DK150690B - Fremgangsmaade og analysepakke til bestemmelse af en komponent i reaktionen mellem et specifikt binder-protein og det tilsvarende bindelige stofved enzym-immunoanalyse - Google Patents

Description

150690 ø

Det er kendt, at en komponent i reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof kan bestemmes ved, at man inkuberer en af de omhandlede komponenter forsynet med en markør i en reaktionsblanding, som i det mindste indeholder den anden komponent, 5 og derpå iværksætter en adskillelse mellem den mærkede komponent, som henholdsvis er og ikke er bundet til dens bindingspartner og endelig bestemmer markøren i mindst en af de to fremkomne fraktioner. Fordelingen af den mærkede komponent over de to fraktioner er et mål for den mængde af den søgte komponent, som er til stede i prøven. Der 10 kan beskrives tre systemer, i hvilke den ovennævnte fremgangsmåde kan anvendes, a) antistoffer som specifikke binder-proteiner og de tilsvarende antigener som bindelige stoffer. Stoffer, som kan bestemmes 150690 . 2 på denne måde, er bl, a. proteinhormoner og deres antistoffer eller virus-antigener og deres antistoffer, b) antistoffer som specifikke binder-proteiner og haptener som bindeligt stof. Her defineres hap-tenerne som proteinfri stoffer, der kan reagere med antistoffer uden 5 at være i stand til at inducere dem. Stoffer, som kan bestemmes i et sådant system, er bl.a. steroidhormoner og vitaminer, c) proteiner, som i legemet virker som receptor- eller transport-molekyler som specifikke binder-proteiner og stoffer, som er bundet af dem som binde-lige stoffer. Dette system er f.eks. egnet til bestemmelse af ste-10 roidhormoner, men også af thyroxin og triiodthyronin, vitamin B12, den intrinsicole faktor og det adrenocorticotrope hormon.

De vigtigste punkter i de beskrevne analysemetoder er anvendelsen af en markør og adskillelsen af den mærkede komponent i en fraktion, 15 som er bundet, og en fraktion, som ikke er bundet til den tilsvarende komponent.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 5462/71 kendes en fremgangsmåde, ved hvilken der anvendes enzymmærket komponent i forbindel-20 se med en kvantitativ immunologisk bestemmelse. Ved denne kendte fremgangsmåde sker adskillelsen mellem flydende og fast fase ved gelfiltrering, men denne metode er upraktisk og kan ikke give nogen pålidelig og let bestemmelse. Ved metoden kan immunokomponenter kun bestemmes i en koncentration på 50-100 nanogram pr. milliliter.

25

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 2812/67 kendes endvidere en fremgangsmåde, ved hvilken der gøres brug af uopløseliggjorte antistoffer overfor proteiner eller peptider, som er antigener, i en radio-immun bestemmelse. Radiaktive atomer anvendt som markører er 30 f.eks. 131j, 125^, 14^, 3^, 5?Co Denne fremgangsmåde er kendetegnet ved en høj følsomhed. Imidlertid er denne fremgangsmåde begrænset til institutter, hvor det nødvendige specielle apparatur er tilgængeligt.

Adskillelsesmetoderne kan opdeles på følgende måde: 35 a) Fremgangsmåder afhængige af forskellen i fysiske egenskaber mellem den ikke bundne, mærkede komponent og dens kompleks med bindings-partneren, såsom gel-filtrering, elektroforese, saltudfældning og absorption til dekstran-overtrukket trækul.

40 b. Den såkaldte fastfase-metode, ved hvilken den ene komponent allerede i forvejen er bragt i uopløselig form ved tværbinding eller ved 3 150690 covalent binding eller fysisk adsorption til en fast bærer, c) Den såkaldte dobbelte antistof«metode,ifølge hvilken det dannede kompleks, antigen (eller hapten)«antistof udfældes ved hjælp af antistoffer over for antistoffet i komplekset, hvilken fremgangsmåde 5 kun er kendt fra systemer, i hvilke antistoffer i opløst form kommer i betragtning«

Medens de under a) og c) omtalte fremgangsmåder er relativt komplicerede, lider de under b) omtalte af den ulempe, at en reaktions-10 komponent, når den bringes i uopløselig form, som regel vil mindske sin affinitet til reaktions-partneren. Imidlertid er en høj affinit« vigtig for tilvejebringelse af et følsomt prøvesystem.

Ifølge opfindelsen har man fundet en fremgangsmåde til bestemmelse 15 af en komponent i reaktionen mellem et specifikt binder-protein og det tilsvarende bindelige stof under anvendelse af den kendte bindingsaffinitet af sådanne komponenter indbyrdes, idet man ved bestemmelsen anvender en kendt mængde af et koblingsprodukt af det bindelige stof med et enzym og eventuelt også en kendt mængde af det 20 specifikke binderprotein (i det tilfælde, at det bindelige stof er den komponent, der skal bestemmes), hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man yderligere anvender . uopløseliggjo.rte antistoffer oVér for det-< specif ikke binder-protein,·' og at man efter reaktionen bestemmer enzymaktiviteten i den flydende eller 25 faste fase af reaktionsblandingen. Denne fremgangsmåde muliggør bestemmelse af komponenter, der er til stede i en koncentration på 1-1C nanogram pr. milliliter.

I den foreliggende beskrivelse bruges begreberne conjugat og enzym-30 conjugat synonymt for koblingsproduktet af det bindelige stof og enzymet.

Det bindelige stof kan opdages og bestemmes ved, at man sammenbringer den ukendte prøve eller en fortyndingsserie af samme med en kendt 35 mængde af et conjugat af det stof, der skal bestemmes, og et enzym og med en mængde specifikt binderprotein i afhængighed af den mængde enzym-conjugat, som tilsættes. Derpå tilsættes en mængde, fortrinsvis et overskud af de antistoffer, der er gjort uopløselige over for det specifikke binder-protein, så at hele enzym-conjugatet, som har 40 reageret med binder-proteinet, ved hjælp af dette protein bliver koblet til disse uopløselige antistoffer. Jo mere bindeligt stof der ex 4 150690 til stede i prøven, jo mindre enzym-conjugat vil reagere med det specifikke binder-protein og sluttelig komme i den uopløselige fase. Resultatet bliver, at mere ubundet enzym-conjugat forbliver i den flydende fase og på simpel måde kan bestemmes der. Det specifikke 5 binder-protein kan bestemmes ved, at man inkuberer prøven eller fortyndingsserier af denne med en kendt mængde enzym-conjugat og med en mængde af de over for det specifikke binder-protein uopløselig-gjorte antistoffer. Enzymaktiviteten kan kun finde sted i den uopløselige fase, hvis conjugatet har reageret med det specifikke bin-10 der-protein, d.v.s. jo mere specifikt binder-protein, der er i prøven, jo mindre bundet enzym-conjugat vil forblive i den flydende fase.

Den beskrevne analyse-metodes følsomhed kan varieres ved at ændre mængderne af reagenserne. Imidlertid er den mængde enzym-conjugat, 15 som kan anvendes, begrænset nedefter af kravet om, at dets enzymaktivitet kan måles på rimelig måde, hvorfor analyse-metodens følsomhed har sin begrænsning. Den minimalt målelige enzym-aktivitet er bl. a. afhængig af naturen af det enzym, der anvendes ved koblingen, og af substratets natur og endelig af enzym-reaktionens 20 inkubationstid. Fremdeles indvirker det specifikke binder-proteins affinitet stærkt på bestemmelsens følsomhed. Ved en analyse-metode af høj følsomhed kræves specifikke binder-proteiner med en høj affinitet.

25 Mængderne af de for en bestemmelse nødvendige reagenser må fastlægges ad empirisk vej.

Til bestemmelsen af det bindelige stof må mængden af enzym-conjugatet bestemmes ved hjælp af enzymaktiviteten. Derpå inkuberes denne mængde 30 med en fortyndingsserie af det specifikke binder-protein til bestemmelse af den nødvendige mængde af dette protein. Fortrinsvis vælger man en mængde specifikt binderprotein, som kan binde 50-90% af enzym-conjugatet. Til sidst undersøger man, hvorvidt den ønskede følsomhed så er blevet nået, idet man undersøger en fortyndingsserie af 35 det stof, der skal undersøges ved metoden.

Til bestemmelsen af det specifikke binder-protein må der angående doseringen af enzym-conjugatet tages hensyn til dettes aktivitet, som skal kunne bestemmes med rimelig nøjagtighed.

s 150690

De antistoffer over for det specifikke binder-protein, der er gjort uopløselige, tilsættes fortrinsvis i overskud ved de to bestemmelses-måder. Disses dosering bestemmes ved forudgående forsøg.

5 Denne fremgangsmådes fordele over for de kendte er, at kombinationen af "Dobbelt Antistof" og "Fast Fase"-metoden, i det følgende af bekvemmelighedsgrunde betegnet DASP-metoden, frembyder adskillige fordele over for de kendte fremgangsmåder. Således er udførelsen af den nye fremgangsmåde, d.v.s. tilførsel af uopløseliggjorte anti-10 stoffer over for det specifikke binder-protein, inkubation, centrifugering og måling, meget simpel, doseringen er ofte lettere end ved fast-fase-metoderne, fordi det er tilstrækkeligt at tilsætte et overskud af uopløst materiale, hvorimod man ved fast-fase-metoderne skal bruge en nøjagtigt udmålt mængde af det faste materiale. Frem-15 deles er affiniteten hos binder-proteinet til det bindelige stof ikke svækket af bindingen til bærermaterialet, således som det kan være tilfældet ved fast-fase-metoden. En yderligere fordel over for den sidste fremgangsmåde er den hurtige ligevægt-indstilling hos reaktionen mellem det specifikke binder-protein og det bindelige stof 20 (begge i opløsning). En yderligere fordel består i, at ved DASP- fremgangsmåden kan det uopløseliggjorte antistof, nedenfor betegnet immunoadsorbenten, bruges i ethvert system, i hvilket man bruger antistoffer som specifikke binder-proteiner, forudsat at disse antistoffer er præpareret i de samme dyrearter. På den anden side, for 25 ethvert antigen eller hapten, der skal bestemmes efter fast-fase-metoden, skal antistofferne gøres uopløselige. Den dobbelte antistofmetode er meget følsom over for relativt små ændringer i saltkoncentrationerne, pH og lignende, som gør en vidtgående kontrol af betingelserne nødvendig. Yderligere kræver metoden tilføjelse af 30 "bærer"-γ-globulin og følgelig meget andet antistof til opnåelse af et immunt precipitat. Foruden at være en mere enkel fremgangsmåde fører DASP-metoden, som ikke kræver "bærer"-γ-globulin, til besparelse af materialer. Endelig skal det nævnes, at en dobbelt antistoflignende adskillelse anvendt ved transport- eller receptor-proteiner 35 ikke er mulig, da der ikke kan fremskaffes et "bærer"-protein til dette formål. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen frembyder derfor en enestående lejlighed i denne henseende.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan let gøres automatisk. Det er 40 principielt muligt at bringe reaktionskomponenterne sammen straks _ t t _ . i _ j . _ -? , » t_ _ i i ^ ^___ ^ r Λ__i · T __ __ i i____ 6 150690 man dog fortrinsvis de uopløselige antistoffer over for det specifikke binder-protein til reaktionsblandingen som det sidste reagens, idet det har vist sig, at bestemmelsen derved får en højere følsomhed.

5

Ved fremgangsmådens anvendelse til bestemmelse af det bindelige stof går man af samme grund hensigtsmæssigt frem på den måde, at man først til prøven sætter det specifikke binder-protein og derpå enzym-con-jugatet og til sidst de uopløselige antistoffer over for det speci-fikke binder-protein.

Det for opfindelsen nødvendige reagens, d.v.s. koblingsproduktet af antigen, hapten eller det bindelige stof med enzymet, kan fremstilles på kendt måde. Disse fremgangsmåder kan også bruges til at bin-15 de et hapten eller et lavmolekulært bindeligt stof til et enzym, forudsat at et af stofferne har en eller flere aminogrupper og det andet en eller flere carboxylgrupper. Hvis det sidste ikke er tilfældet, er det muligt at indføre den ønskede gruppe i molekylet, som skal kobles, ved hjælp af en kendt organokemisk proces. Der kendes 20 også fremgangsmåder til sammenbinding af amino- og carboxylgrupper, eventuelt ved at indføre en bro. Endelig kan komponenter som glutar-aldehyd, difluordinitrodiphenylsulfon og di- og tri-chloro-s-tria= zin ofte anvendes til den omhandlede kobling. Det kan blive nødvendigt at adskille de fremstillede enzymconjugater fra uomdannede stof-25 fer og fra stoffer, som er blevet inaktive. Til dette formål kan man benytte kendte fremgangsmåder, såsom udfældning med organiske opløsningsmidler, gelfiltration og centrifugering ved en vægtfyldegradient .

20 Valget af det enzym, der benyttes i koblingsproduktet, er bestemt ved et antal egenskaber hos enzymet. Naturligvis er det vigtigt, at enzymet er resistent over for koblingen med et andet molekyle, d.v.s. over for ændring af en eller flere aminosyre-sidekæder. Enzymets specifikke aktivitet er også af stor vigtighed. Da en mindre mæng-25 de enzym—conjugat behøver at tilføjes for at opnå en målelig enzympåvirkning, bliver undersøgelsessystemet mere følsomt. Fremdeles bør man foretrække de enzymer, hos hvilke en bestemmelse af aktiviteten kan foretages på en simpel måde, I første række bør man tage de enzymer i betragtning, for hvilke aktiviteten kan béstemmes kolorime-40. trisk, épektrofotometrisk eller fluorimetrisk. Sådanne bestemmelser 7 150690

Man kan bestemme aktiviteten af de, .enzymer kolorimetrisk, som katalyserer en reaktion, ved hvilken der. .opstår eller forsvinder et farvet stof, enten ved den primære eller den sekundære reaktion.

5 Som enzymer, der- kan" anvendes som den enzymatisk; aktive komponent i conjugater, skal nævnes catalase, peroxidase (3-glucoronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glucose-oxidase, galactose-oxidase og alkalisk phosphatase.

10 Ved afslutningen af reaktionen mellem komponenterne og reagenserne kc man ifølge opfindelsen bestemme enzymaktiviteten i den flydende ellei den faste fase, eller i begge faserne af reaktionsblandingen. Det simpleste er imidlertid at bestemme enzymaktiviteten i den flydende fase, 15

De antistoffer, der er gjort uopløselige over for de specifikke binde proteiner, som også er vigtige reagenser for fremgangsmåden ifølge op findelsen, kan også fremstilles på kendt måde. Antistofferne kan fremstilles, idet man tager et renset præparat af det specifikke bin-20 der-protein eller af de proteiner, som har i det mindste delvis de sa me antigen-egenskaber som det specifikke binder-protein, og så injice rer dette på kendt måde i en anden dyreart end den, fra hvilken man fik det. Det behandlede dyrs serum eller gamma-globulin-fraktionen af dette kan gøres uopløseligt ved kryds-led-forbindelse med sådanne sto 25 fer som glutaraldehyd og chlormyresyre-ethylester eller ved binding t faste bærerpartikler enten fysisk eller adsorptivt eller kemisk ved dannelse af covalente bindinger. Som faste bærere kan anvendes sådanm stoffer som cellulose (ændret eller ikke), agarose, kryds-led-forbundi dekstran, polystyren og lignende. En covalent binding til disse stof· 30 fer af antistoffer kan foretages ved hjælp af sådanne stoffer som car: bodiimider, di- og tri-chloro-s-triaziner, glutaraldehyd, cyanogenbro-mid og f.eks. ved diazotering.

Fordelene ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af 35 binderprotein opnås, hvis man anvender et overskud af uopløselige ant: stoffer, således at det specifikke binderprotein går helt over i den faste fase.

De former, i hvilke reagenserne kan anvendes, er mangfoldige. Den 40 enzym-conjugerede komponent i reaktionssysternet kan frysetørres eller 8 150690 opløses i en stødpude. Man kan også bruge en fast bærer, f,eks. en papirstrimmel imprægneret med conjugatet. Denne anvendes også til de nødvendige binder-proteiner.

Den uopløselige komponent kan bringes i form af partikler af forskellig størrelse, såsom granuler, flager, stave eller i form af en strimmel af et eller andet bæremateriale.

Opfindelsen angår endvidere en analysepakke til bestemmelse af * et specifikt binder-protein eller det tilsvarende bindelige stof ved den beskrevne fremgangsmåde, hvilken analysepakke er ejendommelig ved at den hovedsagelig indeholder: a) en kendt mængde conjugat af det bindelige stof og et enzym, ’ b) en kendt mængde binder-protein, hvis analysepakken skal anvendes til bestemmelse af det bindelige stof, c) én kendt mængde uopløseliggjorte antistoffer rettede imod det binderprotein, som er tilsat, eller som skal bestemmes, d) et substrat til bestemmelse af aktiviteten af det anvendte enzym.

i

Analysepakken kan fremdeles indeholde de nødvendige yderligere midler til analysens udførelse, såsom reagensglas, pipetter og flasker med opløsninger.

Analysepakken kan særlig hyppigt og med særlig fordel anvendes til opdagelse og bestemmelse af et antigen eller et hapten, og til dette formål indeholder den i hovedsagen: a) en kendt mængde af et conjugat af antigenet eller haptenet og et enzym, b) en tilsvarende mængde af tilsvarende antistoffer, c) en kendt mængde uopløseliggjorte antistoffer, rettede imod de anvendte antistoffer, d) et substrat til bestemmelse af aktiviteten af det anvendte enzym.

Når man anvender sådanne analysepakker til påvisning og bestemmelse af antistoffer, behøver man ikke de under b) nævnte antistoffer.

150690 9

En vigtig udførelsesform for en analysepakke ifølge opfindelsen er én ana-lysepakke til bestemmelse af de gonadotrope hormoner og særlig til bestem' melse af HCG (Human Chorionic Gonadotropin) som et middel til bestemmelse 5 af graviditet allerede på et meget tidligt stadium, hvilken analysepakke er ejendommelig ved, at den består af en beholder, der som væsentlige bestanddele i lyofiliserede lag indeholder: a) en bestemt mængde af et HCG-conjugat og et enzym, f.eks. HCG-peroxidase b) en bestemt mængde anti-HCG, c) en bestemt mængde uopløseliggjorte antistoffer oyer for anti-HCG sammei med et substrat til bestemmelse af enzymaktiviteten af det resterende HCG-enzym i den flydende fase.

Ved tilsætning af en vis mængde urin fra en formodet gravid kvinde, til 15 denne analyseblanding og ved at inkubere urinen med disse bestanddele dannes der en blanding af uopløseligt stof, idet den øvrige del indeholder det tilbageblevne opløselige HCG-enzym-conjugat. Mængden af det sidste afhænger af mængden af HCG i den undersøgte urin. Ved bestemmelse af enzymaktiviteten hos dette tilbageblevne HCG-enzym-conjugat kan man 20 fastslå, om urinen skyldes en gravid kvinde eller ej.

En fremgangsmåde, der fortrinsvis anvendes ved bestemmelsen af enzymaktiviteten, består i, at man bringer et indikator-papir imprægneret med enzymreagenser, f.eks, hvis der bruges en peroxidase, en H„09-forsyner så- 25 ^ ^ som urinstof-EL^,med et farvereagens såsom o-tolidin.

Ved korrekt valg af mængderne af hvert af reagenserne bliver det muligt at fastslå graviditet allerede på et meget tidligt stadium og på en simpel, hurtig og meget pålidelig måde, som kan udføres af en ikke opøvet 30 person.

150690 10

Eksempel 1.

Bestemmelse af det menneskelige chloriongonadotropin (HCG).

5 a) Fremstilling af HCG-HRP.

5 mg HCG og 20 mg peberrods-peroxidase (HRP) opløses i 2 ml 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,2. Efter tilsætning af ko μΐ 25$ glutaraldehyd-ορløsning rystedes “blandingen i 2 timer ved stuetemperatur. Efter 5 minutters centrifugering ved 250 g fraktioneredes væsken over Sephadex G-200 i 0,05 M phosphat= stødpude med pH-værdien 6,2. Fraktionerne, hos hvilke den højeste enzymaktivitets $ var bundet af antistoffer overfor HCG brugtes under analysen.

15 b) Fremstilling af antistoffer overfor HCG.

Antistoffer overfor HCG indiceredes i kaniner som angivet af Schuurs et al. Acta Endocr. (Kbh) 59j 120,(1968).

c) Fremstilling af antistoffer overfor kanin-y-globulin.

2q Kanin-Y-globulin isoleredes fra normalt kanin-serum ved udfældning med l8$ w/v fast natriumsulfat. Antistoffer overfor dette fremstilledes ved immunisering af et får i overensstemmelse med følgende skemai 25 dag mængde Freud's adjuvans injektionsmåde 0 o,5 mg + intramuscular 1^· o,5 mg + intramuscular 28 1 mg + intramuscular b2 1 mg - intravenøs 3Q 56 1 mg - intravenøs den 70.dag blev fåret åreladt.

d) Fremstilling af immunoadsorbent-eellulose /får-anti-(kanin-γ-globu= 35 lin)7.

γ-globulinfraktionen af fåre-serumet beskrevet under c) fremstilledes ved udfældning med 165¾ w/v fast natriumsulfat. Efter vaskning optoges udfældningen i så meget 0,05 M borat-stødpude med pH-værdien 8,6, at den fremkomne proteinkoncentration udgjorte 10 mg/ml.

4Q 350 mg m-aminobenzyloxymethylcellulose opslemmedes i 50 ml destilleret 11 15069¾ vand og diazoteredes ved tilsætning af 10 ml 30$ saltsyre og dråbevis tilsætning af 10 ml 10$ NaDiK^-opløsning ved 0°C. Op-slemningen centrifugeres. Den vaskedes, og bundfaldet resuspendere-des i *+3 ml 0,05 M natriumborat med pH-værdien 8,6, derpå tilsattes 5 7 ml af den fremstillede γ-globin-opløsning. Blandingen omrørtes i 26 timer ved å-°C, hvorpå den centrifugeredes og vaskedes med 0,02 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0.

e) Bestemmelse af HCG

10 Der fremstilledes en fortyndingsserie (32 -16-8-^-2-1-o,5-IU/ml) af HCG i 0,02 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0, som indeholdt 2$ v/v normalt fåreserum.

0,5 ml af hver af de HCG-indeholdende prøver inkuberedes med 0,1 ml kanin-(anti-HCG)-serum og 0,1 ml HCG-KRP-conjugat, begge i passen-15 de fortynding i eii halv time’ved stuetemperatur. Derpå tilsatte 0,3 ml af immunoadsorbenten (10 mg/ml) fremstillet ifølge d),og den fremkomne blanding omrørtes i en time ved stuetemperatur. Efter centrifugering bestemtes enzymaktiviteten: resten ved at blande 0,5 ml .

af denne væske med 1,5 ml substrat (10μ1 30$ ^.$2 °& 20 mg 5-amino--20 salicylsyre i 150 ml 0,02 M phosphatstødpude med pH-værdien.6,0), og efter 30 minutter ved 25°C måltes ekstinctionen ved 1+60 mm.

På denne måde påvistes det, at det var muligt at opdage en HCG-koncentration fra 0,5 til lIU/ml i prøven. Ved denne metode kunne man også undersøge urinprøver. Undersøgelsen er derfor egnet til 25 en graviditetsprøve. Forholdet til en eksisterende undersøgelsesmetode, en hæmaglutinations-·inhibitions-prøve var god. Det påvistes muligt at forøge systemets følsomhed ved anvendelse af en pre-incubation. Her incubereres prøven først med antiserumet og derpå tilsattes HCG-HRP-conjugatet.

30

Eksempel II.

Bestemmelse af insulin og anti-insulin.

a) fremstilling af insulin-(glucose-oxidase).

35 Der opløstes 5 mg grise-insulin af 25 mg glucose-oxidase i 2 ml 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,5. Hertil sættes 5 μΐ glutaraldehyd-opløsning, hvorefter blandingen rystedes i 90 minutter ved stuetemperatur. Blandingen fraktionereres over Sephadex 150690 12 G-200 i 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,5.De .fraktioner, af hvilke den højeste procentiske enzym-aktivitet kunne hindes af antistoffer overfor insulin, anvendtes ved analysen 5 b) Fremstilling af antistoffer overfor insulin.

Man ggv·' 10 marsvin &n;- ugentlig intramuskulær injektion med 1 mg grise-insulin i fuldstændig Freud's adjuvans gennem en periode på ^+-8 uger. Efter 10 ugers hvile gav man dyrene yderligere 1 mg insulin ved intravenøs injektion uden adjuvans. To uger senere blev 10 dyrene åreladt. Man modarbejdede den tilstødende hypoglycæmi ved intraperional administration af glucose.

c) Fremstilling af antistoffer ' overfor. maxsvin-γ-globulin.

Der . fremstilledes marsvin-Y-globulin ved tilsætning af 1 15 volumen ^mættet ammoniumsulfat-opløsninq til 2 volumen marsvine- serum. Den fremkomne udskillelse vaskedes to gange med 33i° mættet ammoniumsulfat-opløsning, hvorefter den optoges i en fysiologisk saltopløsning. Derpå immuniseredes et får med voksende doser af det fremstillede γ-globulin: 0,5 - 1 og 2 mg. Injektionerne blev 20 givet hver anden uge, idet immunogenet var blandet med fuldstændig

Freud's adjuvans. To uger efter den sidste injektion gaves der yderligere 2 mg γ-globulin i en fysiologisk saltopløsning, og en uge senere blev dyret åreladt.

25 d) Fremstilling af uopløselige antistoffer overfor marsvin-Y-globulin.

10 g mikrokrystallinsk cellulose aktiveredes ved, at det under omrøring sattes til H00 ml 2,5$ w/v CWBr-opløsning, hvorefter pH-værdien øgedes til 10,5 nied 1 N NaOH-opløsning, idet denne værdi opret 30 holdtes i 2 minutter. Derpå vaskedes cellulosen med isvand og med 0,1 M NaHCOy Der tilsattes 1,6 g Na^SO^ til 10 ml fåre-anti( marsvin.-γ-globulin) -serum. Efter en times omrøring ved stuetemperatur centrifugeres udfældningen. Der vaskedes to gange med 20 ml 16$ w/v Na^O^-opløsning, hvorefter det optoges i 10 ml 0,1 M NaHCO^-35 opløsning. Den aktiverede cellulose blandedes med *+0 ml 0,1 M NåKCO^- opløsning og de 10 ml γ-globulin-opløsning. Denne suspension om-rørtes i ^0 timer ved ^°0 og vaskedes efterhånden to gange med 150690 13 500 ml 0,5 M NaHCO^j to gange med 500 ml 0,05 M citrat af pH-værdien 1,1 og to gange med 500 ml 0,05 M phosphat af pH-værdien 6?5 5 e) Bestemmelse af antistoffer overfor insulin.

0,1 ml insulin-(glucose-oxidase) inkuberedes i passende fortynding med 0,*+ ml af en fortynding s serie af en marsvin-anti-insulin-serum i timer. Fortynding s s er i en foretoges med 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0. Derpå tilsattes 0,3 ml immunoadsorbent 10 (15 mg/ml) og 0,2 ml stødpude, og blandingen omrørtes natten over ved *f°C. Efter centrifugering bestemtes enzymaktiviteten'af den resterende opløsning ved incubering af 0,5 ml af denne med 2,5 ml substrat i 30 minutter, hvorpå man målte ekstinetionen ved *+60 nm. Substratet indeholdt 50 mg glucose, 10 μg peroxidase og 1 mg 15 5- amino salicyl syre pr. 2,5 ml 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0.

Med dette system kunne antistofindholdet i de forskellige slags serum sammenlignes. Som referencepunkt valgtes den serumfortynding, hvor 5o5 af den totale kombinerbare enzymaktivitet er bundet.

20 f) Bestemmelse af insulin.

0,2 ml af en fortyndingsserie af insulin incuberedes i 2 timer med 0,1+ ml anti-insulin-serum i en sådan fortynding, at den kunne binde 60$ af det tilsatte enzym-conjugat. Derpå tilsattes 0,1 ml 25 insulin-(glucose-oxidase) · des i timer. Endelig tilsattes 0,3 ml immunoadsorbent (15 mg/ml). Blandingen omrørtes natten over ved H°C. Efter centrifugering måltes enzymaktiviteten i resto. løsningen som angivet under e). Bestemmelsens følsomhed, som afhænger af det anvendte antiserum, lig-30 ger indenfor nanogram-ordenen: 20-100 mg/ml, d.v.s* 0,5-2,5 mU/ml.

Eksempel III.

Bestemmelse af oestradiol.

35 a) Fremstilling af oestradiol-17-succinyl-HRP.

50 mg oestradiol-17-hemisuceinat og 0,08 ml tri-n-butylamin opløstes i 2,5 ml dioxan. Til den kolde (2°C) opløsning sattes 15 Hl isobutylchlorocarbonat. Efter 3o minutter blandedes denne opløsning

lif T5069Q

med 100 mg peberrodsperoxidase (HRP) i 7?5 ml af en dioxan/vand-blanding (2:3)5 som var indstillet til en pH-værdi på 9j5 med natriumhydroxid. Opløsningen omrørtes i *+ timer ved 2°C og dialyseredes derpå i 18 timer. Udfældningen, der var dannet efter at dialysatets 5 pH-værdi var indstillet til *+,6, centrifugeredes fra, vaskedes og op toges i 5 ml destilleret vand, som var indstillet til en pH-værdi på 8. Stoffet rensedes yderligere ved to ganges udfældning med 10 ml acetone. Det færdige produkt optoges i 10 ml 0,05 M piiospliat-stødpude med pH-værdien 738.

10 b) Fremstilling af østradiol-17-suecinyl-BSA.

Fremstillingen foretoges ifølge den blandede anhydrid-metode, som er angivet i eksempel Illa. Denne fremstilling foretoges, idet man gik ud fra 100 mg østradiol-17-hemisuccinat og 150 mg hornkvægsse-15 rum-albumin (BSA).

c) Fremstilling af antistoffer overfor østradiol.

Man injicerede et får en gang i *+ uger med k mg østradiol-17-succinyl-BSA i fuldstændig Freund's adjuvans. Med regelmæssige mellem 20 rum udtoges der blod fra dyret. Serumet absorberedes med BSA, som var gjort uopløseligt.

d) Fremstilling af antistoffer overfor fåre-Y-globulin.

Der fremstilledes fåre-Y-globulin som angivet i eksempel I, men nu 25 med 16$ w/v natriumsulfat. Man immunicerede så kaniner med denne fåre-Y-globulin efter følgende skema:

Dag mængde Freund's ad.iuvans innektionsmåde 0 200 ^g + intramuskulær 30 lb *+00 μg + ' " 28 800 μg + " b2 800 ug - intravenøs o c 2 Uger efter den sidste injektion blev dyret åreladt.

i5 150690 e) Fremstilling af immunoadsorbenten /kanin-anti (-fåre-Y-globulin)_7-cellulose.

Y-Globulinfraktionen fra de antisera, der er angivet under d), fremstilledes ved udfældning med 18$ w/v Wa^SO^. Det fremkomne produkt 5 kobledes med cellulose efter Gurvich's metode, angivet i eksempel I.

f) Bestemmelse af østradiol.

Immunreaktionen udførtes i 0,02 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0, som indeholdt 2$ BSA.

10 5 ml af prøven blandedes med 0,1 ml af fåre-anti-østradiolserumet i den ønskede fortynding. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur tilsattes 0,1 ml østradiol-17-succinyl-HRP i en passende fortynding, hvorefter der fulgte en anden 30 minutters inkubation 15 ved stuetemperatur. Derpå tilsattes Qf3 ml immunoadsorbent"su" spension (30 mg/mll, og blandingen omrørtes i 2 timer ved stue" temperatur. Derpå adskiltes den flydende og den faste fase ved centrifugering. Enzymaktiviteten i den flydende bestanddel måltes som angivet i eksempel I. Man kunne anvende fåre-anti-østradiol-20 serumet i fortyndinger fra 1:1600 til 1:12800 i afhængighed af kva liteten af det anvendte østradiol-17-succinyl-HRP. Ved en fortynding af 1:12800 af antiserumet kunne en østradiol-koncentration på 10 ng/ml opdages i prøven. Østradiol og østron viste en krydsreaktion i dette system.

25

Eksempel IV

Bestemmelse af cortisol og corticoid-bindende globulin.

a) Fremstilling af cortisol-21-(galaktose-oxidase).

30 Man koblede 50 mg cortisol-21-hemisuccinat og 100 mg galaktose- oxidase ved hjælp af den blandede anhydrid-teknik angivet i eksempel Illa.

b) Corticoid-bindende globulin (CBG) isoleredes fra human serum ved 35 hjælp af successions-kromatografi over DEAE-cellulose og hydroxyl- apatit.

Antistoffer overfor dette fremstilledes ved injicering af kaniner i 1^—dagesmellemrum med 500 Pg CBG i fuldstændig Freund's adjuvans.

Efter 3 måneder injiceredes dyrene med 1 mg CBG, og 2 uger senere i6 150690 c) γ-Globulin- fraktionen af anti-CBG- serum koblede s til m- aminobenzy1= oxymethylcellulose som angivet i eksempel III.

d) Bestemmelse af cortisol.

5 0,5 nil af en prøve, der indeholdt cortisol (standard-opløsning) ekstraheredes med 2 x 3 nil methylenchlorid. Den sammenbragte ekstraktionsvæske inddampedes til tørhed. Residuenten optoges i 0,5 ml 0,05 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,2. Derpå blandedes med 0,1 ml af en opløsning af CBG i den samme stødpude i en passende 10 koncentration, og der inkuberedes i 30 minutter ved h°C. Derpå tilsattes 0,1 ml cortisol-21-(galaktose-oxidase), også i passende fortyndingjOg 0,3 ml af immunoadsorbenten, der fremstilledes under c), med en koncentration af 5 mg/ml. Den fremkomne blanding omrør-tes i 2 timer ved ^°0 og derpå centrifugeredes, hvorefter enzymakti-15 viteten måltes i restvæsken. I den anledning tilsattes 0,5 nil af samme til 1,5 ml substrat bestående af 100 mg D-galaktose, 20 mg 5-aminosalicylsyre og 10 Mg peroxidase i 150 ml 0,02 M phosphat-stødpude med pH-værdien 6,0. Efter 30 minutter måltes ekstinctionen ved *+60 nm. Ved anvendelse af en CBG-koncentration på O,1* Mg/ml og 20 'så meget cortisol-21-(galaktose-oxidase), at 80$ af enzym-konjugatet var bundet til immunoadsorbenten, uden at der tilføjedes steroider, viste det sig muligt at bestemme mængder af fra 3 til 30 ng cortisol e) Bestemmelse af CBG var også mulig med de angivne reagenser. Fra en 25 fortyndingsserie af transcortin, rækkende fra O til 1280 ng/ml in kuberedes 0,5 ml i 15 minutter med 0,2 ml cortisol-21-(galaktose-oxidase) i passende fortynding. Derpå tilsattes 0,3 ml immunoad-sorbent-suspension (5 mg/ml), og blandingen omrørtes i 15 minutter. De to inkubationer holdtes ved Η-°ϋ. Derpå måltes enzymaktiviteten 30 i restvæsken som under d) c Analysemetodens følsomhed viste sig at være 50 ng/ml).

Eksempel V

35 I en flaske lyofiliseredes efterhånden følgende reagenser i adskilte lag: 0,3 ml af immunoadsorbent-suspensionen (10 mg/ml) som angivet i eksempel la.

40 2) 0,1 ml af en Ifo mannitol-opløsning.

Claims (2)

17 150.690 3) 0,1 nil af HCG-HRP som angivet i eksempel la. et andet lag af 0,1 ml af en 1} mannitol-opløsning. 5) 0,1 ml af kanin(anti-HCG)-serum som angivet i eksempel II. 5 Til denne lyofiliserede Handing sattes 0,5 ml af en urinprøve og derpå 0,5 ml destilleret vand. Efter 10 minutter bestemtes enzymaktiviteten i restvæsken ved hjælp af en papirstrimmel imprægneret med urinstof-hydrogenperoxid og o-tolidin. 10 Såfremt urinprøven stammede fra en gravid kvinde (> 2 IU HCG/ml), fremkom der en blå farve indenfor 5 minutter, hvorimod der, når urinprøven stammede fra en ikke-gravid kvinde, ikke fremkom nogen farve indenfor den samme tid. 15 „ ^ Patentkrav *

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en komponent i reaktionen 2Q mellem et specifikt binder-protein og det tilsvarende bindelige stof under anvendelse af den kendte bindingsaffinitet af sådanne komponenter indbyrdes, idet man ved bestemmelsen anvender en kendt mængde af et kob'lingsprodukt af det bindelige stof med et enzym og eventuelt også en kendt mængde af det specifikke binderyprotein 25 (i det tilfælde, at det bindelige stof er den komponent, der skal bestemmes), kendetegnet ved, at man yderligere anvender uopløseliggiorte antistoffer over for det specifikke binder-protein, og at man efter reaktionen bestemmer enzymaktiviteten i den flydende eller den faste fase af 3Q reaktionsblandingen. 1

2 Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man tilsætter de uopløselige antistoffer over for det specifikke binder-protein til reaktionsblandingen som det sidste reagens. 35 2 Fremgangsmåde ifølge krav 2 til bestemmelse af det bindelige stof, kendetegnet ved, at man først til prøven sætter det specifikke binder-protein og derpå enzymconjugatet og til sidst de uopløselige antistoffer over for det specifikke binder-