JP7520820B2 - 筋萎縮性側索硬化症の治療方法 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症の治療方法 Download PDF

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Description

関連出願
この出願は、２０１８年９月２０日に出願されたイスラエル特許出願公開第２６１９０８号および２０１９年６月２７日に出願されたイスラエル特許出願公開第２６７７５２号の優先権の利益を主張しており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
上記の出願の内容はすべて、あたかもその全体が本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
２０１９年９月１９日に作成された２２，１３８バイトを含む７８８１８ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔというタイトルのＡＳＣＩＩファイルは、本願の提出と同時に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法、より具体的には、ただし排他的になることなく、細菌集団またはその代謝物による治療に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの早期死亡と診断から３～５年の平均生存率とを特徴とする進行性の特発性神経変性疾患である。ＡＬＳ症例の大部分は孤発性（ｓＡＬＳ）であるが、症例の１０～２０％は家族性（ｆＡＬＳ）であり、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）などの遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる。エダラボンのようなＡＬＳ標的薬を開発するために多大な努力がなされているが、これまでのところ、効果を確証させる疾患の修正活性をもたらしたものはない。過去の疫学研究では、ＡＬＳの発生と重症度に相関する明確な環境要因は特定されていないが、中枢神経系（ＣＮＳ）は、消化管から血流へと吸収され、脳血液関門（ＢＢＢ）を介してＣＮＳに到達し得る循環性の小分子量の代謝物などの末梢信号により影響されるということが、いっそう認識されるようになってきている。そこでは、それらがニューロンや他の常在細胞の代謝、転写、エピジェネティックなプログラムを調節できる。
複数の宿主の生理学的機能に影響を与える微生物の生態系である腸内マイクロバイオームは、そのような潜在的に生物活性のある中枢神経系疾患を調節する代謝物の大規模な潜在的供給源である。確かに、蓄積された証拠は、腸内マイクロバイオームの組成と機能が、自閉症、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、およびてんかん発作などの神経障害の病因に重要な役割を果たしていることを示唆している。腸内マイクロバイオームによって分泌、枯渇、または修正された代謝物は、ニューロンの伝達、シナプスの可塑性、髄鞘形成、および宿主の複雑な行動に関与することが示された。いくつかのヒントは、宿主の腸内マイクロバイオームのインターフェースがＡＬＳの過程に潜在的に関与している可能性があることを示唆している。低レベルの結腸密着結合タンパク質Ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１（ＺＯ－１）および付着タンパク質Ｅ－カドヘリンを伴う腸内バリアの破壊が２か月齢のＳＯＤ１－Ｔｇマウスで報告されており、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓという酪酸産生細菌の減少を特徴とする腸内毒素症を引き起こす可能性がある。ＳＯＤ１－Ｔｇマウスへの酪酸の投与は、マイクロバイオームの組成を変化させたが、マイクロバイオームの評価は単一の時点で１群あたり３匹の動物で行われ、そのため、この設定での腸内毒素症の範囲、重要性、メカニズムの正確な評価は不可能であった。ＡＬＳ患者の１６Ｓ ｒＤＮＡ分析は相反する結果をもたらしており、１つの研究は５人の健常な対照と比較した６人のＡＬＳ患者の異生物構成に注目し、一方で別の研究は２５人のＡＬＳ患者と３２人の健常な対照の間に有意な組成の違いを示さなかった。この設定では、直接的な機能的マイクロバイオームの調査は行われていない。
背景技術には、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｂｅｄｌａｃｋ＆Ｔｈｅ ＡＬＳＵｎｔａｎｇｌｅｄ Ｇｒｏｕｐ（２０１８）ＡＬＳＵｎｔａｎｇｌｅｄ ４２：Ｅｌｙｓｉｕｍ ｈｅａｌｔｈ’ｓ‘‘ｂａｓｉｓ’’，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，１９：３－４，３１７－３１９，ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６７８４２１．２０１７．１３７３９７８；およびＨａｒｌａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１，１０８３６－１０８４６が含まれる。
Ｒｉｃｈａｒｄ Ｂｅｄｌａｃｋ＆Ｔｈｅ ＡＬＳＵｎｔａｎｇｌｅｄ Ｇｒｏｕｐ（２０１８）ＡＬＳＵｎｔａｎｇｌｅｄ ４２：Ｅｌｙｓｉｕｍ ｈｅａｌｔｈ’ｓ‘‘ｂａｓｉｓ’’，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，１９：３－４，３１７－３１９，ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６７８４２１．２０１７．１３７３９７８；およびＨａｒｌａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１，１０８３６－１０８４６
本発明の態様によれば、治療有効量の少なくとも２つの代謝物を対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供され、少なくとも２つの代謝物の少なくとも１つは、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、ニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される。
本発明の態様によれば、ＡＬＳを治療するための少なくとも２つの代謝物の使用が提供され、少なくとも２つの代謝物の少なくとも１つは、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、ニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される。
本発明の態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉｓｔａｎｏｓｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択される、細菌集団を含む治療有効量のプロバイオティクスを対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供される。
本発明の態様によれば、ＡＬＳを治療するためのプロバイオティクスの使用が提供され、プロバイオティクスが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉｓｔａｎｏｓｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択される。
本発明の態様によれば、対象の腸内マイクロバイオームにおけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓ２４ ７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａからなる群から選択される細菌集団の量を選択的に減少させる治療有効量の薬剤を対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供される。
本発明の態様によれば、ＡＬＳを治療するため、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓ２４ ７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａからなる群から選択される細菌集団の量を選択的に減少させる薬剤の使用が提供される。
本発明の態様によれば、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される治療有効量の代謝物を対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供される。
本発明の態様によれば、ＡＬＳを治療するために、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される、代謝物の使用が提供される。
本発明の態様によれば、対象の微生物代謝物を分析することを含む、対象のＡＬＳを診断する方法が提供され、健常な対象における微生物代謝物の存在量と比較した、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される微生物代謝物の存在量の統計的に有意な減少が、ＡＬＳを示し、および／または健常な対象における微生物代謝物の存在量と比較した、タウロウルコレートからなる群から選択される微生物代謝物の存在量の統計的に有意な減少が、ＡＬＳを示す。
本発明の態様によれば、対象のマイクロバイオームにおけるＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓの量および／または活性を分析することを含む、対象のＡＬＳを診断する方法が提供され、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較して、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓの存在量および／または活性の統計的に有意な増加がＡＬＳを示す。
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの代謝物のうちの少なくとも１つは、ニコチンアミド、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩およびシンナメートからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの代謝物のうちの少なくとも１つは、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルタメートニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメートおよび１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの代謝物は、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルタメートニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメートおよび１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの代謝物のうちの少なくとも１つはニコチンアミドである。
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの代謝物のうちの少なくとも１つは、細菌集団に含まれる。
本発明の実施形態によれば、細菌集団は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉｓｔａｎｏｓｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、細菌集団は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）を含む。
細菌集団は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍおよびＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓを含む。
本発明の実施形態によれば、細菌集団は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、細菌集団は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、およびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、細菌集団はＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む。
本発明の実施形態によれば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓは、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓまたはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓを含む。
本発明の実施形態によれば、薬剤は抗生物質である。
本発明の実施形態によれば、薬剤はバクテリオファージである。
本発明の実施形態によれば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓは、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓまたはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓを含む。
本発明の実施形態によれば、方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅからなる群から選択される細菌の少なくとも１つの量および／または活性を分析することをさらに含み、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較して、細菌の存在量の統計的に有意な増加がＡＬＳを示す。
本発明の実施形態によれば、方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓからなる群から選択される細菌の少なくとも１つの量および／または活性を分析することをさらに含む、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較しされる細菌の存在量の統計的に有意な減少は、ＡＬＳを示している。
本発明の実施形態によれば、分析は、対象のマイクロバイオームのサンプルを分析することを含む。
本発明の実施形態によれば、マイクロバイオームが、腸内マイクロバイオーム、口腔マイクロバイオーム、気管支マイクロバイオーム、皮膚マイクロバイオーム、および膣マイクロバイオームからなる群から選択される。
本発明の実施形態によれば、マイクロバイオームは腸内マイクロバイオームである。
本発明の実施形態によれば、サンプルは糞便サンプルを含む。
本発明の実施形態によれば、分析することは、対象の血液サンプルにおいて行われる。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
本明細書では、本発明のいくつかの実施形態を、単なる例として、添付の図面を参照して説明する。ここで図面を詳細に具体的に参照すると、示されている詳細は例としてであり、本発明の実施形態の例示的な説明の目的のためであることが強調される。これに関して、図面と共に得られる説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
図１Ａ～Ｋ抗生物質での治療は、ＡＬＳマウスモデルの運動症状を悪化させる。（Ａ）実験計画。（Ｂ）ロータロッド、（Ｃ）吊り下げワイヤーグリップテスト、（Ｄ）疾患の経過全体にわたる神経学的スコアリングの行動による、運動症状の評価。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、マンホイットニーＵ検定。実験を３回繰り返した（Ｎ＝５～１０匹のマウス）。（Ｅ）組織学的画像、および（Ｆ）１４０日齢の水およびＡｂｘで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの脊髄における下位運動ニューロンの定量化。＊Ｐ＜０．０５、マンホイットニーＵ検定。（Ｇ）Ｔ２マップおよび（Ｈ～Ｉ）疾患の進行中の水およびＡｂｘで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの間の対応する領域におけるＴ２緩和時間の定量化。＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵ検定。実験を２回繰り返した（Ｎ＝５匹のマウス）。（Ｊ）ＧＦ（Ｎ＝１４）およびＳＰＦ（Ｎ＝１７）のＳＯＤ１－Ｔｇマウスの生存。＊＊Ｐ＜０．００５、ログランク検定。実験を２回繰り返した。（Ｋ）Ａｂｘおよび水で処理したＴＤＰ４３－Ｔｇ（各群でＮ＝１０）マウスの生存。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ログランク検定。実験を２回繰り返した。 図２Ａ～Ｈ。ＳＯＤ１－Ｔｇマウスは、ＷＴ同腹仔対照と比較して初期の腸内マイクロバイオームの組成および機能の違いを発症する。（Ａ）４０日目（発症前）、（Ｂ）１００日目（発症）および（Ｃ）１４０日目（進行性疾患）の重み付けＵｎｉＦｒａｃ ＰＣｏＡ。実験を３回繰り返した（各群でＮ＝６匹のマウス）。（Ｄ）疾患の進行中にＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇの便のサンプルを腸内マイクロバイオームメタゲノムショットガンシーケンシングすることによって得られた種レベルの分類群の概要。（Ｅ）ＷＴおよびＳＯＤ１－ＴｇマイクロバイオームのＫＥＧＧエントリーのＰＣＡ。ｐ＝１．５７ｘ１０ー１４、スピアマンの相関係数。（Ｆ）概略図、および（Ｇ）トリプトファン代謝の細菌遺伝子存在量のヒートマップ。（Ｈ）ニコチンアミドおよびニコチン酸生合成経路の細菌遺伝子存在量のヒートマップ。Ｎ＝６マウス、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵ検定。 図３Ａ～Ｈ。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動変性を改善し、寿命を延ばす。（Ａ）経時的な、ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴの便のＡＭ相対的存在量（１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンス）の線形回帰、および（Ｂ）糞便ＤＮＡ抽出物中のＡＭ １６Ｓ遺伝子コピーのｑＰＣＲ（Ｎ＝６マウス）。（Ｃ）ロータロッド、（Ｄ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｅ）神経学的スコアリングによって示されるＡＭで処理されたＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスの運動機能。（Ｆ）組織学的画像および（Ｇ）１４０日齢のＰＢＳおよびＡＭで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおける脊髄の運動ニューロンの定量化。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５マンホイットニーＵ検定。（Ｈ）ＰＢＳ、ＡＭ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（ＰＭ）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（ＬＧ）で処理したマウスの生存率＊＊＊Ｐ＜０．０００５ログランク検定。実験を６回繰り返した（Ｎ＝５～２６匹のマウス）。 図４Ａ～Ｆ。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの治療は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおけるニコチンアミド生合成の増強に関連している。（Ａ）ＡＭで処理されたＳＯＤ１－Ｔｇマウス（右上象限Ｎ＝７～８マウス）で有意に増加した血清代謝物。（Ｂ）ＡＭまたはＰＢＳで処理されたＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスの血清レベルのニコチンアミド経路代謝物。（Ｃ）細菌培養物中のニコチンアミドレベル。＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。（Ｄ）１００日目および（Ｅ）１４０日目にＡＭまたはＰＢＳで治療したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスのＣＳＦニコチンアミドレベル。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。（Ｆ）ＡＭ処理されたＳＯＤ１－Ｔｇ糞便サンプルにおけるマイクロバイオーム由来のニコチンアミド産生遺伝子の概略図。示された遺伝子は、ＡＭ処理（Ｎ＝７～８マウス）後に存在量が増加した。マンホイットニーＵ順位和検定。 図５Ａ～Ｇ。ニコチンアミド処理は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳの進行を改善する。（Ａ）ＣＳＦおよび（Ｂ）ＮＡＭおよびビヒクルで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウス（Ｎ＝１０マウス）における血清ＮＡＭレベル。（Ｃ）ロータロッド、（Ｄ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｅ）神経学的スコアリングによって示される皮下浸透圧ポンプを使用したＮＡＭまたはビヒクル処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動能力。＊Ｐ＜０．０５＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。実験を３回繰り返した（Ｎ＝１０匹のマウス）。（Ｆ）ＮＡＭおよびビヒクルで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの生存評価。ｐ＝０．１７５７、ログランク検定。（Ｇ）ＷＴまたはΔｎａｄＡＥ．ｃｏｌｉを接種したＡｂｘで前処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの神経学的スコアリング。＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。 図６Ａ～Ｅ。ＡＭおよびＮＡＭ治療の潜在的な下流運動ニューロン調節メカニズムを明らかにする。（Ａ）ＮＡＭ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウス（Ｎ＝１０マウス）の脊髄におけるＦＤＲ補正された差次的発現遺伝子のヒートマップ。（Ｂ）ＡＭおよびＮＡＭで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウス間の脊髄転写物のｌｏｇ２倍の変化のスピアマン相関。（Ｃ）４つの神経病理学的な群に分類されたＫＯＧデータベースを用いたＮＡＭ治療後の有意に差次的に発現された遺伝子の比較。（Ｄ）ＮＡＭ処理および（Ｅ）ＡＭ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの脊髄転写産物の生物学的プロセス、分子機能、および細胞成分へのＦＤＲ補正遺伝子セット強化分布。 図７Ａ～Ｆ。マイクロバイオーム由来のニコチンアミド代謝は、ＡＬＳ患者で損なわれる（Ａ）細菌種の組成のＰＣＡ（ＰＣ１でｐ＝３．３ｘ１０ー６、スピアマン相関係数）または（Ｂ）ＡＬＳ患者（Ｎ＝３２）および健常対照（家族、Ｎ＝２７）からの便のサンプルのメタゲノムショットガンシーケンシングによって得られた、ＫＥＧＧオルソロジー（ＫＯ）注釈付き細菌遺伝子（ＰＣ１でｐ＝２．８ｘ１０ー９、スピアマン相関係数）。（Ｃ）ＡＬＳおよび健常者の便のサンプルにおけるニコチンアミド経路のマイクロバイオーム関連遺伝子のＫＯ相対存在量。（Ｄ）非標的メタボロミクスによって得られたＡＬＳ患者および健常な個人におけるトリプトファン／ニコチンアミド経路の血清代謝物レベル。（Ｅ）血清および（Ｆ）ＡＬＳ患者（血清でＮ＝４１、ＣＳＦで１２）および健常対照者（血清でＮ＝２１、ＣＳＦで１７）のＣＳＦ ＮＡＭレベル、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵテスト。 図８Ａ～Ｉ。抗生物質治療は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ症状を悪化させる。ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔対照マウスは、４０日齢から実験のエンドポイントまで、非処理または飲料水中の広域スペクトルＡｂｘで処理された。６０日目、８０日目、１００日目、１２０日目、および１４０日目に、マウスの運動能力を（Ａ、Ｄ、およびＧ）ロータロッド、（Ｂ、Ｅ、およびＨ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ、Ｆ、およびＩ）神経学的スコアリングによって評価した。（Ｎ＝５～１０マウス）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、マンホイットニーＵ検定。 図９Ａ～Ｐ。ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ症状に対する抗生物質治療の効果。（Ａ）ロータロッド、（Ｂ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ）神経学的スコアによって示される、ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ治療における経時的な運動機能の線形回帰。（Ｄ）脳領域のＭＲＩおよびＡＬＳ全体にわたる水とＡｂｘ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウス間のＴ２緩和時間の対応する（Ｅ～Ｉ）の定量化。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５、マンホイットニーＵ検定。（Ｊ）４６時間、１００～１０１日にわたるホームケージの運動分析（Ｎ＝５マウス）。＊Ｐ＝０．０３。水とＡｂｘで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウス間の５０日目（Ｏ）および１４０日目（Ｐ）の小腸（Ｋ～Ｌ）、結腸（Ｍ～Ｎ）、脊髄における免疫細胞亜集団の分布。（Ｎ＝５マウス）、マンホイットニーＵ検定。 図１０Ａ～Ｄ。ＧＦ－対ＳＰＦ－ＳＯＤ１－ＴｇマウスおよびＡｂｘ処理のＴＤＰ４３－Ｔｇマウスの生存。１１５日目に自発的にコロニー形成したＳＰＦ－およびＧＦ－ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの生存。＊Ｐ＜０．０５、ログランク検定。実験は２回行われた。（Ａ）（Ｎ＝１３のＳＰＦおよび６のＧＦ ＳＯＤ１－Ｔｇマウス）および（Ｂ）（Ｎ＝５のＳＰＦおよび８のＧＦ－ＳＯＤ１－Ｔｇマウス）。（Ｃ～Ｄ）Ａｂｘおよび水で処理したＴＤＰ４３－Ｔｇマウスの生存率＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ログランク検定。実験は２回行った（各群でＮ＝５～１０匹のマウス）。 図１１Ａ～Ｏ。ＡＬＳの進行全体にわたるＳＯＤ１－Ｔｇマウスモデルの微生物の組成ダイナミクス。（Ａ）ＡＬＳの経過中の個々のＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおける細菌叢の分類群の概要、および（Ｂ）糞便のサンプルの１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングによって得られた属（平均化された時点）。（Ｎ＝６マウス）、実験を３回繰り返した。（Ｃ）疾患の進行全体にわたるＳＯＤ１－ＴｇマウスとＷＴマウスの間の差次的に表れる有意な属の相対的な存在量。（Ｄ～Ｍ）ＷＴとＳＯＤ１－Ｔｇの便の間における、ＡＬＳ進行中の代表的な細菌の相対的な存在量の変化に関するＦＤＲ補正線形回帰比較。スピアマンの相関係数。（Ｎ）経時的なＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマイクロバイオームのアルファ多様性。実験を３回繰り返した（各群でＮ＝６匹のマウス）。（Ｏ）ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウス（Ｎ＝５～６のマウス）の糞便サンプルから抽出された１ｎｇのＤＮＡにおける総１６Ｓコピー数のｑＰＣＲベースの定量化。 図１２Ａ～Ｍ。ＡＬＳ進行全体にわたるＡｂｘ治療ＳＯＤ１－Ｔｇマウスモデルの微生物組成ダイナミクス。（Ａ）ＡＬＳの経過中の個々のＡｂｘ処理されたＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおける細菌門の分類群の概要。慢性的なＡｂｘレジーム下の疾患の（Ｂ）４７日目（Ａｂｘ前）および（Ｃ～Ｇ）６０～１４０日目の重み付けＵｎｉＦｒａｃＰＣｏＡ。（Ｈ～Ｍ）ＡＬＳの経過中のＡｂｘ処理されたＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスの有意に強化された細菌属のＦＤＲ補正ボルケーノプロット。 図１３Ａ～Ｉ。ＡＬＳの進行全体にわたるＥｘ－ＧＦＳＯＤ１－Ｔｇマウスモデルにおける微生物の自発的なコロニー形成。（Ａ）ＡＬＳの経過中に特発性細菌コロニー形成を経ている個々のＥｘ－ＧＦ ＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇの細菌属の分類群の概要。（Ｂ～Ｅ）自発的コロニー形成後４日目、５日目、５３日目および６３日目のＥｘ－ＧＦ ＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスの重み付けＵｎｉＦｒａｃＰＣｏＡ。（Ｆ～Ｉ）自発的コロニー形成後の４日目、５日目、５３日目、および６３日目のＡＬＳの経過中のＥｘ－ＧＦＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇの有意に強化された細菌属のＦＤＲ補正ボルケーノプロット。 図１４Ａ～Ｅ。ＳＯＤ１－Ｔｇマウスモデルにおける飼養所の影響を受けた腸内毒素症（Ａ）重み付けＵｎｉＦｒａｃ ＰＣｏＡおよび（Ｂ）異なる非バリアの飼養所（飼養所Ｂ、ベングリオン大学）に４週齢、６週齢、８週齢、１２週齢で収容されたＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスのアルファ多様性。（Ｃ）飼養所Ａ（ワイツマン科学研究所）および飼養所Ｂ（ベングリオン大学）の８０日齢のＷＴマウスにおける細菌属の個体および（Ｄ）平均分類群の概要。（Ｅ）２つの施設のＷＴ動物における上位２０の非常に豊富なマイクロバイオーム属の存在比の概要、およびＳＯＤ１－Ｔｇ動物におけるそれらの対応する存在量。比較は、各群で１回（Ｎ＝５～８の）マウスで実行した。 図１５Ａ～Ｎ。ＷＴとＳＯＤ１－Ｔｇ糞便マイクロバイオームのメタゲノムの違い（Ａ）細菌組成のＰＣｏＡプロット、および（Ｂ）メタゲノムショットガンシーケンシングによって得られたＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスの腸内マイクロバイオームの種レベルでの分類群の概要表現。実験を２回繰り返した（Ｎ＝６のマウス）。（Ｃ～Ｎ）ＷＴとＳＯＤ１－Ｔｇの便の間における、ＡＬＳ進行中の代表的な細菌の相対的な存在量の変化に関するＦＤＲ補正線形回帰比較。スピアマンの相関係数。 図１６Ａ～Ｌ。６０日齢ＷＴ（Ｎ＝８）およびＳＯＤ１－Ｔｇ（Ｎ＝７）マウスの食品摂取量（Ａ、Ｂ）、水消費量（Ｃ、Ｄ）、呼吸交換率（Ｅ、Ｆ）、Ｏ２消費量（Ｇ、Ｈ）、熱産生（Ｉ）、運動（Ｊ）および速度（Ｋ、Ｌ）のＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔の代表的な記録（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）および定量化（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｌ）における代謝測定。 図１７Ａ～Ｌ。選択されたＡＬＳ相関マイクロバイオーム株によるＡｂｘ前処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの単一コロニー形成。（Ａ）ロータロッド、（Ｂ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ）神経学的スコアリングによって示される、ＰＢＳ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ（ＥＬ）、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＣＣ）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ（ＰＧ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ（ＬＭ）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＰＤ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（ＬＧ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（ＰＭ）、または Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ、ＡＴＣＣ ８３５）で処理されたＡｂｘ前処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動機能。（Ｄ～Ｆ）ＰＢＳまたはＥｉｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｔａｙｉ（ＥＴ）、または（Ｇ～Ｉ）Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ（ＳＶ）で処理されたＡｂｘ前処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動機能。（Ｊ～Ｌ）ＰＢＳ、ＬＭ、ＰＤ、ＬＧ、ＰＭ、またはＡＭで処理された、Ａｂｘで前処理されたＷＴ同腹仔対照の運動機能。（Ｎ＝６～８のマウス）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。 図１８Ａ～Ｍ。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓの単一コロニー形成が、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ進行に与える影響。（Ａ）ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ便（Ｎ＝６マウス）のＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ（ＲＴ）の相対的な存在量（１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンス）の線形回帰。ＰＢＳまたはＲＴで処理されたＡｂｘ前処理ＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇの（Ｂ）ロータロッド、（Ｃ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｄ）神経学的スコアリング（Ｎ＝５～９マウス）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵ検定。１４０日齢のＰＢＳおよびＲＴで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの（Ｅ）組織学的画像および（Ｆ）脊髄運動ニューロンの定量化。疾患全体にわたるＰＢＳとＲＴ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウス間の（Ｇ）脳領域および対応する（Ｈ－Ｍ）Ｔ２緩和時間の定量化。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５マンホイットニーＵ検定。実験を２回繰り返した（Ｎ＝５匹のマウス）。 図１９Ａ～Ｉ。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓの治療は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ症状を悪化させる。（Ａ、Ｄ、Ｇ）ロータロッド、（Ｂ、Ｅ、Ｈ）吊り下げワイヤーグリップテスト、（Ｃ、Ｆ、Ｉ）神経学的スコアリングによる、３つの生物学的反復におけるＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ（ＲＴ）によるＡｂｘ前処理ＳＯＤ１ーＴｇおよびＷＴ同腹子処理の評価。（Ｎ＝５～１０のマウス）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５マンホイットニーＵ検定。 図２０Ａ～Ｏ。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ治療は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ症状を軽減する。Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔対照マウスを、６０日齢から実験の終点までビヒクルとしてＡＭ（ＡＴＣＣ ８３５）またはＰＢＳで経口投与した。６０日目、８０日目、１００日目、１２０日目、および１４０日目に、マウスの運動能力を（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、およびＯ）ロータロッド、（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＭ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＮ）神経学的スコアリングによって評価した。（Ｎ＝５～２６マウス）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵ検定。 図２１Ａ～Ｌ。ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳの症状とマイクロバイオームの組成に対するＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ治療の効果。（Ａ～Ｄ）１００日目および１４０日目のＰＢＳおよびＡＭ（ＡＴＣＣ ８３５）処理Ａｂｘ前処理ＳＯＤ１－ＴｇマウスにおけるＴ２緩和時間の定量化。＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５、マンホイットニーＵ検定。（Ｅ）ＰＢＳ、ＡＭ、Ｐ．Ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（ＰＭ）またはＬ．ｇａｓｅｒｉ（ＬＧ）で処理された１２０日のＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇの全身ＦＩＴＣ－デキストラン測定。（Ｆ）ＰＢＳまたはＡＭで処理されたＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおける細菌種の組成のＰＣｏＡ。（Ｇ）ＰＢＳまたはＡＭで処理されたＳＯＤ１－Ｔｇの属細菌の概要。ＰＢＳまたはＡＭで処理された（Ｈ）ＳＯＤ１－Ｔｇまたは（Ｉ）ＷＴマウスにおけるＡＭの相対的な存在量。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５、マンホイットニー順位和検定。１４０日齢のＡＭまたはＰＢＳで処理したＷＴおよびＳＯＤ１－ＴｇマウスのＧＩ管全体の粘膜および管腔サンプルにおけるＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ １６Ｓコピー数の（Ｉ）個々のおよび（Ｊ）平均のｑＰＣＲベースの倍率変化、（Ｋ）ＳＯＤ１－Ｔｇの属細菌の概要、または（Ｌ）ＰＢＳまたはＡＭで処理されたＷＴマウス。 図２２Ａ～Ｃ。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ２８６９）での治療は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ症状を軽減する。Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔対照マウスを、６０日齢から実験の終点までビヒクルとしてＡＭ（ＡＴＣＣ ２８６９）またはＰＢＳで経口投与した。６０日目、８０日目、１００日目、１２０日目、および１４０日目に、マウスの運動能力を（Ａ）、ロータロッド、（Ｂ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ）神経学的スコアリングによって評価した。（Ｎ＝８～１０マウス）、＊＊Ｐ＜０．００５、マンホイットニーＵ検定。 図２３Ａ～Ｊ。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａでの治療は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの粘液特性を変化させる。１４０日齢の（Ａ）ＰＢＳおよび（Ｂ）ＡＭ（ＢＡＡ－８３５）Ａｂｘで前処理したＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスの遠位結腸粘膜の免疫組織化学的評価。ＤＮＡはＳｙｔｏｘ－ｇｒｅｅｎ（緑）で染色され、粘液は抗ＭＵＣ２Ｃ３抗血清とヤギ抗Ｉｇ（赤）で染色された。上皮と外側の粘液／管腔の細菌の間の非染色領域は内側の粘液層であり、この中の細菌へのポイントが可能になる。（Ｃ）総粘液プロテオミクスランドスケープおよび（Ｄ）ＡＭ関連ペプチドのヒートマップ表現および（Ｅ～Ｊ）主要な代表的な粘液成分の定量化。（Ｎ＝４～８マウス）、マンホイットニーＵ検定。 図２４Ａ～Ｇ。血清のメタボロミクスのプロファイルは、ＡＬＳ ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの抗生物質またはＡＭの治療の影響を受ける。１００日齢の血清代謝物のヒートマップ表現（Ａ）ナイーブＳＯＤ１－ＴｇおよびそれらのＷＴ同腹仔、（Ｂ）水またはＡｂｘの処理のＳＯＤ１－Ｔｇマウス、（Ｃ）ＰＢＳまたはＡＭの処理のＳＯＤ１－Ｔｇマウス。（Ｄ）腸内マイクロバイオームに由来する可能性によってＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡｂｘ治療によって有意に変化した上位６つの血清代謝物のスコアリング。（Ｅ）ロータロッド、（Ｆ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｇ）神経学的スコアリングによって示される皮下浸透圧ポンプを使用したフェノール硫酸塩またはビヒクル処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動能力。 図２５Ａ～Ｂ。トリプトファンとニコチンアミドの代謝は、ＡＬＳ ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの抗生物質またはＡＭ治療の影響を受ける。（Ａ）水およびＡｂｘ処理または（Ｂ）ＰＢＳおよびＡＭ処理された１００日齢のＳＯＤ１－Ｔｇマウスのトリプトファン代謝の非標的メタボロミクス評価。 図２６Ａ～Ｉ。ニコチンアミド処理は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳの進行を改善する。（Ａ、ＤおよびＧ）ロータロッド、（Ｂ、ＥおよびＨ）吊り下げワイヤーグリップテスト、および（Ｃ、ＦおよびＩ）神経学的スコアリングによって示される皮下浸透圧ポンプを使用したＮＡＭまたはビヒクル処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動能力。（Ｎ＝１０匹のマウス）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５、マンホイットニーＵ検定。 図２７Ａ～Ｃ。ＮＡＭ産生が損なわれた腸共生菌によるＳＯＤ１－Ｔｇマウスの単回接種（Ａ）ＷＴまたはΔｎａｄＡのＥ．ｃｏｌｉ培養物中のニコチンアミドレベル。＊＊＊Ｐ＜０．０００５、マンホイットニーＵ検定。（Ｂ）ロータロッドおよび（Ｃ）吊り下げワイヤーグリップテストによって示される、ＷＴまたはΔｎａｄＡのＥ．ｃｏｌｉを接種したＡｂｘで前処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動能力。 ＮＡＭは、核呼吸因子－１（ＮＲＦ－１）に関連する遺伝子を差次的に発現した。ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＭおよびＮＡＭ処理後に同様に変化し、核呼吸因子－１（ＮＲＦ－１）転写因子の結合部位を共有するＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって得られた脊髄転写物の表現。分析は、Ｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒプラットフォーム８５を使用して行われた。 図２９Ａ～Ｂ。ＡＬＳ患者における異なる腸内マイクロバイオームの組成と血清代謝物のプロファイル。（Ａ）メタゲノムショットガンシーケンシングによって得られた健常な家族およびＡＬＳ患者の腸内マイクロバイオームの種レベルでの分類群の概要表現およびＡＬＳ患者と健常な対照の個体の間の上位２０の変化した細菌種の表。（Ｂ）非標的化メタボロミクスによって得られた健常な個人（Ｎ＝１３）とＡＬＳ患者（Ｎ＝２３）の間で差次的に表された血清代謝物の上位９７。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法、より具体的には、ただし排他的になることなく、細菌集団またはその代謝物による治療に関する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行することができる。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、特発性の遺伝的影響を受けた神経変性疾患であり、その様々な発症と臨床経過は、未知の環境要因によって引き起こされる可能性がある。
本発明者らは、最も一般的に使用されるＡＬＳマウスモデル（ＳＯＤ１－Ｔｇマウスモデル）における広域スペクトル抗生物質誘発性腸内マイクロバイオームの枯渇が、疾患の症状の悪化につながることを今や実証している（図１Ａ～Ｋ）。さらに、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの腸内マイクロバイオームの組成とメタゲノム機能は、運動の臨床症状が現れる前でさえ、ＷＴの同腹仔と比較して変化し、これらのマウスの全身メタボロミクスプロファイルが著しく変化した（図２Ａ～Ｈ）。
いくつかの微生物種は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの疾患の重症度と相関または反相関していることが確認された。これらのうち、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）の嫌気性単培養によるＳＯＤ１－Ｔｇの抗生物質後のコロニー形成は、運動の症状と生存の改善をもたらし（図３Ａ～Ｈ）、一方でＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓによるコロニー形成は、疾患の症状の悪化と関連していた（図１４Ａ～Ｍおよび図１５Ａ～Ｉ）。さらに、ニコチンアミド（ＮＡＭ）生合成経路の主要なＡＭ由来微生物遺伝子は、ＡＭ補充ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの腸内マイクロバイオームで強化され、一方でＮＡとその生合成中間体は、この設定ではＡＭ処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）および血清で強化された（図４Ａ～Ｆ）。さらに、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの全身的なＮＡＭ補給は、明確な有益なＣＮＳトランスクリプトーム修飾と相まって、運動ニューロン症状の臨床的改善を誘発した（図５Ａ～Ｆおよび６Ａ－Ｅ）。ヒトでは、健常な家族の対照と比較して、ＡＬＳ患者では、異生物性腸内マイクロバイオームのメタゲノム構成、歪んだ血清メタボロミクスプロファイル、および血清とＣＳＦのＮＡＭレベルの変化が、認められた（図７Ａ～Ｅ）。総合すると、これらの結果は、ＡＬＳ動物モデルおよび潜在的にヒトにおいて、異なる腸内共生生物、それらの調節された代謝物、および運動症状の間に調節リンクが存在する可能性があることを示唆している。
結果として、本教示は、ＡＬＳの治療のための腸内マイクロバイオーム関連調節剤の使用を示唆している。
したがって、本発明の第１の態様によれば、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥからなる群から選択される治療有効量の代謝物を対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、ＡＬＳの進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる、または逆転させる、ＡＬＳの臨床的または審美的症状を実質的に改善する、またはＡＬＳの臨床的または審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、病状（すなわち、ＡＬＳ）の発症を阻害、予防または阻止すること、および／または病状の軽減、寛解、または退行を引き起こすことを指す。当業者は、本明細書でさらに開示されるように、様々な方法論およびアッセイを使用して、病状の発生または病状の減少、寛解または退行を評価できることを理解するであろう。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルーゲーリック病および運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）とも呼ばれ、随意筋運動を制御する中枢神経系の神経細胞である運動ニューロンの変性によって引き起こされる進行性の致命的な神経変性疾患である。ＡＬＳは通常、上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの両方が変性し、筋肉へのメッセージの送信を停止するため、全身の筋力低下と萎縮を引き起こす。筋肉は、機能できず、徐々に弱くなり、除神経のために線維束性収縮（単収縮）を発症し、最終的にはその除神経のために萎縮する。罹患した対象は、最終的にすべての随意運動を開始および制御する能力を失う可能性がある。膀胱括約筋と腸括約筋、および眼球運動を司る筋肉は、常にではないが、通常は無事である。認知機能障害または行動機能障害もこの疾患に関連している。ＡＬＳ対象の約半数が認知と行動に軽度の変化を経ており、１０～１５％が前頭側頭型認知症の兆候を示している。言語機能障害、高次機能障害、および社会的認知と言語記憶の問題は、ＡＬＳで最も一般的に報告されている認知症状である。
本明細書で使用される「ＡＬＳ」という用語は、古典的ＡＬＳ（典型的には下位運動ニューロンおよび上位運動ニューロンの両方に影響が及ぶ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ、典型的には上位運動ニューロンのみに影響が及ぶ）、進行性球麻痺（ＰＢＰまたはＢｕｌｂａｒ Ｏｎｓｅｔ、通常は飲み込み、噛み砕き、発話の困難が開始するＡＬＳの変形版）、進行性筋萎縮性筋萎縮症（ＰＭＡ、通常は下位運動ニューロンにのみ影響が及ぶ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られるＡＬＳのすべての分類を含む。
特定の実施形態によれば、ＡＬＳは古典的なＡＬＳである。
「ＡＬＳ」という用語には、孤発性および家族性（遺伝性）ＡＬＳ、任意の進行速度のＡＬＳ（すなわち、急速または遅い進行）、および任意の段階のＡＬＳ（例えば、ＡＬＳの発症前、発症および後期）が含まれる。
特定の実施形態によれば、ＡＬＳは孤発性ＡＬＳである。
特定の実施形態によれば、ＡＬＳは家族性ＡＬＳである。
特定の実施形態によれば、ＡＬＳは急速進行性ＡＬＳである。
本明細書で使用される場合、「急速進行性ＡＬＳ」という句は、症状が継続的に進行し、診断から１年未満以内に運動ニューロンの著しい劣悪化が観察され、最大４年対象が生存し得るＡＬＳを指す。特定の実施形態によれば、急速進行性ＡＬＳは、１ヶ月の期間にわたって０．６５ＡＬＳＦＲＳ－Ｒポイントを超える変化を特徴とする。
特定の実施形態によれば、ＡＬＳは、ＡＬＳ関連うつ病である。
本明細書で使用される場合、「ＡＬＳ関連うつ病」という句は、ＡＬＳ発症後に始まるうつ病および／または不安症を指す。特定の実施形態によれば、ＡＬＳ関連うつ病は、ＡＬＳの作用機序の一部であり、例えば、情動調節障害と前頭葉型認知症ＡＬＳに起因する可能性がある。うつ病を診断および監視する方法は当技術分野で周知であり、ＡＬＳうつ病目録（ＡＤＩ－１２）、ベックうつ病目録（ＢＤＩ）および病院不安抑うつ尺度（ＨＡＤＳ）質問票が含まれるが、これらに限定されない。
上記のように、本発明の方法は、とりわけ、ＡＬＳを治療することを対象とする。治療は、ＡＬＳ症状の検出後を含め、疾患のどの段階でも開始できる。
ＡＬＳの検出は、体内のどの運動ニューロンが最初に損傷を受けているか（したがって、体内のどの筋肉が最初に損傷を受けているか）に応じて、様々な症状の出現によって判断される場合がある。一般に、ＡＬＳ症状には、典型的には明らかな衰弱および／または筋萎縮である最も初期の症状が含まれる。その他の症状には、筋肉の線維束性収縮（単収縮）、けいれん、または影響の及んだ筋肉のこわばり、腕や脚に影響を与える筋力低下、および／または不明瞭な発話や鼻声が含まれる。ほとんどのＡＬＳ患者は、腕または脚に最初の症状が出る。明瞭な発話や嚥下の困難に、他者が最初に気づく。その他の症状には、嚥下困難、舌の可動性の喪失、呼吸困難などがある。
症状は、変性した神経系の部分、すなわち上位運動ニューロンと下位運動ニューロンによって分類することもできる。上位運動ニューロン変性の症状には、筋肉の緊張と硬直（痙縮）、および過剰な絞扼反射を含む反射の亢進（反射亢進）が含まれる。下位運動ニューロン変性の症状には、筋力低下と萎縮、筋肉のけいれん、および皮膚の下に見られる筋肉のつかの間の単収縮（線維束性収縮）が含まれる。ＡＬＳと診断されるには、患者が他の原因に帰属し得ない上位および／または下位運動ニューロン損傷の兆候と症状患っている必要がある。
あるいは、治療は、疾患の進行段階で開始され得る、例えば、筋力の低下と萎縮が体の様々な部分に広がり、対象は、動き［例えば、対象は、引き締まった筋肉（痙縮）、誇大な反射（反射亢進）、筋力低下と萎縮、筋肉のけいれん、および／または皮膚の下に見られる筋肉のつかの間の単収縮（線維束性収縮）に苛まれることがある］、飲み込み（嚥下障害）、発話、または言葉の形成に関する問題が増加する場合がある。
ＡＬＳの進行を監視する方法は、当技術分野でよく知られている。そのような方法の非限定的な例には、医師による身体的評価；体重；心電図（ＥＣＧ）；ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳまたはＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）のスコア；例えば肺活量（努力性肺活量または通常の肺活量）によって測定することができる呼吸機能；例えばハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、握力ダイナモメトリー、手動筋力テスト（ＭＭＴ）、電気インピーダンス筋電図（ＥＩＭ）、および最大自発的等尺性収縮テスト（ＭＶＩＣＴ）によって測定することができる筋力；運動ユニット数推定（ＭＵＮＥ）；例えばＡＬＳうつ病目録（ＡＤＩ－１２）、ベックうつ病目録（ＢＤＩ）および病院不安うつ病尺度（ＨＡＤＳ）質問票によって測定することができる認知／行動機能；例えばＡＬＳ評価質問票（ＡＬＳＡＱ－４０）によって評価することができる生活の質；およびＡｋｔリン酸化およびｐＡｋｔ：ｔＡｋｔ比が含まれる（その内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１６０５６３号を参照されたい）。
特定の実施形態によれば、対象は、ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ）；呼吸機能；筋力および／または認知機能によって監視される。
特定の実施形態によれば、筋力は、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、握力ダイナモメトリー、手動筋力テスト（ＭＭＴ）および電気インピーダンス筋電図（ＥＩＭ）からなる群から選択される方法によって評価される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、疾患（すなわち、ＡＬＳ）と診断された、または疾患（すなわち、ＡＬＳ）を発症するリスクがある、任意の年齢および任意の性別のヒトである対象を指す。
特定の実施形態によれば、対象は、急速進行性ＡＬＳおよび／またはＡＬＳ関連のうつ病を有する。
特定の実施形態によれば、対象は、可能性があり明確なＡＬＳのエル・エスコリアル基準を満たしている、すなわち、対象は以下を提示している。
１．臨床的、電気生理学的または神経病理学的検査による下位運動ニューロン（ＬＭＮ）変性の兆候、
２．臨床検査による上位運動ニューロン（ＵＭＮ）変性の兆候、および
３．ある地域内または他の地域への兆候の漸進的な広がり。併せて、以下が欠如している。
－ＬＭＮおよび／またはＵＭＮ変性の兆候を説明し得る他の疾患のプロセスの電気生理学的証拠、および
－観察された臨床的および電気生理学的兆候を説明し得る他の疾患のプロセスの神経画像による証拠。
特定の実施形態によれば、対象は、本発明による治療前に２６～４２のＡＬＳＦＲＳ－Ｒスコアを有する。
特定の実施形態によれば、対象は、本発明による治療前の過去３～１２ヶ月にわたって、月あたり０．６５のＡＬＳＦＲＳ－Ｒポイントを超える疾患進行速度を有する。
前述のように、この方法は、治療有効量の以下の細菌代謝物のうちの少なくとも１つを対象に投与することを含む：４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥ。
特定の実施形態によれば、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルタメートニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメートおよび１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣからなる群から選択される少なくとも２つの代謝物が提供される。
別の実施形態では、細菌代謝物ニコチンアミドは、上記の代謝物の１つと一緒に提供される。
さらに別の実施形態では、細菌代謝物ニコチンアミドは提供されない。
本明細書で使用される場合、「シンナメート」という用語は、シンナメート、その塩、シンナメートエステル、ｐ－ジメチルアミノシンナメート、シンナムアルデヒド、酢酸シンナミル、シンナミルアルコール、安息香酸シンナミル、シンナメートシンナミル、ギ酸シンナミル、イソ酪酸シンナミル、イソ吉草酸シンナミル、およびフェニル酢酸シンナミル、およびそれらの組み合わせを指す。
本発明のこの態様のエクオールは、（Ｓ）－エクオール（例えば、閉経期の女性のほてりの治療のために現在開発中のＡＵＳ－１３１）であり得る。一実施形態では、エクオールはエクオール塩、例えば、エクオール硫酸塩である。
「ナイアシンアミド」としても知られるニコチンアミド（ＮＡ）は、ビタミンＢ３（ナイアシン）のアミド誘導体である。ＮＡの化学式はＣ６Ｈ６Ｎ２Ｏである。
ニコチンアミド、ならびに本発明で使用される他の化合物は、塩、錯体、水和物および溶媒和物を形成することができる場合があり、定義された処理においてそのような形態を使用することが本明細書で企図されているということが、当業者によって理解される。高純度のニコチンアミド製剤、例えば純度９７または９９％が、市販されている。そのような市販の製剤は、本発明の方法で使用するためのニコチンアミド組成物を調製するために適切に使用され得る。さらに、高純度のニコチンアミドの合成方法は、当業者に知られている。
特定の実施形態によれば、ニコチンアミドは、ニコチンアミド誘導体またはニコチンアミド模倣物である。本明細書で使用される「ニコチンアミド（ＮＡ）の誘導体」という用語は、天然のＮＡの化学的に修飾された誘導体である化合物を意味する。一実施形態では、化学修飾は、アミド部分の窒素または酸素原子を介した、（環の炭素または窒素メンバーを介した）基本的なＮＡ構造のピリジン環の置換であり得る。置換される場合、１つまたは複数の水素原子を置換基で置き換えることができ、および／または置換基をＮ原子に結合させて、四価の正に帯電した窒素を形成することができる。したがって、本発明のニコチンアミドは、置換または非置換のニコチンアミドを含む。別の実施形態では、化学修飾は、単一の基の欠失または置換例えば、ＮＡのチオベンズアミド類似体を形成することであり得、このすべては、有機化学に精通している人々に認められている。本発明の文脈における誘導体はまた、ＮＡのヌクレオシド誘導体（例えば、ニコチンアミドアデニン）を含む。ＮＡの様々な誘導体が記載されており、一部はまた、ＰＤＥ４酵素の阻害活性（ＷＯ０３／０６８２３３；ＷＯ０２／０６０８７５；ＧＢ２３２７６７５Ａ）に関連して、またはＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ０１／５５１１４）として記載されている。例えば、４－アリール－ニコチンアミド誘導体を調製するプロセス（ＷＯ０５／０１４５４９）として記載されている。他の例示的なニコチンアミド誘導体は、ＷＯ０１／５５１１４およびＥＰ２１２８２４４に開示されている。
ニコチンアミド模倣物には、ニコチンアミドの修飾型、および多能性細胞からのＲＰＥ細胞の分化および成熟におけるニコチンアミドの効果を再現するニコチンアミドの化学的類似体が含まれる。例示的なニコチンアミド模倣物には、安息香酸、３－アミノ安息香酸、および６－アミノニコチンアミドが含まれる。ニコチンアミド模倣物として作用する可能性のある別のクラスの化合物は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤である。例示的なＰＡＲＰ阻害剤には、３－アミノベンズアミド、イニパリブ（ＢＳＩ ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ－０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ－８８８）、ＣＥＰ ９７２２、ＭＫ ４８２７、およびＢＭＮ－６７３が含まれる。
一実施形態では、ニコチンアミドはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）である。別の実施形態では、ニコチンアミドはニコチンアミドリボシドである。
本明細書に記載の細菌代謝物の例示的な用量には、１日１～５００ｍｇ／ｋｇが含まれる。本発明の一実施形態では、治療は、＞１０ｍｇ／ｋｇの毎日の投与、例えば１０～５００ｍｇ／ｋｇの毎日の投与を含む。
本発明者らは、上記の細菌代謝物の組み合わせ、例えば、２つの代謝物、３つの代謝物、４つの代謝物、５つの代謝物、６つの代謝物、７つの代謝物、８つの代謝物、９つの代謝物またはそれより多い代謝物を企図している。
したがって、例えば、組み合わせは以下を含み得る：
ニコチンアミドとフェノール硫酸塩；
ニコチンアミドとエクオール；
ニコチンアミドとシンナメート；
ニコチンアミド、フェノール硫酸塩およびエクオール；
ニコチンアミド、フェノール硫酸塩およびシンナメート；
ニコチンアミド、エクオールおよびシンナメート；
ニコチンアミド、エクオール、フェノール硫酸塩およびシンナメート。
ニコチンアミド、および、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルタメートニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメートおよび１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣからなる群から選択される代謝物の少なくとも１つ。
細菌代謝物は、それ自体で、または医薬組成物の一部として提供され得、それは適切な担体または賦形剤と混合される。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を用いた、本明細書に記載の有効成分の１つまたは複数の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果を司る、本明細書に記載の細菌代謝物の１つまたは複数を指す。
以下、互換的に使用され得る「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。これらの句にはアジュバントが含まれている。
本明細書において、「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
薬物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、ペンシルベニア州イーストン、最新版に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達を含み得、これには、筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、心臓内、例えば、右心室腔または左心室腔内、総頚動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内への注射が含まれ得る。
特定の実施形態によれば、薬剤は経口または直腸に投与される。
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接医薬組成物を注射することにより、全身的ではなく局所的な方法で、医薬組成物を投与することができる。
「組織」という用語は、１つまたは複数の機能を実行するように設計された細胞からなる生物の一部を指す。例としては、脳組織、網膜、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、浮揚、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、有効成分を薬学的に使用できる調製物に加工することを容易にする、賦形剤および助剤を含む、１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で処方することができる。適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液に処方することができる。経粘膜投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が製剤において使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に処方することができる。そのような担体は、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製でき、任意選択で得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、適切な助剤を添加した後、所望するのであれば、錠剤または糖衣錠のコアを得る。適切な賦形剤は、特に、糖、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム、および／または生理学的に許容されるポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望であれば、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。
糖衣錠コアには適切なコーティングが施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択で含み得る強化糖溶液を使用することができる。染料または顔料は、識別のために、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口にて使用できる医薬組成物には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた柔らかく密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択で安定剤と混合した有効成分を含み得る。ソフトカプセルでは、有効成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与用のすべての製剤は、選択した投与経路に適した投与量であるべきである。
頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
経鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して、加圧パックまたはネブライザからエアゾールスプレーの呈示の形で、便利にも送達される。加圧エアロゾルの場合、投与ユニットは、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって、決定することができる。ディスペンサーで使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と適切な粉末ベース、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含むように処方することができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、または任意選択で防腐剤を添加した複数回投与容器で提示することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液であり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤を含み得る。
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液は、適切な油性または水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。任意選択で、懸濁液はまた、高い濃度の溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含み得る。
あるいは、有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水ベースの溶液と構成するための粉末形態であり得る。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に処方され得る。
本発明のいくつかの実施形態の文脈での使用に適した医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは、障害（例えば、ＡＬＳ）の症状を予防、緩和または改善するか、または治療される対象の生存を延長するのに有効な有効成分（例えば、ニコチンアミド）の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量または用量は、最初に、インビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために、動物モデルにおいて用量を処方することができる。このような情報は、ヒトの有用な用量をより正確に判断するために使用できる。
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、細胞の培養または実験動物において、インビトロでの標準的な製薬の処置によって判断することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための一連の投与量を処方する際に使用することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．の１９７５年、‘‘Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’’，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照）。
投与量と間隔は、有効成分の血液、脳、またはＣＳＦレベルが生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘発または抑制するのに十分であるように個別に調整することができる。ＭＥＣは製剤ごとに異なるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから推定できる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特性と投与経路によって異なる。検出アッセイは、血漿濃度を判定するために使用することができる。
治療される状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、単回または複数回の投与であり得、治療の過程は、数日から数週間、または治癒がもたらされるか、または病状の減少が達成されるまで続く。
もちろん、投与される組成物の量は、治療される対象、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断などに依存する。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与の説明書が添付されている場合がある。パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知に適合され得る。この通知は、組成物の形態またはヒトまたは獣医の投与の機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品挿入物に関するものである可能性がある。適合性のある医薬担体に処方された本発明の調製物を含む組成物はまた、調製され、適切な容器に入れられ、上でさらに詳述されるように、示された状態の治療のために標識され得る。
本発明の代謝物は、食品（フードバー、ビスケット、スナック食品、および当技術分野で周知の他の標準的な食品形態など）、または飲料配合物で提供することができる。飲料には、香料、緩衝液などを含めることができる。本発明の代謝物を含む栄養補助食品もまた企図される。
本発明のこの態様の代謝物は、代謝物を生成する微生物を含むプロバイオティクス組成物を介して提供することができる。
本明細書で使用される「プロバイオティクス」という用語は、適切に投与されると、宿主または対象への健康上の利益、および／またはリスクの減少、および／または宿主生物における疾患（ＡＬＳなど）の症状、障害、状態、またはイベントの軽減を与えることができる、１つまたは複数の微生物を指す。
したがって、本発明の別の態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉｓｔａｎｏｓｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ）、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）の少なくとも１つを含む治療有効量の細菌組成物を対象に投与することを含む、ＡＬＳを治療する方法が提供される。
特定の実施形態によれば、細菌組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍおよびＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つを含む。
特定の実施形態によれば、細菌組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）を含む。
プロバイオティック微生物は、任意の適切な形態、例えば粉末乾燥形態であり得る。さらに、プロバイオティック微生物は、その生存率を高めるために処理を受けていてもよい。例えば、微生物は、多糖類、脂肪、デンプン、タンパク質、または糖マトリックスにコーティングまたはカプセル化され得る。当技術分野で知られている標準的なカプセル化技術を使用することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，５９１号に記載されている技術を使用することができる。
特定の実施形態によれば、プロバイオティック組成物は、食品、機能性食品、または栄養補助食品に処方される。
いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、乳製品であるか、または乳製品を含む。いくつかの実施形態では、乳製品は、ヨーグルトの製品であるか、またはヨーグルトの製品を含む。いくつかの実施形態では、乳製品は、ミルクの製品であるか、またはミルクの製品を含む。
いくつかの実施形態では、乳製品は、チーズの製品であるか、またはチーズの製品を含む。いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、果物に由来するジュースまたは他の製品であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、野菜に由来する製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、穀物、クラッカー、パン、および／またはオートミールを含むがこれらに限定されない穀物の製品であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、米製品であるか、または米製品を含む。いくつかの実施形態では、食品、機能性食品または栄養補助食品は、肉製品であるか、またはそれを含む。
投与の前に、対象は、マイクロバイオームに天然に存在する微生物の数を減少させる薬剤で事前の治療をされ得る（例えば、抗生物質の治療によって）。特定の実施形態によれば、治療は、天然に存在する腸内マイクロバイオームを、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、さらには９０％まで顕著に排除する。
いくつかの特定の実施形態において、投与される適切な用量または量のプロバイオティクスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から外挿され得る。特定の個人に投与される有効な用量または量は、個人の必要性に応じて、時間とともに変化させる（例えば、増加または減少する）ことができる。細菌が投与されるいくつかの実施形態において、適切な投薬量は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上の細菌細胞を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、約１０００以上（例えば、約１５００、２０００、２５００、３０００、３５０００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、またはそれより多い細菌）の細菌細胞の数を提供することによって、より大きな利益が達成され得るという認識を包含する。
本発明者らはさらに、特定の細菌集団のレベルが、ＡＬＳを有する対象のマイクロバイオームにおいて増加することを示した。
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、対象の腸内マイクロバイオームにおけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓ２４ ７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａからなる群から選択される細菌集団の量を選択的に減少させる治療有効量の薬剤を対象に投与し、それによってＡＬＳを治療することを含む、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法が提供される。
特定の実施形態によれば、細菌集団は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅからなる群から選択される。
特定の実施形態によれば、細菌集団は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、ダウンレギュレートされる細菌集団は、以下の細菌のうちの少なくとも１つである：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ＡＳＦ３６０、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｃｈａｅｄｌｅｒｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（ｅ．ｇ．Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、およびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ。
一実施形態では、上記の種／属のうちの少なくとも２つがダウンレギュレートされ、上記の種／属のうちの少なくとも３つがダウンレギュレートされ、上記の種／属のうちの少なくとも４つがダウンレギュレートされる。上記の種／属のうち少なくとも５つがダウンレギュレートされ、上記のすべての種または属がダウンレギュレートされる。
本発明は、少なくとも１つの菌株、菌株の１０％、菌株の２０％、菌株の３０％、菌株の４０％、菌株の５０％、菌株の６０％、菌株の７０％、菌株の８０％、菌株の９０％、または上記の種の菌株のすべてをダウンレギュレートする薬剤を企図する。
本明細書で使用される場合、「ダウンレギュレートする」という用語は、特定の種／属の細菌の量（絶対量または相対量のいずれか）および／または活性（絶対的な活性または相対的な活性のいずれか）を低下させる能力を指す。
一実施形態では、薬剤は、特定の種／属の細菌を特異的にダウンレギュレートする。
したがって、例えば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの他の少なくとも１つの細菌種／属と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減らすことができる。特定の実施形態によれば、薬剤は、マイクロバイオームの他の少なくとも１つの細菌種／属と比較して、特定の細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも１０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも１０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも２０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも２０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも３０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも３０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも４０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも４０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも５０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも５０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも６０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも６０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも７０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも７０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも８０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも８０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
別の実施形態では、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも９０％と比較して、特定の細菌種／属の量を少なくとも２分の１に減少させる。特定の実施形態によれば、薬剤は、対象のマイクロバイオームの全細菌種／属の少なくとも９０％と比較して、特異的な細菌種／属を少なくとも５倍、１０倍またはそれ以上ダウンレギュレートする。
特定の細菌の属、種、または菌株を減少させることができる例示的な薬剤は抗生物質である。
本明細書で使用される場合、「抗生物質」という用語は、天然の供給源から単離された、または天然の供給源から単離され、細菌および他の微生物の増殖を阻害または破壊する能力を有する、主に感染症の治療に利用される化学物質の群を指す。抗生物質の例には、アミカシン；アモキシシリン；アンピシリン；アジスロマイシン；アズルクンイン；アズトレオナム；アズトレオナム；カルベニシリン；セファクロル；セフェピム；セフェタメット；セフィネタゾール；セフィキシム；セフォニシド；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフォテタン；セフォキシチン；セフポドキシム；セフプロジル；セフスロジン；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフロキシム；セファレキシン；セファロチン；セスロマイシン；クロラムフェニコール；シノキサシン；シプロフロキサシン；クラリスロマイシン；クリンダマイシン；クロキサシリン；Ｃｏ－ａｍｏｘｉｃｌａｖｕａｎａｔｅ；ダルババンシン；ダプトマイシン；ドクロキサシリン；ドキシサイクリン；エノキサシン；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルコハク酸塩；エリスロマイシングルコヘプトネート；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；エリスロマイシンステアレート；エリスロマイシン；フィダキソマイシン；フレロキサシン；ゲンタマイシン；イミペネム；カナマイシン；ロメフロキサシン；ロラカルベフ；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；ミノサイクリン；ムピロシン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネチルマイシン；ニトロフラントイン；ノルフロキサシン；オフロキサシン；オキサシリン；ペニシリンＧ；ピペラシリン；レタパムリン；リファキサミン；リファンピン；ロキシスロマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；テイコプラニン；テトラサイクリン；チカルシリン；チゲサイクリン；トブラマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン；ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ；およびそれらの様々な塩、酸、塩基、およびその他の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。抗菌性抗生物質には、アミノグリコシド、カルバペネム、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、フルオロキノロン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド、モノバクテリア、ペニシリン、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンが含まれるが、これらに限定されない。
抗菌剤には、抗菌ペプチドも含まれる。例には、ａｂａｅｃｉｎ；アンドロピン；アピダエシン；ボンビニン；ブレビニン；ブフォリンＩＩ；ＣＡＰ１８；セクロピン；セラトトキシン；ディフェンシン；デルマセプチン；デルムシジン；ドロソマイシン；ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｓ；インドリシジン；ＬＬ３７；マガイニン；最大Ｈ５；メリチン；モリシン；プロフェニン；プロテグリン；および／またはタキプレシンが含まれるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、抗生物質は非吸収性抗生物質である。
抗生物質ではない他の薬剤もまた、本発明者らによって企図されている。
一実施形態では、特定の細菌属／種／株をダウンレギュレートすることができる薬剤は、必須のリソースについて細菌属／種／株と競合する細菌集団である。細菌組成物は、本明細書で以下にさらに記載される。
さらに別の実施形態では、特定の細菌の属／種／株をダウンレギュレートすることができる薬剤は、細菌の種／株の相対的な量を減少させるのに役立つ競合する細菌集団の（または同じ種／株からの）代謝物である。
特定の細菌の属、種、または菌株を特異的に減少させることができる追加の薬剤は、当技術分野で知られており、ポリヌクレオチドサイレンシング剤を含む。
好ましくは、本発明のこの態様のポリヌクレオチドサイレンシング剤は、細菌内の少なくとも１つの必須遺伝子（すなわち、生命と適合性がある）をコードする配列を標的とする。標的とされる配列は、ダウンレギュレートすることが望まれる特定の細菌種に特異的であるべきである。このような遺伝子には、リボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓおよび２３Ｓ）、リボソームタンパク質遺伝子、ｔＲＮＡシンテターゼ、およびｄｎａＢ、ｆａｂＩ、ｆｏｌＡ、ｇｙｒＢ、ｍｕｒＡ、ｐｙｔＨ、ｍｅｔＧ、およびｔｕｆＡ（Ｂ）などの必須であると示されているさらなる遺伝子が含まれる。
本発明の実施形態によれば、ポリヌクレオチドサイレンシング剤は、標的ＲＮＡに特異的であり、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーによって判定されるものとして、他の標的、または標的遺伝子に対して９９％以下の全体的な相同性、例えば標的遺伝子に対して９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％未満の全体的な相同性を示すスプライス変異体を、交差阻害またはサイレンシングしない。
必須の細菌遺伝子をダウンレギュレートすることができる１つの薬剤は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ技術、例えばＣＲＩＳＰＲシステムである。
本明細書で使用される場合、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）としても知られる「ＣＲＩＳＰＲシステム」という用語は、Ｃａｓ遺伝子（例えば、ＣＲＩＳＰＲに関連するエンドヌクレアーゼ９）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはアクティブな部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（「直接反復」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を含む）またはガイド配列（「スペーサー」とも呼ばれる）、例えば非限定的にｃｒＲＮＡ配列（すなわち、標的特異性を付与するが、Ｃａｓに結合するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする内因性細菌ＲＮＡ）またはｓｇＲＮＡ配列（すなわち、単一ガイドＲＮＡ）をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の発現または活性の指示に関与する転写物および他の要素を集合的に指す。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素は、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素（例えば、Ｃａｓ）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａなどの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。
一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサーとも呼ばれる）によって特徴付けられる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。したがって、いくつかの実施形態によれば、標的配列に対する全体的な相同性は、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であり得る。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
したがって、ＣＲＩＳＰＲシステムは２つの異なるコンポーネント、標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびヌクレアーゼ（ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質など）で構成され、それにおいては、ｇＲＮＡが標的配列を標的化し、ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９タンパク質など）が標的配列を切断する。ガイドＲＮＡは、内因性細菌ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせを含み得る、つまり、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化特異性とｔｒａｃｒＲＮＡの足場特性（Ｃａｓ９結合に必要）を組み合わせる。あるいは、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓに直接結合することができる単一のガイドＲＮＡであり得る。
通常、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成により、標的配列において、またはその近く（例えばそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対から以内にて）の一方または両方の鎖が切断される。また、理論に拘束されることを望まないが、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、の６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド、またはその概数より多いもの）を含み得るまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列はまた、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に操作可能にリンクされているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部にハイブリダイゼーションすることなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。
いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するために、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性を有する。標的配列と同様に、機能するのに十分であれば、完全な相補性は必要ない。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適に整列された場合、ｔｒａｃｒメイト配列の全長に沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。
細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの導入は、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が１つまたは複数の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素の発現を駆動する１つまたは複数のベクターを使用して行うことができる。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節要素に作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節要素から発現される２つ以上の要素を単一のベクターに組み合わせて、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素をもたらすことができる。単一のベクターに組み合わされたＣＲＩＳＰＲシステム要素は、任意の適切な方向に配置され得る。例えば、１つの要素は、第２の要素（の「上流」）に対して５’またはそれ（の「下流」）に関して３’に位置する。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同じまたは反対の鎖上に位置し、同じまたは反対の方向に配向され得る。単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ならびにガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（任意選択でガイド配列に作動可能に連結されている）、および１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれたｔｒａｃｒ配列（例えば、異なるイントロンに各々、少なくとも１つのイントロンに２つ以上、または１つのイントロンにすべて）の１つ以上をコードする転写物の発現を駆動できる。
本発明者らは、ＡＬＳを治療することに加えて、疾患を診断するために、対象のマイクロバイオーム中の特定の細菌種を試験することをさらに提案することが理解されるであろう。
したがって、本発明の別の態様によれば、対象のマイクロバイオームにおけるＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓの量および／または活性を分析することを含む、対象のＡＬＳを診断する方法が提供され、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較して、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓの存在量および／または活性の統計的に有意な増加がＡＬＳを示す。
本明細書で使用される場合、「診断」という用語は、疾患の存在の判定、疾患の分類、疾患の重症度（グレードまたはステージ）の判定、疾患の進行および治療への応答のモニタリング、疾患の結果の予測、および／または回復の見通しを示す。
診断に役立つ可能性のある分析可能な追加の細菌種／属には、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ Ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｄｉｓｔａｎｏｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓおよびＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ）、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）が含まれる。
診断に役立つ可能性のある分析可能なさらなる細菌種／属には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅが含まれ、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較して、上記の細菌の存在量の統計的に有意な増加は、ＡＬＳを示す。
診断に役立つ可能性のある分析可能なさらなる細菌種／属には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓが含まれ、健常な対象のマイクロバイオームにおけるその存在量と比較して、前述の細菌の存在量の統計的に有意な減少は、ＡＬＳを示す。
上記の細菌種の量は、通常、健常な対象のマイクロバイオームにおけるそれらの存在量と比較して、ＡＬＳの対象では減少する。
上記の細菌種の量は、通常、健常な対象のマイクロバイオームにおけるそれらの存在量と比較して、ＡＬＳの対象において増加する。
対象をＡＬＳであると診断するために、典型的には少なくとも１（例えばＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または上記で開示された種／属のさらに多くが分析される。
典型的には、所定のレベルを超える上記の細菌種／属のいずれかの増加は、健常な対象（例えば、ＡＬＳではない対象）のマイクロバイオームにおけるその微生物量と比較して、量の少なくとも１．５倍、量の２倍、量の３倍、量の４倍、量の５倍である。
典型的には、所定のレベルを超える上記の細菌種／属のいずれかの減少は、健常な対象（例えば、ＡＬＳではない対象）のマイクロバイオームにおけるその微生物量と比較して、量の少なくとも１．５倍、量の２倍、量の３倍、量の４倍、量の５倍少ない。
特定の細菌種の存在量および／または活性を比較する場合、同じ器官または組織のマイクロバイオームを比較するように注意を払う必要があることが理解されよう。
一実施形態では、上記で開示された細菌の存在量が分析される。
微生物のレベルまたは存在の測定は、微生物の構成要素または微生物の副産物の存在を分析することによって行うことができる。したがって、例えば、微生物のレベルまたは存在は、ＤＮＡ配列のレベルを測定することによって影響を受ける可能性がある。いくつかの実施形態において、微生物のレベルまたは存在は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を測定することによって影響を受ける可能性がある。他の実施形態では、微生物のレベルまたは存在は、ＲＮＡ転写物を測定することによって影響を受ける可能性がある。さらに他の実施形態では、微生物のレベルまたは存在は、タンパク質を測定することによって影響を受ける可能性がある。さらに他の実施形態では、微生物のレベルまたは存在は、代謝物を測定することによって影響を受ける可能性がある。
マイクロバイオームのサンプルの入手
マイクロバイオームを分析するために、対象からサンプルを採取する。
対象は通常、哺乳類の対象－－例えば、人間の対象である。
したがって、例えば、腸内マイクロバイオームを分析するために糞便サンプルを採取することができ、気管支マイクロバイオームを分析するために気管支サンプルを採取することができ、口腔マイクロバイオームを分析するために唾液サンプルを採取することなどができる。特定の実施形態によれば、対象のマイクロバイオームは、対象の便サンプルに由来する。
本発明者らは、摂食パターンの変化（例えば、概日リズムのずれによる）がマイクロバイオームの組成に影響を与えることを示した。したがって、サンプルは１日の決まった時間に採取することが好ましい。
マイクロバイオームから染色体（ゲノム）ＤＮＡを取得することは、例えば、上で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに開示されているような従来の技術を使用して行うことができる。場合によっては、特に、少量のＤＮＡが特定のステップで使用される場合、無関係な環状合成二本鎖ＤＮＡなどの担体ＤＮＡを提供することが有利であり、少量のサンプルＤＮＡしか利用できず、非特異的結合、例えばコンテナの壁などに対する損失の危険性がある場合はいつでも、サンプルＤＮＡと混合して使用するようにする。
一実施形態では、染色体ＤＮＡの長い断片が得られる。細胞を溶解し、穏やかな遠心分離ステップで無傷の核をペレット化することができる。次に、ゲノムＤＮＡが放出される（例えば、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅの消化により、数時間（例えば、１～５時間））。材料は、例えば、一定期間（すなわち、２～１６時間）の透析および／または希釈によって、残存する細胞廃棄物の濃度を低下させるように処理することができる。このような方法では、多くの破壊的なプロセス（エタノール沈殿、遠心分離、ボルテックスなど）を使用する必要がないため、ゲノム核酸はほとんど無傷のままで、１５０キロベースを超える長さの断片の大部分が生成される。いくつかの実施形態において、断片は、長さが約５から約７５０キロベースである。さらなる実施形態において、断片は、長さが約１５０から約６００、約２００から約５００、約２５０から約４００、および約３００から約３５０キロベースである。
次に、任意選択で、標的ゲノムＤＮＡは、酵素消化、剪断、または超音波処理を含む従来の技術によって所望のサイズに分画または断片化され、後者の２つは、本発明において特定の用途を見出す。
標的核酸の断片の大きさは、ソース標的核酸、および使用されるライブラリー構築方法に応じて変化し得るが、標準的な全ゲノム配列決定の場合、そのような断片は、長さが５０から６００ヌクレオチドの範囲であり得る。別の実施形態では、断片は、長さが３００から６００または２００から２０００ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、断片は、長さが１０～１００、５０～１００、５０～３００、１００～２００、２００～３００、５０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００、４００～５００、４００～６００、５００～６００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～１０００、９００～１０００、１５００～２０００、１７５０～２０００、および５０～２０００ヌクレオチドである。より長い断片も、企図されている。
さらなる実施形態で、特定のサイズまたは特定の範囲のサイズの断片が単離される。そのような方法は当技術分野で周知である。例えば、ゲル分画を使用して、例えば、５００塩基対＋５０塩基対などの塩基対の範囲内にある特定のサイズの断片の集団を生成することができる。
多くの場合、溶解および抽出中に生成されるせん断力によって目的の範囲の断片が生成されるため、抽出されたＤＮＡの酵素消化は必要ない。さらなる実施形態において、より短い断片（１～５ｋｂ）は、制限エンドヌクレアーゼを使用する酵素的断片化によって生成され得る。
微生物のレベルの定量化：
微生物の存在量を判定することは、マイクロバイオームのいずれかの特徴を考慮に入れることによって影響を受ける可能性があることが理解されよう。したがって、微生物の存在量は、様々な系統発生レベルでの存在量を考慮することによって影響を受ける可能性がある。すなわち、遺伝子の存在量のレベルで；遺伝子代謝経路の存在量；亜種株の同定；特定の細菌領域におけるＳＮＰおよび挿入と欠失；本明細書で以下にさらに記載されるように、細菌の増殖速度、マイクロバイオームの微生物の多様性である。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタイプの微生物またはその成分または生成物のレベルまたはレベルのセットを判定することは、１つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたはレベルのセットを判定することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡ配列は、異なる微生物のタイプを区別するために使用することができる任意のＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態において、１つ以上のＤＮＡ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。特定の実施形態において、１つ以上のＤＮＡ配列は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１，０００、５，０００以上の配列が増幅される。
１６Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、それぞれ原核生物および真核生物のリボソームの小サブユニット構成要素をコードする。ｒＲＮＡ遺伝子は、微生物の種類を区別するのに特に有用である。これらの遺伝子の配列は微生物種間で異なるが、遺伝子にはプライマー結合のための高度に保存された領域があるためである。保存されたプライマー結合領域間のこの特異性により、多くの異なるタイプの微生物のｒＲＮＡ遺伝子を単一のプライマーセットで増幅し、増幅された配列で区別することができるようになる。
いくつかの実施形態では、微生物叢のサンプル（例えば、糞便サンプル）は、１つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたはレベルのセットについて直接アッセイされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、微生物叢のサンプルから単離され、単離されたＤＮＡは、１つ以上のＤＮＡ配列のレベルまたはレベルのセットについてアッセイされる。微生物ＤＮＡを単離する方法は当技術分野でよく知られている。例には、フェノール－クロロホルム抽出、およびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を含む多種多様な市販のキットが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＤＮＡ配列のレベルまたはレベルのセットは、ＰＣＲ（例えば、標準的ＰＣＲ、半定量的、または定量的ＰＣＲ）を使用してＤＮＡ配列を増幅することによって判定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＤＮＡ配列のレベルまたはレベルのセットは、定量的ＰＣＲを使用してＤＮＡ配列を増幅することによって判定される。これらおよび他の基本的なＤＮＡ増幅手順は、当技術分野の専門家に周知であり、Ａｕｓｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ Ｅ，Ｍｏｏｒｅ Ｄ，Ｓｅｉｄｍａｎ Ｊ Ｇ，Ｓｍｉｔｈ Ｊ Ａ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において記載されている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、個々の微生物型を他の異なる微生物型から区別する１つ以上の配列に特異的なプライマーを使用して増幅される。いくつかの実施形態において、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列またはその断片は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーを使用して増幅される。いくつかの実施形態において、１８Ｓ ＤＮＡ配列は、１８Ｓ ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用して増幅される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたはレベルのセットは、フィロチップ技術を使用して判定される。フィロチップの使用は当技術分野で周知であり、Ｈａｚｅｎ ｅｔ ａｌ（‘‘Ｄｅｅｐ－ｓｅａ ｏｉｌ ｐｌｕｍｅ ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ ｏｉｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．’’Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０，２０４～２０８，２０１０）において記載されており、その全体は参照により組み込まれる。簡単に説明すると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、微生物叢のサンプルから抽出されたＤＮＡから増幅および標識される。次に、増幅されたＤＮＡは、微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを含むアレイにハイブリダイズする。次に、各プローブへの結合レベルが定量化され、プローブされた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に対応する微生物タイプのサンプルレベルが提供される。いくつかの実施形態では、フィロチップ分析は、商業的ベンダーによって実行される。例には、Ｓｅｃｏｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンフランシスコ）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記の細菌種／株のいずれかの存在量は、ＤＮＡ配列決定によって判定される。
配列決定の方法は、一般に当業者に知られている。好ましい配列決定法は、次世代配列決定法または並列ハイスループット配列決定法である。例えば、細菌ゲノム配列は、超並列署名シーケンス（ＭＰＳＳ）を使用して取得できる。想定される配列方法の例は、パイロシーケンス、特に４５４パイロシーケンスであり、例えばＲｏｃｈｅ ４５４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒに基づいている。この方法は、油溶液の中の水滴内のＤＮＡを増幅し、各液滴は単一のプライマーコーティングされたビーズに付着した単一のＤＮＡテンプレートを含み、次いでクローンコロニーを形成する。パイロシーケンシングは、ルシフェラーゼを使用して、発生期のＤＮＡに追加された個々のヌクレオチドを検出するための光を生成し、結合されたデータを使用して、配列の読み取り値を生成する。さらに別の想定される例は、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａのシーケンスであり、例えばリバーシブルダイターミネーターに基づくＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒテクノロジーを使用する。ＤＮＡ分子は通常、スライド上のプライマーに付着して増幅され、局所的なクローンコロニーが形成される。続いて、一度に１つのタイプのヌクレオチドを加えることができ、組み込まれていないヌクレオチドは洗い流される。続いて、蛍光標識されたヌクレオチドの画像を撮影し、色素をＤＮＡから化学的に除去して、次のサイクルを可能にする。さらに別の例は、ライゲーションによるシーケンシングを採用するＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤテクノロジーの使用である。この方法は、固定の長さのすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールの使用に基づいており、配列決定された位置に従って標識されている。このようなオリゴヌクレオチドはアニーリングされ、ライゲーションされる。続いて、配列を一致させるためのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションは、通常、その位置のヌクレオチドを知らせるシグナルをもたらす。ＤＮＡは通常、エマルジョンＰＣＲによって増幅されるため、各々が同じＤＮＡ分子のコピーのみを含む得られたビーズをスライドガラスに配置すると、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンスに匹敵する量と長さのシーケンスが得られる。さらなる方法は、Ｈｅｌｉｃｏｓのヘリスコープ技術に基づいており、アレイにつながれたｐｏｌｙＴオリゴマーによって断片が捕捉される。各シーケンスサイクルで、ポリメラーゼと単一の蛍光標識ヌクレオチドが追加され、アレイが画像化される。その後、蛍光タグが除去され、このサイクルが繰り返される。本発明の方法に含まれる配列決定技術のさらなる例は、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアの使用による配列決定、顕微鏡ベースの配列決定技術、マイクロ流体的なサンガー配列決定、またはマイクロチップベースの配列決定方法である。本発明はまた、これらの技術のさらなる開発、例えば、配列決定の精度、または生物のゲノム配列の判定に必要な時間などのさらなる改善を想定している。
一実施形態によれば、配列決定方法は、ディープシーケンシングを含む。
本明細書で使用される場合、「ディープシーケンシング」という用語は、標的配列が単一の試験で複数回読み取られる配列決定方法を指す。１回のディープシーケンスの実行は、同じ標的配列で実行される多数のシーケンス反応で構成され、それぞれが独立したシーケンス読み出しを生成する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のタイプの微生物のレベルまたはレベルのセットを判定することは、１つ以上の微生物ＲＮＡ分子（例えば、転写物）のレベルまたはレベルのセットを判定することを含む。ＲＮＡ転写物のレベルを定量化する方法は当技術分野で周知であり、ノーザン分析、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、およびマイクロアレイ分析が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、１つ以上のタイプの微生物のレベルまたはレベルのセットを判定することは、１つ以上の微生物ポリペプチドのレベルまたはレベルのセットを判定することを含む。ポリペプチドレベルを定量化する方法は当技術分野で周知であり、ウエスタン分析および質量分析が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で上述したように、微生物の存在量を分析することに加えて（またはその代わりに）、本発明はまた、微生物の産物のレベルを分析することを企図する。
微生物の産物の例には、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、炭水化物および代謝物が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「代謝物」は、代謝の中間体または生成物である。代謝物という用語は一般に小分子に限定されており、ＤＮＡやタンパク質などの高分子化合物は含まれていない。代謝物は、代謝経路の酵素、そのような経路の中間体、または代謝経路によって得られる生成物の基質として機能し得る。
好ましい実施形態では、代謝物には、糖、有機酸、アミノ酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、オリゴペプチド（長さが約１００アミノ酸未満）、ならびにそれらのイオン性断片が含まれるが、これらに限定されない。細胞内に存在する細胞の産物を測定するために、細胞を溶解することもできる。特に、代謝物は、分子量が約３０００ダルトン未満であり、より具体的には、約５０から約３０００ダルトンである。
本発明のこの態様の代謝物は、一次代謝物（すなわち、成長のため微生物に必須）または二次代謝物（成長、発達または生殖において役割を果たさず、成長の終わりまたは定常期付近で形成されるもの）であり得る。
本発明の代謝物が関与する代謝経路の代表的な例には、クエン酸回路、呼吸鎖、光合成、光呼吸、糖分解、糖新生、ヘキソース一リン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸産生およびβ酸化、尿素回路、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路、例えばプロテアソーム分解、アミノ酸分解経路、脂質、ポリケチド（例えば、フラボノイドおよびイソフラボノイドを含む）、イソプレノイド（例えば、テルペン、ステロール、ステロイド、カロテノイド、キサントフィルを含む）、炭水化物、フェニルプロパノイドおよび誘導体、アルカロイド、ベンゼノイド、インドール、インドール－硫黄化合物、ポルフィリン、アントシアン、ホルモン、ビタミン、補因子、例えば補欠分子族または電子担体、リグニン、グルコシノレート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびｔＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡなどの関連分子の生合成または分解が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、代謝物のレベルは、質量分析によって判定される。いくつかの実施形態では、代謝物のレベルは、本明細書で以下にさらに説明されるように、核磁気共鳴分光法によって判定される。いくつかの実施形態において、代謝物のレベルは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって判定される。いくつかの実施形態において、代謝物のレベルは、比色分析によって判定される。いくつかの実施形態において、代謝物のレベルは、分光光度法によって判定される。
特定の実施形態によれば、以下の代謝物のうちの少なくとも１つの存在量が分析される：４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルコン酸塩、ニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメート、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ、シュウ酸塩、ステアロイルスフィンゴミエリン、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣ（１６：０／２２：６）、３－ウレイドプロピオネート、１－（１－エニル－パルミトイル）－２－アラキドノイル－ＧＰＣ（Ｐ－１６：０／２０：４）、パルミトイルスフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１６：０）、スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：１、ｄ１８：２／１８：０）、ピルビン酸、タウロコレート、Ｎ－アセチルチロシン、タウロ－ベータ－ムリコレート、タウロウルソデオキシコレート、フェノール硫酸塩、エクオール硫酸塩、シンナメート、フェニルプロピオニルグリシン、２－アミノフェノールサルフェート、４－アリルフェノールサルフェート、エクオールグルクロニド、パルミトレオイル－リノレオイル－グリセロール、オレオイル－リノレノイル－グリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ＧＰＥ、ハイドロキノンサルフェート、グアイアコールサルフェート、ジアシルグリセロール、パルミトイル－リノレオイル－グリセロール、ゲンチセート、および１３－ＨＯＤＥ＋９－ＨＯＤＥ。
特定の実施形態によれば、ニコチンアミドの量が分析される。
別の実施形態によれば、代謝物は、４－ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリエタノールアミン、セロトニン、２－ケト－３－デオキシ－グルタメートニコチンアミド、ニコチンアミド、Ｎ－トリメチル５－アミノ吉草酸、フェニルアラニルグリシン、テオブロミン、シスグリ、グルタメートおよび１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ＧＰＣからなる群から選択される。
対象をＡＬＳであると診断するために、典型的には少なくとも１（例えばニコチンアミド）、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または上記で開示された種／属のさらに多くが、分析される。
典型的には、所定のレベルを超える上記の代謝物のいずれかの増加は、健常な対象（例えば、ＡＬＳではない対象）のマイクロバイオームにおけるその代謝物の量と比較して、量の少なくとも１．５倍、量の２倍、量の３倍、量の４倍、量の５倍である。
典型的には、所定のレベル未満の減少は、健常な対象（例えば、、ＡＬＳではない対象）のマイクロバイオームのその代謝物の量と比較して、少なくとも１．５倍低く、２倍低く、３倍低く、４倍低く、５倍低い量である。
前述のように、本発明者らは、ＡＬＳの診断のために特定の微生物種／株の存在量を判定するだけでなく（またはその代わりに）、マイクロバイオームの微生物の微生物成長ダイナミクスを分析することも企図している。
「成長ダイナミクス」という用語は、細菌の成長期（例えば、遅滞期、定常期、指数増殖期、死滅期）および成長速度自体を指す。
成長ダイナミクスの測定は、ＷＯ ２０１６／０７９７３１に記載されている方法を使用して行うことができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
細菌成長ダイナミクスを分析する他の方法は当技術分野で知られており、例えば、ある期間にわたる細菌接種物の光学密度の分析を含む。
陽性の診断が下されたら、診断を裏付けるために追加の検査を実施することができる。例えば、イメージング、筋生検などがある。対象は診断後に治療され得る－例えば、本明細書に記載の細菌集団／代謝物を使用するか、またはＡＬＳの他のいずれかの既知のゴールドスタンダードの治療によってなされ得る。
本明細書で使用される「約」という用語は、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの結合は、「含むが限定されない」ことを意味する。
「からなる」という用語は、「含んで限定される」ことを意味する。
「から本質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部品を含むことができるが、追加の成分、ステップおよび／または部品がクレームされる組成物、方法、または構造の基本的および新規の特性を実質的に変更しない場合のみを含み得ることを意味する。
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの副次的な範囲およびその範囲内の個々の番号、例えば１、２、３、４、５、６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、それは、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の表示番号と第２の表示番号との「範囲／間の範囲」、また第１の表示番号から第２の表示番号「の範囲／までの範囲」という句は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の表示番号およびそれらの間のすべての分数と整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の実務家により公知であるか、公知の様式、方法、手段、技術および処置から容易に開発される様式、手段、技術、および手順を含むがこれらに限定されない、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術、および手順を指す。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の他の説明された実施形態で適切に提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
本明細書の上にて詳述され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。
ここで、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上記の説明とともに、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で説明するものである。
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験室手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で徹底的に説明されている。例えば、‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’’Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，‘‘Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ’’，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）‘‘Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ’’，Ｖｏｌｓ．１～４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；第４，６８３，２０２号明細書；第４，８０１，５３１号明細書；第５，１９２，６５９号明細書および第５，２７２，０５７号明細書；‘‘Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ’’，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；‘‘Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’’ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），‘‘Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），‘‘Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）にて記載されている方法論を参照されたい；米国特許第３，７９１，９３２号明細書；第３，８３９，１５３号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，８５０，５７８号明細書；第３，８５３，９８７号明細書；第３，８６７，５１７号明細書；第３，８７９，２６２号明細書；第３，９０１，６５４号明細書；第３，９３５，０７４号明細書；第３，９８４，５３３号明細書；第３，９９６，３４５号明細書；第４，０３４，０７４号明細書；第４，０９８，８７６号明細書；第４，８７９，２１９号明細書；第５，０１１，７７１号明細書、および第５，２８１，５２１号明細書；‘‘Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’’Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；‘‘Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ’’Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；‘‘Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ’’Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；‘‘Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ’’Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ’’ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；‘‘Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’’Ｖｏｌ．１～３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；‘‘ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ’’ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）などの特許および科学文献に利用可能なイムノアッセイが広範囲に記載されており、参照されたい；これらはすべて、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれている。他の一般的な参考文献は、この文書全体で提示されている。その中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。ここに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＧ９３Ａ ｍＳＯＤ１－Ｔｇマウスを使用した。すべての実験で、年齢と性を一致させたマウスを使用し、ＷＴ同腹仔を対照として使用した。実験開始時のマウスは４０日齢であった。すべてのマウスは、厳密な２４時間の逆明暗サイクルで維持され、明かりが午後１０時から午前１０時まで点されていた。トリプトファン欠乏食（Ａ１００３３Ｙｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、米国、ニュージャージー）が、４０日齢から実験のエンドポイントまで適用された。抗生物質治療のために、マウスは、前述のように４０日齢から、飲料水においてバンコマイシン（０．５ｇ／ｌ）、アンピシリン（１ｇ／ｌ）、カナマイシン（１ｇ／ｌ）、およびメトロニダゾール（１ｇ／ｌ）の組み合わせを与えられた（Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓのコロニー形成のため、４０日齢のマウスを抗生物質で２週間処理し、２日間の洗浄期間の後、実験の終点まで毎週２００μｌのＰＢＳ懸濁細菌（Ｏ．Ｄ．＝０．７）を強制飼養した。
代謝物の投与
ＮＡＭおよびフェノール硫酸塩のｉｎ ｖｉｖｏ投与には、Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプモデル１００４（チャールズリバー）を使用した（０．１１μＬ／時の速度で４週間化合物を注入）。ポンプには、滅菌水で希釈した１００μＬの５０ｍｇ／ｍｌニコチンアミド（Ｃｙｍｉｔ Ｑｕｉｍｉｃａ、バルセロナ、スペイン）または３３．３３ｍｇ／ｍｌのフェノール硫酸ナトリウム塩（ＴＬＣ、オンタリオ、カナダ）を充填した（４９．２８ｍｇ／ｋｇ／週のＮＡＭおよび３０．８ｍｇ／ｋｇ／週の硫酸フェノールに相当）。ビヒクル制御ポンプには、同量の超純水が含まれていた。６週齢のＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔し、首の皮膚を剃り、７０％エタノールで滅菌し、皮膚に１ｃｍの切開を行い、浸透圧ミニポンプを最小限の鈍的切開に続いて挿入し、右後部側面の上方に配置した。次に、無菌の外科用クリップで切り口を閉じ、ストレス、出血、痛み、または異常な行動の何らかの兆候がないか、動物を注意深く監視した。ミニポンプは、マウスが生後５か月になるまで、４週間ごとに３回交換した。
マウスの運動機能の評価
ロータロッド：運動協調性およびバランスを評価するために、各マウスをロータロッドデバイス（Ｐａｎｌａｂ Ｌｅ８５００ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、スペイン）で、加速速度モード（１０分間で４ｒｐｍから４０ｒｐｍに増加）にて、最大テスト時間５分でテストした。マウスは、正式な試験の前に、水平回転ロッドに慣らし、３回の試行で事前に訓練した。各マウスは、６０、８０、１００、１２０、および１４０日齢で３回記録された。装置は、マウスがスピンドルから落ちたときの経過時間を自動的に記録した。
吊り下げワイヤーグリップテスト：マウスは前足で２ｍｍの厚さの水平金属ワイヤー（作業面から８０ｃｍ上に吊るされている）をつかむことができ、ワイヤーをつかむために後ろ足を上手く持ち上げるまでの待ち時間が記録される。マウスを３０秒間観察し、次のようにスコアを付ける。０＝１０秒以内に脱落する。１＝２つの前足でバーにぶら下がっている。２＝バーに登ろうとする。３＝２つの前足と片方または両方の後足でバーにぶら下がっている。４＝４本の足すべてと尾をバーに巻き付けてぶら下がる。５＝バーの端まで積極的に逃げる。
神経学的スコアリング：マウスは、ＡＬＳ ＴＤＩによって開発されたシステムによって神経学的にスコアリングされた（Ｈａｔｚｉｐｅｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）：スコア０：マウスが尾でぶら下がっていたときに、後脚が外側正中線から完全に伸びており、またマウスはこの状態を２～３回ぶら下がりながら２秒間保持できる。スコア１：側方正中線に向かう脚の伸長が崩れる、または部分的に崩れる（脱力する）、あるいは尾でのぶら下がり中に後肢が震える。スコア２：１２インチの歩行中に、つま先が少なくとも２回下に曲がるか、足のいずれかの部分がケージの底／テーブルに沿って引きずられている。スコア３：硬直した麻痺または最小限の関節の動き、足は前方への動きを生成するために使用されていない。スコア４：マウスをどちらかの側に置いてから３０秒以内に直立することができない。
ホームケージの移動：ＩｎｆｒａＭｏｔ（ＴＳＥ－Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した体温画像の自動検知により、ホームケージ内で４６時間にわたって動物の移動を定量化した。個々の動物の動きを３０分ごとに合計した。
生存
１３０日齢から、マウスを毎日モニターした。エンドポイントは、神経学的スコアが４に達すること、および／または体重が１５％以上減少することと定めた。カプランマイヤー法を使用して生存確率を計算し、ログランク検定を使用して統計分析を実行した。
脳脊髄液（ＣＳＦ）の抽出
マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。首の皮膚を剃り、マウスを定位固定装置にうつ伏せに置いた。頭部をヘッドアダプターで固定した。手術部位を７０％エタノールで拭き取り、皮膚の矢状切開を後頭より下に施した。解剖用顕微鏡下で、皮下組織と筋肉（頸板状筋と大後頭直筋）を鉗子による鈍的切開によって分離した。一対のマイクロリトラクターが、筋肉を離して保持するために使用されている。硬膜を無菌の綿棒で吸い取って乾かした。ＣＳＦは、毛細管を使用して収集され、硬膜を通って大槽、棘筋動脈の外側に浸透し、直ちに液体窒素で凍結され、－８０℃で保存された。
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ＭＲＩスキャン中、マウスは酸素（１リットル／分）と混合されたイソフルラン（誘導用に５％、維持用に１～２％）で麻酔され、鼻マスクを通して送達された。麻酔をかけたら、磁石内の再現性のある位置付けを確実にするために、動物をヘッドホルダーに入れた。呼吸数をモニターし、実験期間中、毎分約６０～８０回の呼吸を維持した。ＭＲＩ実験は、３方向のそれぞれで最大４０ガウス／ｃｍのパルス勾配を生成できる勾配式コイルシステムを備えた９．４ Ｔｅｓｌａ ＢｉｏＳｐｅｃ Ｍａｇｎｅｔ ９４／２０ ＵＳＲシステム（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）で実行された。すべてのＭＲ画像は、受信直交マウスヘッド表面コイルと送信線形コイル（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して取得された。Ｔ２マップは、マルチスライススピンエコー（ＭＳＭＥ）画像化シーケンスを使用して、次のパラメーターで取得された：３０００ｍｓの繰り返し遅延（ＴＲ）、１６回のエコー（ＴＥ）増分（１０から１６０ｍｓまで直線的に）、２５６×１２８の行列の次元（２５６×２５６に補間）、および２つの平均、１２分４８秒の画像取得時間に対応。Ｔ２データセットは、スライスごとに１６枚の画像でからなっていた。２．０×２．０ｃｍ２の視野（ＦＯＶ）で、スライスの厚さが１．００ｍｍである１３個の連続スライスを取得した。
画像分析：定量的なＴ２マップは、マルチエコーＴ２強調画像から作成された。マルチエコー信号を単指数関数的減衰に適合させて、各画像ピクセルのＴ２値を抽出した。すべての画像分析は、Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１３Ｂで記述された自家製のスクリプトを使用して実行された。ＭＲＩデータセット分析の前に、対象間および対象内の同時登録が適用された。マウスの脳地図への最適な適合性（頭の動きの画像アーティファクトの修正）のために、すべての画像は、ＳＰＭソフトウェア（バージョン１２、ＵＣＬ、ロンドン、英国）を使用して、アトラス登録、つまり再スライス、再調整、および平滑化を受けた。結果は平均±ＳＤとして報告された。ｔ検定を使用して、２群の平均を比較した。０．０１未満のｐ値は統計的に有意であると見なされた。
組織学
脊髄（Ｃ３－Ｔ６）の切片をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して、ルクソール・ファスト・ブルーとクレシル・エクト・バイオレットで染色した。続いて、盲検化された研究者によって切片が検査され、前角のクレシル・バイオレット陽性運動ニューロンが数えられてニューロンの生存が評価された。結腸組織を乾燥メタノール性カルノイで固定し、核染色剤であるシトックスグリーンで染色し、Ｍｕｃ２ムチンを抗ＭＵＣ２Ｃ３抗血清およびヤギ抗ウサギ－Ａｌｅｘａ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）６６で染色した。
ＦＩＴＣ－デキストランによる腸上皮バリア透過性の測定
アッセイ当日、４ｋＤａフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストランをＰＢＳに溶解して８０ｍｇｍｌ－１の濃度にした。１５０μｌのデキストランで強制経口投与する前に、マウスを４時間絶食させた。強制経口投与の３時間後にマウスに麻酔をかけ、血液を採取し、１，０００ｘｇで１２分間４℃で遠心分離した。血清を収集し、４８５ｎｍの励起波長と５３５ｎｍの発光波長で蛍光を定量した。
フローサイトメトリー
４０日齢以降Ａｂｘまたはコントロールとして水で処理したＷＴおよびＳＯＤ１－Ｔｇマウスを、１４０日目（小腸および結腸の場合）、または６０日目および１４０日目（脊髄の場合）のいずれかに、小腸、結腸、および脊髄の細胞性分析に使用した。小腸および結腸のサンプルを糞便から徹底的に洗い流した後、３７℃で３０分間２ｍＭのＥＤＴＡを解離させた。激しく振とうした後、上皮画分を廃棄した。次に、固有層分析のためにＤＮＡａｓｅＩとコラゲナーゼを使用してサンプルが消化された。脊髄のサンプルを個々のマウスから採取し、ホモジナイズし、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ１を含むＨＢＳＳ溶液とインキュベートして、７０μｍメッシュでろ過した。密度遠心分離の前に、均質化した切片を４０％パーコールに再懸濁した（１０００×ｇ。２０℃で１５分、低加速、ブレーキなし）。単離した細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、細胞の表面を直接染色するために１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁した。単細胞懸濁液を、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＮＫ１．１に対する抗体で氷上で４５分間染色した。染色した細胞をＢＤ－ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
粘液プロテオミクス分析
プロテオーム分析のために、単離された粘液サンプルを還元バッファー（６Ｍ塩酸グアニジニウム、０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＤＴＴ（Ｍｅｒｃｋ））中で３７℃で一晩インキュベートし、可溶性画分を、尿素の代わりに６Ｍ ＧｕＨＣｌを使用した先行のプロトコル６７に従ったフィルター支援サンプル前処理用のスピンフィルター（１０ｋＤａ、ＰＡＬＬ、ニューヨーク州ポートワシントン）の上に加えた。フィルター上のタンパク質をアルキル化し、続いてＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ、バージニア州リッチモンド）で４時間消化した後、一晩トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州フィッツバーグ）で消化した。Ｍｕｃ２絶対定量用の重ペプチド（ＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ ＴＱＬ、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）（１０ペプチド、各１００ｆｍｏｌ６８を、トリプシン消化前に添加した。遠心分離後にフィルターから放出されたペプチドは、ＳｔａｇｅＴｉｐ Ｃ１８カラムで洗浄した６９。ＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され、ナノエレクトロスプレーイオン源を介してＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続された。ペプチドは、インハウスに充填された逆相カラム（１５０×０．０７５ｍｍの内径、Ｃ１８－ＡＱ３μｍ）により、３００ｎｌ／ｍｉｎの流速を使用して、バッファーＢ（Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：０．１％ギ酸／８０％アセトニトリル）の１０～４５％の３０分の勾配で分離した。完全質量スペクトルは、３５０～１，６００ｍ／ｚから６０，０００（ｍ／ｚ２００）の分解能で取得された。最大１５個の最も強いピーク（電荷状態≧２）が断片化され、タンデム質量スペクトルが１５，０００の分解能と２０秒の動的排除で取得された。絶対定量には、別個の標的質量分析法を使用した。この方法では、前駆体と、重ペプチドおよび対応する軽ペプチドの断片のみを３０，０００の分解能でスキャンした。タンパク質は、すべてのマウスムチン配列を含む社内データベースが追加されたマウス（２０１８年７月１１日ダウンロード）ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベースに対して検索することにより、ＭａｘＱｕａｎｔプログラム（バージョン１．５．７．４７０）で識別された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｍｅｄｋｅｍ（ｄｏｔ）ｇｕ）（ｄｏｔ）ｓｅ／ｍｕｃｉｎｂｉｏｌｏｇｙ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／）。検索は、完全なトリプシン特異性、最大２回の切断ミス、再キャリブレーションに使用される最初の検索での２０ｐｐｍの前駆体の許容値、続いて主要な検索での７ｐｐｍ、断片のイオンでの０．５Ｄａで実行された。システインのカルバミドメチル化は固定修飾に設定され、メチオニン酸化とタンパク質のＮ末端アセチル化は可変修飾として設定された。必要な偽発見率（ＦＤＲ）は、ペプチドレベルとタンパク質レベルの両方で１％に設定され、必要な最小ペプチドの長さは６アミノ酸に設定された。タンパク質は、ＭａｘＱｕａｎｔラベルフリー定量（ＬＦＱ）オプションに基づいて、定量に最低２つのペプチドを使用して定量した。Ｍｕｃ２の絶対的な定量は、Ｓｋｙｌｉｎｅ（バージョン４．２．０７１）を使用して実行された。
細菌培養：Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２８６９）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ（ＡＴＣＣ ２７７５６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（ＡＴＣＣ ３３３２３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（ＡＴＣＣ ２５８４５）、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ－１５９２１）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ（ＤＳＭ－１９４４８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ（ＤＳＭ－１００１９４）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡＴＣＣ ８５０３）、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｔａｙｉ（ＤＳＭ－２４４０４）Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ（ＳＤＭ－１５１７６）を、嫌気性条件下で、３７℃で振とうせずに、刻んだ肉培地（ＢＤ ２９７３０７）で培養した（ＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、７５％Ｎ２、２０％ＣＯ２、５％Ｈ２）。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ（ＤＳＭ－１５６４４）は、０．５％アルギニンを添加した刻んだ肉培地で培養した。すべての株は、全遺伝子１６Ｓサンガーシーケンシングによって純度が検証された。ＷＴおよびΔｎａｄＡＥ．ｃｏｌｉは、もともと「Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ７２」から入手し、ＬＢ培地（ＷＴ）、または３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ΔｎａｄＡ）を添加したＬＢで増殖させた。細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏのニコチンアミドの分泌を測定するために、菌株を刻んだ肉培地で定常期まで増殖させ、遠心分離し、微量元素とグルコース（４ｇ／ｌ）を含むＭ９最小培地で２回洗浄し、嫌気性条件下で３時間Ｍ９に再懸濁した。遠心分離後、標的化されたニコチンアミド測定のために５０μｌの上清を収集し、ＢＣＡ法を使用してペレットからタンパク質を抽出した：簡単に述べると、細菌ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファーでホモジナイズし、４℃で４５分間インキュベートし、２０分間、１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃で遠心分離した。次に、培地のニコチンアミド測定値を、各サンプルの総タンパク質レベルに対して正規化した。
核酸抽出
ＤＮＡの精製：ＤＮＡは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の推奨に従って使用して、マウスの糞便サンプルから単離した。
自動化されたプラットフォーム用に最適化されたＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、患者の糞便スワブからＤＮＡを単離した。
ＲＮＡの精製：脊髄、結腸、筋肉（外側広筋）のサンプルをマウスから採取し、液体窒素で急速冷凍した。Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で組織をホモジナイズした。標準的なクロロホルム抽出を使用してＲＮＡを精製した。２マイクログラムのトータルＲＮＡを使用してｃＤＮＡを生成した（ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
ＰＣＲは、Ｖｉｉａ７の機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、Ｋａｐａ Ｓｙｂｒ ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。ＰＣＲ条件は、９５℃で２０秒間、続いて９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間を４０サイクル行った。データは、参照のハウスキーピング遺伝子として機能する１６Ｓを使用したΔΔＣｔ法を使用して分析された。１６Ｓサイクルは、実験条件に影響されないよう保証された。
核酸処理とライブラリーの調製
細菌のＤＮＡの定量化用の１６Ｓ ｑＰＣＲプロトコル：Ｆａｓｔ Ｓｙｂｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を２回使用してプライマーセット（表１に示す）で増幅する前に、ＤＮＡテンプレートを１ｎｇ／ｕｌに希釈した。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの増幅条件は次のとおりである。９５℃で３分間の変性、続いて９５℃で３秒間の変性を４０サイクル；６６℃で３０秒間アニーリングした後、曲線を満たす。全細菌（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の増幅条件は次のとおりである。９５℃で３分間の変性、続いて９５℃で３秒間の変性を４０サイクル；６０℃で３０秒間アニーリングした後、曲線を満たす。サイクルの差が２を超える重複は、分析から除外された。４０サイクル後に増幅されなかったいずれのサンプルのＣＴ値も、４０（検出のしきい値）として定義された。
１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシング
１６Ｓアンプリコンパイロシーケンスでは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプライマー５１５Ｆ／８０６Ｒを使用してＶ４領域にまたがるＰＣＲ増幅を実行し、続いて２ｘ２５０ｂｐのペアエンドシーケンス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）を使用してシーケンスした。カスタムプライマーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑキットに追加した結果、ペアエンド結合後に２５３ｂｐの断片が１１０，９９８±６６，９４６リード（平均±ＳＤ）の深さまでシーケンスされた。
リード１：ＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ（配列番号８）
リード２：ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（配列番号９）
インデックス付加シーケンスプライマー：ＡＴＴＡＧＡＷＡＣＣＣＢＤＧＴＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＡ（配列番号：１０）
全ゲノムショットガンシーケンシング
１００ｎｇの精製されたＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ Ｅ２２０Ｘソニケーターで剪断した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換ライブラリーは、説明されているように調製され（Ｓｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームで、８０ｂｐの読み取り長からヒトのサンプルの場合は１０Ｍの読み取り、ＡＭ処理マウスサンプルの場合は１Ｍの読み取り、ナイーブＷＴマウスとＳＯＤ１－Ｔｇマウスの比較の場合は５Ｍの読み取りの深さまで、配列決定された。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ
リボソームＲＮＡは、公開されている方法の修正版（Ａｄｉｃｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）に従って、ＲｎａｓｅＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２９７）によって選択的に枯渇させた。具体的には、マウスｒＲＮＡ１８Ｓおよび２８Ｓに相補的な５０ｂｐのＤＮＡオリゴ（２５ｎＭ、ＩＤＴ、表３に示す）のプールを、７５μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁した。全ＲＮＡ（１０μｌのＨ２Ｏ中１００～１０００ｎｇ）を等量のｒＲＮＡオリゴプールと混合し、２μｌおよび３μｌの５ｘ ｒＲＮＡハイブリダイゼーションバッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、ＨＣｌでｐＨ７．４まで滴定）に希釈し、追加された。サンプルを９５℃で２分間インキュベートした後、温度をゆっくりと（－０．１℃／ｓ）３７℃まで下げた。ＲＮＡｓｅＨ酵素混合物（２μｌの１０Ｕ ＲＮＡｓｅＨ、２μｌの１０×ＲＮＡｓｅＨバッファー、１μｌのＨ２Ｏ、合計５μｌのミックス）をハイブリダイゼーション終了の５分前に調製し、３７℃に予熱した。それらが３７℃に達したときに酵素混合物をサンプルに添加し、それらをこの温度で３０分間インキュベートした。サンプルは、２．２ｘ ＳＰＲＩビーズ（Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、製造元の指示に従って精製した。残留オリゴは、３７℃で３０分間インキュベートした５μｌのＤＮＡｓｅ反応混合物（１μｌのＴｒｕｂｏ ＤＮＡｓｅ、２．５μｌのＴｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅの１０ｘバッファー、１．５μｌのＨ２Ｏ）とインキュベートすることにより、ＤＮＡｓｅ処理（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ２２３８）で除去した。サンプルを２．２ｘＳＰＲＩビーズで再度精製し、３．６μｌのプライミング混合物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂの０．３μｌランダムプライマー、Ｅ７４２０、３．３μｌのＨ２Ｏ）に懸濁した。続いて、サンプルを６５℃で５分間プライミングした。次にサンプルを氷に移し、２μｌのファーストストランド混合物を加えた（１μｌの５ｘファーストストランドバッファー、ＮＥＢ Ｅ７４２０；０．１２５μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤、ＮＥＢ Ｅ７４２０；０．２５μｌのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素、ＮＥＢ Ｅ７４２０；および０．６２５μｌの０．２μｌ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、Ｓｉｇｍａ、Ａ１４１０）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ、Ｅ７４２０）を製造元の指示に従って使用して、ファーストストランドの合成とその後すべてのライブラリー調製ステップを実行した（すべての反応量を４分の１に減らした）。
１６Ｓ ｒＤＮＡ分析
重複するペアエンドのＦＡＳＴＱファイルは、Ｑｉｉｍｅ ２バージョン２０１８．４．０（Ｑｉｉｍｅ２）で実装されたデータキュレーションパイプラインで照合および処理された（Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ペアエンドシーケンスデータは、Ｑｉｉｍｅ２ ｄｅｍｕｘ－ｅｍｐ－ｐａｉｒｅｄを使用してサンプル固有のバーコードに従って逆多重化された。トリミングおよびアンプリコンシーケンスバリアント（ＡＳＶ）のピッキングは、ＤＡＤＡ２を使用して実行された（Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。アルファ希薄化曲線は、Ｑｉｉｍｅ２のアルファ希薄化を使用してプロットされ、各比較に適切なサブサンプリングの深度を設定するために使用された。サンプルは、Ｑｉｉｍｅ２機能テーブルｒａｒｅｆｙを使用して希薄化した（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。読み取り深度が関連するサブサンプリング深度よりも低いサンプルは、分析から除外された。ＡＳＶには、９７％の同一性のＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓ ｒＲＮＡデータベースである、２０１３年８月にトレーニングされた単純ベイズ適合分類器を使用した分類学的注釈が割り当てられた（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。相対存在量テーブルは、Ｑｉｉｍｅ２機能テーブルｓｕｍｍａｒｉｚｅ－ｔａｘａを使用して計算された。順序プロットは、主座標分析（ＰＣｏＡ）を使用して、重み付けされていないおよび重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離行列から計算された。
メタゲノム解析
メタゲノム解析では、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを含むメタゲノムリードと質の低いリードをフィルタリングし、質の低いリードのエッジをトリミングした。宿主のＤＮＡは、ＧＥＭ（Ｍａｒｃｏ－Ｓｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を使用して、包括的パラメーターを使用してヒトまたはマウスのゲノム（それぞれ、ｈｇ１９またはｍｍ１０）にマッピングすることにより検出され、宿主の読み取りは削除された。マウスのメタゲノムでは１００万回の読み取りが、ヒトでは７００万から１０００万回の読み取りがサブサンプリングされた。メタゲノムシーケンスからの相対的な存在量は、デフォルトのパラメーターでＭｅｔａＰｈｌＡｎ２（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を使用して計算された。ＭｅｔａＰｈｌＡｎの相対的な存在量は、５ｘ１０－４のレベルで制限されていた。ＫＯの相対存在量は、ＤＩＡＭＯＮＤ（Ｂｕｃｈｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用してＫＥＧＧ（Ｋａｎｅｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．，２００６）細菌遺伝子データベースにマッピングし、最初のヒットのみを考慮し、ｅ値＜０．０００１を許容することによって得られた。ＫＯの相対的な存在量は、そのＫＯに関連する細菌遺伝子にマッピングされたすべてのリードの合計を、サンプル内のマッピングされたリードの総数で割ったものとして判定された。ＫＯの相対的な存在量は、マウスでは２×１０－５、ヒトでは２×１０－７のレベルに制限されていた。サンプルの１０％未満に存在する分類群とＫ０は廃棄された。
代謝物の選択：ＷＴおよびＳＯＤ１－ＴｇマウスでＡｂｘによって変更された上位１２の重要な血清代謝物を使用して、１２の代謝物を合成または分解する可能性のあるＫＥＧＧ遺伝子のすべてのヌクレオチド配列を最初にダウンロードした。次に、ＫＥＧＧ遺伝子のボウタイインデックスを作成し、ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴメタゲノムサンプルにマッピングした。最後に、すべてのマップされたリードを取得し、すべてのサンプルとＫＥＧＧ遺伝子について、ＫＥＧＧ遺伝子にマップされたリードの数とその平均スコアを報告する。スコアはｂｏｗｔｉｅ２８４で定めれたとおりで、範囲は０～－４５であり、０は完全一致を示す。
ＲＮＡｓｅｑ分析
データの前処理：ｂｃｌファイルはｆａｓｔｑに変換され、アダプターのトリミングはｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用して実行された。次に、ＳＴＡＲ（スプライス部位認識アラインメント）を使用して、リードをｍｍ１０の参照ゲノム（ＵＣＳＣ）にアラインメントした。ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ－ｈ－Ｆ ２５６－Ｆ １０２４を使用して、二次アラインメントとＰＣＲ／光学的重複を削除した。アラインメントは、ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ（ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ－ａ ５－ｓ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｒ）を使用して遺伝子にビニングされた。転写物完全性数（ＴＩＮ）の中央値は、ＲＳｅＱＣを使用して計算された。（ｔｉｎ．ｐｙ．ｂｅｄファイル：ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅｄｏｔｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｒｓｅｑｃ／ｆｉｌｅｓ／ＢＥＤ／Ｍｏｕｓｅ＿Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／からダウンロードしたｍｍ１０ ＲｅｆＳｅｑ．ｂｅｄ．ｇｚ）
差次的遺伝子発現：各比較について、総読み取り数のうち読み取り値が１０ー４以上で、各比較における群の少なくとも５分の１で発現している遺伝子を分析に含めた。Ｄｅｓｅｑ２モデルは、各比較のために個別に適合された［設計：カウント～群＋中央値（ＴＩＮ）］。Ｄｅｓｅｑ２オブジェクトのＷａｌｄ検定を使用して、差次的に発現する遺伝子が見つかった。ヒートマップは、正規化されたログ変換データ（ｒｌｏｇ）を使用して作成された。
遺伝子セット強化分析：各遺伝子について、ＤＥＳｅｑの結果から次のスコアを計算した。－ｌｏｇ（ｐａｄｊ｝ ｓｉｇｎ（ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ）．ｂｕｌｋ．ｇｓｅａ関数が、ユニバースモデルとしてｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｅ－ｌａｂ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｇｓｋｂ／２－ＭｏｕｓｅＰａｔｈ／ＭｏｕｓｅＰａｔｈ＿ＧＯ＿ｇｍｔｄｏｔｇｍｔを使用して、ライガーパッケージから使用された。
非標的メタボロミクス
血清および盲腸のサンプルを収集し、直ちに液体窒素で凍結し、－８０℃で保存した。サンプルの調製と分析はＭｅｔａｂｏｌｏｎ Ｉｎｃによって行われた。自動化されたＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用してサンプルを調製した。タンパク質、タンパク質に結合した、または沈殿したタンパク質マトリックスにトラップされた解離した小分子を除去し、化学的に多様な代謝物を回収するために、タンパク質をメタノールで沈殿させた。得られた抽出物を５つのフラクションに分けた。１つは陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を使用したＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つは陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化を使用したＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つはＬＣ極性プラットフォーム用、もう１つはＧＣ－ＭＳによる分析用にして、１つのサンプルがバックアップ用に確保された。サンプルをＴｕｒｂｏＶａｐ（Ｚｙｍａｒｋ）に短時間置いて、有機溶媒を除去した。ＬＣの場合、分析の準備をする前に、サンプルを窒素下で一晩保存した。ＧＣの場合、分析の準備をする前に、各サンプルを真空下で一晩乾燥させた。
データ抽出と化合物の同定：Ｍｅｔａｂｏｌｏｎのハードウェアとソフトウェアを使用して、生データが抽出され、ピークが特定され、ＱＣ処理された。化合物は、精製された標準または再発する未知のエンティティのライブラリーエントリと比較することによって識別された。
代謝物の定量化とデータの正規化：ピークは、曲線下面積を使用して定量化された。複数の日にわたる研究では、データの正規化ステップを実行して、機器の日中でのチューニングの違いに起因する変動を修正した。
標的化メタボロミクス
５０ｎｇ／ｍｌのＤ５－グルタミン酸と５０ｎｇ／ｍｌのＤ４－ニコチンアミド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、内部標準としてすべてのサンプルに添加した。サンプル（５０％メタノール中）をスピードバックで乾燥させてメタノールを吹き飛ばしてから、凍結乾燥機で完全に乾燥させた。すべてのサンプルを１００μｌの０．１％ギ酸に再溶解した。
液体クロマトグラフィー：液体クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで実施した。代謝物は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３カラム（２．１×１５０ｍｍ、粒子サイズ１．８μｍ；Ｗａｔｅｒｓ）で、１０分間のプログラムを使用して４０℃で単離した。移動相は、（Ａ）水と（Ｂ）アセトニトリルからなり、それぞれ０．１％ギ酸を含んでいた。勾配の条件は次のとおりである。０～１分＝９９．９％、Ａ；０．１％Ｂ；１～６分＝０．１％～１０．０％Ｂ；６～７分＝１０％～１００％ Ｂ；７．０～７．２分＝１００％ Ｂ；７．２～１０分＝９９．９％Ａ、０．１％Ｂ。注入量は１．０μｌ、流速は０．３ｍｌ／分であった。
質量分析：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｚｓｐｒａｙ ＥＳＩソースを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏトリプル四重極で実行された。ＭＲＭは陽イオンモードで実行された。その他のＭＳパラメーターには、６００℃での脱溶媒和温度、９００Ｌ／Ｈｒでの脱溶媒和ガスフロー、７Ｂａｒでの１５０Ｌ／Ｈｒネブライザ圧力でのコーンガスフロー、２．５３ｋＶでのキャピラリ電圧（ＣＶ）が含まれる。使用したＭＲＭの移行は次のとおりである。（ａ）各々、グルタミン酸：１４８．１＞８４．１および１４８．１＞１０２、衝突エネルギー（ＣＥ）１５および１１Ｖ。（ｂ）それぞれ、Ｌ－Ｄ５－グルタミン酸：１５３．１＞８８．１および１５３＞１０７、ＣＥ１５および１１Ｖ。（ｃ）ニコチンアミド：それぞれ１２３＞７８および１２３＞８０、ＣＥ １９、１３Ｖ、および（ｄ）それぞれ、Ｄ４－ニコチンアミド１２７＞８１および１２７＞８４、ＣＥ １９、１７Ｖ。衝突ガスとしてアルゴン（０．１０ｍｇ／分）を使用した。ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）は、定性および定量分析に使用された。
患者と対照者
臨床試験：ヒトの試験は、Ｈａｄａｓｓａｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ承認番号ＨＭＯ－１６－０３９６）およびＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ監視委員会（ＩＲＢ承認番号３６５－１）によって承認された。書面によるインフォームドコンセントがすべての対象から得られた。
除外および組み入れ基準（ヒトのコホート）：すべての対象は、以下の組み入れ基準を満たした：現在、いずれの食事療法または栄養士の相談にも沿わせておらず、インフォームドコンセントを提出できる１８～７０歳の男性および女性。除外基準は次のとおりである。（ｉ）妊娠または不妊治療。（ｉｉ）参加前３か月以内の抗生物質または抗真菌剤の使用。（ｉｉｉ）参加前の１か月以内の任意の形態のプロバイオティクスの消費。（ｉｖ）登録前の３年間の慢性的に活性の炎症性疾患または腫瘍性疾患。（ｖ）炎症性腸疾患およびセリアック病を含む慢性胃腸障害。（ｖｉ）参加前６か月の心筋梗塞または脳血管障害。（ｖｉｉ）凝固障害。（ｖｉｉｉ）慢性免疫抑制薬の使用。（ｉｘ）事前に診断されたＩ型またはＩＩ型糖尿病または抗糖尿病薬による治療。組み入れ基準と除外基準の順守は、医師によって検証された。
統計分析
データは平均±ＳＥＭとして表される。ｐ値＜０．０５が有意であると見なされた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）。ペアワイズ比較は、スチューデントのｔ検定を使用して実行された。分布が正規であることがわかっていない場合は、マンホイットニーＵ検定を使用した。複数の群間の比較はＡＮＯＶＡを使用して実行され、ＦＤＲ補正は複数の比較を調整するために使用された。線形回帰を使用して、時間依存性の様式で時間と治療の関数として神経表現型の測定値（ロータロッド、グリップテストスコア、神経学的スコア）をモデル化することにより、対照のマウスとＳＯＤ１－ＴｇマウスにおけるＡｂｘの効果を経時的に分析した。
表現型～時間＋時間ｘ治療＋時間ｘ遺伝子型＋時間ｘ治療ｘ遺伝子型
ここで、時間は日（６０、８０、１００、１２０、および１４０）であり、治療（±Ａｂｘ）および遺伝子型（ＷＴまたはＳＯＤ１－Ｔｇ）はバイナリインジケーターである。次に、治療の有意性は、時間ｘ治療予測因子のｐ値によって推測されている。この分析では、ｐｙｔｈｏｎ ｓｔａｔｓｍｏｄｅｌｓ．ａｐｉ．ｏｌｓバージョン０．８．０ｓｔａｔｓｍｏｄｅｌｓを使用した。
時間の経過に伴う微生物量の変化は、線形回帰を使用して評価された。
ＯＵＴ～時間＋時間ｘ遺伝子型
ＯＵＴの存在量に影響を与える遺伝子型の有意性は、複数のＯＴＵの５％ＦＤＲ補正後の時間ｘ遺伝子型予測子のｐ値によって推測された。
ニコチンアミドおよびトリプトファン代謝経路のＫＯを分析するために、マンホイットニーＵ順位和検定を使用して群間のＫ０レベルを比較した。この分析では、ｐｙｔｈｏｎｓｔａｔｓ．ＨｉｇｈｅｒＬｅｖｅｌＲａｎｋｓｕｍ．ｄｉｒｅｃｔｅｄ＿ｍａｎｎｗｈｉｔｎｅｙｕが使用された。
結果
腸内マイクロバイオームの変化は、ＡＬＳマウスモデルの運動症状を悪化させる。
ＡＬＳにおける腸内マイクロバイオームの潜在的な調節的役割を評価するために、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の高コピー数ｍＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ（ここでは「ＳＯＤ１－Ｔｇ」）マウスモデルを使用した。バンコマイシン（０．５ｇ／ｌ）、アンピシリン（１ｇ／ｌ）、ネオマイシン（１ｇ／ｌ）、およびメトロニダゾール（１ｇ／ｌ）（広域抗生物質、Ａｂｘ）の併用投与により、当施設で雄と雌のＳＯＤ１－Ｔｇまたは同腹仔対照の腸内マイクロバイオームを枯渇させることから調査を開始し、それらは、４０日齢からマウスの固有のマイクロバイオームを著しく枯渇させることが一貫して示されている２５（図１Ａ）。運動能力は、複数の方法、すなわちロータロッド運動テスト２６、吊り下げワイヤーグリップテスト２７、および神経学的スコアリング２８を使用して定量化された。プロジェクト全体を通して、主要な繰り返し実験は、２名の盲目の研究者によって独立して採点された。驚くべきことに、Ａｂｘ治療は、水で処理されたＳＯＤ１－Ｔｇ群と比較して、ＡＬＳ進行中の運動異常の有意かつ実質的な悪化と関連していた。プールされた結果（群あたりＮ＝１５～３０マウス、図１Ｂ～Ｄ）と各反復の独立した結果（（各反復の各群でＮ＝５～１０のマウス、３つの独立した反復、図８Ａ～Ｉ）の双方は、ロータロッド運動テスト（図１Ｂ、図８Ａ、８Ｄ、および８Ｇ）、吊り下げワイヤーグリップテスト（図１Ｃ、図８Ｂ、８Ｅ、および８Ｈ）、および神経学的スコアリング（図１Ｄ、図８Ｃ、８Ｆ、および８Ｉ）で悪化した結果を示した。特に、Ａｂｘ処理は、Ａｂｘ処理されていないＷＴマウスと比較して、本飼養所でのＷＴ同腹仔対照のロータロッドまたはグリップテストのパフォーマンスに影響を与えなかった（図１Ｂ～Ｄおよび図８Ａ～Ｉ）。線形回帰分析は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスにおけるこれらの神経病理学的測定値に対するＡｂｘ治療の統計的に有意な負の効果をさらに支持した（図９Ａ～Ｃ）。
これらの発見と一致して、１４０日目のニューロン数の脊髄組織病理学的分析（ルクソールファストブルー染色を使用）は、水で処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較してＡｂｘ処理した運動ニューロン細胞数の有意な減少を明らかにし（図１Ｅ～Ｆ）、慢性的なＡｂｘ曝露後の運動ニューロン細胞死の増加を示唆している。さらに、ＳＯＤ１－Ｔｇモデル（図９Ｄ２９、３０）で変性することが知られている領域のマウスの脳幹のＴ２重み付け磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、Ａｂｘ処理ＳＯＤ１－ＴｇマウスがＴ２緩和時間の延長Ａｂｘを証明し（図１Ｇ～Ｉ、図９Ｄ～Ｉ）、より高いレベルの自由水、強化された脳萎縮および神経変性を示す３１。自動化されたホームケージ移動システムは、水処理されたＳＯＤ１－Ｔｇ対照と比較して、１００日目にＡｂｘ処理されたＳＯＤ１－Ｔｇマウスの活性の有意な減少（ｐ＝０．０３）を明らかにした（図９Ｊ）。ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動機能におけるＡｂｘ誘発性の悪化は、水処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較して、脊髄（活性化ミクログリアを含む）、小腸、または固有層結腸の主要な免疫細胞亜集団の変化とは関連しておらず（図９Ｋ～Ｐ）、Ａｂｘ関連の表現型の違いが顕著な免疫異常によって媒介されなかったことを示唆している。
重要なことに、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの無菌環境への再誘導の試みは、ＳＯＤ１－Ｔｇの高率の死亡率と関連していたが、ＷＴ同腹仔対照の死亡率とは関連していなかった（１８か月間の３０匹の妊娠した雌親の再誘導の試みの失敗）。再誘導が成功すると、ＧＦ ＳＯＤ１－Ｔｇマウスは、ＧＦ ＷＴ同腹仔またはコロニー形成したＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較して、有意に増強された死亡率を特徴とした（図１Ｊ、プールされた結果、群あたりＮ＝９～２２マウス、図１０Ａ～Ｂ、２つの独立した反復、群あたりＮ＝５～１３）。ＧＦマウスが１１５日目に自発的にコロニー形成した場合でも、死亡率の上昇は依然として存在しており、微生物の駆動者が初期の病期でＡＬＳの進行に影響を与えることを示唆している。さらに、Ａｂｘ処理によるマイクロバイオームの枯渇は、追加のＡＬＳマウスモデルであるＴＤＰ４３－Ｔｇマウスで死亡率を実質的かつ有意に増強し（プールされた結果については図１Ｋ、個々の繰り返しについては図１０Ｃ～Ｄ）、この有害なマイクロバイオーム枯渇効果がＳＯＤ１変異に限定されなかったことを示唆している。まとめると、これらの結果は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳ発現に対する、本発明者らの飼養場でのＡｂｘを介したマイクロバイオームの変化（またはＧＦマウスでのその欠如）の潜在的な有害な影響を示し、局所的に異生物の腸内マイクロバイオーム構成がこのモデルにおける疾患の進行を調節する可能性があることを示唆している。
ＳＯＤ１－Ｔｇマウスは、飼養場依存性の前臨床腸内毒素症を発症する。
当飼養場でのＳＯＤ１－ＴｇモデルにおけるＡＬＳ神経病理学に対するこれらの示唆された微生物媒介効果は、ＡＬＳの過程を調節する可能性のある局所的に蔓延している共生株を特定する機会を提示した。実際、当施設でのＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔対照における１６ｓ ｒＤＮＡシーケンスによる糞便のマイクロバイオームの組成と機能の評価は、疾患経過中に持続する初期の有意なマイクロバイオームの組成の違いを示した（図２Ａ～Ｃ、図１１Ａ～Ｃ）。特に、当飼養場では、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの腸内毒素症は、主にＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属によって引き起こされ、これらはすべて、ＷＴ同腹仔対照と比較してＳＯＤ１－Ｔｇの糞便で有意に減少した（図１１Ｃ～Ｇ）が、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏａｃｅａｅ、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａは、ＳＯＤ１－Ｔｇの糞便のマイクロバイオームにおいて１６Ｓ ｒＤＮＡが豊富に含まれていた（図１１Ｈ～Ｍ）。さらに、観察された属の総数（アルファ多様性）は、すべての時点でＳＯＤ１－Ｔｇの便でより多く（図１１Ｎ）、ＷＴ同腹仔と比較してＳＯＤ１－Ｔｇマウスのコミュニティ構造が変化したことを示している。しかし、糞便中の総細菌量は、ＳＯＤ１－Ｔｇの対照とＷＴの対照の間で変動がなかった（図１１Ｏ）。さらに、Ａｂｘで処理されたＳＯＤ１－Ｔｇの腸内マイクロバイオーム構成と当飼養所でのそれらのＷＴ同腹仔対照でさえ、疾患の進行全体にわたって、調べられたすべての時点で、有意に異なるマイクロバイオーム組成をもたらした（図１２Ａ～Ｇ）。バクテロイデスが栄えることによって駆動されており、Ａｂｘで処理されたＷＴマイクロバイオームにおいてパラバクテロイデス属とクロストリジウム属、およびＡｂｘで処理されたＳＯＤ１－ＴｇマウスにおいてＳｕｔｔｅｒｅｌｌａ属とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ属であった（図１２Ｈ～Ｍ）。重要なことに、当飼養所でのＧＦ ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔の自発的コロニー形成は、デノボの腸内毒素症の発症と関連していたが（図１３Ａ～Ｉ）、これらの施設依存性の腸内毒素症の違いは、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅがほとんど存在しないことを特徴とする２番目の障壁のない（非ＳＰＦ）の飼養所では観察されなかった（図１４Ａ～Ｅ）。全体として、これらの施設依存の変化は、マウス－ＡＬＳの遺伝的感受性と、局所的に蔓延している共生の特徴との組み合わせが、この施設でのＡＬＳ調節に寄与する可能性のある初期の前臨床腸内毒素症を引き起こすことを示唆した。
当飼養所でのＡＬＳの進行に関連する種レベルの組成的および機能的マイクロバイオームの違いをさらに評価するために、異なる時点でのＷＴ同腹仔と比較して、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの糞便微生物ＤＮＡのショットガンメタゲノムシーケンスを実施した。実際、ＭｅｔａＰｈｌａｎ２を使用すると、複数の種レベルの分類学的差異に起因して、同腹仔対照と比較してＳＯＤ１マウスのマイクロバイオーム組成に有意差が認められた（図２Ｄおよび図１５Ａ～Ｂ）。例えば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、非分類のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、非分類のＳｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、およびＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（図１５Ｃ～Ｈおよび図３Ａ）は、ＳＯＤ１－Ｔｇマイクロバイオームで有意に減少したが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉおよびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（図１５Ｉ～Ｎ）は、ＷＴ同腹仔対照と比較して強化されていた。機能的には、ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ糞便細菌代謝物は微生物遺伝子に関して別々にクラスター化され（ＰＣ１の場合：４０日目、ｐ＝０．０００２、６０日目、ｐ＝０．０００２、８０日目、ｐ＝０．０００５、１００日目、ｐ＝０．０００５、ＫＥＧＧオルソロジー、ＫＯ、図２Ｅ）、トリプトファン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の表現の著しい減少（図２Ｆ～Ｇ）およびニコチンアミドおよびニコチン酸代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の実質的な変化（図２Ｈ）を含む。これらの初期のマイクロバイオームの影響がＳＯＤ１－Ｔｇマウスの代謝の変化に続発することを除外するために、前臨床６０日目に詳細な代謝評価を行い、食物と水の摂取量、呼吸交換率、酸素消費量、運動、および熱生成に有意な変化は見られなかった。（図１６Ａ～Ｌ）。
まとめると、これらの結果は、単一遺伝子型に収容されたＳＯＤ１マウスは、臨床運動ニューロン機能障害症状が現れる前でさえ、腸の微生物組成と機能が、当飼育場でのＷＴ同腹仔構成から分岐していることを示した。
ＡＬＳ悪化への共生微生物の寄与
次に、上記の飼養所依存性の異なる豊富な腸内共生微生物とマウスＡＬＳ関連運動機能の調節との間の考えられる因果関係を判定すべく模索した。総じて、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｔａｙｉ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅファミリーのメンバー）、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ、およびＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む１１株を検証し、本複合１６Ｓ ｒＤＮＡとショットガンメタゲノム分析によって、当飼養所でのＳＯＤ１－ＴｇモデルにおけるＡＬＳ進行の重症度と相関することが示唆された（図１１Ａ～Ｏおよび図１５Ａ～Ｎ）。この目的のために、上記の各株（定常期Ｏ．Ｄ．＝０．４～０．７）の嫌気性培養物を、Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスに、６日間の間隔で合計１５の治療に対して繰り返し経口投与することにより単回接種した。示された細菌のほとんどによるこれらのマウスの単コロニー形成は、ＡＬＳの症状に影響を与えなかった（図１７Ａ～Ｌ）。Ａｂｘで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスに、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＰＤ、図１７Ａ～Ｌ）とＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ（ＲＴ、図１８Ａ～Ｍおよび図１９Ａ～Ｉ）の２つの菌株を補充すると、疾患の進行が悪化し、一方でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉとＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａでの処理（それぞれＬＧとＰＭ）は、行動テストのすべてではないが一部で疾患促進効果を示した（図１７Ａ～Ｌ）。実際、ＲＴレベルはＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＬＳの進行と正の相関があり（図１８Ａ）、４つの独立した治療のプールされた結果によって示されるように、ロータロッド、グリップテスト、および神経学的スコアによって示されるように、管理運動機能で悪化した（群あたりＮ＝２０～４０匹のマウス、図１８Ｂ～Ｄ）が、独立して分析された反復間でいくらかの変動が認められた（各反復の各群でＮ＝５～１０匹のマウス、図１９Ａ～Ｉ）。ニューロンの死亡率に組織学的な違いはないが（図１８Ｅ～Ｆ）、ＲＴで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスでは、ビヒクル処理のものと比較してＴ２重み付けＭＲＩスキャン（図１８Ｇ～Ｍ）を使用した早期発症（１００日目）の萎縮が見られた。注目すべきことに、テストされた１１の細菌株はいずれもＷＴ動物の運動能力に影響を与えなかった（９つのテストされた細菌株については図１７Ｇ～Ｉ、ＲＴについては図１８Ａ～Ｍおよび図１９Ａ～Ｉ）。まとめると、これらの結果は、複数の共生生物がＳＯＤ１－ＴｇＡＬＳマウスモデルの運動ニューロン変性に寄与する可能性があることを示唆している。
ＡＭコロニー形成はマウスのＡＬＳを改善し、生存を延長する。
当飼養所のＳＯＤ１－Ｔｇマウスで異なって変化した種の１つは、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＭ）であり、１６Ｓ ｒＤＮＡ（図１１Ｃ）とショットガンメタゲノムシーケンス（図１５Ｂおよび図３Ａ）の両方が、ＷＴ同腹仔のマイクロバイオームでの安定した高い表現と比較して、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスで疾患が進行するにつれて、その存在量が徐々に減少したことを示していた。当飼養所でのＡＭ１６Ｓ ｒＤＮＡコピーのレベルの低下は、ＡＭ固有のｑＰＣＲを使用してＳＯＤ１－Ｔｇの便のサンプルで検証された（図３Ｂ）。Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスを嫌気的に単培養したＡＭ株（ＢＡＡ－８３５、Ｏ．Ｄ．＝０．７、定常期）で、６日間隔で経口投与し、合計１５回の治療を行った処理は、ロータロッド、グリップおよび神経学的スコアリングテストにより定量化されて、プールされたサンプル（群あたりＮ＝３４～６２のマウス、図３Ｃ～Ｅ）において、または６回の反復とは独立して（各反復の各群にＮ＝５～２５匹のマウス、図１７Ａ～Ｃおよび図２０Ａ～Ｏ）評価されたとき、ＡＭ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動機能の改善と関連があった。このＡＭを介した機能の改善は、ビヒクルで処理したＡｂｘで前処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較して、ＡＭで処理したＳＯＤ１－Ｔｇ脊髄における運動ニューロンの生存率が高いことを伴った（図３Ｆ～Ｇ、ｐ＝０．００４１）。重要なことに、ＡＭ処理は、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの寿命を、ビヒクル処理マウス、または細菌対照として機能する他の共生マイクロバイオーム種で処理されたＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較して、有意にまた大幅に延長した。（図３Ｈ）。ＡＭ治療はまた、ＭＲＩによって測定された特定のＡＬＳの影響を受けた脳の領域における低いＴ２緩和時間の短縮によって示されるように、１４０日目の脳の萎縮を減少させた（図２１Ａ～Ｄ）。ＡＬＳの進行に対するＡＭの有益な効果は、他の状況でこの細菌によって誘発される可能性のある腸の透過性の変化に起因しなかった３２。１２０日目に、ＡＭ、ＰＢＳ、および他の微生物処理ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴマウスの間で全身のＦＩＴＣ－デキストラン流入に違いが見られなかったためである。（図２１Ｅ）。ＡＭで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスのマイクロバイオームメタゲノムは、ＰＢＳで処理したＳＯＤ１－Ｔｇ対照とは異なるクラスターを形成した（図２１Ｆ）。予想通り、ＡＭの相対的な存在量は、ビヒクルで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較して、ＡＭで処理した糞便サンプルで有意に増加した（図２１Ｇ）。対照的に、本飼養場で高く安定した固有のＡＭレベルを保持するＷＴマウスは、長期投与時にのみレベルが上昇した外因的に投与されたＡＭの競合相手を特徴としていた（図２１Ｈ）。さらに、ＡＭは、ＷＴ ＧＩ管と比較して、ＳＯＤ１－Ｔｇ ＧＩ管の様々な領域でより広範囲かつ効率的にコロニーを形成することがわかった（図２１Ｉ～Ｊ）。その結果、Ａｂｘ治療後のＡＭ補充は、ＷＴマウスとＳＯＤ１－Ｔｇマウスの両方のマイクロバイオーム組成を異なる方法で変化させた（図２１Ｋ、Ｌ）。
本発明者らの結果をさらに検証するために、Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔を別のＡＭ株（ＡＴＣＣ ２８６９）で単コロニー化した。ＡＭ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ ８３５）で観察された結果と同様に、ＡＭ ２８６９コロニー形成ＳＯＤ１－Ｔｇマウスは運動能力の有意な改善を示し（図２２Ａ～Ｃ）、ＡＬＳの症状に対するＡＭの観察された有益な効果が異なるＡＭ株にまたがる可能性があることを示唆している。ＡＭはムチングリカン分解細菌である３３ため、１４０日目にＡＭまたはＰＢＳで処理したＳＯＤ１－Ｔｇの遠位結腸粘液の組織病理学的分析をさらに実施した。無傷の内粘液層粘液が、ＡＭ補充およびＰＢＳ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスで観察された（図２３Ａ）。ＰＢＳで処理した対照のＳＯＤ１－Ｔｇマウスとは対照的に、ＡＭで処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスでは、細菌が内粘液に浸透し、まれに陰窩に侵入した（図２３Ｂ、白い矢印）。プロテオミクス分析では、ＡＭ補充マウスの粘液成分レベルに有意差は見られなかった（図２３Ｃ～Ｊ）。まとめると、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスへの単回接種による複数の差次的に発現する腸内共生の評価により、マウスのＡＬＳ疾患の経過と重症度を逆に（ＰＤ、ＲＴ、場合によってはＬＧとＰＭ）または有利に（ＡＭ）調節する選択された共生が特定された。
ＡＭは、ニコチンアミドレベルを全身で上昇させることにより、マウスのＡＬＳを軽減する。
異なる腸内共生生物がマウスのＡＬＳの臨床経過に及ぼす上記の調節的影響は、様々なメカニズムによってもたらされる可能性がある。一例として、次にマイクロバイオームによって誘発されるメカニズムを評価し、当飼養所でのマウスのＡＬＳ疾患の経過に対するＡＭを介した有益な効果を説明する可能性がある。腸内マイクロバイオームがＣＮＳ疾患部位から離れていることを考えると、腸内マイクロバイオームによって調節される代謝物は、ＣＮＳ９、１０に移行することにより、ＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動ニューロン感受性に影響を与える可能性があると仮定した。この目的のために、ＡＬＳの初期段階（１００日目）に、ＡＭ補充およびビヒクルコントロールの血清に特異的に豊富なマイクロバイオーム依存性分子候補を特定するために、非標的メタボロミクスプロファイリングを利用した。ＳＯＤ１－Ｔｇマウスで同定された７１１の血清代謝物のうち、８４の代謝物がＡＭ補給によって有意に変化し、そのうち５１がＡＭ処理によって上昇した（図４Ａおよび図２４Ａ～Ｃ）。これらのうち、６つの代謝物のみの生合成遺伝子（ヌクレオチド配列、ＫＥＧＧデータベース）がメタゲノムインデックスにアラインメントされ、２つの代謝物、ニコチンアミドとフェノール硫酸塩が、当飼養所のＳＯＤ１－Ｔｇマイクロバイオームを凌ぐＷＴマイクロバイオームによって合成される最高のメタゲノム確率を特徴としている（図２４Ｄ）。マウスのＡＬＳの経過する期間中の継続的な薬物投与を確実にする皮下に埋め込まれた徐放性ミニ浸透圧ポンプを使用したＳＯＤ１－Ｔｇマウスへのフェノール硫酸塩の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＬＳ症状に影響を与えなかった（図２４Ｅ～Ｇ）。
いくつかの重要な観察は、ＮＡＭがＡＭを介したマウスのＡＬＳの正の調節に関与している可能性があることを示唆した。メタゲノムＮＡＭ生合成経路の顕著な変化は、Ａｂｘ処理時に認められた（図２Ｈ）。ＮＡＭ生合成中間体の血清レベルの強化は、ＡＭ補充時に認められた（図４Ｂ）。さらに、ショットガンメタゲノムシーケンシングにより、ＮＡＭ３４、３５の生成に関与していることも示されている腸内マイクロバイオーム由来のトリプトファン代謝経路のいくつかの遺伝子（図２Ｆ～Ｇ）が、ナイーブＳＯＤ１マウスでは有意に減少していることが明示され、一方でトリプトファン経路の全身性代謝物は、Ａｂｘ処理またはＡＭ補給時に変化し（図２５Ａ～Ｂ）、トリプトファンの代謝のマイクロバイオーム調節がこれらの設定でのＮＡＭレベルの変化に寄与する可能性があることを示唆している。
ＡＭがＮＡＭを生成および分泌できるかどうかを調べるために、嫌気的に増殖したＡＭのＮＡＭレベルを測定し、標的化メタボロミクスを使用してグラム陽性および陰性の共生分離株を制御した。実際、熱で死滅させたＡＭまたは他の共生分離株から収集した上清と比較して、ＡＭ培養培地では有意に高いレベルのＮＡＭが見つかった（図４Ｃ）。ＡＭ分泌／誘導ＮＡＭがＣＮＳに到達し、運動ニューロンに影響を与える可能性をさらに調査するために、当飼養所でビヒクル処理ＳＯＤ１－ＴｇおよびＷＴ同腹仔マウスと比較したＡＭ処理のＣＳＦにおけるＮＡＭレベルを測定した。実際、ＣＳＦのＮＡＭレベルは、ＡＭ処理したＳＯＤ１－ＴｇマウスとＷＴマウスの両方ですでに１００日齢（疾患初期）で有意に高かった（図４Ｄ）。疾患の進行期（１４０日目）では、ＣＳＦのＮＡＭレベルはＡＭ治療ＳＯＤ１－Ｔｇマウスで有意に高かったが、ＡＭ治療ＷＴマウスでは、非治療対照と比較して高くなく（図４Ｅ）、ＷＴマウスとＳＯＤ１－Ｔｇマウスの間で認められる腸のコロニー形成の安定性の違いを反映している可能性がある。（図２１Ｇ～Ｌ）。重要なことに、ＮＡＭ代謝に関与する酵素をコードする１０個のＡＭゲノム関連遺伝子のうち８個は、ビヒクル処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスと比較してＡＭ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスで有意に強化されており（図４Ｆ）、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＡＭ補充は、機能的なＮＡＭ生合成を直接修正する可能性があることを示唆している。
全身性ＮＡＭレベルの増加について、ＡＭ補充時に認められる関連する表現型の作用と因果関係をもたせるために、ＳＯＤ１－ＴｇマウスにＮＡＭを継続的に補充し、埋め込み式小型浸透圧ポンプを介して皮下投与し、０．１１μｌ／ｈｒの一定速度と４９．２８ｍｇ／ｋｇ／週の累積投与量でＮＡＭを放出した。ポンプを２８日ごとに、４０～１５２日齢の間に合計４回交換することにより、疾患全体を通してマウスへの安定した継続的なＮＡＭ投与を確実に行った。実際、ＮＡＭのレベルは、水で処理した対照と比較して、ＮＡＭで処理したＳＯＤ１－ＴｇマウスのＣＳＦおよび血清で、有意に増加した（図５Ａ～Ｂ）。重要なことに、プール分析（群あたりＮ＝３０のマウス、図５Ｃ～Ｅ）、または独立して３回の繰り返しで（各繰り返しの各群でＮ＝１０のマウス、図２６Ａ～Ｉ）によって示されるように、行動および神経学的運動試験の両方において、ＮＡＭ処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスは、ビヒクル処理ＳＯＤ１－Ｔｇマウスよりも、有意に良好なパフォーマンスであった。注目すべきことに、ＮＡＭの治療は生存率を改善する有意ではない傾向をもたらし（図５Ｆ）、おそらく不十分な投与または曝露時間、または観察されたＡＭ誘発の生存の恩恵に到達する他のＡＭ媒介調節メカニズムの統合の必要性（図３Ｈ）を反映している。
ＧＩ細菌によって産生されたＮＡＭが運動能力に影響を与えることができるかを調べるために、Ａｂｘで前処理したＳＯＤ１－Ｔｇマウスに、対照としてＷＴ Ｅ．ｃｏｌｉを接種するか、ＮＡＭ産生の低下を示すΔｎａｄＡ Ｅ．ｃｏｌｉを接種した（図２７）。注目すべきことに、Ｅ．ｃｏｌｉはマウス消化管のコロニー形成が不十分であると考えられる３６。ΔｎａｄＡ Ｅ．ｃｏｌｉの補充はロータロッドとグリップテストのパフォーマンスに影響を与えなかったが（図２７）、ＷＴ Ｅ．ｃｏｌｉ治療の動物と比較してＳＯＤ１－Ｔｇマウスの神経学的スコアを有意に改善し（図５Ｇ）、腸内細菌が分泌したＮＡＭは、コロニー形成能力が低くても、このＡＬＳマウスモデルのいくつかの運動能力に影響を与え得ることを示唆している。
ＡＬＳ変調の潜在的なＡＭおよびＮＡＭメカニズム
ＡＭおよびＮＡＭがＳＯＤ１－Ｔｇマウスの運動ニューロンの生存を助け、ＡＬＳの進行を改善する可能性のある潜在的な分子メカニズムを探究するために、当飼養所にてＡＭおよびＮＡＭで処理したマウスから収集した脊髄サンプルのバルクＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施し、ＡＭまたはＮＡＭ補充の処理によって誘発された転写の変化を、対応する対照（ＡＭおよびＮＡＭ処理実験で、それぞれＰＢＳ処理または水処理の対照）と比較した。全体として、２１３遺伝子の偽発見率（ＦＤＲ）で補正された発現は、ＳＯＤ１－ＴｇマウスのＮＡＭ処理後に有意に変化した（図６Ａ）。また、これらの遺伝子のうち３１個は、ＡＭ処理後の発現パターンに有意な相関があった（図６Ｂ）。ＮＡＭ応答性遺伝子に表現型オントロジーの注釈を付けると、異常な脳の形態、生理学、および運動に関連する４つのカテゴリーに２１％の有意な適合が得られ、これらの遺伝子はまた疾患修正性である可能性があることが示された（図６Ｃ）。ＡＭおよびＮＡＭの影響を受けた転写産物の機能を判定するために、ＧＯ（遺伝子オントロジー）経路を遺伝子の各群に割り当てた（図６Ｄ～Ｅ）。ＡＭとＮＡＭの介入の間で共有される最も有意に強化された経路は、ミトコンドリアの構造と機能、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋（ＮＡＤ＋）の恒常性、およびスーパーオキシドラジカルの除去、ＡＬＳで破壊されることが知られている標準的な機能に関連している。興味深いことに、ＡＭ処理とＮＡＭ処理の間で共有される遺伝子の２８．６％は、ミトコンドリアの生合成、電子伝達系の活動、および酸化ストレスを制御することが知られている転写因子Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ－１（ＮＲＦ－１、図２８）によって調節されていることがわかった３７～４１。
ヒトＡＬＳ患者における腸内毒素症およびＮＡＭレベルの障害
最後に、当飼養所でのＳＯＤ１－Ｔｇの所見とヒトのＡＬＳの特徴との間の予備的な関連を調べた。この目的のために、ＡＬＳ患者３２人と、健常なＢＭＩおよび年齢が一致する家族２７人から便のサンプルを対照として収集し、腸内マイクロバイオームのメタゲノムを配列決定することにより、人間の観察研究を実施した。ショットガンメタゲノムシーケンシングによって定量化されたＡＬＳ患者のマイクロバイオームの組成は、健常な対照家族とは有意に異なっていた（図７Ａ、ＰＣ１の場合：ｐ＝３．３ｘ１０ー６）。ＦＤＲ補正後、特定の細菌種の存在量にいずれの有意差も観察されなかったが、複数の組成の傾向が認められ（図２９Ａ）、ヒトＡＬＳマイクロバイオームの有意に異なる全体的なクラスタリングが細菌の存在量の多数の蓄積された小さな変化に起因する可能性を示唆している。機能的には、ＡＬＳマイクロバイオームは全体的な細菌遺伝子含有量における有意差を示し（図７Ｂ、ＰＣ１の場合：ｐ＝２．８８ｘ１０ー９）、トリプトファンおよびＮＡＭ代謝に関与するいくつかの重要な遺伝子のＦＤＲ補正（これらの経路に合わせて調整）の減少を伴い、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｋ０３７８３、ｐｕｎＡ）、ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（Ｋ０３７４２、Ａｍｕｃ＿０４３０）、Ｌ－アスパラギン酸オキシダーゼ（Ｋ００２７８、Ａｍｕｃ＿１０７９）ＮＡＤ＋シンターゼ（Ｋ０１９５０、Ａｍｕｃ＿０６２０）、２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｋ００１６４、ＯＧＤＨ）、ニコチン酸ヌクレオチドピロホスホリラーゼ（Ｋ００７６７、Ａｍｕｃ＿１２６３）およびエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ（Ｋ０１７８２、ｆａｄＪ、図７Ｃ）がある。重要なことに、これらの有意に減少した遺伝子のいくつかはすべてＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａゲノムにマッピングされており、検査されたＡＬＳ患者のマイクロバイオームにおけるＡＭの相対的な存在量は健常な対照と類似していたが、独自のＡＭ株のＮＡＭ生合成能力はＡＬＳで異なって損なわれる可能性があることを示唆している。
ＡＬＳ患者の血清の非標的化メタボロミクスプロファイリングにより、リルゾールの上昇（外因的に投与されたＡＬＳの治療）、クレアチンおよび３－ヒドロキシ－２－エチルプロピオネートおよび還元メチルインドール３－アセテートおよびトリエタノールアミンを含む、複数の有意に変化した代謝物が明らかになった（図２９Ｂ）。興味深いことに、トリプトファン－ニコチンアミド代謝経路の重要な分子は、ＡＬＳ患者の血清で有意に変化し、その中には、インドレアアセテート、キヌレニン、セロトニン、循環ニコチンアミドがあり（図７Ｄ～Ｅ）、これらのヒトのＡＬＳの症例の一部で異常なＮＡＭ代謝が示唆された。これらの全身異常がＣＮＳにも反映されるかどうかを調べるために、１２人のＡＬＳ患者のＣＳＦ中のＮＡＭのレベルを１７人の健常な非家家族対照と比較した。ＡＬＳ患者の平均ＮＡＭのＣＳＦレベルは、健常な個人の平均よりも有意に低く、一部の患者は著しく低いＮＡＭのＣＳＦレベルを特徴としていた（図７Ｆ）。
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