения рН суспензии эритроцитов (КВС), к которым добавлена композиция, на уровне выше примерно 7,1 и ниже 7,2.

При создании изобретения были созданы композиции аддитивных растворов, практически свободные от хлорида, что неожиданно не оказывало отрицательного действия на систему и позволяло добавлять увеличенные количества забуферивающей системы для дополнительного забуферивания рН. Одним из вариантов осуществления изобретения является также водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С. Эта композиция содержит: аденин; декстрозу; по меньшей мере один неметаболизируемый защищающий мембрану сахар; и рН-забуферивающую систему. рН-забуферивающая система содержит комбинацию физиологически приемлемых забуферивающих агентов и должна включать по меньшей мере один агент, который является источником бикарбонатных анионов, по меньшей мере один агент, который является источником фосфатных анионов, и по меньшей мере один агент, который является источником натриевых катионов. рН-забуферивающая система присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы композиция обладала способностью поддерживать значения рН суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавляют композицию, на уровне, достаточном для создания и поддержания в процессе периода хранения равновесной реакции в эритроцитах, которая благоприятна для гликолиза по сравнению с синтезом 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) из 1,3-ДФГ, что создает тем самым чистый прирост синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) при реакции равновесия в течение периода хранения. Композиция практически свободна от ионов хлорида экзогенного происхождения. В контексте настоящего описания понятие практически свободна от хлоридных ионов экзогенного происхождения означает, что вне зависимости от любой присутствующей концентрации хлоридных ионов никакого источника ионов хлорида не было добавлено к композиции.

Другими вариантами осуществления изобретения являются суспензия эритроцитов, включающая любую из композиций, предлагаемых в изобретении, и варианты осуществления изобретения, в которых суспензию можно применять для непосредственной инфузии в организм пациента, который нуждается в такой инфузии.

- 5 024520

Следующие варианты осуществления изобретения относятся к композиции, в которой по меньшей мере один агент, являющийся источником катионов натрия, выбирают из группы, включающей бикарбонат натрия, вторичный кислый фосфат натрия и их комбинации. В более конкретном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один агент, являющийся источником бикарбонатных анионов, представляет собой бикарбонат натрия. В других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один агент, являющийся источником фосфатных ионов, выбирают из группы, включающей фосфат натрия, вторичный кислый фосфат натрия, средний фосфат натрия и их комбинации. В более конкретном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один агент, являющийся источником фосфатных ионов, представляет собой вторичный кислый фосфат натрия. В других вариантах осуществления изобретения в композиции, предлагаемой в изобретении, комбинация физиологически приемлемых забуферивающих агентов содержит также по меньшей мере один агент, который является источником физиологически приемлемого катиона, выбранного из группы, включающей Н+, калий, аммоний, магний и их комбинации.

В другом варианте композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, по меньшей мере один неметаболизируемый защищающий мембрану сахар представляет собой маннит. Некоторые сахарные спирты, в частности являющиеся производными моносахаридов сахарные спирты (например, сорбит, маннит, ксилит, эритрит), представляют собой небольшие гидрофильные молекулы, которые, вероятно, легко могут диффундировать через некоторые липидные барьеры и могут играть важную роль в клеточной стабильности. Маннит, в частности, является известным антиоксидантом, который действует в качестве акцептора гидроксильных радикалов ίη νίνο. Он, вероятно, играет заметную роль в поддержании целостности клеточной мембраны и считается защищающим мембрану сахаром. Другие небольшие полиолы могут также функционировать в качестве защищающих мембрану Сахаров. Важно отметить, что глюкоза и маннит имеют одинаковую мольную массу, составляющую 180 г/моль. Сахарные спирты не метаболизируются эритроцитами.

В контексте настоящего описания указанная осмолярность представляет собой полученную эмпирическим путем величину. Осмолярность является мерой осмотического давления, оказываемого раствором на идеальную полупроницаемую мембрану (которая позволяет свободно проходить воде и полностью препятствует движению растворенного вещества) по сравнению с чистой водой. Осмолярность зависит от количества частиц в растворе, но не зависит от природы этих частиц. Осмолярность простого раствора равна молярности, умноженной на количество частиц на молекулу. Для реальных растворов это явление может быть существенно более сложным. Белки, характеризующиеся многими эквивалентами/л, могут только лишь в незначительной степени вносить вклад в осмолярность, поскольку они состоят из небольшого количества очень крупных частиц. Не все ионы являются свободными в растворе. Катионы могут быть связаны с другими анионами или белками. Не весь объем раствора является водным. Для большей строгости все эти факторы следует учитывать при расчете. Тоничность, величина близко связанная с осмолярностью, и в некоторых случаях более ценная для описания биологических клеточных условий, является мерой осмотического давления, которое субстанция может оказывать на клеточную мембрану, по сравнению с плазмой крови. Осмолярность служит для расчета эффективного градиента для воды при условии, что все оказывающее осмотическое давление растворенное вещество полностью не способно к проникновению. Это облегчает подсчет количества растворенных частиц. Например, 300 мМ раствор глюкозы и 150 мМ раствор Ναί'Ί имеют одинаковую осмолярность. Однако клетки, помещенные в каждый из этих растворов, будут вести себя очень различно. Тоничность представляет собой функциональное понятие, которое описывает тенденцию раствора сопротивляться увеличению внутриклеточного объема.

Согласно другим вариантам осуществления изобретения композиции, предлагаемые в изобретении, имеют осмолярность, составляющую от примерно 200 до примерно 310 мОсм (мосмол). В более конкретных вариантах осуществления изобретения композиции имеют осмолярность от примерно 221 до примерно 280 мОсм. В наиболее конкретном варианте осуществления изобретения осмолярность составляет примерно 270 мОсм.

Как уже отмечалось, КВС метаболизируют глюкозу (ά-глюкоза синоним декстрозы) для создания АТФ. Отходы представляют собой лактат и протоны. Протоны накапливаются, вызывая понижение значения рН и ингибируя дальнейший метаболизм. Бикарбонат был предложен в качестве буферной системы, поскольку он объединяется с протонами и в присутствии ангидразы угольной кислоты (карбонатдегидрогеназы) КБС превращается в воду и диоксид углерода. В контейнере для хранения, в котором может происходить диффузия диоксида углерода, нет условий для осуществления обратной реакции, и реакция идет в направлении образования СО₂. Забуферивающая система на основе бикарбоната обладает значительной емкостью. Бикарбонат в физиологических концентрациях в аддитивном растворе создает рСО2 в растворе, что обеспечивает диффузию вплоть до 1-2 ммолей СО2 в неделю из мешка из полихлорвинила (ПВХ) объемом 600 мл. Однако предыдущие попытки создания предназначенных для хранения КВС аддитивных растворов с бикарбонатам не увенчались успехом с точки зрения синтеза АТФ и пролонгированного эффективного периода хранения. Например, у ВеиБег (ВАО-РМ) описано добавление бикарбоната в растворы, предназначенные для хранения КВС, но при этом не удалось контролировать

- 6 024520 высокие значения рН, приводящие к быстрому истощения АТФ.

Благодаря открытию того факта, что физиологический раствор не является необходимым ингредиентом композиций аддитивных растворов, предназначенных для хранения КВС, и что концентрацию декстрозы можно снижать без отрицательного воздействия на синтез АТФ, авторы настоящего изобретения получили возможность реализовать более широкую вариацию (игру) параметров раствора для повышения значения и более точной настройки рН-забуферивающей системы. Предлагаемая в настоящем изобретении забуферивающая система не только обеспечивает первоначально требуемое значение рН в композиции аддитивного раствора, но может придавать также определенное значение рН суспензии КБС, что в свою очередь, позволяет модулировать внутриклеточное значение рН КБС с целью увеличения до максимума синтеза АТФ. Забуферивающая система, с помощью которой достигается указанная модуляция значения рН, оказывает влияние на период хранения. Таким образом, целенаправленно контролируют забуферивающую емкость или силу рН-забуферивающей системы. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения являются композиции, предлагаемые в изобретении, где композиция имеет значение рН от примерно 8 до примерно 9. В более конкретных вариантах осуществления изобретения значение рН составляет от примерно 8,2 до примерно 8,8. В еще более конкретных вариантах осуществления изобретения значение рН композиции составляет от примерно 8,4 до примерно 8,6, и в еще одном наиболее конкретном варианте осуществления изобретения значение рН композиции составляет примерно 8,5. Еще одним вариантом осуществления изобретения являются композиции, предлагаемые в изобретении, в которых забуферивающая система имеет забуферивающую емкость в суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавляют композицию, обеспечивающую повышение по меньшей мере примерно на 2 мЭкв при значении рН от 6,5 до 7,2 в течение периода хранения, составляющего 6 недель. Предлагаемая в настоящем изобретении забуферивающая система может обеспечивать забуферивающую емкость по меньшей мере на уровне указанного значения, но может придавать и более высокие забуферивающие емкости суспензии КВС, тем самым еще более удлиняя период хранения КВС.

При создании изобретения были определены необходимые диапазоны ингредиентов композиции, обеспечивающие указанные в настоящем описании преимущества. Одним из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, является композиция, содержащая аденин в концентрации примерно 1-3 мМ, декстрозу в концентрации от примерно 20 до примерно 115 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации от примерно 15 до примерно 60 мМ, бикарбонат натрия в концентрации от примерно 20 до примерно 130 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации от примерно 4 до примерно 20 мМ. В более конкретном варианте осуществления изобретения композиция содержит аденин в концентрации примерно 2 мМ, декстрозу в концентрации от примерно 60 до примерно 100 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации от примерно 40 до примерно 60 мМ, бикарбонат натрия в концентрации от примерно 22 до примерно 40 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации от примерно 7 до примерно 15 мМ. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения композиция содержит аденин в концентрации примерно 2 мМ, декстрозу в концентрации примерно 80 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации примерно 55 мМ, бикарбонат натрия в концентрации примерно 26 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации примерно 12 мМ, и значение рН композиции составляет примерно 8,5.

В настоящем изобретении предложены также варианты способа. Одним из таких вариантов осуществления изобретения является способ консервации эритроцитов (КВС) с целью хранения в течение определенного периода времени. Способ заключается в том, что: (а) смешивают образец собранной цельной крови, которая содержит КВС, подлежащие хранению, и плазму, с антикоагулянтным раствором, получая тем самым суспензию собранной цельной крови; (б) обрабатывают суспензию собранной цельной крови для уменьшения содержания плазмы и концентрирования КВС, получая в результате эритроцитарную массу; (в) смешивают эритроцитарную массу с водной композицией в количестве, достаточным для получения суспензии КВС, в которой КВС присутствуют в концентрации от примерно 35 до примерно 70 об.%; (г) охлаждают суспензию КВС до температуры от примерно 1 до примерно 6°С; и (д) хранят охлажденную суспензию КВС в соответствиями со стандартными для банков крови процедурами, известными в данной области. Водная композиция в основном состоит из: аденина; декстрозы; по меньшей мере одного неметаболизируемого защищающего мембрану сахара и рН-забуферивающей системы. рН-забуферивающая система содержит комбинацию физиологически приемлемых забуферивающих агентов, включая по меньшей мере один агент, который является источником бикарбонатных анионов, по меньшей мере один агент, являющийся источником фосфатных анионов, и по меньшей мере один агент, являющийся источником натриевых катионов, где рН-забуферивающая система присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы композиция могла поддерживать значение рН суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавляют композицию, на уровне, достаточном для создания и поддержания в процессе периода хранения равновесной реакции в эритроцитах, которая более благоприятна для гликолиза по сравнению с синтезом 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) из 1,3-ДФГ, что создает тем самым чистый прирост аденозинтрифосфата (АТФ) при реакции равновесия в течение периода хранения. При приготовлении раствор разделяют с целью отделения декстрозы и фосфата и бикарбоната в процессе тепловой стерилизации.

- 7 024520

КВС, которые можно применять согласно настоящему изобретению, представляют собой КВС, которые отделены от плазмы и ресуспендированы в антикоагулянтном растворе с помощью обычного процесса получения компонентов. В целом, метод состоит в следующем: стандартный образец цельной крови (450 ±45 мл), содержащий КВС и плазму, смешивают с антикоагулянтным раствором (примерно 63 мл) с получением суспензии цельной крови. Можно использовать также объемы раствора, пропорционально увеличенные или уменьшенные в зависимости от объемов крови, взятой у доноров, такие как от 400±40 мл до 500±50 мл. Затем суспензию цельной крови центрифугируют для отделения КВС от плазмы крови, получая в результате эритроцитарную массу. Производительность всего процесса повышается при снижении лейкоцитов с помощью общепринятых методов.

Приемлемые антикоагулянты представляют собой общепринятые антикоагулянты, для которых известно, что их можно применять для хранения КВС. Предпочтительными антикоагулянтами являются цитратные антикоагулянты, которые имеют значение рН от 5,5 до 8,0, например ЦФД, ЦФД половинной силы и т.п. Наиболее предпочтительным антикоагулянтом является ЦФД.

Затем суспензию КВС, как правило, хранят в стандартных мешках из ПВХ для хранения крови, используя либо мешок для сбора, либо предназначенные для переноса упаковки из ПВХ различного размера в зависимости от объема хранящихся аликвот. Суспензию КВС хранят при температуре примерно 1-6°С с использованием стандартной для банков крови процедуры, описанной в руководстве Клиническая практика трансфузии крови (СйшсаКРгасйсе о£ В1оой ТгаикГикюи, под ред. Рс1/ и МуцНег. изд-во СЬигсЫ11-Ыуш§81оп риЬйкйегк, Ν.Υ., 1981. Все процитированные выше и ниже документы включены в настоящее описание в качестве ссылки. Согласно конкретному варианту способа, предлагаемого в изобретении, суспензию КВС можно применять для непосредственной инфузии в организм пациента, который нуждается в такой инфузии. Поскольку мешки из ПВХ для хранения крови удовлетворяют промышленным стандартам, то согласно настоящему изобретению для хранения можно применять широкое разнообразие мешков, приспособленных для хранения суспензии КВС, которые, например, могут при необходимости содержать различные пластификаторы. Соответствующие компоненты мешка или контейнера, применяемого в технологии хранения КВС, не обсуждаются в данном описании, но они очевидны обычным специалистам в данной области, и поэтому для воплощения на практике настоящего изобретения можно применять контейнеры, полученные с использованием многочисленных технологий.

Аддитивные растворы, предлагаемые в изобретении, можно применять также для регидратации лиофилизированных КВС или при оттаивании хранящейся замороженной крови или компонента крови, например КВС.

В конкретных вариантах способа консервации КВС, предлагаемого в изобретении, по меньшей мере один неметаболизируемый защищающий мембрану сахар представляет собой моносахарид, являющийся производным сахарного спирта, и в более конкретном варианте неметаболизируемый защищающий мембрану сахар представляет собой маннит. В дополнительных вариантах способа по меньшей мере один агент, являющийся источником натриевых катионов, выбирают из группы, включающей бикарбонат натрия, вторичный кислый фосфат натрия и их комбинации. В конкретных вариантах по меньшей мере один агент, являющийся источником бикарбонатных анионов, представляет собой бикарбонат натрия. В других вариантах способа консервации КВС, предлагаемого в изобретении, по меньшей мере один агент, являющийся источником фосфатных ионов, выбирают из группы, включающей фосфат натрия, вторичный кислый фосфат натрия, средний фосфат натрия и их комбинации, в более конкретных вариантах по меньшей мере один агент, являющийся источником фосфатных ионов, представляет собой вторичный кислый фосфат натрия. В других вариантах способа, предлагаемого в изобретении, комбинация физиологически приемлемых забуферивающих агентов дополнительно содержит по меньшей мере один агент, являющийся источником физиологически приемлемого катиона, выбранного из группы, включающей Н+, калий, аммоний, магний и их комбинации.

В других вариантах способа консервации КВС, предлагаемого в изобретении, осмолярность композиции составляет от примерно 200 до примерно 310 мОсм. В конкретных вариантах осмолярность составляет от примерно 221 до примерно 280 мОсм и в наиболее конкретном варианте осмолярность составляет примерно 270 мОсм. В других вариантах способа, предлагаемого в изобретении, значение рН композиции составляет от примерно 8 до примерно 9. В конкретных вариантах значение рН составляет от примерно 8,2 до примерно 8,8 и в более конкретных вариантах значение рН композиции составляет от примерно 8,4 до примерно 8,6. В наиболее конкретном варианте значение рН композиции составляет примерно 8,5. В другом варианте способа консервации КВС, предлагаемого в изобретении, забуферивающая система обладает забуферивающей емкостью в суспензии эритроцитов (КВС), к которой добавляют композицию, которая повышается на 2 мЭкв при значении рН от 6,5 до 7,2 при хранении в течение 6 недель.

В других вариантах способа консервации КВС, предлагаемого в настоящем изобретении, композиция обладает способностью поддерживать значение рН суспензии эритроцитов (КВС), к которым добавляют композицию, на уровне от примерно 6,4 до примерно 7,4. В конкретных вариантах способа композиция обладает способностью поддерживать значение рН суспензии эритроцитов (КВС), к которым ком- 8 024520 позиция добавлена, на уровне от 7,0 и менее чем примерно 7,2, и в еще более конкретных вариантах способа композиция обладает способностью поддерживать значение рН суспензии эритроцитов (КВС), к которым композиция добавлена, на уровне более чем примерно 7,1 и мене чем 7,2.

В способах, предлагаемых в настоящем изобретении, используются также конкретные диапазоны необходимых ингредиентов композиции. В одном из вариантов способа композиция содержит аденин в концентрации примерно 1-3 мМ, декстрозу в концентрации от примерно 20 до примерно 115 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации от примерно 15 до примерно 60 мМ, бикарбонат натрия в концентрации от примерно 20 до примерно 130 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации от примерно 4 до примерно 20 мМ. В более конкретном варианте композиция содержит аденин в концентрации примерно 2 мМ, декстрозу в концентрации от примерно 60 до примерно 100 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации от примерно 40 до примерно 60 мМ, бикарбонат натрия в концентрации от примерно 22 до примерно 40 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации от примерно 7 до примерно 15 мМ, в наиболее конкретном варианте композиция содержит аденин в концентрации примерно 2 мМ, декстрозу в концентрации примерно 80 мМ, неметаболизируемый защищающий мембрану сахар в концентрации примерно 55 мМ, бикарбонат натрия в концентрации примерно 26 мМ и вторичный кислый фосфат натрия в концентрации примерно 12 мМ, и, кроме того, значение рН композиции составляет примерно 8,5. Согласно способу, предлагаемому в изобретении, аддитивный раствор добавляют к суспензии эритроцитарной массы в количестве, достаточном для получения терапевтически эффективного количества для восстановления КБС в клеточной суспензии. Предпочтительно аддитивный раствор добавляют в объеме от примерно 60 до примерно 400 мл, предпочтительно от примерно 100 до примерно 150 мл, наиболее предпочтительно примерно 110 мл. Раствор, как правило, применяют в объемном соотношении раствора и собранной цельной крови 1:4,5 (100 мл на 450 мл собранной цельной крови, 111 мл на 500 мл собранной цельной крови или в эквивалентных объемах). В конкретных вариантах способа консервации КВС, предлагаемого в настоящем изобретении, объемное соотношение композиции и собранной цельной крови составляет примерно 1:4,5. В более конкретном варианте объем композиции составляет примерно 110 мл, а объем собранной цельной крови составляет примерно 500 мл.

Объем фракции КВС в клеточной суспензии, т.е. после добавления аддитивного раствора, составляет примерно от 27 до 70% в пересчете на объем всей суспензии. Более предпочтительно объем фракции КВС в клеточной суспензии составляет от примерно 35 до примерно 50%. Наиболее предпочтительно объем фракции КВС в клеточной суспензии составляет примерно 43% в пересчете на объем всей суспензии.

При создании настоящего изобретения в процессе периода хранения осуществляли мониторинг и сбор данных, относящихся к здоровью (качеству) эритроцитов. Как показано на фиг. 1 и 2, хранение согласно настоящему изобретению приводило к повышению качества эритроцитов в течение более продолжительных промежутков времени, а также при использовании меньших объемов. Как указано выше, повреждение при хранении крови является результатом процесса апоптоза, и мембрана эритроцитов подвергается физиологическим и морфологическим изменениям, соответствующим запрограммированной гибели клеток. Для эритроцитов известно, что в процессе хранения площадь поверхности мембран уменьшается, что приводит к изменениям формы, т.е. к переходу от двояковогнутой формы, которая обеспечивает максимальную для данного объема площадь поверхности, облегчает диффузию газов и питательных веществ, к более сферической форме, которая характерна для погибающей, хрупкой клетки. Мембрана эритроцита первоначально является гибкой и способной к деформации, что облегчает проникновение через мелкие капилляры. Указанное изменение общей формы сопровождается отщеплением от мембраны микропузырьков с образованием спикул на наружной поверхности эритроцита, так что в конце этого процесса клетка при ее обследовании напоминает покрытого колючками ежа (поэтому указанный процесс называют пойкилоцитным (приводящим к образованию шипов) изменением и конечную форму перед лизисом называют пойкилоцитом с шиповидными отростками). Полученная в результате хрупкость в конце концов приводит к лизису и гибели клетки. Скорость гемолиза является индикатором обширности и серьезности этой активности. Помимо того, что они приводят к неприемлемым уровням гемолиза в условиях хранения, эти морфологические изменения запускают механизм клиренса в организме больного реципиента при реинфузии хранящихся эритроцитов, снижая восстановление после реинфузии и снижая эффективность трансфузии. Применение композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, и способов консервации эритроцитов, в которых их используют, приводит к пониженной осмотической хрупкости и пониженной скорости гемолиза. Это соответствует повышенному сохранению площади поверхности клеточной мембраны и морфологического состояния, и, как следствие, повышает восстановление жизнеспособных эритроцитов и снижает клиренс из организма подвергнутого реинфузии больного-реципиента после реинфузии эритроцитов.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является способ повышения сохранности мембраны эритроцитов (КВС) и подавления апоптоза КВС в течение периода хранения. Способ заключается в том, что хранят КВС в течение периода хранения в суспензиях, в которые добавлены композиции, предлагаемые в изобретении. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения

- 9 024520 концентрация микропузырьков снижается примерно на 75% по сравнению с концентрациями, выявленными в эритроцитах при хранении в течение такого же периода хранения в суспензиях КБ С, содержащих Αδ-3.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ снижения хрупкости эритроцитов (КВС) и подавления гемолиза КВС в течение периода хранения. Способ заключается в том, что хранят КВС в течение периода хранения в суспензиях, к которым добавлены композиции, предлагаемые в изобретении. Другим вариантом осуществления изобретения являются способы повышения жизнеспособности эритроцитов (КВС) после периода хранения и после инфузии в организм пациента, который нуждается в такой инфузии, и снижения скорости клиренса из организма пациента после инфузии КВС. Способы заключаются в том, что хранят КВС в течение периода хранения в суспензиях, к которым добавлены композиции, предлагаемые в изобретении.

Композиция аддитивного раствора, предлагаемая в изобретении, обладает несколькими преимуществами по сравнению с известными из прототипов аддитивными растворами. Хранящиеся в ней эритроциты могут храниться в течение более длительного периода, по меньшей мере в течение 8 недель, с более высоким уровнем восстановления через 24 ч ίη νίνο по данным радиоактивного анализа меченных с помощью хрома КВС по сравнению с любым из получивших в настоящее время лицензию аддитивных растворов. Применение композиций, предлагаемых в изобретении, заметно снижает обширность и серьезность повреждения при хранении. В течение периода хранения уровень гемолиза эритроцитов является приемлемым, он составляет 0,2% через 6 недель и 0,4% через 8 недель, все эти уровни ниже принятого ГОЛ предела, составляющего 1% в конце лицензионного срока хранения. Для эритроцитов при их хранении в аддитивных растворах, предлагаемых в изобретении, характерна меньшая потеря мембран в процессе хранения, что продемонстрировано по меньшей концентрации мембранных микропузырьков и меньшей осмотической хрупкости. Можно предполагать, что сохранение мембраны в процессе хранения должно способствовать тому, что КВС, хранившиеся в растворе, будут иметь лучшие характеристики текучести по сравнению с клетками, у которых утрачена большая часть мембран. Сохранение обычной физиологии мембраны подавляет также механизмы, существующие в организме больного-реципиента, которые запускают избирательный клиренс из кровотока и деструкцию эритроцитов. В результате после реинфузии эритроциты дольше сохраняются в организме больного-реципиента и возможно удлиняется восстановление эритроцитов после реинфузии. Кроме того, более длительный период выживания эритроцитов после инфузии может снижать потребность в повторных трансфузиях, что снижает связанные с этим процессом риски для пациента. Растворы, предлагаемые в изобретении, обеспечивают также более высокие концентрации АТФ в КВС во время последних фаз хранения, что, как ожидается, должно улучшать секрецию КВС АТФ и тем самым улучшать текучесть и продолжительность жизни клеток после трансфузии. С прагматической точки зрения можно считать, что растворы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с общепринятыми системами сбора, при которых осуществляют сбор цельной крови в ЦФД или ЦФ2Д для получения свежезамороженной плазмы и тромбоцитов, полученных от произвольных доноров, или для сбора свежей цельной крови для непредвиденных случаев.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, которые даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема настоящего изобретения, как он определен в прилагаемой формуле изобретения.

Примеры

Композиции тестируемых аддитивных растворов	А8-3	ΕΑδ-61	ΕΑ876ν6	ΕΑδ-81
1ЧаС1	70	26	30
ЫаНСОз			30	26
ΝβΗ₂ΡΟ₄	23
Νβ₂ΗΡΟ₄		12	9	12
Аденин	2	2	2	2
1Чаз-цитрат	18
Декстроза	55	110	50	80
Маннит		55	30	55
Объем	110	170	170	ПО
рН	5,8	8.3	8,4	8,5

Пример 1.

В этом примере проиллюстрирован профиль характеристик и преимущества одного из вариантов предлагаемой в изобретении композиции аддитивного раствора, обозначенной как ΕΑδ-81 (см. таблицу). И ΕΑδ-81, и применяемую в качестве примера для сравнения композицию Αδ-3 (МОпсек фирма Ра1 В1ошеФса1) использовали в общепринятых объемах, а другие применяемые в качестве примеров для сравнения композиции ΕΑδ-61 и ΕΑδ-76ν6, использовали в более разбавленных, больших объемах. В состав и ΕΑδ-81, и ΕΑδ-76ν6 входит бикарбонат (см. фиг. 1, на которой содержащие бикарбонат композиции обозначены кружками, а композиции, не содержащие бикарбонат, обозначены ромбами). Композиции,

- 10 024520 которые используют в большем объеме, обозначены закрашенными фигурами, а композиции, которые используют в общепринятых объемах, обозначены незакрашенными фигурами. Подразумевается, что все объемы композиций аддитивных растворов, представленных в настоящем описании, даны из расчета на 500 мл, при этом объемное соотношении раствора и цельной крови составляет 1:4,5.

В первом примере описаны результаты группового исследования, проведенного с целью оценки воздействия ингредиентов раствора для хранения на метаболизм и целостность КВС при 10-недельном хранении в мешках из ПВХ. Групповое исследование снижает наибольший источник вариабельности в общепринятых опытах по хранению крови, который связан с исходными различиями КВС от различных доноров. При групповом исследовании в каждой группе используют некоторое количество клеток каждого донора, сохраняя обычный размер группы. Группы КВС, которые не обладают реактивностью при анализе с помощью непрямого антиглобулинового теста (ΙΑΤ), объединяют в 4 идентичные АВО-группы. Затем каждый набор объединяют, смешивают и разделяют на аликвоты, получая 4 идентичные объединенные группы. В каждом из 4 повторов опыта используют по 1 единице из каждого пула.

Состав композиций Α8-3 и ΕΑ8 представлен в таблице. Композиции, обозначенные как ΕΑ8, получали в лабораторных условиях, используя аденин, сахара и соли фирмы 81дта Сйет1са1к, Сент-Луис, шт. Миссури, имеющие чистоту, соответствующую требованиям фармакопеи США (И8Р), и после стерилизации фильтрацией помещали мешки для хранения объемом 1 л (Код 4К2032, фирма Вах!ет Неаййсате, Дирфилд, шт. Иллинойс), согласно руководству, подробно описанному у Некк и др., ТНе еГГес1к о£ рйокрйа!е, рН, апб Α8 уо1ите оп КВС к!отеб ίη ка1те-абетпе-д1исоке-таппйо1 ко1и1юпк, ТгапШМоп. 40, август 2000, с. 1000-1006, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Мешки для хранения выдерживали при 37°С в течение 2 недель. Затем растворы культивировали и культуры инкубировали в течение еще 2 недель. Стерильность подтверждали по отсутствию роста бактерий и грибов в течение 7-14 дней (тип 8ербСйеск, фирма ВесЮп-Эйкткоп МютоЪю1оду 8ук1етк, Спаркс, шт. Мэдисон), и растворы разделяли на аликвоты по массе и помещали в ПВХ-мешки объемом 600 мл (Код 4К2023, фирма Вах!ет Неаййсате Согр., Дирфилд, шт. Иллинойс). Все операции осуществляли с использованием стерильного присоединяющего устройства (тип 8СИ 312, фирма Тегито Мебюа1 Согр., Элктон, шт. Мэдисон).

Получение единицы хранения КВС.

Стандартные единицы хранения крови (500±55 мл) собирали в 70 мл раствора ЦФ2Д в состоящую из трех мешков систему для сбора (номер кода 127-23, фирма Ра11 Сотротайоп, Ист Хилс, шт. Нью-Йорк). В единицах хранения осуществляли лейкоредукцию (удаление лейкоцитов из цельной крови) с помощью интегрального фильтра для лейкоредукции. Эритроцитарную массу получали путем центрифугирования в течение 5 мин с последующим частичным удалением плазмы (с сохранением 65 мл), после чего в стерильных условиях добавляли указанные объемы Α8 или ΕΑ8. Единицы хранения держали в вертикальном положении при 1-6°С в течение 10 недель, за исключением того, что примерно один раз в неделю осуществляли перемешивание и отбор образца объемом 15 мл.

Оценка ш уйто.

Лейкоредукцию (удаление лейкоцитов из цельной крови) подтверждали с помощью проточной цитометрии. Общую концентрацию гемоглобина (НЪ) оценивали с помощью клинического гематологического анализатора (тип Нета1о1оду Се11 Соийет 8ук1ет, серии 9110+, фирма Вакег, Аллентаун, шт. Пенсильвания). Средний объем клеток (МСУ (средний объем эритроцитов)) определяли по количеству КВС и по микрогематокритному числу хранящейся суспензии. НЪ в супернатанте определяли спектрофотометрически с помощью модифицированного анализа Драбкина, описанного у Мооге и др., А шютотобй йсабоп о£ 1йе ИтаЪкш йетодФЪш аккау £от теакийпд р1акта йетодФЪш ш 1йе гапде о£ 5 1о 2000 тд/б1, Вюсйет Меб 26, 1981, с.167-173, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Процент гемолиза определяли из соотношения свободного и общего НЪ и по гематокритному числу.

Концентрации АТФ КВС определяли в супернатантах депротеинизированных РКВС. Аликвоты клеток смешивали с холодной 10%-ной трихлоруксусной кислотой для осаждения белков крови, центрифугировали при 2700хд в течение 10 мин и свободный от белков супернатант замораживали и хранили при -80°С до анализа. АФТ анализировали ферментативно с помощью поступающего в продажу тестнабора (тип Ртосебитек 366-ИУ, фирма 81дта И1адпокйск, Сент-Луис, шт. Миссури).

Содержание в крови газов, бикарбоната и значение рН определяли или рассчитывали с помощью газового анализатора крови (тип Согтпд 855, Итака, шт. Нью-Йорк). Таким образом, рН оценивали при 37°С. Внеклеточный натрий, калий, хлорид, фосфат, лактат и глюкозу оценивали с помощью программируемого химического анализатора (анализатор типа Нйасй 902, фирма Воейтшдет Маппйеш Сотротайоп, Индианаполис, шт. Индиана). Средний уровень изменения формы КВС при превращением дискоцитов в пойкилоциты с шиловидными отростками и в сфероциты оценивали с помощью метода, описанного у Икту, Мооге и Мапо1о, Могрйо1оду о£ кФтеб, гс|иуепа1еб йитап ету1йтосу1ек, Уох 8апд 28, 1975, с. 176-183, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Микропузырьки определяли в супернатанте в конце периода хранения. Плазму подвергали ультрацентрифугированию, деб- 11 024520 рис пузырьков промывали трижды в физиологическом растворе и затем количественно определяли общее содержание белка методом Бэдфорда (фирма ВюРаД, Ричмонд, шт. Калифорния).

Результаты сравнительного анализа 4 растворов, применявшихся для хранения РВС, проиллюстрированы на фиг. 1 и 2. При использовании всех растворов для хранения концентрация АТФ РВС возрастала в первую неделю хранения (фиг. 1А). При использовании ΕΑδ концентрация АТФ продолжала возрастать в течение второй недели и превышала концентрацию, полученную при использовании Αδ-3, в течение всего периода исследования. В течение 8 недель хранения и далее концентрация АТФ в ΕΑδ-81 была эквивалентной концентрации в ΕΑδ-61 с увеличенным объемом, а при применении композиции ΕΑδ-78, которая имела как увеличенный объем, так и буферную систему на основе бикарбоната, обнаружены несколько более высокие концентрации.

Гемолиз (разрушение эритроцитов) повышался в процессе хранения во всех растворах для хранения (фиг. 1Б). Однако во все моменты времени гемолиз был выше при применении Αδ-3. Он умеренно снижался при использовании ΕΑδ-81 и в большей степени снижался при применении других ΕΑδ. Не выявлено дополнительное снижение гемолиза при использовании бикарбоната в растворах большого объема. Как и ожидалось, применение меньших объемов Αδ, приводило к более высокому гематокритному числу при хранении (фиг. 1В) и снижению объема РВС в процессе хранения при использовании всех растворов.

Концентрации лактата оказались выше во все моменты времени при применении содержащих бикарбонат ΕΑδ (фиг. 1Г). Общее производство лактата во время 8-недельного хранения составляло 9 мМ при применении Αδ-3, 12 мМ при применении ΕΑδ-61, 13 мМ при применении ΕΑδ-81 и 15 мМ при применении ΕΑδ-78. Значение рН вне- и внутри клеток также было выше практически во все моменты времени, но различие внутриклеточных значений рН не было статистически значимым (фиг. 1Д и 1Ε). Зависимость от времени потери бикарбоната и повышения и понижения уровня РСО2, что обеспечивает забуферивание в суспендирующем растворе, представлена на фиг. 1Ж и 1З.

В целом, сравнение композиции ΕΑδ-81, предлагаемой в изобретении, и Αδ-3 при хранении клеток свидетельствует о лучшей утилизации энергии, что приводит к получению более высоких концентраций АТФ, меньшему уровню гемолиза, улучшенной морфологии, меньшему образованию микропузырьков и несколько более высокому значению рН при применении первой из указанных композиций. Ранее изученные ΕΑδ, прежде всего ΕΑδ-76ν6, обладали даже большим преимуществом в некоторых аспектах, но их применение в большем объеме приводит к большему разведению РВС при хранении, что может обусловливать гемодилюцию при многократной трансфузии пациентам-реципиентам.

Пример 2.

В этом примере проиллюстрировано, что предлагаемая в изобретении композиция ΕΑδ обеспечивает хранение РВС при использовании общепринятого объема аддитивного раствора в течение 8 недель, при этом обнаружена более высокая способностью к восстановлению, меньший уровень гемолиза и повышенное сохранение мембран по сравнению с известным, предназначенным для 6-недельного хранения раствором.

Были отобраны 12 добровольцев, удовлетворяющих принятым для доноров критериям Департамента по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средства США (ΡΌΑ) и Американской ассоциации банков крови. У людей брали по 500 мл (одна единица хранения) цельной крови, которую собирали в содержащие ЦФ2Д первичный мешок (номер кода 127-23, фирма Ра11 Согроπιΐίοη. Ист Хилс, шт. Нью-Йорк), и подвергали лейкоредукции, удаляя всю плазму за исключением примерно 65 мл.

Добавляли 110 мл ΕΑδ-81 и растворы эритроцитарной массы хранили в вертикальном положении при 1-6°С, при этом половину образцов (η=6) хранили в течение 6 недель, а половину образцов (η=6) в течение 8 недель. За неделю до окончания срока хранения в стерильных условиях отирали образцы единиц хранения и культивировали. Если рост культуры не был обнаружен, то небольшую аликвоту хранящихся РВС метили с помощью 51-Сг и возвращали в организм донора с использованием протокола Μοτοίί для оценки восстановления РВС с использованием одной метки.

Строили графики зависимости средних значений и стандартных отклонений и рассчитывали другие характерные статистические данные для групп хранения с помощью программного обеспечения для электронных таблиц (Εχοβΐ, фирма Μκτοδοίΐ, Ричмонд, шт. Вашингтон). Производство лактата в каждой из систем хранения рассчитывали, исходя из начальной и конечной концентраций, и объемы систем хранения регулировали в зависимости от уровня гемоглобина и белка в сыворотке. Прямоугольные диаграммы данных о восстановлении РВС получали с помощью программы δуδΐаΐ Ует. 6 (фирма δΡδδ 1пс., Чикаго, шт. Иллинойс).

РВС при хранении после лейкоредукции в ЦФ2Д/ЕА8-81 в течение 6 недель имели средний аутологический уровень восстановления через 24 ч ίη νίνο 85±5%, а уровень восстановления ίη νίνο после 8-недельного хранения 87±2% (фиг. 2). Обнаруженное аномальное более высокое восстановление при более длительном хранении, вероятно, связано с небольшим объемом выборки при исследовании и большой вариабельностью способности к хранению крови, полученной от различных индивидуумов.

- 12 024520

Однако способность к восстановлению оказалась выше по сравнению с другими лицензированными растворами для хранения и удовлетворяла критериям лицензирования, принятым в США и Европе (т.е. при их применении происходит восстановление более 75% и гемолиз составляет менее 1% (критерии, принятые в США) и восстановление более 75% и гемолиз менее 0,8% (критерии, принятые в Европе). Полученная в результате гемолиза фракция ВВС в этом опыте составляла 0,2±0,2 через 6 недель и 0,4±0,2 через 8 недель. Концентрация белка в микропузырьках ВВС составляла 8±4 через 6 недель и 12±6 мг/дл через 8 недель, это позволяет оценить, что было потеряно только примерно 5% гемоглобина ВВС.

Улучшенная характеристика хранения при использовании композиции ΕΑδ-81, предлагаемой в изобретении, как с позиций продолжительности хранения, так и с позиций улучшения физиологической функции продукта после его инфузии, вероятно, обусловлена нескольким факторами. Во-первых, новая система модуляции значения рН обеспечивает непрерывное рН-забуферивающее действие суспендированного раствора в течение изученного периода хранения, что является достаточным для поддержания значения рН во внутриклеточном пространстве на уровне, достаточном для создания внутреннего равновесия в клетке в отношении гликолиза и для противодействия приводящему к поглощению АТФ производству 2,3-ДФГ. Кроме того, более высокая внеклеточная концентрация фосфата при применении этой композиции участвует в ограничении внеклеточной концентрации Са++, что в свою очередь, подавляет некоторые связанные с апоптозом процессы, такие как перемешивание фосфолипидов и деформация, и потеря мембран. Это приводит к улучшенному восстановлению после инфузии и более высокому качеству мембран у вводимых ВВС, дополнительно снижая запуск механизмов быстрого клиренса ίη У1уо у подвергнутых инфузии пациентов, и приводит к более высокому проценту способных к восстановлению введенных ВВС в течение более длительного периода после инфузии. Композиция ΕΑδ-81, из которой удален ЫаС1, является наиболее предпочтительной, поскольку содержит более высокие количества определенных забуферивающих соединений, сохраняя при этом приемлемую осмолярность, она обеспечивает более эффективную, более продолжительную модуляцию значений рН в суспензии ВВС, в которую добавлен аддитивный раствор, и содержит большее количество доступного фосфата для минимизации нежелательных клеточных процессов, связанных с повышением концентрации Са++ и понижением концентрации АТФ. Кроме того, возможность приготавливать ΕΑδ-81 в общепринятых объемах делает ее особенно пригодной для применения при множественных и массированных трансфузиях пациентам.

Claims

1. Водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С, где композиция свободна от ионов хлора экзогенного происхождения и состоит из аденина в количестве примерно 2 мМ, декстрозы в количестве примерно 80 мМ, неметаболизируемого защищающего мембрану сахара в количестве примерно 55 мМ, бикарбоната натрия в количестве примерно 26 мМ и вторичного кислого фосфата натрия в количестве примерно 12 мМ.

2. Водная композиция по п.1, значение рН которой составляет примерно 8,5.

3. Водная композиция по п.1, осмолярность которой составляет от примерно 200 до примерно 310 мОсм.

4. Водная композиция по п.3, осмолярность которой составляет от примерно 221 до примерно 280 мОсм.

5. Водная композиция по п.4, осмолярность которой составляет примерно 270 мОсм.

6. Водная композиция, предназначенная для хранения эритроцитов при температуре от примерно 1 до примерно 6°С, где композиция свободна от ионов хлора экзогенного происхождения и состоит из

1-3 мМ аденина;

20-115 мМ декстрозы;

4-60 мМ вторичного кислого фосфата натрия.

7. Водная композиция по п.6, значение рН которой составляет примерно 8,5.

8. Водная композиция по п.6, осмолярность которой составляет от примерно 200 до примерно 310 мОсм.

9. Водная композиция по п.8, осмолярность которой составляет от примерно 221 до примерно 280 мОсм.

10. Водная композиция по п.9, осмолярность которой составляет примерно 270 мОсм.