JP5700576B2 - 細胞除去方法、細胞除去システム及び白血球除去方法 - Google Patents
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Description
また、遠心分離機の遠心力を用いて前記分離層を前記フィルタ側に押し出し、前記遠心力を変えることにより、前記分離層の前記フィルタの通過速度を変えてもよい。
前記白血球の濃度が高い分離層がフィルタを通過する際には通過速度を遅くし、前記白血球の濃度が低い分離層がフィルタを通過する際には通過速度を速くし、前記白血球の濃度が中間の分離層がフィルタを通過する際には通過速度を中間にしてもよい。
本実験で使用したフィルタの作成方法は、次の通りである。
(1)ろ材の作製:
フィルタの材質として次のポリマーを使用した。
2−ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)とジメチルアミノエチルメタクリレート(DM)からなるランダムポリマー(HEMAとDMのモル組成比は97:3。以下「HM−3」と略す。)。
HM−3は、エタノール中のモノマー濃度を1モル/Lとし、開始剤として2,2’−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)(和光純薬工業社製、商品名V−65)を0.005モル/Lの存在下、60℃で8時間ランダム重合することによって合成された。
まずHM−3を水/エタノールの混合溶媒(水/エタノールの重量比が5/95)に溶解し、0.1重量%の溶液を調製した。この溶液に以下のA、Bの不織布を浸し、余分な液を除去した後、40℃で16時間真空乾燥を行った。
A: 平均繊維直径1.8μmのメルトブロー法により製造されたポリエステル不織布
B: 平均繊維直径1.2μmのメルトブロー法により製造されたポリエステル不織布
(2)フィルタの作製
前記のHM−3によりコーティングされた平均繊維直径1.8μmのメルトブロー法により製造されたポリエステル不織布を充填密度0.18g/cm3、厚み1.5mmに、その下層に同様の平均繊維直径1.2μmのポリエステル不織布を充填密度0.2g/cm3 、厚み3mmになるように、有効濾過面積67mm×67mmの容器に充填した。
上記フィルタを用いた実施例1の血液の遠心ろ過方法は次の通りである。
(1)健常人から250mLのCPD(Citrate-Phosphate-Dextrose)を加えた新鮮全血(以下、「全血」とする。)を血液バッグに採取した。
(2)全血を250mLの遠心用ボトルに移し、遠心カップに挿入し、1250Gで5分間遠心後、遠心カップから遠心用ボトルを取り出した。
(3)ボトル中には、約140mLの赤血球濃厚層と、約110mLの多血小板血漿層が形成されていた。
(4)約110mLの多血小板血漿層を吸引し、ボトルに回収した。このとき、赤血球濃厚層との界面への影響がないよう、吸引は注意深く行われた。
(5)ボトル中に残った赤血球濃厚層を上部から35mL注意深く吸引採取し、それを赤血球濃厚液の第一層とした。白血球の濃度(ミクロセルカウンターによって計測した)は、469×10e2/μLであり、ヘマトクリットは30.5%であり、血小板の濃度は29.1×10e4/μLであった。
(6)さらにボルト中に残った赤血球濃厚層を上部から35mL注意深く吸引採取し、それを赤血球濃厚液の第二層とした。白血球の濃度は、141×10e2/μLであり、ヘマトクリットは53.5%であり、血小板の濃度は9.1×10e4/μLであった。
(7)つぎにボトル中に残っている赤血球濃厚層を上部から30mL採取し、5mLのSAGM液(赤血球保存液)と混和して、35mLの赤血球濃厚液の第三層とした。白血球の濃度は、22×10e2/μLであり、ヘマトクリットは60.2%であり、血小板の濃度は4×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は26×10e2/μLであり、ヘマトクリットは70.2%、血小板濃度は5×10e4/μLであった。
(8)つぎにボトル中の残りの赤血球濃厚層を、上部から26mL採取し、9mLのSAGM液と混和して、35mLの赤血球濃厚液の第四層とした。白血球の濃度は、9.3×10e2/μLであり、ヘマトクリットは61.3%であり、血小板の濃度は2×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は12.5×10e2/μLであり、ヘマトクリットは82.5%、血小板濃度は3×10e4/μLであった。
(9)つぎにボトル中の残りの赤血球濃厚層を、上部から18mL採取し、8mLのSAGM液と混和して、26mLの赤血球濃厚液の第五層とした。白血球の濃度は、7.6×10e2/μLであり、ヘマトクリットは60.5%であり、血小板の濃度は1×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は11.0×10e2/μLであり、ヘマトクリットは87.4%、血小板濃度は1×10e4/μLであった。
(10)上記白血球除去フィルタの入口側に、五口に別れた軟質塩化ビニル製導管を接続した。フィルタの出口側には、回収用血液バッグを末端に接続した同様の導管を接続した。前述の赤血球濃厚液の第一層から第五層のそれぞれを容量50mLの5つのシリンジに移し、導管の五口の接続口にそれぞれのシリンジを接続した。各シリンジ内の赤血球濃厚液が均一になるように、シリンジを十分転倒混和した後に、流速20mL/分に設定されたシリンジポンプに設置した。
(11)赤血球濃厚液の第五層の入ったシリンジに対しシリンジポンプのスイッチを入れ、第五層を送液してフィルタによる濾過を開始した。第五層の赤血球濃厚液がシリンジ内になくなったら、第四層の赤血球濃厚液の送液を行った。その後、第三層、第二層、第一層の赤血球濃厚液の送液を順に行った。このようにして、白血球濃度の低い第五層から白血球濃度の高い第一層まで順に送液してフィルタを通し、回収用血液バックに回収した。
(12)最終的に回収用血液バッグに回収された赤血球濃厚液は、145mLであった。混和後サンプリングして計測した白血球の濃度(フローサイトメーター装置を用いてカウントした)は、3.01個/μLであり、ヘマトクリットは57.6%であり、血小板は検出されなかった。最終的に回収された白血球除去赤血球濃厚液145mL中の総白血球数は0.44×10e6個であった。
上記フィルタを用いた比較例1の血液の遠心ろ過方法は次の通りである。
(1)健常人から250mLのCPDを加えた全血を血液バッグに採取した。
(2)全血を250mLの遠心用ボトルに移し、遠心カップに挿入し、1250Gで5分間遠心後、遠心カップから遠心用ボトルを取り出した。
(3)ボトル中には、約140mLの赤血球濃厚層と、約110mLの多血小板血漿層が形成されていた。
(4)約110mLの多血小板血漿層を吸引し、ボトルに回収した。このとき、赤血球濃厚層との界面への影響がないよう、吸引は注意深く行われた。
(5)ボトル中に残った赤血球濃厚層にSAGM液を22mL添加した後均一になるよう混和し、162mLの赤血球濃厚液を調製した。白血球の濃度は、132×10e2/μLであり、ヘマトクリットは53.7%であり、血小板の濃度は27.3×10e4/μLであった。調製された赤血球濃厚液162mL中の総白血球数は2.1×10e9と計算された。
(6)赤血球濃厚液を35mL×4本と22mL×1本のシリンジに分注し、実施例1と同じ方法で作成した白血球除去フィルタの入口側に、五口に別れた軟質塩化ビニル製導管を接続した。出口側には、回収用血液バッグを末端に接続した同様の導管を接続した。その後、各シリンジを、導管の五口の接続口にそれぞれ接続した。各シリンジ内の赤血球濃厚液が均一になるように、シリンジを十分転倒混和した後に、流速20mL/分に設定されたシリンジポンプに設置した。全シリンジには、同じ白血球濃度の赤血球濃厚液が入っている。
(7)赤血球濃厚液が入った第一本目のシリンジに対しシリンジポンプのスイッチを入れ、赤血球濃厚液を送液してフィルタによる濾過を開始した。第一本目の赤血球濃厚液がシリンジ内になくなったら、第二本目のシリンジの送液を開始した。このようにして、全五本のシリンジの赤血球濃厚液をフィルタに通し、回収用血液バックに回収した。
(8)最終的に回収用血液バッグに回収された赤血球濃厚液は、145mLであった。混和後サンプリングして計測した白血球の濃度(フローサイトメーター装置を用いてカウントした)は、7.46個/μLであり、ヘマトクリットは53.7%であり、血小板は検出されなかった。最終的に回収された白血球除去赤血球濃厚液145mL中の総白血球数は1.08×10e6個であった。
上記フィルタを用いた比較例2の血液の遠心ろ過方法は次の通りである。
(1)健常人から250mLのCPDを加えた全血を血液バッグに採取した。
(2)全血を250mLの遠心用ボトルに移し、遠心カップに挿入し、1250Gで5分間遠心後、遠心カップから遠心用ボトルを取り出した。
(3)ボトル中には、約140mLの赤血球濃厚層と、約110mLの多血小板血漿層が形成されていた。
(4)約110mLの多血小板血漿層を吸引し、ボトルに回収した。このとき、赤血球濃厚層との界面への影響がないよう、吸引は注意深く行われた。
(5)ボトル中に残った赤血球濃厚層を上部から35mL注意深く吸引採取し、それを赤血球濃厚液の第一層とした。白血球の濃度(ミクロセルカウンターによって計測した)は、469×10e2/μLであり、ヘマトクリットは30.5%であり、血小板の濃度は29.1×10e4/μLであった。
(6)さらにボルト中に残った赤血球濃厚層を上部から35mL注意深く吸引採取し、それを赤血球濃厚液の第二層とした。白血球の濃度は、141×10e2/μLであり、ヘマトクリットは53.5%であり、血小板の濃度は9.1×10e4/μLであった。
(7)つぎにボトル中に残っている赤血球濃厚層を上部から30mL採取し、5mLのSAGM液(赤血球保存液)と混和して、35mLの赤血球濃厚液の第三層とした。白血球の濃度は、22×10e2/μLであり、ヘマトクリットは60.2%であり、血小板の濃度は4×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は26×10e2/μLであり、ヘマトクリットは70.2%、血小板濃度は5×10e4/μLであった。
(8)つぎにボトル中の残りの赤血球濃厚層を、上部から26mL採取し、9mLのSAGM液と混和して、35mLの赤血球濃厚液の第四層とした。白血球の濃度は、9.3×10e2/μLであり、ヘマトクリットは61.3%であり、血小板の濃度は2×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は12.5×10e2/μLであり、ヘマトクリットは82.5%、血小板濃度は3×10e4/μLであった。
(9)つぎにボトル中の残りの赤血球濃厚層を、上部から18mL採取し、8mLのSAGM液と混和して、26mLの赤血球濃厚液の第五層とした。白血球の濃度は、7.6×10e2/μLであり、ヘマトクリットは60.5%であり、血小板の濃度は1×10e4/μLであった。なお希釈率から、SAGM液を添加する前の白血球濃度は11.0×10e2/μLであり、ヘマトクリットは87.4%、血小板濃度は1×10e4/μLであった。
(10)上記白血球除去フィルタの入口側に、五口に別れた軟質塩化ビニル製導管を接続した。フィルタの出口側には、回収用血液バッグを末端に接続した同様の導管を接続した。前述の赤血球濃厚液の第一層から第五層のそれぞれを容量50mLの5つのシリンジに移し、導管の五口の接続口にそれぞれのシリンジを接続した。各シリンジ内の赤血球濃厚液が均一になるように、シリンジを十分転倒混和した後に、流速20mL/分に設定されたシリンジポンプに設置した。
(11)赤血球濃厚液の第一層の入ったシリンジに対しシリンジポンプのスイッチを入れ、第一層を送液してフィルタによる濾過を開始した。第一層の赤血球濃厚液がシリンジ内になくなったら、第二層の赤血球濃厚液の送液を行った。その後、第三層、第四層、第五層の赤血球濃厚液の送液を順に行った。このようにして、白血球濃度の高い第一層から白血球濃度の低い第五層まで順に送液してフィルタを通し、回収用血液バックに回収した。
(12)最終的に回収用血液バッグに回収された赤血球濃厚液は、145mLであった。混和後サンプリングして計測した白血球の濃度(フローサイトメーター装置を用いてカウントした)は、38.2個/μLであり、ヘマトクリットは58.7%であり、血小板は検出されなかった。最終的に回収された白血球除去赤血球濃厚液145mL中の総白血球数は5.54×10e6個であった。
2 遠心分離機
10 血液バック
10a 第1の端部
10b 第2の端部
11 第1の血液成分バック
12 第2の血液成分バック
13 第1の流路
14 第2の流路
15 フィルタ
30 第1の開閉弁
31 第2の開閉弁
A〜D 分離層
F 遠心力方向
Claims (16)
- 体液から所定の細胞を除去する方法であって、
第1のバックに収容された体液に遠心分離による遠心力を与えて、前記所定の細胞の濃度勾配を有する分離層を形成する工程と、
前記分離層を前記所定の細胞の濃度勾配に従って前記所定の細胞の濃度が低い側から順にフィルタに通して、前記分離層から前記所定の細胞を除去する工程と、
前記所定の細胞が除去された前記分離層を第2のバックに収容する工程と、を有し、
前記分離層を前記フィルタに通す際に、前記所定の細胞の濃度に応じて通過速度を変える、細胞除去方法。 - 前記遠心分離による遠心力を用いて、前記分離層を前記フィルタに通す、請求項1に記載の細胞除去方法。
- 前記第2のバックには、前記分離層から前記所定の細胞が除去されて生成された所定の体液成分が収容され、
前記体液成分を保存するための保存液を、前記フィルタに通す前の前記分離層に加える、請求項1又は2に記載の細胞除去方法。 - 前記遠心力により分離された、前記分離層以外の他の分離層を、前記分離層とは別の第3のバックに収容する、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞除去方法。
- 前記所定の細胞は、病原物質である、請求項1〜4のいずれかに記載の細胞除去方法。
- 前記体液は、血液であり、
前記所定の細胞は、白血球であり、
前記分離層から所定の細胞が除去されて、赤血球を主成分とする血液成分が生成される、請求項1〜5のいずれかに記載の細胞除去方法。 - 遠心分離機に搭載されて、体液から所定の細胞を除去する細胞除去システムであって、
体液を収容する体液バックと、
体液中の相対的に細胞濃度の高い第1の体液成分を収容する第1の体液成分バックと、
体液中の相対的に細胞濃度の低い第2の体液成分を収容する第2の体液成分バックと、
前記第1の体液成分バックと前記体液バックを接続する第1の流路と、
前記第2の体液成分バックと前記体液バックを接続する第2の流路と、
前記第1の流路に設けられ、当該流路を通過する体液成分から所定の細胞を除去するフィルタと、
前記第1の流路の開閉を行う第1の開閉弁と、
前記第2の流路の開閉を行う第2の開閉弁と、を有し、
前記第1の流路と前記第2の流路は、前記体液バックにおける、前記遠心分離機に搭載された際の当該遠心分離機による遠心力方向側の端部に接続されている、細胞除去システム。 - 遠心分離機に搭載されて、体液から所定の細胞を除去する細胞除去システムであって、
体液を収容する体液バックと、
体液中の相対的に細胞濃度の高い第1の体液成分を収容する第1の体液成分バックと、
体液中の相対的に細胞濃度の低い第2の体液成分を収容する第2の体液成分バックと、
前記第1の体液成分バックと前記体液バックを接続する第1の流路と、
前記第2の体液成分バックと前記体液バックを接続する第2の流路と、
前記第1の流路に設けられ、当該流路を通過する体液成分から所定の細胞を除去するフィルタと、
前記第1の流路の開閉を行う第1の開閉弁と、
前記第2の流路の開閉を行う第2の開閉弁と、を有し、
前記第1の流路は、前記体液バックにおける、前記遠心分離機に搭載された際の当該遠心分離機による遠心力方向側の端部に接続され、
前記第2の流路は、前記体液バックにおける、前記遠心分離機に搭載された際の当該遠心分離機による遠心力方向の逆側の端部に接続されている、細胞除去システム。 - 前記第2の流路には、当該流路を通過する体液成分から所定の細胞を除去する他のフィルタが設けられている、請求項7又は8に記載の細胞除去システム。
- 前記第1の流路の前記フィルタより前記体液バック側に、前記第1の体液成分を保存するための保存液を供給するための保存液供給回路をさらに有する、請求項7〜9のいずれかに記載の細胞除去システム。
- 前記所定の細胞は、病原物質である、請求項7〜10のいずれかに記載の細胞除去システム。
- 前記体液は、血液であり、
前記第1の体液成分は、赤血球を主成分とする血液成分であり、
前記第2の体液成分は、血漿を主成分とする血液成分であり、
前記所定の細胞は、白血球である、請求項7〜11のいずれかに記載の細胞除去システム。 - 赤血球と白血球を含む体液から白血球を除去する方法であって、
第1のバックに収容された体液に遠心分離による遠心力を与えて、少なくとも前記赤血球と前記白血球を含み、前記白血球の濃度勾配を有する分離層を形成する工程と、
前記分離層を前記白血球の濃度勾配に従って前記白血球の濃度が低い側から順にフィルタに通して、前記分離層から前記白血球を除去する工程と、
前記白血球が除去された前記分離層を第2のバックに収容する工程と、を有し、
前記分離層を前記フィルタに通す際に、前記白血球の濃度に応じて通過速度を変える、白血球除去方法。 - 押圧機構により前記分離層を前記フィルタ側に押し出し、前記押圧機構の押圧板による第1のバックの押圧速度を変えることにより、前記分離層の前記フィルタの通過速度を変える、請求項13に記載の白血球除去方法。
- 遠心分離機の遠心力を用いて前記分離層を前記フィルタ側に押し出し、前記遠心力を変えることにより、前記分離層の前記フィルタの通過速度を変える、請求項13に記載の白血球除去方法。
- 前記白血球の濃度が高い分離層がフィルタを通過する際には通過速度を遅くし、
前記白血球の濃度が低い分離層がフィルタを通過する際には通過速度を速くし、
前記白血球の濃度が中間の分離層がフィルタを通過する際には通過速度を中間にする、請求項13〜15のいずれかに記載の白血球除去方法。
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