BR112012016033B1 - métodos de aumento de produção de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância à deficiência de nitrogênio, eficiência no uso de nitrogênio e/ou redução do tempo de florescimento de uma planta, e, para produzir uma planta transgênica - Google Patents

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Abstract

MÉTODO DE AUMENTO DE PRODUÇÃO, BIOMASSA, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, TEOR DE ÓLEO, PRODUÇÃO DA FIBRA, QUALIDADE DA FIBRA, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO E/OU EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO DE UMA PLANTA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUCTO DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, CÉLULA DE PLANTA E PLANTA, em que são providos polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo no mínimo 80% homólogo à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N°: 799, 488-798, 800-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486- 5550, 5553, e 5558-8091; e polinucleotídeos isolados compreendendo sequências de ácidos nucléicos no mínimo 80% idênticas ao SEQ ID N°: 460, 1-459, 461-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632- 1642, 16454850 or 4851; também são providas construções de ácidos nucléicos compreendendo estas, os polinucleotídeos isolados codificados, células transgênicas e plantas transgênicas compreendendo estas e métodos de utilização para aumento do rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de Óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta; também são providos polinucleotídeos isolados compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos determinada no ID SEQ N°: 8096, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado seja capaz de regular a expressão de no mínimo uma sequência de polinucleotídeos conectada de formada operável.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, construções de ácido nucléico incluindo estes, células transgênicas incluindo estes, plantas transgênicas exogenamente expressando estes e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a métodos de utilizar estes para aumentar o rendimento (ex.: rendimento da semente, rendimento do óleo), a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a tolerância ao estresse abiótico da qualidade da fibra e/ou a eficiência no uso de fertilizante (ex.: eficiência no uso de nitrogênio) de uma planta.
[002] As condições do estresse abiótico (ABS; também referido como "estresse ambiental") tais como salinidade, estiagem, enchente, temperatura subideal e poluição tóxico-química, causam dano substancial às plantas agrícolas. A maior parte das plantas desenvolveu estratégias para se protegerem contra essas condições. Entretanto, se a gravidade e duração dessas condições de estresse forem muito grandes, os efeitos no desenvolvimento, crescimento e produção das plantas de colheita são profundos. Além disso, a maioria das plantas cultivadas são altamente suscetíveis ao estresse abiótico e, assim, requerem condições de cultivo ideias para as produções comerciais. A exposição contínua ao estresse causa grandes alterações no metabolismo da planta, que, por fim, leva à morte celular e, consequentemente, perdas de produção.
[003] A escassez global de abastecimento de água é um dos problemas mais graves da agricultura afetando o crescimento das plantas e o rendimento da safra, por isso são feitos esforços para minimizar os efeitos prejudiciais da desertificação e salinização das terras aráveis do mundo. A escassez de água é um componente comum de muitos estresses de planta e ocorre em células vegetais quando a taxa de transpiração total da planta excede a absorção de água. Além de estiagem, outros estresses, tais como salinidade e baixa temperatura, produzem desidratação celular.
[004] A estiagem é um fenômeno gradual, que envolve períodos de anormais de tempo seco que persistem por tempo suficiente para produzir sérios desequilíbrios hidrológicos como danos à colheita e escassez no fornecimento de água. Em casos graves, a estiagem pode durar muitos anos e resultar em efeitoS devastadores na agricultura e no fornecimento de água. Além disso, a estiagem está associada com o aumento de susceptibilidade a várias doenças.
[005] Para a maior parte das plantas cultivadas, as regiões de terra do mundo são muito áridas. Além disso, o uso exagerado da água disponível resulta em maior perda de terra utilizável para agricultura (desertificação) e o aumento no acúmulo de sal nos solos contribui para a perda de água disponível nos solos.
[006] A salinidade elevada, altos níveis de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Espera-se que essa condição só piore, reduzindo, desse modo, a disponibilidade de terras aráveis e produção da safra, já que nenhuma das cinco principais colheitas de comida, ou seja, trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Efeitos prejudiciais do sal nas plantas resultam tanto de escassez de água, o que leva ao estresse osmótico (similar ao estresse de estiagem), Como do efeito de excesso de -íons de sódio em processos bioquímicos críticos. Bem como congelamento e estiagem, o excesso de sal causa escassez de água; e a presença de excesso de sal dificulta a extração de água de seu ambiente para as raízes das plantas. A salinidade do solo é, portanto, uma das variáveis mais importantes que determinam se uma planta pode florescer. Em muitas partes do mundo, áreas de terra consideráveis não são cultiváveis devido à salinidade naturalmente alta do solo. Assim, a salinização dos solos que são utilizados para produção agrícola é um problema, significativo e crescente em regiões que dependem muito da agricultura, e é piorado pelo exagero na utilização, o exagero na fertilização e pela escassez de água, tipicamente causados por mudanças climáticas e pelas exigências da crescente população. A tolerância ao sal é de particular importância no início do ciclo de vida da planta, já que a evaporação da superfície do solo causa um movimento ascendente da água, e o sal é acumulado na camada superior do solo onde as sementes são colocadas. Por outro lado, a germinação normalmente acontece sob uma concentração de sal maior que o nível medido de sal em todo o perfil do solo.
[007] A germinação de muitas safras é sensível à temperatura. Um gene que aumentaria a germinação em condições quentes seria útil para safras que são plantadas tardiamente na temporada ou em climas quentes. Além disso, mudas e plantas maduras que são expostas a excesso de calor podem sofrer de choque térmico, que. pode aparecer em diversos órgãos, incluindo folhas e, particularmente, frutas, quando a respiração for insuficiente para superar o estresse de calor. O calor também danifica estruturas celulares, incluindo organelas e citoesqueletos, e prejudica as funções da membrana. O choque térmico pode produzir uma diminuição na síntese geral de proteínas, seguida pela expressão de proteínas de choque térmico, por exemplo chaperonas, que estão envolvidas na renaturação proteínas desnaturadas pelo calor.
[008] O estresse de calor normalmente acompanha condições de baixa disponibilidade de água. O próprio calor é visto como um estresse interativo e acrescenta aos eféitos prejudiciais causados por condições de deficiência de água. A evaporação da água aumenta juntamente com o aumento da temperatura durante o dia e pode resultar em altas taxas de transpiração e baixos potenciais de água da planta. Os danos causados ao pólen pela temperatura alta quase sempre ocorrem junto com o estresse de estiagem, e raramente ocorrem sob condições com bastante água. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de diversas maneiras; portanto, entender a interação entre diferentes estresses pode ser importante para o desenvolvimento de estratégias para melhorar a tolerância ao estresse pela manipulação genética.
[009] Condições frias em excesso, ex.: temperaturas baixas, porém acima de zero, afetam safras de origens tropicais, como soja, arroz, milho e algodão. O dano causado pelo frio normalmente inclui murchidão, necrose, clorose ou vazamento de íons em membranas de células. Os mecanismos subjacentes de sensibilidade ao frio ainda não são completamente entendidos, mas provavelmente envolvem o nível de saturação da membrana e outras deficiências fisiológicas. Por exemplo, a fotoinibição da fotossintese (interrupção da fotossintese devido às altas intensidades de luz) normalmente ocorre sob condições atmosféricas claras subsequentes a noites frias de fim de verão/outono. Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e qualidade inferior do produto por meio do amadurecimento atrasado do milho.
[0010] A transdução de sinal de estresse de sal e estiagem consiste em vias de sinalização de homeostase iônica e osmótica. O aspecto iônico do estresse de sal é sinalizado por meio da via SOS onde um complexo de proteínas quinases SOS3-SOS2 responsiva ao cálcio controla a expressão e a atividade de transportadores de íons, como o SOS1. O componente osmótico do estresse de sal envolve reações complexas da planta que se sobrepõem com as respostas de estresse de frio e/ou estiagem.
[0011] Aspectos comuns da resposta ao estresse de estiagem, frio e sal [Revisado em Xiong and Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25: 131-139] incluindo: (a) mudanças temporárias nos níveis de cálcio citoplásmico no início do evento de sinalização; (b) transdução de sinal por meio de proteínas quinases ativadas por mitógeno e/ou dependentes de cálcio (CDPKs) e proteínas fosfatases; (c) aumentos em níveis de ácido abscísico em resposta ao acionamento de um subconjunto de respostas pelo estresse; (d) fosfatos de inositol como moléculas de sinal (no mínimo um subconjunto das mudanças transcripcionais responsivas ao estresse); (e) ativação de fosfolipases, que por sua vez geram uma matriz diversa de moléculas de segundos mensageiros, algumas das quais podem regular a atividade de quinases responsivas ao estresse; (f) indução de genes abundantes na embriogênese tardia (LEA) incluindo os genes COR/RD responsivos a CRT/DRE; (g) níveis aumentados de antioxidantes e osmólitos compatíveis, tais como prolina e açúcares solúveis; e (h) acumulação de espécies de oxigênio reativo, tais como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais de hidroxila. A biossíntese do ácido abscísico é regulada por estresse osmótico em múltiplas etapas. As sinalizações de estresse osmótico tanto dependentes quanto independentes de ABA primeiro modificam de forma constitutiva os fatores de transcrição expressados, levando à expressão de ativadores transcripcionais de resposta precoce, que então ativam os genes descendentes de efeito de tolerância ao estresse.
[0012] Diversos genes que aumentam a tolerância ao estresse de frio ou sal também podem melhorar a proteção contra o estresse de estiagem, estes incluem, por exemplo, o fator de transcrição AtCBF/DREBI, OsCDPK7 (Saijo et al. 2000, Plant J. 23: 319-327) ou AVP1 (uma bomba de próton de pirofosfatase vacuolar, Gaxiola et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).
[0013] O desenvolvimento de plantas tolerantes ao estresse é uma estratégia que tem o potencial de resolver ou mediar pelo menos alguns desses problemas. Entretanto, as estratégias tradicionais de criação de plantas utilizadas para desenvolver novas linhas de plantas que exibem tolerância à ABS são relativamente ineficientes já que são cansativas, consomem tempo e possuem resultados imprevisíveis. Além do mais, recursos limitados de plasma germinal para tolerância ao estresse e incompatibilidade em cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados na criação convencional. Além disso, os processos celulares levando à tolerância de ABS são complexos por natureza e envolvem mecanismos múltiplos de adaptação celular e numerosas vias metabólicas.
[0014] Esforços de engenharia genética, visando conferir tolerância a estresse abiótico a safras transgênicas, foram descritos em diversas publicações [Apse and Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13:14.6-150 2002), Quesada et al. (Plant Physiol. 130:951-963, 2002), Holmstrom et al. (Nature 379: 683-684, 1996), Xu et a1. (Plant Physiol 110: 249- 257, 1996), Piion- Smits and Ebskamp (Plant Physiol 107; 125-130, 1995) and Tarczynski et al. (Science 259: 508510, 1993)].
[0015] Várias patentes e solicitações de patentes divulgam genes e proteínas que podem ser utilizadas para aumentar a tolerância de plantas a estresses abióticos. Estas incluem, por exemplo, as Patentes Americanas números 5.296.462 e 5.356.816 (para aumento de tolerância ao estresse de frio); Patente Americana nc. 6.670.528 (para aumento de ABST); Patente Americana n° 6.720.477 (para aumento de ABST); Solicitação, Americana Ser. n° 10/231035 (para aumento de ABST); W02004/104162 (para aumento de ABST e biomassa); W02007/020638 (para aumento de ABST, biomassa, vigor e/ou rendimento); W02007/049275 (para aumento de ABST, biomassa, vigor e/ou rendimento); W02010/076756 (para aumento de ABST, biomassa e/ou rendimento); W02009/083958 (para aumento de eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, tolerância ao estresse biótico/abiótico, rendimento e/ou biomassa); W02010/020941 (para aumento de eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento e/ou biomassa); W02009/141824 (para aumento de utilidade da planta); W02010/049897 (para aumento de rendimento da planta).
[0016] Os nutrientes (macro e micronutrientes) otimizados afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Um dos macronutrientes essenciais para a planta é o Nitrogênio. O nitrogênio é responsável pela biossíntese de aminoácidos e ácidos nucleicos, grupos prostéticos, hormônios de plantas, defesas químicas das plantas, e similares. O nitrogênio é geralmente um elemento de limitação da velocidade de crescimento da planta e todos os cultivos em campo têm uma dependência fundamental de fertilizantes nitrogenosos inorgânicos. Uma vez que o fertilizante é rapidamente retirado da maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido aos cultivos em crescimento duas ou três vezes durante a estação de crescimento. Outros macronutrientes importantes são o fósforo (P) e o potássio (K), que têm uma correlação direta com o rendimento e a tolerância geral da planta.
[0017] Óleos vegetais ou de sementes são a principal fonte de energia e nutrição na dieta humana e animal. São também utilizados na produção industrial, por exemplo, tintas e lubrificantes. Além disso, os óleos à base de plantas representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fósseis atualmente utilizados são recursos finitos e estão sendo gradualmente exauridos, cultivos de biomassa de rápido crescimento podem ser utilizados como combustíveis alternativos ou para estoques de energia para processos industriais e podem reduzir a dependência dos fornecimentos de energia fóssil. Entretanto, o principal problema para o aumento de consumo de óleos de planta como biocombustíveis é o preço do óleo, que ainda é maior que o combustível fóssil. Além disso, a taxa de produção de óleos à base de plantas é limitada pela disponibilidade de solo agrícola e água.
[0018] Assim, o aumento dos rendimentos de óleos à base de plantas a partir da mesma área de cultivo pode superar eficientemente a escassez de espaço para produção e pode, ao mesmo tempo, aumentar os preços do óleo vegetal.
[0019] Estudos visando o aumento dos rendimentos de óleos à base de plantas dão ênfase à identificação de genes envolvidos no metabolismo do óleo, bem como nos genes capazes de aumentar os rendimentos da planta e da semente em plantas transgênicas. Os genes conhecidos por estarem envolvidos no aumento dos rendimentos de óleos à base de plantas incluem aqueles que participam na síntese ou no captura de ácido graxa, por exemplo, a desaturase [ou seja, DELTA6, DELTA12 ou acil-ACP (Ssi2; Fonte de Informação Arabidopsis (TAIR; Hypertext Transfer Protocolo://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/), TAIR No. AT2G43710)1, OleosinA (TAIR No. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR No. AT2G29980), e vários fatores e ativadores de transcrição, tais como Lecl [TAIR No. AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26;93(7): 1195-205], Lec2 [TAIR No. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21):4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABB [TAIR No. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] e Wril [TAIR No. AT3G54320, Cernac and Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575-85], Esforços de engenharia genética visando aumentar o teor de óleo em plantas (por exemplo, em sementes) incluem regulações ascendentes de retículos endoplasmáticos (FAD3) e ácidos graxos insaturados plastidiais (FAD7) em batata (Zabrouskov V., et al., 2002; Physiol Plant. 116:172-185); super-expressão dos fatores de transcrição GmDof4 e GmDofll (Wang HW et al., 2007; Plant J. 52:716-29); super- expressão de uma levedura de desidrogenase glicerol-3-fosfato sob o controle de um promotor específico de sementes (Vigeolas H, et al. 2007, Plant Biotechnol J. 5:431-41; Solicitação de Patente Americana n° 20060168684); utilizando os genes da Arabidopsis FAE1 e da levedura SLC1-1 para melhoras no ácido erécico e no teor de óleo em semente de colza (Katavic V, et al., 2000, Biochem Soc Trans. 28:935-7).
[0020] Várias patentes e solicitações de patentes divulgam genes e proteínas que podem aumentar o teor de óleo em plantas. Estas incluem, por exemplo, a Solicitação de Patente Americana n° 20080076179 (proteína de metabolismo de lipídio); Solicitação de Patente Americana n° 20060206961 (polipeptídeo Ypr140w); Solicitação de Patente Americana n° 20060174373 [proteína de melhora da síntese de triacilglicerois (TEP)]; Solicitação de Patente Americana números 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 2.0060195943 (divulgação de plantas transgênicas como melhor eficiência no uso de nitrogênio, que pode ser utilizado para a conversão em combustível ou matérias-primas químicas); W02008/122980 (polinucleotídeos para aumento no teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor de uma planta.
[0021] Algodão e subprodutos de algodão fornecem máterias-primas que são utilizadas para produzir uma rica variedade de produtos com base no consumidor, além de têxteis incluindo produtos alimentícios de algodão, alimentação do gado, fertilizantes e papel. A produção, comercialização, consumo e venda de produtos com base em algodão gera um excesso de $100 bilhões anualmente. somente nos EUA, tornando o algodão a colheita número um em valor acrescentado.
[0022] Embora 90% do valor do algodão como colheita viva na fibra (filaça), o rendimento e a qualidade da fibra diminuíram devido à erosão geral em diversidade genética de variedades de algodão, e uma vulnerabilidade aumentada da colheita a condições ambientais.
[0023] Há diversas variedades de planta de algodão, das quais fibras de algodão com uma variedade de características poderá ser obtidas e utilizadas para diversas aplicações. Fibras de algodão podem ser caracterizadas de acordo com uma variedade de propriedades, algumas das quais são consideradas altamente desejadas dentro da indústria têxtil para produção de produtos de alta qualidade crescente e exploração otimizada de tecnologias de fiação de modero. Propriedades desejadas comercialmente incluem comprimento, uniformidade do comprimento, finura, razão de maturidade, produção de fibra de algodão diminuída, micronaire, força do feixe e força da fibra única. Muitos esforços foram aplicados na melhora das características de fibras de algodão, com foco principalmente no comprimento da fibra e finura da fibra. Particularmente, há uma grande demanda de fibras de algodãO de comprimentos específicos.
[0024] Uma fibra de algodão é composta de uma célula única que é diferenciada de uma célula epidérmica do revestimento da semente, com desenvolvimento em quatro estágios, a saber, iniciação, alongamento, espessura da parede celular secundária e maturação. Mais especificamente, o alongamento de uma fibra de algodão começa na célula epidérmica do óvulo imediatamente após o florescimento, após o qual a fibra de algodão rapidamente alonga-se por aproximadamente 21 dias. O alongamento da fibra então é finalizado e uma parede celular secundária é formada e cresce ao longo da maturação para tornar-se uma fibra de algodão madura.
[0025] Diversos genes candidatos que estão associados com o alongamento, formação, qualidade e rendimento de fibras de algodão foram divulgados em diversas solicitações de patente, tais como a Patente Americana N° 5.880.100 e as solicitações de Patente Americanas N° de Ser. 08/580.545, 08/867.484 e 09/262.653 (descrevendo genes envolvidos no estágio de alongamento da fibra de algodão); W00245485 (melhorando a qualidade da fibra modulando a síntese da sacarose); Patente Americana N° 6.472.588 e W00117333 (aumentando a qualidade da fibra por transformação com um DNA codificando a síntese de fosfato de sacarose); W09508914 (utilizando um promotor específico de fibras e uma sequência de codificação codificando a peroxidase de algodão); W09626639 (utilizando uma sequência do promotor especifica de ovário para expressar o crescimento da planta modificando hormônios em tecido de óvulo de algodão, para alteração das características de qualidade de fibra, tais como dimensão e força da fibra); Patente Americana N° 5.981.834, Patente Americana N° 5.597.718, Patente Americana N° 5.620.882, Patente Americana N° 5.521.708 e Patente Americana N° 5.495.070 (sequências de codificação para alteração das características de fibra de plantas produtoras de fibras transgênicas); Patente Americana N° U.S. 2002049999 e U.S. 2003074697 (expressando uma codificação de gene para endoxiloglucan transferase, catalase ou peroxidase para melhora nas características da fibra de algodão); WO 01/40250 (melhora na qualidade da fibra de algodão pela modulação da expressão do gene do fator de transcrição); WO 96/40924 (uma região regulatória transcricional da fibra de algodão associada que é expressa em fibra de algodão); EP0834566 (um gene que controle o mecanismo de formação de fibras na planta de algodão); W02005/121364 (melhora na qualidade da fibra de algodão pela planta de algodão do gene modulados); W02008/075364 (melhora na qualidade da fibra, rendimento/biomassa/vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de plantas).
[0026] Um promotor é uma sequência de ácido nucleico com aproximadamente 200-1500 pares de base de comprimento e normalmente fica localizado a montante das sequências de codificação. Um promotor funciona na direção da transcrição de uma sequência de codificação adjacente e, portanto, age como um interruptor para a expressão gênica em um organismo. Portanto, todos os processos celulares são basicamente governados pela atividade dos promotores, tornando tais elementos regulatórios importantes ferramentas comerciais e de pesquisa.
[0027] Os promotores são normalmente utilizados para expressão gênica heteróloga em sistemas de expressões comerciais, terapia de genes e uma variedade de aplicações para pesquisas.
[0028] A escolha da sequência do promotor determina quando, onde e com qual força o gehe heterólogo de escolha é expresso. Desse modo, quando uma expressão constitutiva ao longo de um organismo é desejada, um promotor constitutivo é utilizado de preferência. Por outro lado, quando a expressão gênica engatilhada é desejada, um promotor indutivo é preferido. De modo similar, quando uma expressão tiver que ser confinada em um tecido em particular, ou em um estágio fisiológico ou de desenvolvimento particular, um promotor específico de tecido ou um promotor específico de estágio é respectivamente preferido.
[0029] Os promotores constitutivos são ativos por meio do ciclo da célula e têm sido utilizados para expressar genes heterólogos em plantas transgênicas de modo a permitir a expressão de características codificadas pelos genes heterólogos ao longo da planta em todos os momentos. Exemplos de promotores constitutivos conhecidos normalmente utilizados para transformação de planta incluem o promotor da proteína de choque de calor do couve-flor (hsp80), o promotor do vírus de mosaico da couve-flor, o promotor da nopalina síntase (nos), octopina (ocs), o promotor de Agrobacterium e o promotor de Agrobacterium da síntase manopina (mas).
[0030] Os promotores induzíveis podem ser ligados por um agente indutor e ficam tipicamente ativos enquanto eles ficam expostos ao agente indutor. O agente indutor pode ser um agente químico, tal como um metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico diretamente imposto sob a planta, tais como frio, calor, sal, toxinas, ou por meio da ação de um patógeno microbiano ou uma peste. Desse modo, os promotores indutíveis podem ser utilizados para regular a expressão de características desejadas, tais como genes que controlam peste de insetos ou patógenos microbianos, considerando que a proteína somente é produzida pouco tempo após a infecção ou primeiras mordidas do inseto de forma transitória a fim de diminuir a pressão seletiva para insetos resistentes. Por exemplo, plantas podem ser transformadas para expressar características inseticidas ou fungicidas, tais como as toxinas Bacillus thuringiensis (Bt), proteínas de revestimento de vírus, glucanases, chitinases ou fitoalexinas. Em outro exemplo, as plantas podem ser transformadas para tolerar herbicidas por super-expressão, sob exposição a um herbicida, a enzima do ácido acetohidroxi síntase, que neutraliza múltiplos tipos de herbicidas [Hattori, J. et a/., Mol. General. Genet. 246: 419 (1995)].
[0031] Diversos promotores específicos de frutas foram descritos, incluindo um promotor Thi isolado de maçã (Patente Americana N° 6,392,122); um promotor isolado de morango (Patente Americana N° 6,080,914); promotores E4 e E8 isolados de tomate (Patente Americana N° 5,859,330); um promotor de poligalacturonase (Patente Americana N° 4,943,674); e o promotor de gene de tomate 2A11 [Van H.aaren et al., Plant Mol. Biol. 21: 625-640 (1993)]. Tais promotores específicos de frutas podem ser utilizados, por exemplo, para modificar o amadurecimento da fruta pela regulação da expressão de ACC deaminase que inibe a biossíntese do etileno. Outros produtos de gene que podem ser desejados para expressão em tecidos de frUtas incluem os genes codificando características de sabor ou cor, tais como a síntase de fosfato de sacarose, ciclase ou taumatina.
[0032] Promotores específicos de semente foram descritos nas Patentes Americanas números 6,403,862, 5,608,152 e 5,504,200; e na Solicitação de Patente Americana N° Ser. 09/998059 e 10/137964. Tais promotores específicos de semente podem ser utilizados, por exemplo, para alterar os níveis de ácidos graxos saturados ou insaturados; para aumentar os níveis de lisina - ou enxofre - contendo aminoácidos, ou para modificar a quantidade de amido contido nas sementes.
[0033] Diversos promotores que regulam a expressão gênica especificamente durante o estágio de germinação foram descritos, incluindo os promotores quase isolados de cistatina-1 e a-glucuronidase (Patente Americana N° 6,359,196), e o promotor de hidrolase [Skriver etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7266-7270 (1991)].
[0034] W02004/081173 divulga novas sequências regulatórias derivadas de plantas e construções e métodos de utilização destas para direcionar a expressão de sequências de polinucleotídeos exógenos em plantas.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0035] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de.uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotidio exógeno compreendendo uma seqüência codificando um polipeptídio pelo menos 80% idêntico o SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 546-5550, 5553, 5558-8090 ou 8091, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0036] De acordo com um aspecto de algumas funções da presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídio selecionado do grupo consistindo do SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454- 5459, 5462-5469, 54715475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 55545557, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0037] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção é fornecido um método para aumentar o teor de. óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta Um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico ao SEQ ID N°: 5470, 5476, ou 5481, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra da planta.
[0038] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica ao SEQ ID NO: 1487, 814-1598, 1600- 1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4850 ou 4851, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0039] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo do SEQ ID NO: 1-487, 814- 1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0040] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção é fornecido um método para aumentar o teor de óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico compreendendo um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico ao SEQ ID N°: 1627, 1629, ou 1631, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra da planta.
[0041] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de. ácido nucleico codificando um polipeptídio que compreende a sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácido descrita nos SEQ ID N°s: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8090 ou 8091, caracterizado pelo fato de que tal sequência de. ácido seja capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0042] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID N°s: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 55588091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 55545557.
[0043] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 80% idêntica ao SEQ ID NO: 1-487, 8141598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645- 4850 ou 4851, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido seja capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiático e/ou a eficiência. no uso de nitrogênio da planta.
[0044] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID Nas: 1487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632- 1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[0045] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[0046] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80% homóloga ao SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8090 ou 8091, caracterizado pelo fato de que tal sequência de ácido seja capaz de aumentar o rendimento, a biomaSsa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0047] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID N°s: 488813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5558-8091, 5454-5459, 54625469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551,5552, e 5554-5557.
[0048] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa exogenamente o polinucleotídeo da invenção, ou a construção de ácido nucleico da invenção.
[0049] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa exogenamente o polipeptídeo da invenção.
[0050] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgênica que expressa exogenamente o polipeptídeo de algumas aplicações da invenção.
[0051] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgênica compreendendo a construção do ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.
[0052] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido descrita pelo SEQ ID NO: 8096.
[0053] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção.
[0054] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma célula transgênica compreendendo a construção do ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.
[0055] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma planta transgênica compreendendo a construção do ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.
[0056] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de produção de planta transgênica, compreendendo a transformação de uma planta com o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção ou com a construção de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção.
[0057] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de expressar um polipeptideo de interesse em urna célula compreendendo a transformação da célula com uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse conectado de forma operável ao polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção, expressando, desse modo, o polipeptídeo de interesse na célula.
[0058] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID N°s: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 54625469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 5554-5557.
[0059] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID N°s:-1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605- 1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e1644.
[0060] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotideo consiste na sequência de ácido nucleicoselecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 16051626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[0061] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 54625469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 5554-5557.
[0062] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula de planta faz parte de uma planta.
[0063] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotideo isolado e/ou à célula hospedeira.
[0064] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotideo exógeno sob o estresse abiótico.
[0065] De acordo com algumas aplicações da invenção, o estresse abiótico é selecionado dentre um grupo que consiste em salinidade, seca, privação de água, inundação, estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e Irradiação UV.
[0066] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rendimento compreende rendimento de sementes ou rendimento de óleo.
[0067] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é determinado pelo ID SEQ NO: 8096.
[0068] De acordo com algumas aplicações da invenção, a construção do ácido nucleico, compreendendo ainda pelo menos um polinucleotideo heterólogo operável ligado ao polinucleotideo isolado.
[0069] De acordo com algumas aplicações da invenção, o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo é um gene repórter.
[0070] De acordo com algumas aplicações da invenção, a construção do ácido nucleico, compreendendo ainda um polinucleotídeo heterólogo ligado de forma operável ao polinucleotídeo isolado.
[0071] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo consiste na sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID N's: 1-487, 814-1598, 16001603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[0072] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula transgênica de algumas aplicações da invenção, sendo uma célula de planta.
[0073] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°s: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 54715475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485; 5551, 5552, e 5554-5557.
[0074] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo codificando o polipeptideo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°s: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645- 4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[0075] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e/ou científicos usados no presente têm o mesmo significado àquele comumente entendido pelo perito na especialidade na qual esta invenção pertence. Embora as métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou para testar a invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflitos, a especificação da patente, inclusive as definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não servem necessariamente para serem limitantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0076] Algumas realizações da invenção estão descritas no presente, apenas como exemplo, com referência aos desenhos que o acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhe, vale notar que as particularidades mostradas servem como exemplo e para fins de discussão ilustrativa de realizações da invenção. A esse respeito, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente aos peritos na especialidade como as aplicações da invenção podem ser praticadas.
[0077] Nos desenhos: a figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídio binário modificado pGI contendo o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096) e o GUSintron (pQYN_6669) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do -DNA; MCS - Local múltiplo de clonagem; RE - qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor síntase nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador síntase nopalina; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); Gusintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron). As sequências de polinucleotídeos isolados da invenção foram clonadas no vetor durante a substituição do gene repórter GUSintron.
[0078] a figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmidio binário modificado pGI contendo o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do - DNA; MCS - Local múltiplo de clonagem; RE qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor sintase nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter terminador sintase nopalina; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); Gusintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e intron). As sequências de polinucleotideos isolados da invenção foram clonadas no MCS do vetor.
[0079] as figuras 3A-F são imagens ilustrando a visualização do desenvolvimento raiz de plantas transgênicas expressando exogenamente o polinucleotídeo de algumas aplicações da invenção quando cultivados em placas de agar transparentes sob condições normais (FIGs. 3A-B), de estresse asmático (15% PEG, FIGs. 3C-D) ou de limite de nitrogênio (FIGs. 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de agar transparentes por 17 dias (7 dias no viveiro e 10 dias após o transplante). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias, começando no dia 1 após o transplante. Figura 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tirada após 10 dias do transplante em placas de agar, quando cultivadas sob condições normais (padrão). Figura 3B - Uma imagem da análise da raiz de plantas mostrada na Figura 3A, na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3C Uma imagem de uma fotografia de plantas tirada após 10 dias do transplante em placas de agar, quando cultivadas sob altas condições osmóticas (PEG 15%). Figura 3D - Uma imagem da análise da raiz de plantas mostrada na Figura 3C, na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Figura 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tirada após 10 dias do transplante em placas de agar, cultivadas sob baixas condições de nitrogênio. Figura 3F - Uma imagem da análise da raiz de plantas mostrada na Figura 3E, na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.
[0080] a figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário modificado pGI contendo o Promotor Raiz (pQNa_RP) utilizado para expressar As sequências de polinucleotídeos isolados da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do - DNA; NOS pro = promotor síntase nopalina; NPT-II - gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = nopaline synthase terminator; Poly-A signal (polyadenylation signal); As sequências de polinucleotídeos isolados, de acordo com algumas aplicações da invenção, foram clonadas no MCS do vetor.
[0081] a figura 5 ilustra o alinhamento da sequência entre a nova sequência do promotor (SQE ID NO: 8096) identificada no presente da Arabidopsis thaliana e o promotor de Arabidopsis At6669 divulgado anteriormente (W02004/081173; descrita pelo SEQ ID NO: 8093 no presente). Os nucleotídeos não correspondidos são sublinhados nas posições 270; 484; 867-868; 967; 2295 e 2316-2318 do SEQ ID NO: 8096. Novos domínios são marcados com uma caixa vazia nas posições 862-865; 23922395 e 2314-2317 do SEQ ID NO: 80.96. Note que o elemento regulatório YACT na posição 862-865 e o elemento regulatório AAAG nas posições 2392-2395 e 2314-2317 da nova sequência do promotor (SEQ ID NO: 8096) estão em falta no promotor At6669 (SEQ ID NO: 8093) previamente divulgado.
[0082] a figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmideo pQYN.
[0083] a figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmideo pQFN.
[0084] a figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmideó pQFYN.
[0085] as figuras 9A-D são imagens que ilustram a coloração GUS com mudas A. thaliana com 11 dias de vida, as quais foram transformadas com o cassete de expressão íntron GUS sob o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096). Observe que a nova sequência do promotor p6669 induz a expressão GUS (coloração azul) em muda A. thaliana com 11 dias de vida, especialmente em raízes, cotilédones e folhas. A expressão GUS é demonstrada para quatro eventos independentes (eventos números 12516, 12515, 12512, 12511).
[0086] as figuras 10A-D são imagens que ilustram a coloração GUS com mudas A. thaliana com 20 dias de vida, as quais foram transformadas com o cassete de expressão intron GUS sob o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096). Observe que a nova sequência do promotor p6669 induz a expressão GUS (coloração azul) em muda A. thaliana com 20 dias de vida, especialmente em raizes, principalmente na ponta da raiz e nas faltas. A expressão GUS é demonstrada para quarto eventos independentes (eventos números 12516, 12515, 12512, 12511).
[0087] as figuras 11A-L são imagens que ilustram a coloração GUS com mudas A. thaliana com 41 dias de vida, as quais foram transformadas com o cassete de expressão intron GUS sob o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096). Observe que a nova sequência do promotor p6669 induz a expressão GUS (coloração azul) em muda A. thaliana com 41 dias de vida, especialmente no caule, principalmente na ponta da raiz e nas folhas. Foi detectada uma forte expressão na flor, folhas e folhas de caule. A expressão GUS é demonstrada para quatro eventos independentes: Figuras 11A-C - evento 12511; Figuras 11D-F - evento 12516; Figuras 11G-I - evento 12515; Figuras 11J-L - evento 12512.
[0088] a figura 12 é uma ilustração esquemática do plásmídeo binário modificado pGI utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do -DNA; NOS pro = promotor síntase nopalina; NPT-II = gene neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador sintase nopalina; RE = qualquer enzima de restrição; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilaçào); 35S - o promotor 35S (SEQ ID NO: 809.4). As sequências de polinucleotideOs isolados de algumas aplicações da invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.
DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0089] A presente invenção, em algumas de suas aplicações, está relacionada a polinucleotideos e polipeptideos isolados, construções de ácido nucléico codificando estes, células expressando estes, plantas transgênicas expressando estes e métodos para utilizar estes pata aumentar o rendiMento, biomassa, vigor, taxa de crescimento, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0090] Antes de explicar ao menos uma realização da invenção em detalhes, vale compreender que a invenção não se limita necessariamente em sua aplicação aos detalhes apresentados na descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticada ou executada de várias maneiras.
[0091] Os presentes inventores identificaram novos polinucleotideos e polipeptideos que podem ser utilizados para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência do uso de fertilizante (ex.: eficiência do uso de nitrogênio) de uma planta, e uma nova sequência ~latória que pode ser utilizada para expressar genes heterólogos em células hospedeiras, tal como em plantas.
[0092] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar polinucleotídeos que aumentam o rendimento (por exemplo, o rendimento de semente, o rendimento de óleo e o teor de óleo), a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência na utilização de nitrogênio de uma planta. Os genes que afetam as características de interesse foram identificados (Tabela 27, Exemplo 10) com base nas análises de correlação realizadas utilizando os ecotipos de Arabidopsis (Exemplos 2 e 3), variedades de tomate (Exemplo 4), ecotipos de b. Juncea (Exemplos 5 e 6), variedades de Sorgo, híbridos do milho (Exemplo 8) e os perfis de expressão dos genes de acordo com as aplicações de expressão selecionadas (ex.: tecidos, estágios de desenvolvimento e condições de estresse) (Tabelas 1-26, Exemplos 1-9). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 28, Exemplo 11). Os polinucleotídeos identificados foram clonados em vetores binários (Exemplo 12, Tabela 29) e plantas transgênicas super-expressando os polinucleotídeos e polipeptídeos identificados foram geradas (Exemplo 13) e testadas quanto ao efeito do gene exógeno na característica de interesse (ex.: maior peso fresco e seco, área da folha, cobertura e comprimento da folha, taxa de. crescimento relativo (TCR) da área da folha, TCR da cobertura da folha, TCR do comprimento da folha, rendimento da semente, rendimento do óleo, matéria seca, índice de colheita, taxa de crescimento, área da roseta, diâmetro da roseta, TCR do número de folha, TCR da cobertura do canteiro, TCR do diâmetro da roseta, área da lâmina da folha, porcentagem de óleo em semente e peso de 1000 sementes, cobertura do canteiro, tolerância a condições de estresse abiótico e a condições limitantes de fertilizantes; Exemplos 14-16; Tabelas 30-48). Além disso, conforme adiante mostrado na seção de Exemplos que segue, os presentes inventores divulgaram uma nova sequência do promotor que pode ser utilizada para expressar o gene de interesse em uma célula hospedeira (Exemplo 17, Figuras 5, 8-11). Num todo, esses resultados sugerem a utilização dos novos polinucleotideos e polipeptídeos da invenção para aumentar a o rendimento (inclusive o rendimento de óleo, o rendimento de sementes e o teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[0093] Portanto, de acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica ao SEQ ID NO: 1487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4850 ou 4851, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[0094] Conforme aqui utilizada, a frase "rendimento da planta" refere- se à quantidade (conforme determinada por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por estação de cultivo. Portanto, o maior rendimento poderia afetar o benefício econômico que se pode obter a partir da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.
[0095] Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser afetado por vários parâmetros incluindo, entre outros, a biomassa da planta; o vigor da planta; a taxa de crescimento; o rendimento de semente; a quantidade de sementes ou grãos; a qualidade de sementes ou grãos; o rendimento de óleo; o teor de óleo, amido e/ou proteína nos órgãos colhidos (por exemplo, sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (botões) por panícula (expressa como a proporção entre o número de sementes preenchidas e o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de cultivo (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e divisão de carbono (a distribuição/alocação de carbono em uma planta); resistência à sombra; número de órgãos colhíveis (por exemplo, sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [por exemplo, aumento do diâmetro, espessura ou melhora das propriedades físicas do talo (por exemplo, elasticidade)].
[0096] Conforme utilizada no presente documento, a frase "rendimento de sementes" refere-se ao número ou peso de sementes por planta, sementes por vagem, ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, o rendimento de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (por exemplo, comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), número de sementes (preenchidas) e taxa de preenchimento de semente e por teor de óleo da semente. Portanto, o aumento do rendimento de semente por planta poderia afetar o beneficio econômico que se pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento do rendimento de semente por área de cultivo pode ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas cultivadas na mesma determinada área.
[0097] O termo "semente" (também denominada "grão" ou "cerne"), conforme aqui utilizado, refere-se a uma pequena planta embrionária protegida por uma cobertura denominada revestimento de semente (geralmente com algum alimento estocado), o produto do óvulo maduro de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta-mãe.
[0098] A frase "teor de óleo" conforme utilizada no presente documento refere-se à quantia de lipídios em um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a parte vegetativa da planta (teor de óleo vegetativo) e é normalmente expressa como a porcentagem de peso seco (10% da umidade das sementes) ou peso liquido (para a parte vegetativa).
[0099] Deve ser observado que o teor de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca de um tecido (por exemplo, semente, parte vegetativa), bem como a massa ou o tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de crescimento.
[00100] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser realizado aumentando-se o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta que compreende óleo por período de crescimento. Assim, o maior teor de óleo de uma planta pode ser obtido aumentado-se o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.
[00101] Conforme aqui utilizada, a frase "biomassa da planta" refere-se à quantidade (ex.: medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em uma estação de cultivo, que poderia também determinar ou afetar o rendimento da planta ou, o rendimento por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes desta, por exemplo, partes acima do solo (colhíveis), bioMassa vegetativa, raízes e sementes.
[00102] Conforme aqui utilizada, a frase "taxa de crescimento" refere- se ao al=to do tamanho do órgão/tecido da planta no decorrer do tempo (pode ser medida em cm por dia).
[00103] Conforme aqui utilizada, a frase "vigor da planta" refere-se à quantidade (medida por peso) de tecido produzido pela planta em um determinado tempo. Portanto, o aumento do vigor poderia determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por época de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor precoce (semente e/ou muda) resulta na melhora da estrutura do campo. Deve ser observado que o rendimento da planta pode ser determinado sob estresse (por exemplo, estresse abiótico, condições de limitação de nitrogênio) ou condições sem estresse (normais).
[00104] A melhora do vigor precoce é um objetivo importante de programas modernos de criação de arroz tanto em cultivares temperados ou tropicais. Raízes longas são importantes para a ancoragem apropriada do solo em atroz de semente com água. Quando o arroz for plantado em campos alagados, e quando as plantas tiverem que emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com vigor. Quando for utilizada uma semeadeira, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para boa emergência de mudas. A capacidade de realizar a engenharia de forma precoce em plantas seria muito importante na agricultura. Por exemplo, baixo vigor precoce tem sido uma limitação à introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) com base no plasma germinativo Corn Belt [Cinturão do Milho] no Atlântico Europeu.
[00105] Conforme aqui utilizada, a frase "condições sem estresse" refere-se às condições de crescimento (por exemplo, água, temperatura, ciclos de luz-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente, por exemplo, nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não vão significantemente além das condições climáticas do dia-a-dia e outras condições abiótica que as plantas podem encontrar, e que permitem o crescimento ideal, o metabolismo, a reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida (por exemplo, em uma planta de cultivo desde a semente até a planta matura e de volta à semente). As pessoas com experiência na técnica têm Ciência das condições normais de solo e das condições climáticas para certa planta em certa localização geográfica. Deve ser observado que embora as condições sem estresse possam incluir algumas pequenas variações em relação às condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), essas variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.
[00106] A frase "estresse abiótico", conforme aqui utilizada, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Assim, o estresse abiótico pode ser induzido por condições crescimento ambiental subideais, por exemplo, salinidade, privação de água, cheias, geadas, baixa ou alta temperatuta, toxicidade a metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou radiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Antecedentes.
[00107] A frase "tolerância de estresse abiótico", conforme usada no presente, refere-se à capacidade de uma planta de suportar o estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.
[00108] As plantas são sujeitas a uma variedade de desafios ambientais. Muitas destas, incluindo estresse de sal, estresse osmótico geral, estresse de estiagem e estresse de congelamento, possuem a capacidade de impactar toda a disponibilidade de água celular e da planta. Não é surpresa, portanto, que as respostas da planta a essa coleção de estresses são relacionadas. Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273 et al. observa que "a maioria dos estudos sobre a sinalização de estresse de água tiveram como foco primário o estresse de sal, pois as respostas da planta ao sal e à estiagem são relacionadas de forma próxima e os mecanismos se sobrepoem". Muitos exemplos de respostas e vias similares a essa configuração de estresses foram documentados. Por exemplo, os fatores de transcrição CBF foram analisados como sendo resistentes às condições de sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta tanto ao estresse de sal como ao estresse de desidratação, um processo que é mediado amplamente por meio de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada dos fatores de transcrição que São vinculados a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Na Mesembryanthemum crystallinum (folha-de-gelo), Patharker e Cushman demonstraram que uma quinase de proteína dependente de cálcio (McCDPKI) é induzida por exposição a estresses de sal e estiagem (Patharker and Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A quinase induzida por estresse também foi mostrada para fosforilar um fator de transcrição, presumidamente alterando a sua atividade, embora os níveis de transcrição do fator alvo de transcrição não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. De modo similar, Saijo et. al demonstrou que uma quinase de proteína dependente de calmodulina induzido por estiagem / sal de arroz (OsCDPK7) conferiu maior tolerância a sal e estiagem ao arroz quando super-expressada (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 319-327).
[00109] A exposição à desidratação invoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, bem como o estresse de congelamento (vide, por exemplo, Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz a tolerância ao congelamento (vide, por exemplo, Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250255^ and Glár et al. (1992) Planta 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimação fria, as estratégias que permitem que as plantas sobrevivam sob baixas condições de água incluem, por exemplo, área reduzida de superfície, ou produção de óleo ou cera na superfície. Em outro exemplo, o maior conteúdo de soluto da planta previne a evaporação e perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osmótico e os similares, fornecendo, portanto, melhor tolerância à planta para os estresses acima.
[00110] Estima-se que algumas vias envolvidas na resistência a um estresse (conforme descrito acima) também estarão envolvidas na resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou por homólogoS. De fato, as vias gerais de resistência são relacionadas, não idênticas e, portanto, todos os genes controlando a resistência a um estresse controlarão e resistência a outros estresses. Todavia, caso um gene seja resistente às condições de um desses estresses, seria aparente a uma pessoa com conhecimento na técnica testar quanto à resistência a esses estresses relacionados. Métodos de avaliação de resistência ao estresse são fornecidos na seção de Exemplos que segue.
[00111] Conforme utilizada no presente, a frase "eficiência do uso de água (WUE - Water Use Efficiency)" refere-se ao nível de matéria orgânica por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco da planta em relação ao uso de água da planta, por exemplo, a biomassa produzida por transpiração de unidade.
[00112] Conforme utilizada no presente documento, a frase "eficiência de uso de fertilizantes" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que levam a um aumento do rendimento, biomassa, vigor, e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada na planta. O processo metabólico pode ser a captação, dispersão, absorção, acúmulo, relocação (na planta) e uso um ou mais das metades orgânicas ou minerais absorvidas pela planta, como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.
[00113] Conforme utilizada no presente documento, a frase "condições limitadas por fertilizantes" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.
[00114] Conforme utilizada no presente documento, a frase "eficiência de uso do nitrogênio (NUE - Nitrogen Use Efficiency)" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que levam a um aumento no rendimento, biomassa, vigor, e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada na planta. O processo metabólico pode ser a captação, dispersão, absorção, acúmulo, relocação (na planta) e uso de nitrogênio absorvido pela planta.
[00115] Conforme utilizada no presente documento, a frase "condições limitadas pelo nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (ex., concentração) de nitrogênio (ex., amônia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.
[00116] O NUE e o FUE melhorados da planta são traduzidos no campo seja por colheita de quantidades similares de rendimento, enquanto implementa-se menos fertilizantes, ou rendimentos melhorados adquiridos pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Dessa forma, o NUE e o FUE melhorados possuem um efeito direto no rendimento da planta no campo. Dessa forma, os polinucleotídeos e os polipeptídeos de algumas funções da invenção afetam positivamente o rendimento da planta e da semente e a biomassa da planta. Além disso, o benefício do NUE da melhora da planta certamente melhorará a qualidade da colheita e constituintes bioquímicos da semente, tais como o rendimento de proteína e o rendimento de óleo.
[00117] Deve ser observado que o ABST melhorado proporcionará às plantas um vigor melhorado também sob condições de não-estresse, resultando em colheitas com melhores biomassas e/ou rendimento, por exemplo, fibras alongadas para a indústria de algodão, maior teor de óleo.
[00118] O termo "fibra" é utilizado inclusive para as células condutoras com paredes grossas, tais como vasos e traqueídes e para conjuntos fibrilares de diversas células individuais de fibra. Assim, o termo "fibra" refere-se a (a) células de paredes grossas condutoras e não-condutoras do xílem; (b) fibras de origem interno ao xílem, incluindo aquelas do floema, do súber, do tecido da planta e da epiderme; e (c) fibras de hastes, folhas, raízes, sementes e flores de inflorescência (tais como aquelas de Sorgo vulgare utilizadas na fabricação de vassouras e escovas.
[00119] Exemplos de plantas produtoras de fibras incluem, mas não se limitam a, colheitas de agricultura como algodão, árvores de Bombax (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosote, winterfat, balsa, kenaf, roseta, juta, sisal abacá, linhaça, milho, cana de açúcar, cânhamo, rami, mafumeira, cairo, bambu, Tillandsia usneoides e agave spp. (ex.: sisal).
[00120] Conforme utilizada aqui, a frase "qualidade da fibra" refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que seja desejado agriculturalmente, ou necessário na indústria de fibra (descrito mais abaixo). Exemplos de tais parâmetros incluem, mas não se limitam a, comprimento da fibra, força da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento de unidade, razão e maturidade da fibra (descritos mais abaixo).
[00121] A qualidade da fibra de algodão (filaça) é normalmente medida de acordo com o comprimento, força e qualidade da fibra. Dessa forma, a qualidade da fibra é considerada maior quando a fibra é mais longa, mais forte e com mais qualidade.
[00122] Conforme aqui utilizada, a frase "rendimento da fibra" refere- se ao volume ou quantidade de fibras produzidas a partir da planta produtora de fibras.
[00123] Conforme aqui utilizado, o termo "aumento" refere-se ao aumento de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, no rendimento, rendimento da semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta em comparação a uma planta nativa [ou seja, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, por exemplo, uma planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento).
[00124] A frase "expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno", conforme utilizada aqui, refere-se a regular o nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta introduzindo o polinucleotídeo exógeno dentro de uma célula de planta ou planta e expressando por meio recombinantes, conforme descrito mais abaixo.
[00125] Conforme utilizada aqui, a expressão "expressando" refere-se a expressão no mRNA e, opcionalmente, ao nível do polipeptídeo.
[00126] Conforme aqui utilizada, a frase "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência heteróloga de ácido nucleico que pode não ser naturalmente expresso na planta ou cuja superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de forma estável ou temporária, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve ser observado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que seja idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência endógena de ácido nucleico da planta.
[00127] O termo "endógeno", conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que está e/ou expressado naturalmente dentro de uma planta ou célula da mesma.
[00128] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende um ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605- 1626, 1632-1642, 1645-4851.
[00129] De acordo com algumas aplicações da invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácidos ou ácido nucleico da invenção e não sobre suas porções.
[00130] De acordo com algumas aplicações da invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácidos ou ácido nucleico da invenção e não sobre suas porções.
[00131] A identidade (ou seja, a homologia percentual) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação Biotecnológica](NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão.
[00132] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851.
[00133] De acordo com algumas aplicações da invenção o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pelo SEQ ID NO: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645- 4851, 1599, 1604, 1628, 1630, ou 1644.
[00134] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma seqüência selecionada'a partir do grupo consistindo do SEQ ID NO: 1487, 814-1598, 1600- 1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00135] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é definido pela sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 16001603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[00136] De acordo um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de aumentar o teor de óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, compreendendo uma sequência de ácido nucleico seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1627, 1629, e 1631, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra da planta.
[00137] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar o teor de óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência do ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo do SEQ ID N°: 1627, 1629, e 1631, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra da planta.
[00138] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é definido pela sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1627, 1629, e 1631.
[00139] Conforme utilizado no presente, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência única ou dupla de ácido nucleico que é isolada e apresentada na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou sequências de polinucleotídeos compostas (ex.: uma combinação do exposto acima).
[00140] O termo "isolado" refere-se a pelo menos parcialmente separado do ambiente natural ex., de uma célula vegetal.
[00141] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência complementar de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente do RNA. Essa sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando uma DNA polimerase dependente do DNA.
[00142] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência genômica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, assim, representa uma parte contígua de um cromossomo.
[00143] Conforme aqui utilizada, a frase "sequência composta de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência, que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas que se interpõem entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, inclusive de outros genes, e tipicamente incluirão sequências de sinal de splicing conservadas. Essas sequências intrônicas podem ainda incluir elementos reguladores de expressão de ação cis.
[00144] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, e 5558-8091.
[00145] A homologia (por exemplo, homologia percentual) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação Biotecnológica](NCBI), por exemplo, utilizando parâmetros padrão, ao iniciar a partir de uma sequência polipeptídica; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via o NCBI), por exemplo utilizando parâmetros padrão, que compara os produtos de translação conceptual de seis quadros de uma sequência de fila de nucleotídeo (ambas as fitas) contra uma base de dados de sequência proteica.
[00146] As sequências homólogas incluem tanto sequências ortólogas como parálogas. O termo "parálogos" refere-se a duplicações genéticas dentro do genoma de uma espécie levando a genes parálogos. O termo "ortólogo" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos em razão de relação ancestral.
[00147] Uma opção de identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledôneas é fazendo uma pesquisa blast recíproca. Isto pode ser realizado por um primeiro blast envolvendo o blasting da sequência de interesse contra qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados NCBI disponível ao público que pode ser encontrada em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse sofreria um blasting contra, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza sativa Nipponbare disponível na NCBI. Os resultados do blast podem ser filtrados. As sequências de comprimento total de qualquer um dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então submetidas a um blasting reverso (segundo blast) contra as sequências do organismo do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados do primeiro e segundo blasts são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultante na maior pontuação (melhor opção) no primeiro blast identificar no segundo blast a sequência de fila (a sequência original de interesse) como a melhor opção. Utilizando a mesma justificativa, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/Tools/clustalw2/index (dot) html], seguido de uma árvore de junção de vizinhos (Hypertext Transfer Protocol://en (dot) wikipedia (dot) org/wiki/Neighbor-joining) que a ajuda a visualizar o clustering.
[00148] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 48525453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, e 5558-8091.
[00149] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídio que consiste na sequência de aminoácido definida pela SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, 55545556 ou 5557.
[00150] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, é afetado pela expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486, 5550, 5553, e 5558-8091, aumentando, assim, o rendimento, biomassa taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00151] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método de aumento de rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, é afetado pela expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou até 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486, -5550, 5553, e 5558-8091, aumentando, assim, o rendimento, biomassa taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00152] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, o método de aumento do rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra tolerância ao estresse abiótico e/ou da eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, entra em efeito pela expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5550, 5552, e 55545557, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00153] De acordo com um aspecto em algumas das aplicações da invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência do uso de nitrogênio de uma planta, compreendendo a expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 54625469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 5554-5557, aumentando assim o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio da planta.
[00154] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácido definida pelos SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462, 5469, 5471-5475, 54775480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, 5554-5556 ou 5557.
[00155] De acordo um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de aumentar o teor de óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, compreendendo a expressão dentro da planta de um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 5470, 5476, e 5481, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra da planta.
[00156] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, o método para aumentar o teor de óleo, o rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta, entra em efeito ao expressar dentro da planta um polinculeotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 5469, 5476, e 5481, aumentando, desse modo, o teor de óleo, rendimento da fibra e/ou qualidade da fibra de uma planta.
[00157] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácido definida pelos SEQ ID NO: 5470, 5476, ou 5481.
[00158] A sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos de tais modificações de sequência incluem, mas não se limitam a, um conteúdo G/C alterado para abordar mais proximamente aquele tipicamente encontrado em espécies de plantas de interesse, e a remoção de códons encontrados atipicamente em espécies de plantas comumente referidas como otimização de códon.
[00159] A frase "otimização de códon" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento deste que se aproxima do uso do códon dentro de uma planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucleico otimizado refere- se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou de ocorrência natural foi modificada para utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro de uma planta. A sequência de nucleotídeo é tipicamente analisada ao nível do DNA e a região de codificação otimizada para expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Neste método, o desvio padrão do uso do códon, uma medida do desvio do uso do códon, pode ser calculado primeiramente encontrando-se o desvio proporcional quadrado do uso de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de planta altamente expressos, seguido de um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn)/Yn]2/N, onde Xn refere-se à frequência de uso do códon em genes de planta de alta expressão, em que Yn refere-se à frequência de uso do códon no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela do uso de códon a partir de genes altamente expressos de plantas dicotiledôneas é compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).
[00160] Um método de otimização da sequência de ácido nucleico de acordo com o uso de códon preferido para um tipo de célula de planta em particular é feito com base no uso direto, sem a realização de quaisquer cálculos estatísticos adicionais, das Tabelas de otimização de códon, como aquelas providas on-line na base de dados de uso de códon do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences [Instituto Nacional de Ciências Agrobiológica]) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) or (dot) jp/codon/). A base de dados de uso de códon contém tabelas de uso de códon para diversas espécies diferentes, onde cada tabela de uso de códon foi estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.
[00161] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie em particular (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural que codifica uma proteína de interesse pode ser o códon otimizado para aquela espécie de planta em particular. Isso é afetado pela substituição de códons que podem ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com códons correspondentes, com relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos sítios em junções potencialmente úteis (terminações 5' e 3' para adicionar peptídeo de sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que podem ser utilizados para cortar e unir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequência de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.
[00162] A sequência de nucleotídeo de codificação de ocorrência natural já pode, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta em particular. Portanto, a otimização de códon da sequência nativa de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência nativa de nucleotídeo, não são estatisticamente favorecidos em relação a uma planta em particular, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códon da planta em particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência modificada de nucleotídeo pode ser totalmente ou parcialmente otimizada para uso de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência modificada de nucleotídeo seja produzida em um nível mais elevado que a proteína codificada pelo gene correspondente de ocorrência natural ou nativo. A construção de genes sintéticos por meio da alteração do uso de códon é descrito, por exemplo, no pedido de patente PCT 93/07278.
[00163] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não-codificador.
[00164] Conforme utilizada no presente documento, a frase "RNA não codificador" refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptideo). Exemplos de tais moléculas RNA não-codificadoras incluem, mas não se limitam a, um RNA anti-sentido, um pré-miRNA (precursor de um microRNA), ou um precursor um RNA Piwi-interativo (piRNA).
[00165] Exemplo não-limitadores de polinucleotídeo de RNA não- codificadores são fornecidos nos SEQ ID NOs: 211-217, 278-284, 486 e 487.
[00166] Assim, a invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima; seus fragmentos, sequências hibridizáveis com estas, sequências homólogas a estas, sequências que codificam polipeptideos similares com uso de códon diferente, sequências alteradas caracterizadas por mutações, tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.
[00167] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851.
[00168] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[00169] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado compreende a sequência de ácido nucléico selecionada do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 16001603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[00170] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é definido pelo SEQ ID NO: 1-487, 814-1598, 16001603, 1605-1626, 16321642, 1645- 4851, 1599, 1604, 1628, 1630, ou 1644.
[00171] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo no SEQ ID N°: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, e 5558-8091.
[00172] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácido é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[00173] A invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 5554-5557.
[00174] A invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, e 5558-8091.
[00175] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácido é capaz de aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta.
[00176] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460,5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 55545557.
[00177] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo é determinado pelo SEQ ID NO: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 54715475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, 5554- 5556 ou 5557.
[00178] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é fornecida uma construção de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor da transcrição direta da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[00179] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos e polipeptídeos descritos acima tendo mutações, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, tanto de ocorrência natural ou produzidos pelo homem, tanto aleatoriamente como de forma direcionada.
[00180] O termo "planta", conforme aqui utilizado, abrange plantas totais, ancestrais e progênie de plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), bem como células, tecidos e órgãos de plantas. A planta pode estar em qualquer forma, inclusive culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem a superfamília Viridiplantae, particularmente as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo um legumes de forragem, plantas ornamentais, agricultura, árvore ou arbustos selecionados da lista envolvendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata,
[00181] Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus 5 spp., Phoenix canadensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve de folhas, linho, couve, lentilha, semente de colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, açúcar beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, planta ornamental, grama e forragem. Alternativamente, algas e outras espécies não-Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos da presente invenção.
[00182] De acordo com algumas aplicações da invenção, a planta usada pelo método da invenção são plantas de cultivo tais como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, palmeira de óleo, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, cholpo e algodão.
[00183] De acordo com algumas aplicações da invenção, é provida uma célula vegetal que expressa exogenamente o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, a combinação de ácido nucleico de algumas configurações da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas configurações da invenção.
[00184] De acordo com algumas aplicações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é executada transformando uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e o cultivo da planta madura em condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.
[00185] De acordo com algumas aplicações da invenção, a transformação é realizada pela introdução, na célula de planta, de uma construção de ácido nucleico que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações da invenção e pelo menos um promotor da transcrição direta do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula de planta). Maiores detalhes da abordagem de transformação adequada são fornecidos abaixo.
[00186] ConfoLme mencionado, a construção do ácido nucleico de acordo com algumas aplicações da invenção compreende uma sequência do promotor e o polinucleotídeo isolado da invenção.
[00187] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é ligado de forma operável à sequência do promotor.
[00188] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "ligada de forma operável" a uma sequência reguladora (ex.: promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulatório sobre a sequência codificadora ligada a ela.
[00189] Conforme utilizado no presente, o termo "promotor" refere-se a uma região do DNA que fica acima do local do início da transcrição de um gene ao qual a polimerase do RNA se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (ex.: em que parte de uma planta) e/ou quando (ou seja, em qual estágio ou condição no ciclo de vida de um organismo) o gene é expresso.
[00190] Qualquer sequência promotora adequada pode ser utilizada pela construção de ácido nucleico da presente invenção. De forma preferencial, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um induzível de estresse abiótico.
[00191] De acordo com algumas aplicações da invenção, o promotor é uma planta promotora, a qual é adequada para expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta.
[00192] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, promotor de CaMV 35S (SEQ ID NO:8094; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor de Arabidopsis At6669 (SEQ ID NO:8096); Ubi 1 de milho (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histona de milho H3 (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Synthetic Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Norte-americanas NOs. 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.
[00193] Promotores adequados específicos do tecido incluem, entre outros, promotores específicos de folhas [conforme descrito, por exemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos de semente [por exemplo, Napina (originada da Brassica napus, que é caracterizada por uma atividade promotora específica da semente; Stuitje A. R. et.al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; SEQ ID N0:8095), de genes específico de semente (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Brazil Nut albumin (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), Trigo SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-10 876, 1992)], promotores específicos do endosperma [ex., trigo LMW e HMW, glutenin-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo a, b e g gliadinas (EMB03:1409-15, 1984), promotor ltrl de cevada, cevada Bl, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), Barley DOF (hena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente- Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 de arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513S22, 1997), ADP-glucose PP do arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), família de gene ESR do milho (Plant J 12:235-46, 1997), gama-kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embrião [por exemplo, OSH1 de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 81178122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:25771, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flor [p. ex., AtPRP4, síntase de chalene (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240245; 1989), apetala- 3] e promotores de raiz tais como o promotor ROOTP [SEQ ID NO: 8097].
[00194] Promotores induzíveis por estresse abiótico incluem, entre outros, promotores induzíveis por sal tais como RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis por seca tais como o promotor do gene rabl7 do milho (Pla et. al, Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al, Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis por calor tais como o promotor hsp80 de calor do tomate (patente americana N° 5.187.267).
[00195] Conforme acima mencionado e ainda descrito no Exemplo 15 da seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores revelaram uma nova sequência promotora (sequências reguladoras de ácido nucleico) que podem ser utilizadas para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta.
[00196] Portanto, de acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido descrita pelo SEQ ID NO:
[00197] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo isolado é capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00198] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo é ligado de forma operável à sequência regulatória do ácido nucleico descritos pelo SEQ ID NO: 8096.
[00199] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da invenção, é fornecido uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo isolado descrito pelo SEQ ID NO: 8096.
[00200] De acordo com algumas aplicações da invenção, a construção do ácido nucleico, compreendendo ainda pelo menos um polinucleotídeo heterólogo operável ligado ao polinucleotídeo isolado.
[00201] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência reguladora de ácido nucleico da invenção varia, em termos de comprimento, de aproximadamente 500 nucleotídeos a aproximadamente 4000 nucleotídeos e inclui uma ou mais regiões de sequência que são capazes de reconhecer e ligar a RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição de ação trans) envolvidas na transcrição.
[00202] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência reguladora está posicionada 1-500 bp acima do códon ATG da sequência de codificação de ácido nucleico, embora seja apreciado que as sequências reguladoras também podem exercer seu efeito quando posicionadas em outro lugar em relação à sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, dentro de um íntron).
[00203] Como é claramente ilustrado na seção de Exemplos a seguir, a nova sequência do promotor At6669 de algumas aplicações da invenção é capaz de regular a expressão de uma sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, um gene repórter, por exemplo, GUS, luciferase) operacionalmente ligada a elas (vide o Exemplo 17 da seção de Exemplos a seguir).
[00204] De acordo com algumas configurações da invenção, as sequências reguladoras de ácido nucleico da invenção são modificadas para criar variações nas sequências da molécula, por exemplo, para intensificar suas atividades de promoção, utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, modificação de DNA baseada em PCR ou técnicas de mutagênese de DNA padrão ou por síntese química dos polinucleotídeos modificados.
[00205] Dessa forma, a sequência regulatória do ácido nucleico da invenção (ex.: SEQ ID NO: 8096) pode ser cortado ou deletado e ainda pode manter a capacidade de direcionar a transcrição de uma sequência de DNA heteróloga ligada de forma operável. O comprimento mínimo de uma região promotora pode ser determinado removendo-se sistematicamente as sequências das terminações 5' e 3' do polinucleotídeo isolado por meio de métodos padrão conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, a remoção de fragmentos de enzima de restrição ou a digestão com nucleares. Consequentemente, quaisquer fragmentos, partes ou regiões de sequência das sequências promotoras de polinucleotídeo reveladas na invenção podem ser utilizados como sequências reguladoras. Será apreciado que as sequências modificadas (coutadas, truncadas e similares) podem adquirir diferentes propriedades de transcrição, tais como a direção de diferente padrão de expressão de gene em comparação ao elemento não modificado.
[00206] Opcionalmente, as sequências definidas nas SEQ ID NOs:8096 podem ser modificadas, por exemplo, para expressão em uma variedade de sistemas de planta. Em outra abordagem, novos promotores híbridos podem ser projetados ou geneticamente modificados por meio de vários métodos. Muitos promotores contêm sequências ascendentes que ativam, intensificam ou definem a potência e/ou a especificidade do promotor, conforme descrito, por exemplo, por Atchison [Ann. Rev. Cell Biol. 4:127 (1988)]. Genes T-DNA, por exemplo, contêm caixas "TATA" que definem o sítio de início da transcrição e outros elementos ascendentes localizados acima do sítio de início da transcrição modulam níveis de transcrição [Gelvin In: Transgenic plants (Kung, S.-D. e Us, R., Eds, San Diego: Academic Press, pp.49-87, (1988)]. Outro promotor quimérico combinou um trimer do ativador de octopina sintase (OCS) para o ativador da manopina sintase (mas) mais o promotor e relatou um aumento na expressão de um gene repórter [Min Ni et al.The Plant Journal 7:661 (1995)]. As sequências reguladoras ascendentes das sequências promotoras de polinucleotídeo da invenção podem ser utilizadas para a construção desses promotores quiméricos ou híbridos. Métodos para a construção de promotores variantes incluem, entre outros, a combinação de elementos de controle de diferentes promotores ou partes ou regiões de duplicação de um promotor (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5,110,732 e 5,097,025). Os técnicos no assunto estão familiarizados com as condições específicas e com os procedimentos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídios, etc.), geração de organismos recombinantes e a triagem e isolamento de genes, [vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989); Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, (1995); Birren et al., Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997); volume 2, Detecting Genes, (1998); volume 3, Cloning Systems, (1999); e volume 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, N.Y].
[00207] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo, que é regulado pela sequência de ácido nucleico descrita pelo SEQ ID NO: 8096, compreende uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[00208] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo, que é regulado pela sequência de ácido nucleico descrita pelo SEQ ID NO: 8096, compreende uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 55588091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, 5554-5556 ou 5557.
[00209] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo, que é regulado pela sequência de acido nucleico descrita pelo SEQ ID NO: 8096, compreende uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 1627, 1629 e 1631.
[00210] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo heterólogo, que é regulado pela sequência de ácido nucleico descrita pelo SEQ ID NO: 8096, compreende uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos SEQ ID NOs: 5470, 5476 e 5481.
[00211] De acordo com algumas aplicações da presente invenção, o método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, vigor, o teor de óleo, o rendimento de fibra, a qualidade de fibra, a tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, entra em efeito expressando dentro da planta uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico descrita no SEQ ID NO: 8096 e uma sequência de polinucleotídeo heterólogo que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao SEQ ID NOs: 1487, 814-1598, 1600-1603, 1605- 1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico seja capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00212] De acordo com algumas aplicações da presente invenção, o método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento de fibra, a qualidade de fibra, a tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, entra em efeito expressando dentro da planta uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico descrita no SEQ ID NO: 8096 e uma sequência de polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% homóloga ao SEQ ID NOs: 488813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 55588091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, 5554-5556 ou 5557, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico seja capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00213] De acordo com algumas aplicações da presente invenção, o método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento de fibra, a qualidade de fibra, a tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, entra em efeito expressando dentro da planta uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico descrita no SEQ ID NO: 8096 e uma sequência de polinucleotideo heterólogo que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% idêntica ao SEQ ID NOs: 1627, 1629 ou 1631, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico seja capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00214] De acordo com algumas aplicações da presente invenção, o método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o teor de óleo, o rendimento de fibra, a qualidade de fibra, a tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, entra em efeito expressando dentro da planta uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico descrita no SEQ ID NO: 8096 e uma sequência de polinucleotídeo heterólogo que codifica uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, por exemplo, 100% homóloga ao SEQ ID NOs: 5470, 5476 ou 5481, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico seja capaz de regular a expressão do polinucleotídeo heterólogo em uma célula hospedeira.
[00215] A construção de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ainda incluir um marcador selecionável adequado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações da invenção, a construção de ácido nucleico utilizada é um vetor-ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a construção compreende um marcador selecionável adequado e uma origem de replicação) e pode ser compatível com a propagação em células. A construção de acordo com a presente invenção por ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagómido, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.
[00216] A construção de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção pode ser utilizada para transformar as células de planta de forma estável ou temporária. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e, dessa forma, representa uma característica estável e herdada. Na transformação temporária, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, porém não é integrado no genoma e, dessa forma. representa uma característica temporária.
[00217] Há vários métodos de introduzir genes estranhos às plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).
[00218] Os métodos básicos para realizar a integração estável de DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobactérias: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K, Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S, and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93- 112.
[00219] 00 Captação direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por rápido choque elétrico de células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384.
[00220] Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células de planta ou tecidos por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de fibra de vidro ou carboneto de silicone das culturas celulares, embriões ou tecido de calo, Patentes dos Estados Unidos N° 5,464,765 ou pela incubação direta do DNA com pólen de germinação, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
[00221] O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídio que contêm segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie de planta e do sistema de liberação da agrobactéria. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que ofereça uma boa fonte para o início de toda a diferenciação da planta. Vide, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de liberação de agrobactéria em combinação com infiltração à vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.
[00222] Há vários métodos de transferência direta de DNA em células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são rapidamente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, por exemplo, cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de planta.
[00223] Após a transformação estável, é realizada a propagação da planta. O método mais comum de propagação de planta é por semente. A regeneração por propagação de semente, no entanto, tem uma deficiência. Devido à heterozigosidade, há uma ausência de uniformidade no cultivo, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com suas próprias características específicas. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada tenha as características idênticas e as características da planta transgênica precursora. Assim, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação, que gera uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.
[00224] A micropropagação é um processo de crescimento de plantas de nova geração a partir de um único pedaço de tecido que foi retirado de uma planta precursora selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas tendo o tecido preferido que expressa a proteína de fusão. As plantas de nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas e possuem todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de planta de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.
[00225] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que exige a alteração do meio de cultura ou das condições de crescimento entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura inicial do tecido; estágio dois, multiplicação da cultura do tecido; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quatro, cultura e endurecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é definida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender os objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em pequenas plantas individuais. No estágio quatro, as pequenas plantas individuais transformadas são transferidas para uma estufa para endurecimento onde a tolerância das plantas à luz aumenta gradualmente, de modo que possa ser cultivada no ambiente natural.
[00226] De acordo com algumas aplicações da invenção, as plantas transgênicas são geradas por transformação temporária de células de folha, células meristemáticas ou toda a planta.
[00227] A transformação temporária pode ser realizada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de planta modificados.
[00228] Os vírus que demonstraram ser úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV ou BCMV). A transformação das plantas usando vírus de planta descrita na Pat. Dos Estados Unidos N° 4,855,237 (vírus do mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Solicitação Japonês Publicada N° 6314693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278.667 (BV) e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritos na WO 87/06261.
[00229] De acordo com algumas aplicações da invenção, o vírus utilizado para as transformações temporárias é não virulento e, assim, incapaz de causar graves sintomas, tais como menor taxa de crescimento, mosaico, manchas em anel, enrolamento da folha, amarelamento, aparecimento de listras, formação de erupções, formação de tumor e formação de furos. Um vírus não virulento adequado pode ser um vírus não virulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser realizada utilizando métodos bem conhecidos na técnica incluindo, entre outros, aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagêne s e direcionada tais como as descritas, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) and Huet et al. (1994).
[00230] Cepas adequadas de vírus podem ser obtidas de fontes disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection [Coleção de Cultura Tipo Dos Estados Unidos] (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de planta infectada pode ser realizado por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Em suma, os tecidos de uma planta infectada em que se crê haver uma alta concentração de um vírus adequado, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flor, são fundamentados em uma solução tampão (p. ex., solução tamponada de fosfato) para gerar uma seiva infectada de vírus que pode ser usada em inoculações futuras.
[00231] A construção dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:12941297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e na Patente dos Estados Unidos 5.316.931.
[00232] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser realizadas no próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídio bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode ser então extraído do plasmídio. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e translação desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA virai. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídio. O plasmídio é então utilizado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídio e pela translação dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que fazem a encapsidação do RNA viral.
[00233] Em uma configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta no qual a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídeo viral, e foi inserida uma sequência de codificação de proteína de revestimento viral de planta não nativa e um promotor não nativo, preferencialmente o promotor subgenômico da sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa, capaz de realizar a expressão no hospedeiro da planta, o empacotamento do polinucleotídeo viral de planta recombinante, e de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência de polinucleotídeo não nativo em seu interior, de modo que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral de planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos adicionais não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeo no hospedeiro da planta e incapaz de realizar a recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativos (estranhos) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou aos promotores subgenômicos virais nativos e não nativos da planta caso mais que uma sequência de polinucleotídeo seja incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativo são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para gerar os produtos desejados.
[00234] Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é provido como na primeira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores subgenômicos de proteína de revestimento não nativa em vez de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00235] Em uma terceira configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante no qual o gene da proteína de revestimento nativa está adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de realizar recombinação entre si e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativo podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos de planta, de modo que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores subgenômicos para gerar o produto desejado.
[00236] Em uma quarta configuração, é provido um polinucleotídeo viral de planta recombinante como na terceira configuração, exceto pelo fato de que a sequência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação de proteína de revestimento não nativa.
[00237] Os vetores virais são encapsidados pela proteína de revestimentos codificada pelo polinucleotídeo viral de planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral de planta recombinante ou vírus de planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras adequadas. O polinucleotídeo viral de planta recombinante é capaz de realizar a replicação no hospedeiro, a difusão sistêmica no hospedeiro e a transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.
[00238] As técnicas de inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principies and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.
[00239] Além do que foi acima exposto, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, permitindo assim a expressão do cloroplasto.
[00240] É conhecida uma técnica de introdução de sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células de planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido por bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma que são integráveis no genoma de cloroplastos via recombinação homóloga, que é prontamente feita pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um estiramento de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve, por meio de procedimentos de seleção sequencial, para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto após essa seleção incluirão o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes relacionados a essa técnica são encontrados na Pat. Dos Estados Unidos N°s 4.945.050 e 5.693.507, que são incorporadas no presente como referência. Um polipeptídeo pode, então, ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e se integrar à membrana interna do cloroplasto.
[00241] Uma vez que os processos que aumentam o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou a tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes que atuam aditivamente ou em sinergia (vide, por exemplo, Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também refere-se à expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para assim atingir um efeito superior sobre o teor de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa, o vigor, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou a tolerância ao estresse abiótico.
[00242] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela cointrodução de múltiplas construções de ácido nucleico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula de planta. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura, usando os métodos descritos acima.
[00243] Alternativamente, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada pela cointrodução, em uma única célula de planta de uma única construção de ácido nucleico, incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes. Essa construção pode ser projetada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico que inclui todas as diferentes sequências de polinucleotídeo exógeno. Para permitir a co-translação dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser interligadas por uma sequência de sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) que facilita a translação de sequências de polinucleotídeo posicionadas abaixo da sequência IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto da terminação 5' fechada como das duas sequências IRES internas da molécula de RNA policistrônico para assim produzir, na célula, diferentes polipeptídeos. Alternativamente, a construção pode incluir várias sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.
[00244] A célula da planta transformada com o constructo incluindo diversos polinucleotídeos exógenos diferentes pode ser regenerada em uma planta madura, usando os métodos descritos acima.
[00245] De forma alternativa, a expressão de diversos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser feita pela introdução de diferentes constructos de ácido nucleico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em diversas plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e resultar na geração selecionada para apresentar características superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência do uso de água, eficiência do uso de fertilizante, crescimento, biomassa, rendimento, teor de óleo e/ou no vigor, utilizando técnicas de geração de planta convencionais.
[00246] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende ainda o crescimento da planta que expressa o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.
[00247] Exemplos não limitadores de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estiagem, privação de água, excesso de água (ex. inundação, alagamento), estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.
[00248] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula, o método entra em efeito com transformação da célula com uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse conectado de forma operável ao polinucleotídeo isolado descrito pelo SEQ ID NO: 8096, expressando, desse modo, o polipeptídeo de interesse na célula.
[00249] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo de interesse compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga ao polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°: 488813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 5471-5475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551,5552, e 55545557.
[00250] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 488-813, 4852-5453, 5460, 5461, 5484, 5486-5550, 5553, 5558-8091, 5454-5459, 5462-5469, 54715475, 5477-5480, 5482, 5483, 5485, 5551, 5552, e 5554-5557.
[00251] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo de interesse compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% homóloga ao polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°: 5470, 5476 e 5481.
[00252] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 5470, 5476 e 5481.
[00253] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% idêntica ao polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°: 1487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 1632-1642, 1645-4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[00254] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 1-487, 814-1598, 1600-1603, 1605-1626, 16321642, 1645- 4851, 1599, 1604, 1628, 1630, e 1644.
[00255] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou mais, digamos 100% idêntica ao polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos SEQ ID N°: 1627, 1629 e 1631.
[00256] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 1627, 1629 e 1631.
[00257] Assim, a invenção abrange células transgênicas (ex.: células de plantas transgênicas), plantas expressando de forma exógena o(s) polinucleotídeo(s) (ex.: plantas transgênicas), as construções de ácido nucleico e/ou polipeptídeo(s) da invenção, e métodos para gerar ou produzir o mesmo. Uma vez expresso dentro da célula da planta ou da planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bastante conhecidos na técnica tais como, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente o polipeptídeo, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), ensaios radioimunológicos (RIA), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.
[00258] Métodos para determinar, na planta, o nível do RNA transcrito a partir do polinucleotídeo exógeno são bastante conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização de RNA in situ.
[00259] A informações da sequência e as anotações reveladas pelos presentes ensinamentos podem ser utilizadas em favor da procriação clássica. Assim, dados de subseqüência dos polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção auxiliada por marcador (MAS), na qual um marcador é utilizado para a seleção indireta de um determinante ou de determinantes genéticos de uma característica de interesse (por exemplo, biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, rendimento, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizante). Os dados de ácido nucleico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou ser ligados a sítios polimórficos ou marcadores genéticos no genoma, tais como polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP), mi crosatélites e polimorfismo de um único nucleotídeo (E.MP) , impressão digital de DNA (DFP) , polimorfismo do comprimento do fragmento amplificado (AFLP) , polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.
[00260] Exemplos seleções auxiliadas por marcador incluem, entre outras, a seleção de uma característica morfológica (por exemplo, um gene que afeta a forma, a cor, a esterilidade do macho ou a resistência, como a presença ou ausência aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de uma característica bioquímica (por exemplo, um gene que codifica uma proteína que pode ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de armazenamento); seleção de uma característica biológica (por exemplo, raças patogênicas ou biótipos de insetos com base na interação do patógeno hospedeiro ou do parasita hospedeiro, podem ser utilizadas como um marcador, uma vez que a constituição genética de um organismo pode afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).
[00261] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla faixa de plantas econômicas, de forma segura e barata.
[00262] As linhas de planta que expressam exogenamente o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são selecionadas para identificar aquelas que demonstram o maior aumento da característica desejada da planta.
[00263] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo) na tolerância de estresse abiótico pode ser determinada utilizando-se métodos conhecidos, tais como os detalhados abaixo na seção de Exemplo que segue.
[00264] Tolerância ao estresse abiótico - As plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como falta de água, temperatura abaixo do ideal (baixa e alta temperatura), deficiência de nutriente, excesso de nutriente, condição de estresse salino, estresse osmótico, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.
[00265] Ensaio de tolerância à salinidade - Plantas transgênicas com tolerância a concentrações muito altas de sal podem exibir melhor germinação, vigor ou crescimento de muda com alta salinidade. O estresse ao sal pode ser efetuado de muitas formas, como, por exemplo, irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (ex.: solução de Hoaglan) ou cultivando as plantas em um meio de cultivo hiperosmótico (ex.: 50% meio de Murashige-Skoog [meio MS]). Uma vez que diferentes plantas variam consideravelmente em termos de sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou da variedade de planta específica, de modo a impor um efeito ameno ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para obter diretrizes sobre a concentração apropriada, vide Bernstein and Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e suas referências).
[00266] Por exemplo, um teste de tolerância à salinidade pode ser realizado por meio da irrigação das plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, NaC1 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão uniforme de sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até que efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais apareçam nas plantas do tipo selvagem. Assim, a aparência fenotípica externa, grau em que a planta murchou e o sucesso geral para atingir a maturidade e resultado são comparados entre as plantas de controle e transgênicas.
[00267] Os parâmetros quantitativos da tolerância medida incluem, entre outras, o peso médio úmido e seco, a taxa de crescimento, o tamanho da folha, a cobertura da folha (área geral da folha), o peso das sementes resultantes, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que apresentam maior biomassa que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.
[00268] Teste de tolerância asmática - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo osmótico era específico de cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ser mais tolerantes à estiagem e/ou ao congelamento. Para os experimentos de germinação com sal e estresse osmótico, o meio é complementado, por exemplo, com NaC1 50 mM, 100 mM, 200 mM ou com NaC1 100 mM, 200 mM e mannitol 400 mM.
[00269] Ensaio de tolerância à seca/ ensaio osmótico - A tolerância à seca é feita para identificar os genes gerando melhor sobrevida de plantas após falta de água aguda. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, pode ser realizado um estresse osmótico gerado pelo osmólito não fônico sorbitol no meio. As plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar de plantas por 4 dias, após no qual são transferidas para placas contendo 500mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento no crescimento, então, as plantas de controle e transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmido e seco), o rendimento e pelos índices de crescimento medidos no momento da floração.
[00270] Ao contrário, são feitas seleções da seca baseadas no solo com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. As sementes das plantas controle Arabidopsis ou de outras plantas transgênicas que superexpressam o polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido após cessada a irrigação, seguida pela colocação dos vasos em papel absorvente para aumentar o índice de secagem do solo. As plantas transgênicas e as controle são comparadas entre si quando a maioria das plantas controle desenvolve grave definhamento. As plantas são novamente aguadas após a obtenção de uma fração significativa das plantas controle que apresenta grave definhamento. As plantas são classificadas comparando-se aos controles para cada um dos dois critérios: tolerância às condições de estiagem e recuperação (sobrevida) após a reidratação.
[00271] Tolerância ao estresse de frio - Para analisar o estresse ao frio, plantas maduras (com 25 dias) são transferidas para câmaras de 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz elementar. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos do período de frio, resultando em retardamento no crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas de controle e transgênicas, medindo o peso da planta (úmido e seco) e comparando os índices de crescimento medidos no momento da floração, o tamanho da planta, o rendimento, entre outros.
[00272] Tolerância ao estresse ao calor - A tolerância ao estresse ao calor é atingida expondo as plantas a temperaturas acima de 34°C por um período determinado. A tolerância da planta é analisada após a transferência das plantas de volta à condição de 22°C para recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas ao estresse pelo frio ou calor.
[00273] Eficiência do uso de água - pode ser determinada como a biomassa gerada por unidade transpiração. Para analisar o WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido nas plantas transgênicas e de controle. O peso fresco (FW) é registrado imediatamente; então as folhas são encharcadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) é registrado. O peso seco total (PS) é registrado após a secagem das folhas a 6000 em peso constante. O teor relativo de água (TRA) é calculado de acordo com a seguinte fórmula I: Fórmula I TRA=[(PF-PS)/(PT-PS)1x100
[00274] Eficiência do uso de fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, por exemplo, em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo de florescimento, rendimento, conteúdo de proteína do galho e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho total da planta madura, sua umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o conteúdo de clorofila das folhas (uma vez que o status de nitrogênio e o grau de verdor da folha estão correlacionados), conteúdo de aminoácido e proteína total das sementes ou outras partes das plantas, como folhas ou galhos, conteúdo de óleo, etc. De forma semelhante, em vez de fornecerem nitrogênio em quantidades limitadas, podem ser adicionados fosfato ou potássio em concentrações elevadas. Novamente, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos relacionados acima. Dessa forma, a eficiência do uso de nitrogênio (NUE), eficiência do uso de fosfato (PUE) e eficiência do uso de potássio (KUE) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de florescerem sob condições restritas de nutrientes.
[00275] Eficiência de uso do nitrogênio - Para verificar se as plantas transgênicas Arabidopsis são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-1,5 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração ideal de nitrogênio). É permitido que as plantas cresçam por mais 25 ou até a produção de sementes. As plantas são então analisadas por seu tamanho total, tempo de florescência, rendimento, teor de proteína do broto e/ou grão/ produção de semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho total da planta, umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de nitrogênio da planta e o grau de verdor da folha são altamente corelacionados), aminoácido e o teor total de proteína das sementes ou de outras partes da planta tais como as folhas ou brotos e o teor de óleo. Plantas transformadas não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou apresentam níveis maiores de parâmetros medidos do que de plantas silvestres, são identificadas como plantas de eficiência de uso do nitrogênio
[00276] Estudo de eficiência do uso de nitrogênio utilizando plantas - O estudo é feito de acordo Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("Engenharia metabólica com o fator de transcrição Dofl em plantas: Assimilação melhorada de nitrogênio e crescimento sob condições com pouco nitrogênio" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7838). Resumidamente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7 a 10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementadas com um agente de seleção, são transferidas para duas condições de limitação de nitrogênio: A media MS na qual a concentração combinada de nitrogênio (NH4NO3 e KNO3) foi 0,75 mM ou 0,05 mM. Permite-se que as plantas cresçam por mais 30-40 dias e então sejam fotografadas, removidas individualmente do Agar (o broto sem a raiz) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Construções para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em mídia seletiva e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento independente de transformação) são cuidadosamente transferidas para o local de limitação de nitrogênio. Para construções para as quais sementes T2 estão disponíveis, diferentes eventos de transformação são analisados. Normalmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o local com limitações de nitrogênio, com permissão para crescer mais 3-4 semanas e serem pesadas no final de tal período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas contendo somente o mesmo promotor, porém sem qualquer gene repórter utilizado como controle.
[00277] Determinação de nitrogênio - O procedimento de determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método da digestão com persulfato de potássio para converter N orgânico em NO3 (Purcell and King 1996 Argon. J. 88:111113, the modified Cd mediated reduction of NO3 to NO2 (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorbância são medidos em 550nm em comparação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.
[00278] Teste de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes das plantas transgênicas que poderia completar o processo de germinação com o percentual de sementes de plantas controle que são tratadas da mesma forma. São consideradas condições normais, por exemplo, incubações a 22°C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é meio MS 50% (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).
[00279] A germinação é verificada também em condições desfavoráveis, como frio (incubando com temperaturas inferiores a 10°C em vez de 22°C) ou usando soluções de inibição de sementes que contenham concentrações altas de um osmólito, como sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM NaCl)
[00280] O efeito da transgene no vigor, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou teor de óleo pode ser determinada usando métodos conhecidos.
[00281] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento, tais como a área foliar, o comprimento da fibra, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e similares por unidade de tempo.
[00282] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando-se análise digital de plantas em cultivo. Por exemplo, imagens de plantas cultivadas em estufa em base de canteiro podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença de área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.
[00283] A avaliação ou taxa de crescimento pode ser feita medindo a biomassa da planta produzida, área de roseta, tamanho da folha ou comprimento da raiz por tempo (pode ser medido em cm por dia da área da folha).
[00284] A área de crescimento relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área de crescimento relativo = Coeficiente da regressão da área ao longo do tempo
[00285] Assim, a taxa da área de crescimento relativo está em unidades de 1/dia e o taxa de crescimento por comprimento está em unidades de 1/dia.
[00286] Rendimento de semente - A avaliação do rendimento de semente por planta pode ser feita medindo-se a quantidade (peso ou tamanho) ou quantidade (ou seja, numérica) de sementes secas produzidas e colhidas de 8 a 16 plantas e dividida pelo número de plantas.
[00287] Por exemplo, o total de sementes de 8 a 16 plantas pode ser coletado, pesado utilizando, por exemplo, uma balança analítica e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. O rendimento de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma forma enquanto se leva em consideração a área de cultivo designada a uma única planta. O aumento do rendimento de semente por área de cultivo poderia ser obtido aumentando-se o rendimento de semente por planta e/ou aumentando-se o número de plantas capazes de crescer em uma determinada área.
[00288] Além disso, o rendimento de semente pode ser determinado pelo peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e fotografadas. Cada amostra é pesada e então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.
[00289] O peso de 1000 sementes pode ser calculado utilizando-se a fórmula II: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000
[00290] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando-se a Fórmula IV Fórmula IV: Índice de Colheita = Rendimento médio de semente por planta/Peso médio seco
[00291] Concentração protéica do grão - O teor de proteína do grão (g proteína do grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g grão N m-2) multiplicada pela razão de conversão de N/proteína de k-5,13 (Musgoe 1990, supra). A concentração de proteína do grão é estimada como a razão do conteúdo de proteína do grão por unidade/massa do grão (g grão proteína kg-1 grão).
[00292] Comprimento da fibra - O comprimento da fibra pode ser medido por fibrografia. O sistema de fibrografia foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". O comprimento médio da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. A fibrografia mede o comprimento em comprimentos amplos de um determinado ponto percentual (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) cottoninc (dot) com/ClassificationofCotton/?Pg=4# Length).
[00293] De acordo com algumas aplicações da invenção, o rendimento aumentado do milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: Aumento no número de plantas por área de cultivo, aumento no número de espigas por planta, aumento no número de fileiras por espiga, número de cernes por cada fileira, peso da cerne, peso de mil cernes (peso-1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento no teor de óleo por cerne e aumento no conteúdo de amido por cerne.
[00294] Como mencionado, o aumento do rendimento da planta pode ser determinado por diversos parâmetros. Por exemplo, o rendimento aumentado de arroz pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: no número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), aumento no teor de óleo por semente, aumento no conteúdo de amido por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa de uma arquitetura modificada.
[00295] Similarmente, o rendimento aumentado de soja pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), redução na quebra de vagens, aumento no teor de óleo por semente, aumento no conteúdo de proteína por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa de uma arquitetura modificada.
[00296] O rendimento aumentado de colza pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), redução na quebra de vagens, aumento no teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa de uma arquitetura modificada.
[00297] O rendimento aumentado de algodão pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento na taxa de preenchimento da semente, aumento no peso de mil cernes (peso-1000), aumento no teor de óleo por semente, melhora no comprimento da fibra, força da fibra, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa de uma arquitetura modificada.
[00298] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da parte vegetativa da planta. Resumidamente, os lipídios (óleo) podem ser extraídos da planta (por exemplo, a semente) por trituração do tecido da planta na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e extração do óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando-se vários métodos conhecidos, tais como Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)]; por Espectroscopia Próxima do Infravermelho (NI), que utiliza a absorção da energia quase no infravermelho (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito na W0/2001/023884, que é com base na extração de solvente de óleo, evaporação do solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo, e direcionamento de uma luz no fluxo de gás e de partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.
[00299] Assim, esta invenção é de grande valor à agricultura por promover o rendimento de colheitas desejadas comercialmente (p. ex.,biomassa do órgão vegetativo como madeira de álamo ou órgão reprodutivo, como número de sementes ou biomassa de semente).
[00300] Quaisquer das plantas transgênicas conforme acima descritas ou partes destas podem ser processadas para produzir um alimento, refeição, proteína ou preparação de óleo, por exemplo, para animais ruminantes.
[00301] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um teor de óleo aumentado podem ser usadas para produzir óleo vegetal (pela extração de óleo da planta).
[00302] O óleo à base de plantas (incluindo o óleo de semente e/ou o óleo da parte vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção, pode ser combinado com uma variedade de outros componentes. Os componentes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o uso pretendido. Exemplos de produtos incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos, e matéria-prima para processo de fermentação. Exemplos de produtos a serem incorporados ao óleo à base de plantas incluem rações animais, alimentos para humanos, tais como, salgadinhos extrudados, pães, como agente ligante de alimentos, rações para aqüicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas para praticantes de esportes, barras nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais. De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.
[00303] De acordo com algumas aplicações da invenção, o óleo compreende um óleo de parte vegetativa.
[00304] De acordo com algumas aplicações da invenção, a célula da planta faz parte de uma planta.
[00305] Conforme utilizado no presente, o termo "cerca de" refere-se a ± 10%.
[00306] Os termos "envolve", "envolvendo", "inclui", "incluindo", "ter" e suas conjugações significam "incluindo, mas não limitado a".
[00307] O termo "consistindo em" significa "incluindo e limitado a".
[00308] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, o método ou estrutura podem incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou parte adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.
[00309] Da forma utilizada aqui, a forma singular "um", "uma" e "o/a" inclui referências de plural a menos que o contexto imponha claramente o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo as misturas deles.
[00310] Ao longo dessa solicitação, várias aplicações dessa invenção podem estar presentes em formato variado. Deve-se compreender que a descrição no formato variado é simplesmente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Consequentemente, deve-se considerar que a descrição de uma variação deve ter revelado especificamente todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Por exemplo, deve-se considerar que a descrição de uma variação como a de 1 a 6 tenha revelado especificamente subvariações como as de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela variação, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.
[00311] Sempre que uma variação numérica for indicada aqui, significa que inclui qualquer numeral mencionado (fracionado ou integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/varia a partir de" um primeiro número indicado "até" um segundo número indicado são usados aqui de forma intercambiável e destinam-se a incluir o primeiro e o segundo número indicado e todos os números fracionados e inteiros entre eles.
[00312] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos por praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.
[00313] Estima-se que determinadas características da invenção, que são, para efeito de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também possam ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, diversas características da invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou de forma adequada em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de diversas aplicações não devem ser consideradas características essenciais daquelas aplicações, a menos que a aplicação não seja funcional sem aqueles elementos.
[00314] Diversas aplicações e aspectos da presente invenção, conforme descritos acima e reivindicados na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.
EXEMPLOS
[00315] Agora, faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações da invenção de forma não limitante.
[00316] De modo geral, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas cuidadosamente na literatura. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conformes descritas nas Patentes dos Estados Unidos Números 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patente, vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N°s 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos aqui incorporados por referência como se fossem integralmente aqui definidos. Outras referências gerais são apresentadas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos descritos sejam bem conhecidos no ramo e são fornecidos para conveniência para o leitor. Todas as informações contidas na literatura são incorporadas aqui como referência. MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA
[00317] Extração de RNA - Tecidos desenvolvendo em várias condições de desenvolvimento foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando o Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) invitrogen (dot) com/content (dot) cfm?pageid=469]. Aproximadamente de 30 a 50 mg de tecido foram retirados das amostras. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pistilo e cadinho em nitrogênio líquido e ressuspenso em 500 p1 de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100 pl de clorofórmio foram adicionados, seguido de precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol 75%. O RNA foi eluído em 30 pl de água sem RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza com minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Incs, CA USA). Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu uma ID do Conjunto de expressão.
[00318] Análise de correlação - foi realizada para os genes selecionados de acordo com algumas aplicações da invenção, nas quais os parãmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com os IDs de correlação) foram utilizados como "eixo x" para correlação com a transcrição do tecido que foi utilizado como "eixo Y". Para cada gene e parâmetro medido um coeficiente de correlação R foi calculado [utilizando o teste de correlação de Pearson Hypertext Transfer Protocol ://World Wide Web (dot) davidmlane (dot) com/hyperstat/A34739 (dot) html] juntamente com um valor p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de expressão de um gene em certo tecido e um desempenho fenotípico ao longo dos ecotipos/variedade/híbrido é alto no valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão de tal gene) e o caráter fenotípico (ex.: melhor eficiência no uso de nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, rendimento, taxa de crescimento e similares). Uma correlação positiva indica que a expressão do gene em certo tecido ou estágio de desenvolvimento e o vetor de correlação (desempenho do fenótipo) são positivamente associados (ambos, o desempenho de expresso e fenotípico, aumentam ou diminuem simultaneamente) enquanto uma correlação negativa indica uma associação negativa (enquanto um aumenta, outro diminui, e vice-versa). Genes cuja expressão em certos tecidos correlaciona-se significantemente com certas característica são apresentados na Tabela 26, juntamente com seu coeficiente de correlação (R, calculado utilizando a correlação de Pearson) e os valores p sob a categoria do conjunto de vetores de ecotipos de biodiesel. EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E PAPEL PROGNOSTICADO UTILIZANDO FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA
[00319] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos que podem aumentar o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, o rendimento da fibra e/ou sua qualidade, a tolerância ao estresse abiótico, a eficiência no uso de nitrogênio e/ou o vigor de uma planta, conforme segue.
[00320] Os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeo aqui utilizados foram de bases de dados disponíveis ao público ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (por exemplo, Cevada e Sorghum). Os dados de sequência de 100 diferentes espécies de planta foram introduzidos em uma única e abrangente base de dados. Outras informações sobre a expressão do gene, anotação de proteína, enzimas e vias também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas
[00321] Genoma de Arabidopsis [TAIR genome version 8 (Hypertext Transfe Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/)]; Genoma de arroz [build 6.0 (Hypertext Transfer Protocol:// http://rice (dot plantbiology(dot)msu(dot)edu/index.shtml]; Álamo [Populus trichocarpa release 1.1 from JGI (assembly release v1.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) genome (dot) jgi-psf (dot) org/)]; Brachypodium [JGI 4x assembly, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) brachpodium (dot) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, version Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Uva [French-Italian Public Consortium for Grapevine Genoma Characterization grapevine genoma (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) genoscope (dot) cns (dot) fr /)]; Feijão em fava [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly [(Hypertext Transfer Protocol://msc (dot) jcvi (dot) org/r communis]; Soja [DOE-JGI SCP, versão Sbil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) phytozome (dot) net/)]; Genoma parcialmente montado do milho [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (dot) org/]; As sequências de EST e mRNA expressas foram extraídas das seguintes bases de dados: Sequências EST e RNA do NCBI (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/dbEST/); RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/RefSeq/); TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/); Bases de dados de proteínas e vias Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/].
[00322] AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/biocyc/index (dot) jsp].
[00323] ENZYME [Hypertext Transfer Protocol://expasy (dot) org/enzyme/].
[00324] Os conjuntos de dados de micromatriz foram baixados de: GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).
[00325] Dados de microtriz proprietário (Vide W02008/122980) e Exemplos 2-9 abaixo.
[00326] Informações de QTL e SNPs Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) gramene (dot) org/qt1/].
[00327] Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) PAnzea (dot) org/index (dot) html].
[00328] Conjunto de base de dados - foi realizada para construir uma base de dados anotada ampla, rica, confiável e de fácil análise contendo sequências genômicas de mRNA, ESTs DNA disponíveis ao público, dados de vários cultivos, bem como QTLs de dados de expressão de gene, anotação de proteína e vias, e outras informações relevantes.
[00329] O conjunto de base de dados compreende uma caixa de ferramentas de refinação, estruturação, anotação e análise de genes, permitindo a construção de uma base de dados personalizada para cada projeto de descoberta de gene. As ferramentas de refinação e estruturação de genes permite detectar, de forma confiável, variantes de conexão e transcrições antisense, gerar a compreensão de vários resultados fenotípicos em potencial de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD para análise do genoma humano foram confirmadas aceitas pela comunidade cientifica [vide, por exemplo, "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002], também demonstraram ser mais eficientes no genoma de planta. Clustering de EST e montagem de gene - Para o clustering e a montagem de genes de organismos com dados disponíveis da sequência de genoma (arabidopsis, arroz, feijão em fava, uva, brachypodium, álamo, soja, sorgo), a versão LEADS genômica (GANG) foi empregada. Essa ferramenta permite um clustering mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma, e prevê a estrutura do gene, bem como eventos alternativos de splicing transcrição anti-sense.
[00330] Para organismos sem dados completos de sequência de genoma disponíveis, o software de clustering "expressed LEADS" foi aplicado.
[00331] Anotação de gene - Os genes e proteínas previstos foram anotados como segue: foi realizada uma busca em blast [Hypertext Transfer Protocol://blast (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] contra todas as sequências de planta UniProt [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) uniprot (dot) org/]. Quadros de leitura aberta de cada suposta transcrição foram analisados e ORF mais longo com maior número de homólogos foi selecionado como a proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas por InterPro [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ebi (dot) ac (dot) uk/interpro/].
[00332] Blast contra proteínas de AraCyc e bases de dados ENZYME foram utilizadas para mapear as transcrições previstas para via de AraCyc.
[00333] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando algoritmo de blast [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov /Blast (dot) cgi] para validar a precisão da sequência protéica prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.
[00334] Perfil de expressão de gene - Várias fontes de dados foram exploradas para o perfil de expressão de gene que combinou dados de micromatriz e perfil digital de expressão (vide abaixo). De acordo com o perfil de expressão de gene, a análise de correlação foi realizada para identificar genes que são co-regulados em diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e que estão associados a diferentes fenótipos.
[00335] Conjuntos de dados de micromatriz disponíveis ao público foram baixadas dos sites da TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos dados de recurso mais importantes para identificar genes importantes para rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso de nitrogênio.
[00336] Um resumo de perfil de expressão digital foi compilado para cada cluster de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequência compreendendo o cluster. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe um perfil de expressão virtual com base nas sequências EST que formam o cluster do gene. A ferramenta provê o perfil de expressão de um cluster em termos de anatomia da planta (por exemplo, o tecido/órgão no qual o gene é expresso), estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (provê as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, tais como estiagem, frio, infecção por patógenos, etc.). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos diferentes clusters, a expressão digital provê um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um cluster ter um total de N ESTs para conter X ESTs de uma certa coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no cluster, b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas e relacionadas, c) o número total de ESTs disponíveis que representam a espécie. Assim, os clusters com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse, indicando uma expressão especializada.
[00337] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) in: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) in: Quatorze amostras de cDNA de dupla-fita obtidas de dois genótipos, dois tecidos de fruta (polpa e casca) e quatro estágios de desenvolvimento foram sequenciados. O pirosequenciamento GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas resultaram em 1.150.657 tags de sequência expressos que se montaram em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). Aanálise dos dados obtidos em comparação à base de dados Cucurbit Genomics [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) icugi (dot) org/] confirmou a precisão do sequenciamento e da montagem. Os padrões de expressão de genes selecionados correspondeu bem aos seus dados qRT-POR. EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PARÂMETROS DE RENDIMENTO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO A MICROMATRIZ INTEGRAL DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE GENOMA DE ARABIDOPSIS 44K
[00338] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Arabidopsis thaliana produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa aproximadamente 40.000 genes e transcrições de A. thaliana projetadas com base nos dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e das bases de dados de Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados ao rendimento, biomassa ou vigor, várias características de planta de 15 diferentes ecotipos de Arabidopsis foram analisados. Dentre eles, nove ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00339] Procedimentos experimentais Extração de RNA - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento incluindo a raiz, folha, flor em antese, semente 5 dias após o florescimento (DAF) e semente 12 DAF, representando diferentes características da planta, foram amostradas e o RNA foi extraído conforme descrito no Exemplo 3 acima. Os conjuntos de expressão (ex.: raiz, folha, etc.) estão presentes na Tabela 26 abaixo.
[00340] Componentes de rendimento e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor - oito de nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (a saber, A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por canteiro. As plantas foram cultivadas em uma estufa sob condições controladas em 22°C, o fertilizante N:P:K [20:20:20; relações de peso; nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado; Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados durante o estágio de muda de plantas cultivadas em cultura do tecido em placas de ágar transparentes com crescimento vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagem digital.
[00341] Imagem digital em ensaios de Cultura de tecidos - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi utilizado para capturar imagens de plantas semeadas em placas quadradas de ágar. O sistema de aquisição de imagem de laboratório consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que incluía 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura.
[00342] Imagem digital em ensaios em estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera com uma lente de comprimento focal de 24 mm (Canon EF series), colocada em um cavalete de ferro customizado, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores cerradas em vasos brancos em uma estufa com ambiente controlado. Os vasos brancos tinham formato quadrado com medidas de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.
[00343] Foi utilizado um sistema de análise de imagem que consistia em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00344] Análise da folha - Utilizando análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número, a área, o perímetro, o comprimento e a largura da folha. No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de cada canteiro dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como, área total da folha, comprimento laminar etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade do limbo foi calculado como a largura laminar dividida pelo comprimento laminar.
[00345] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 2 dias, começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento da raízes foi documentado (Figuras 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula V. Fórmula V: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente da cobertura da raiz ao longo do tempo.
[00346] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com a Fórmula VI. A análise foi concluída com o aparecimento de plantas sobrepostas. Fórmula VI: Área da taxa de crescimento vegetativo relativo = Coeficiente da regressão da área vegetativa ao longo do tempo.
[00347] Para comparação entre os ecotipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas reais. No casos em que as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), somente a maior amostra foi escolhida e acrescentada à comparação Anova.
[00348] Sementes em análise de síliquas - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletadas de cada canteiro nos blocos D e E. As síliquas escolhidas estavam marrom claras, porém ainda intactas. As síliquas de cada canteiro foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e fotografadas utilizando uma câmera digital de alta resolução. Utilizando as imagens, o número de sementes por síliqua foi determinado.
[00349] Peso médio das sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00350] Percentual de óleo nas sementes - Ao final do experimento, todas as sementes dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. Sementes Columbia de 3 canteiros foram misturadas e trituradas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como solvente. A extração foi realizada por 30 horas com temperatura média de 50° C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador sob 35° C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a NMR de Baixa Ressonância.
[00351] teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinada utilizando a NMR de Baixa Ressonância (MARAN Ultra-Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00352] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada canteiro foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas era verde-amarelas e foram coletadas das partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.
[00353] Peso seco e rendimento de semente - No dia 80 após a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) após secagem a 20°C em uma câmara de secagem; Rendimento de semente por planta = peso de semente total por planta (g). Rendimento de óleo - O rendimento de óleo foi calculado utilizando a Fórmula IX. Fórmula VII: Rendimento de óleo da semente = Rendimento de semente por planta (g) * % de óleo na semente.
[00354] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV conforme descrito acima [Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta / peso médio seco]. Resultados experimentais
[00355] Nove diferentes ecotipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados para 18 parâmetros (nomeados como vetores de correlação na Tabela 26). Os parâmetros medidos estão presentes nas Tabelas 1 e 2 abaixo. As correlações da expressão dos genes em vários tecidos com essas medições fenotípicas são apresentadas na Tabela 26, como "Arabidopsis 1" na coluna "Conjunto de Vetor". Tabela 1
Figure img0001
[00356] Tabela 1. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: Rendimento de semente por planta (grama); rendimento de óleo por planta (mg); % de óleo por semente; peso de 1000 sementes (gr); matéria seca por planta (gr); índice de colheita; área total da folha por planta (cm); sementes por síliqua; comprimento da síliqua (cm), "gr" = gramas; "mg" = miligramas; "cm" = centímetros."Tabela 2
Figure img0002
[00357] Tabela 2. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: Cresc. Veg. = taxa de crescimento vegetativo (cm2/dia) até 8 folhas reais; crescimento relativo da raiz = crescimento relativo da raiz (cm/dia); comprimento da raiz, dia 7 (cm); comprimento da raiz, dia 13 (cm); peso fresco por planta (g) no estágio de brotação; comprimento da lâmina = comprimento da lâmina (cm); Largura da lâmina = Largura da lâmina (cm); Largura/comprimento da folha; circularidade do limbo. EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PARÂMETROS DE RENDIMENTO E CONDIÇÕES LIMITADORAS DE NITROGÊNIO UTILIZANDO A MICROMATRIZ INTEGRAL DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE ARABIDOPSIS 44K
[00358] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (dot) chem (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Arabidopsis. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados ao rendimento, biomassa ou vigor, várias características de planta de 14 diferentes ecotipos de Arabidopsis foram analisados. Dentre eles, dez ecotipos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson. Procedimentos experimentais
[00359] Extração de RNA - dois tecidos de plantas [folhas e caules] cultivados em dois níveis diferentes de fertilização de nitrogênio (Nitrogênio 1,5 mM ou Nitrogênio 6 mM) foram amostrados e o RNA foi extraído conforme descrito acima. Os conjuntos de expressão (ex.: raiz, folha, etc.) estão presentes na Tabela 26 abaixo.
[00360] Avaliação dos componentes de rendimento da Arabidopsis e parâmetros relacionados ao vigor sob diferentes níveis de fertilização de nitrogênio - 10 adesões de Arabidopsis em 2 canteiros repetitivos, cada um contendo 8 plantas por canteiro, foram cultivadas na estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi: Sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos de Eppendorf contendo 0,5 x Murashige-Skoog sal basal médio e cultivado em 23°C sob ciclos diários de 12 horas claras e 12 horas escuras por 10 dias. Então, mudas de tamanho similar foram cuidadosamente transferidas para canteiros preenchidos com uma mistura de turfa e perlita em uma razão de 1:1. Condições constantes de limite de nitrogênio foram conseguidas por meio da irrigação de plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 2 mM CaC12, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 5 mM de KC1, 0,01 mM de H3B03 e microelementos, enquanto que a condição normal de irrigação (condição normal de Nitrogênio) foi conseguida por meio da aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3, suplementado com 2 mM e CaC12, 1,25 mM de KH2PO4, 1,50 mM de MgSO4, 0,01 mM de H3B03 e microelementos. Para seguir o crescimento da planta, as bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitadoras de nitrogênio foram iniciada e, subsequentemente, a cada 3 dias por 15 dias adicionais. A área da planta de roseta foi, então, determinada a partir das fotografias digitais. O software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotografias digitais [Hypertext Transfer Protocol://rsb (dot) info (dot) nih (dot) gov/ij/], utilizando scripts proprietários projetados para analisar o tamanho da área da roseta a partir de plantas individuais com uma função do tempo. O sistema de análise de imagem incluía um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1,37 (programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00361] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 26, abaixo.
[00362] Análise de NUE, rendimento dos componentes e parâmetros relacionados ao vigor - Dez ecotipos Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada uma contendo 8 plantas por cobertura, em uma estufa sob condição de temperatura controlada por aproximadamente 12 semanas. As plantas foram irrigadas com diferente concentração de hidrogênio, conforme descrito acima, dependendo do tratamento aplicado. Durante este tempo, dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada por imagem digital. Imagem digital - análise de estufa.
[00363] Um sistema de aquisição de imagens, que consiste de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 400D) acoplada com lentes focais de 55 mm de comprimento (série Canon EF-S) colocada em uma estrutura customizada feita de alumínio, foi utilizado para captura de imagens das plantas cultivadas em recipientes dentro de um ambiente de estufa controlado. O processo de captura de imagens foi repetido a cada 2-3 dias, começando no dia 9-12 até o dia 16-19 (respectivamente) a partir da transplantação.
[00364] Foi utilizado um sistema de processamento de imagens, o qual consiste de um computador pessoal de mesa (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagens baseado em Java, desenvolvido no U.S. National Institutes of Health [Institutos Nacionais de Saúde dos EUA] e está disponível gratuitamente na internet, em http://rsbweb.nih.gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888x2592 pixels) e armazenadas no formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). A seguir, os dados de saída de processamento de imagem foram salvos em arquivos textos e analisados utilizando-se um software de análises estatísticas JMP (instituto SAS).
[00365] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número, a área de limbo da folha, a cobertura do canteiro, o diâmetro da Roseta e a área da Roseta da folha.
[00366] Área de taxa de crescimento relativo: A taxa de crescimento e a taxa de crescimento relativo da roseta e das folhas foram calculadas de acordo com as seguintes fórmulas VIII e IX:
Figure img0003
* 41 É o dia atual da imagem analisada subtraído do dia inicial (Significando que a taxa de crescimento da área é medida em unidades de cm/dia e a taxa de crescimento do comprimento é medida em unidades de cm/dia).
[00367] *EU Embora os exemplos mostrados aqui sejam para os parâmetros da taxa de crescimento da área, os parâmetros da taxa de crescimento do comprimento são calculados utilizando fórmulas similares.
[00368] Rendimento da semente e peso de 1000 sementes - No final do experimento todas as sementes de todos os canteiros foram coletadas e pesadas para medir o rendimento da semente por planta em termos de peso total de semente por planta (gr). Para o cálculo do peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram espalhadas sobre uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00369] Peso seco e rendimento de semente - No final do experimento, as plantas foram colhidas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 30°C em uma câmara de secagem.
[00370] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (Índice de colheita = Rendimento médio de semente por planta / peso seco médio).
[00371] T50 dias para florescimento - Cada uma das plantas foi monitorada por data de florescimento. Os dias de florescimento foram calculados do dia de cultivo até que 50% dos canteiros estivessem florescidos.
[00372] Nível de nitrogênio da planta - O conteúdo de clorofila das folhas é um bom indicador do status de nitrogênio da planta, já que o grau de verdor da folha é altamente correlaciona a tal parâmetro. O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro. Com base nesta medida, parâmetros como a razão entre o rendimento da semente por unidade de nitrogênio [rendimento da semente/nivel N = rendimento da semente por planta [gr]/unidade de SPAD], DW da planta por unidade de nitrogênio [DW/ nível N = biomassa da planta por planta [g]/unidade de SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [nível N/DW= unidade de SPAD/ biomassa da planta por planta (gr)] foram calculados.
[00373] Porcentagem da redução do rendimento da semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas sob condições limitadoras de nitrogênio comparadas ao rendimento de sementes produzidas em níveis normais de nitrogênio expressados em %. Tabela 3
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[00374] Tabela 3. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 1,5 mM Área da Roseta dia 8 (medida em cm2); N 1,5 mM Área da Roseta dia 10 (medida em cm2); N 1,5 mM Número da Folha dia 10; N 1,5 mM Área do Limbo da Folha dia 10 (medida em cm2); N 1,5 mM TCR da área da Roseta dia 3; N 1,5 mM Florescimento t50 (medida em dias); "cm" = centímetros". Tabela 4.
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[00375] São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 1,5 mM Peso Seco (medido em gramas); N 1,5 mM Rendimento da Semente (medido em gr/planta); N 1,5 mM Índice de Colheita; N 1,5 mM Peso de 1000 sementes (medido em gramas); N 1,5 mM rendimento da semente por área da roseta dia 10 (medido em gr/planta *cm2); N 1,5 mM rendimento da semente por limbo da folha (medido em gr/planta *cm2); Tabela 5
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[00376] Tabela 5. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 6 mM Área da Roseta dia 8; N 6 mM Área da Roseta dia 10; N 6 mM Número da Roseta dia 10; N 6 mM Área do Limbo da Folha dia 10. Tabela 6 Parâmetros adicionais medidos em ecotipos da Arabidopsis
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[00377] Tabela 6. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 6 mM TCR da Área da Rose dia 3; N 6 mM Florescimento t50 (medido em dias); N 6 mM Peso Seco (medido em gr/planta); N 6 mM Rendimento da Semente (medido em gr/planta); N 6 mM índice de Colheita; N 6 mM Peso de 1000 Sementes (medido em gr); "gr." = gramas; "mg" = miligramas; "cm" = centímetros". Tabela 7 Parâmetros adicionais medidos em ecotipos da Arabidopsis
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[00378] Tabela 7. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 6 mM rendimento da semente/área da roseta dia 10 (medido em gr/planta*cm2); N 6 mM rendimento da semente/limbo da folha (medido em gr/planta*cm2); Tabela 8 Parâmetros adicionais medidos em ecotipos da Arabidopsis
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[00379] Tabela 8. São apresentados os valores de cada um dos parâmetros medidos em ecotipos de Arabidopsis: N 6 mMSpad/Peso Fresco; N 6 mM Peso Seco/SPAD (biomassa/ Nunidade); N 6 mM spad/Peso Seco(gN/g plant); N 6 mM Rendimento da Semente/N unidade (medido em gr/N unidades); N 1,5 mM Spad/Peso Fresco (medido em 1/gr); N 1,5 mM SPAD/Peso Seco (medido em 1/gr); N 1,5 mM Peso Seco/SPAD (medido em 1/gr); N 1,5 mM rendimento da semente/spad (medido em gr); Resultados experimentais
[00380] Dez diferentes adesões de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivadas e caracterizadas para 33 parâmetros, conforme descrito acima (Tabelas 3-8). A média de cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP. A análise de correlação subsequente foi realizada entre os parâmetros caracterizados nos ecotipos Arabidopsis (que são utilizados como um eixo x para correlação) e a transcrição do tecido, e genes exibindo uma correlação significante para características selecionadas (classificadas utilizando o vetor de correlação) são apresentados na Tabela 26 abaixo, juntamente com os seus valores de correlação (R, calculados utilizando a correlação de Pearson) e os valores p sob a categoria dos conjuntos de vetor Arabidopsis 2 NUE e Arabidopsis 2. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TOMATE E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO DE PRODUÇÃO UTILIZANDO A MICROMATRIZ DE OLIGONUCLEOTÍDIO DE TOMATE
[00381] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Barley, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Tomate. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com ABST, parâmetros relacionados ao rendimento ou vigor, várias características de planta de 18 diferentes ecotipos de Tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson. I. Correlação das variedades de Tomate ao longo do ecotipo cultivado sob condições de irrigação em 50% Procedimentos experimentais
[00382] Procedimento de Cultivo - A variedade de tomate foi cultivada sob condições normais (4-6 litros/m por dia) até o estágio de florescimento. Nesse momento, a irrigação foi reduzida para 50% comparada com condições normais.
[00383] Extração de RNA - Dois tecidos com diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Os conjuntos de expressão (ex.: raiz e folha) estão presentes na Tabela 26 abaixo.
[00384] Parâmetros relacionados aos componentes de rendimento e vigor de tomate sob avaliação de irrigação de água com 50% - 10 variedades de tomate em 3 blocos repetitivos (nomeados de A, B, C e D), cada um contendo 6 plantas por canteiro foram cultivados na estufa. As plantas foram fenotipadas em uma base diária seguindo o descritor padrão de tomate (Tabela 11, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% das frutas estavam vermelhas (maduras). As plantas foram separadas em suas partes vegetativas e frutas, das quais, dois nós foram analisados quanto a parâmetros inflorescentes adicionais tais como tamanho, número de flores e peso inflorescente. Foi medido o peso fresco de todo o material vegetativo. As frutas foram separadas em cores (vermelhas x verdes) e de acordo com o tamanho da fruta (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00385] Os parâmetros de dados coletados estão resumidos na Tabela 9 abaixo. Tabela 9 Parâmetros correlacionados de tomate (vetores)
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[00386] Tabela 9. São fornecidos os parâmetros correlacionados da tomate, "gr" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; Peso da Fruta (gramas) - Ao final do experimento, [quando 50% das frutas estavam maduras (vermelhas)] todas as frutas dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. O total de frutas foi contado e pesado. O peso médio das frutas foi calculado pela divisão do peso total das frutas pelo número total de frutas.
[00387] Peso Vegetativo da Fruta (gramas) - Ao final do experimento, [quando 50% das frutas estavam maduras (vermelhas)] todas as frutas dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. O peso fresco foi medido (gramas). Peso da Inflorescência
[00388] (gramas) - Ao final do experimento, [quando 50% das frutas estavam maduras (vermelhas)] todas as frutas dos canteiros dos blocos A-C foram coletadas. O peso da Inflorescência (gr) e o número de flores por inflorescência foram contadas.
[00389] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro. Eficiência do uso de água
[00390] (WUE) - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração de unidade. Para analisar o WUE, o teor relativo de conteúdo da folha pode ser medido nas plantas transgênicas e de controle. O peso fresco (FW - Fresh Weight) foi registrado imediatamente; as folhas foram então encharcadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (TW) foi registrado. O peso seco total (DW) foi registrado após a secagem das folhas a 60°C em peso constante. O Conteúdo Relativo de Água (CRA) foi calculado de acordo com a Fórmula I (PF - PS/PT - PS) x 100] conforme descrito acima.
[00391] Plantas que mantêm um alto teor relativo de água (TRA) comparadas a linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à estiagem do que aqueles que demonstram conteúdo relativo reduzido de água.
Resultados experimentais
[00392] Dez diferentes adesões de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivadas e caracterizadas para 23 parâmetros, conforme descrito abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 10, 11 e 12 abaixo. A análise subsequente de correlação entre a expressão dos genes selecionados em diversos conjuntos de expressão de transcriptom e os parâmetros medidos em adesões de tomate (Tabelas 10-12) foi realizada, e os resultados foram integrados à base de dados e fornecidos na Tabela 26 abaixo sob a categoria dos conjuntos de vetores, campo de vetores de tomate Normal, campo de vetores de tomate Estiagem. Tabela 10 Parâmetros medidos em adesões de Tomate
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[00393] Tabela 10: São fornecidos os parâmetros relacionados aos componentes medidos de rendimento e vigor sob irrigação normal ou 50% de água para as adesões de tomate (Variedades) de acordo com os números de ID de Correlação (descritos na Tabela 9 acima) conforme segue: 2 [50 % de Irrigação; Fruta por planta (gr.)]; 10 [Irrigação Normal; Fruta por planta (gr.)]; 1 [50 % Irrigação; Peso Vegetativo Fresco (gr.)]; 9 [Irrigação Normal; Peso Vegetativo Fresco (gr.)]; 7 [50 % Irrigação; Peso médio das frutas maduras (gr.)]; 15 [Irrigação Normal; Peso médio das frutas maduras (gr.)]; 18 [50 % Irrigação; Fruta por planta (gr.)/ Irrigação Normal; Fruta por planta (gr.)]; 17 [50 % Irrigation; Peso vegetativo fresco (gr.)/ Irrigação Normal; peso vegetativo fresco (gr.)]. Tabela 11 Parâmetros adicionais medidos em adesões de Tomate
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[00394] Tabela 11: São fornecidos os parâmetros relacionados aos componentes medidos de rendimento e vigor sob irrigação de 50% de água para as adesões de tomate (Variedades) de acordo com os números de ID de Correlação (descritos na Tabela 9 acima) conforme segue: 22 [50 % Irrigação; Peso médio da fruta madura (gr.)/ Irrigação Normal; Peso médio da fruta madura (gr.)]; 8 [50 % Irrigação: SPAD]; 16 [Irrigação Normal; SPAD]; 5 [50 % Irrigação ; eficiência relativa do uso da água]; 13 [Irrigação Normal; eficiência relativa do uso da água]; 23 [50 % Irrigação: SPAD/ Irrigação Normal; SPAD], Tabela 12 Parâmetros adicionais medidos em adesões de Tomate
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[00395] Tabela 12: São fornecidos os parâmetros relacionados aos componentes medidos de rendimento e vigor sob irrigação de 50% de água para as adesões de tomate (Variedades) de acordo com os números de ID de Correlação (descritos na Tabela 9 acima) conforme segue: 21 [50 % Irrigação; eficiência relativa do uso da água/ Irrigação Normal; Eficiência do uso da água]; 4 [50 % Irrigação; número de flores];12 [Irrigação Normal; número de flores]; 3 [50 % Irrigação; Peso de inflorescência (gr.)]; 11 [Irrigação Normal; Peso de inflorescência (gr.)]; 20 [50 % Irrigação; número de flores/ Irrigação Normal; número de flores]; 19 [50 % Irrigação; Peso de inflorescência (gr.)/ Irrigação Normal; Peso de inflorescência (gr.)].II. Correlação das variedades de Tomate sob estresse construído sob condições de 50% de irrigação Procedimentos experimentais
[00396] Procedimento de Cultivo - As variedades de tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m por dia) até o estágio de florescimento. Nesse momento, a irrigação foi reduzida para 50% comparada com condições normais. Amostras de tecido foram colhidas durante período de estresse desenvolvido a cada dois dias.
[00397] Extração de RNA - Todas as 10 variedades de Tomate selecionadas foram amostradas por cada tratamento. Dois tecidos [folhas e flores] sendo cultivados sob condições normais ou 50% de irrigação foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando o Reagente TRIzol da Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) invitrogen (dot) com/content (dot) cfriapageid=469]. Os conjuntos de expressão (ex.: raiz e folha) estão presentes na Tabela 26 abaixo. A extração de RNA dos tecidos foi realizada conforme descrito no Exemplo 2 acima.
[00398] Correlação de características precoces ao longo da coleta de ecotipos de tomate sob alta concentração de salinidade - Dez variedades de tomate foram cultivadas em três canteiros repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa sob condições semi-hidropônicas. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: As sementes de tomate foram semeadas em bandejas cheias de uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas para condições de cultivo de alta salinidade (solução de 100 mMM NaCl) ou para condições normais de crescimento [Hogland campleoto; KNO3 - 0,808 gramas / litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) de micro elementos de 'Super coratin "(Ferro- EDDHA [etilenodiamina-N, N'-bis (2-ácido hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro, e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6,5 - 6,8].
[00399] Parâmetros relacionados ao vigor da tomate sob 100 mM NaC1 - Após 5 semanas do cultivo, a planta foi colhida e analisada quanto ao número de folhas, altura da planta e peso da planta (os parâmetros de dados são resumidos na Tabela 13). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Tabela 13 Parâmetros correlacionados de tomate (vetores)
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[00400] Tabela 13. São apresentados os parâmetros correlacionados de tomate (IDs números 1-7). Resultados experimentais
[00401] Dez diferentes variedades de Tomate foram cultivadas e caracterizadas para 7 parâmetros, conforme descrito abaixo (Tabela 13). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos na Tabela 14 abaixo. A análise de correlação subsequente entre a expressão dos genes selecionados em vários conjuntos de expressão de transcriptom e os parâmetros médios medidos foi conduzida e os resultados foram integrados à base de dados e fornecidos na Tabela 26 abaixo, sob os conjuntos de vetor: Banho de vetores de tomate Normal, e banho de vetores de tomate Salinidade. Tabela 14 Parâmetros medidos em adesões de tomate
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[00402] Tabela 14. São fornecidos os parâmetros relacionados aos componentes medidos de rendimento e vigor sob condições normais ou de 100 mM NaC1 para as adesões de tomate (Variedades) de acordo com os números de ID de Correlação (descritos na Tabela 13 acima) conforme segue: 1 [100 mM NaCl: Número de folhas], 4 [Normal: Número de folhas]; 2 [100 mM NaCl: Altura da planta]; 5 [Normal: Altura da Planta]; 3 [100 mM NaCl: Biomassa da Planta]; 6 [100 mM NaCl: Número de folhas/Normal: Número de folhas]; 7 [100 mM NaCl: Altura da planta/Normal Altura da planta]. EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DO TRANSCRIPTOM B. JUNCEA E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO UTILIZANDO 44KB. MICROMATRIZES DO OLIGONUCLEOTÍDEO JUNCEA
[00403] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de B. Juncea, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 60.000 genes e transcrições de B. juncea. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento, várias características de planta de 11 diferentes ecotipos de B. juncea foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00404] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com característica fenotípicas ao longo do ecotipo Procedimentos experimentais Onze variedades de B. juncea foram cultivadas em três canteiros repetitivos, em campo.
[00405] Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: As sementes de B. juncea foram semeadas em solo e cultivadas sob condições normais até a colheita. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento, as onze diferentes variedades de B. juncea foram analisadas e utilizadas para análise de expressão do gene.
[00406] Extração de RNA - Todas as onze variedades de B. juncea selecionadas foram amostradas por cada tratamento. Tecidos de planta [folha, Caule, meristema lateral e flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Os conjuntos de expressão (ex.: folha, caule, meristema lateral e flor) estão presentes na Tabela 26 abaixo.
[00407] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: Peso fresco (canteiro-colheita) [gr/planta] - peso fresco total por canteiro no momento da colheita normalizado ao número de plantas por canteiro.
[00408] Peso da Semente [miligramas/planta] - o total de sementes de cada canteiro foi extraído, pesado e normalizado para o número de planta em cada canteiro.
[00409] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado: peso da semente/peso fresco
[00410] Dias até a peneiração/florescimento - número de dias até 50% da peneiração/florescimento para cada canteiro.
[00411] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas para cada canteiro.
[00412] Ramo principal - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo principal.
[00413] Ramo lateral - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo lateral.
[00414] Ramo principal - 20° comprimento- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo principal.
[00415] Ramo lateral - 20° comprimento- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo lateral.
[00416] Ramo principal - 20° n° de sementes- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo principal.
[00417] Ramo lateral - 20° n° de sementes- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo lateral.
[00418] Número de ramos laterais - número total de ramos laterais, média de três plantas por canteiro.
[00419] Altura do ramo principal [cm] - comprimento total do ramo principal.
[00420] Posição min. do ramo lateral - nó mais baixo no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.
[00421] Posição max. do ramo lateral - nó mais alto no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.
[00422] Número máximo de nós no ramo lateral - o número mais alto de nós que um ramo lateral teve por planta.
[00423] Comprimento máximo do ramo lateral [cm] - o maior comprimento do ramo lateral por planta.
[00424] Diâmetro máximo do ramo lateral [mm] - o maior diâmetro de base que um ramo lateral teve por planta.
[00425] Teor de Óleo - A análise indireta do teor de óleo foi realizada utilizando a Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)].
[00426] Peso fresco (planta única) (gr/planta) - peso fresco médio de três plantas por canteiro medido no meio da estação. Diâmetro base do ramo principal [mm] - o diâmetro base do ramo principal, média de três plantas por canteiro.
[00427] 1000 Sementes [gr] - peso de 1000 sementes por canteiro. Resultados experimentais
[00428] Onze diferentes variedades de B. juncea (ou seja, sementes ID 646, 648, 650, 657, 661, 662, 663, 664, 669, 670, 671) foram cultivadas e caracterizadas em 23 parâmetros, conforme especificado acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos na Tabela 15 abaixo. A análise subsequente de correlação entre os diversos conjuntos de transcriptom e os parâmetros médios, foi conduzida. Os resultados foram então integrados à base de dados e as correlações selecionadas são mostradas na Tabela 26 abaixo, sob a coluna conjunto de vetor, vetor de ecotipos Juncea. Tabela 15 Parâmetros medidos em adesões de B. juncea
Figure img0016
[00429] Tabela 15: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de B. juncea (ID da semente) sob condições normais. EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DO TRANSCRIPTOM B. JUNCEA E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS DE RENDIMENTO DE JUNCEA CULTIVADA SOB VÁRIA DENSIDADES DE POPULAÇÃO UTILIZANDO MICROMATRIZES DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE 44KB. JUNCEA
[00430] Para produzir uma análise de alta correlação de produção, os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de B. Juncea, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 60.000 genes e transcrições de B. juncea. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento, várias características de planta de duas diferentes variedades de B. juncea cultivadas sob sete diferentes densidades de população foram analisadas e utilizadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00431] Correlação dos níveis de expressão dos genes de B. juncea com característica fenotípicas ao longo de sete densidades de população para dois ecotipos Procedimentos experimentais
[00432] Duas variedades de B. juncea (646 e 671) foram cultivadas em um campo sob sete densidades de população (10, 60, 120, 160, 200, 250 e 300 plantas por m) em dois canteiros repetitivos. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: As sementes de B. juncea foram semeadas em solo e cultivadas sob condições normais até a colheita. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento, as duas diferentes variedades de B. juncea cultivada sob várias densidades de população foram analisadas e utilizadas para análise de expressão do gene. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson para cada ecotipo independentemente.
[00433] Extração de RNA - as duas variedades de B. juncea cultivadas sob sete densidades de população foram amostradas por cada tratamento. Tecidos de planta [Meristema lateral e flor] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micromatriz recebeu uma ID de Conjunto. Os conjuntos de expressão (ex.: Flor e Meristema Lateral) estão inclusos na Tabela 26 abaixo.
[00434] Os parâmetros de dados coletados foram conforme segue: Peso fresco (canteiro-colheita) [gr/planta] - peso fresco total por canteiro no momento da colheita normalizado ao número de plantas por canteiro.
[00435] Peso da Semente [gr/planta] - o total de sementes de cada canteiro foi extraído, pesado e normalizado para o número de planta em cada canteiro.
[00436] Índice de colheita - O índice de colheita foi calculado: peso da semente/peso fresco
[00437] Dias até a peneiração/ florescimento - número de dias até 50% da peneiração/ florescimento para cada canteiro.
[00438] SPAD - O conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada no momento do florescimento. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas para cada canteiro.
[00439] Ramo principal - comprimento médio do nó - comprimento total/número total de nós no ramo principal.
[00440] Ramo lateral - comprimento médio do nó - comprimento total / número total de nós no ramo lateral.
[00441] Ramo principal - 20° comprimento- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo principal.
[00442] Ramo lateral - 20° comprimento- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo lateral.
[00443] Ramo principal - 20° n° de sementes- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo principal.
[00444] Ramo lateral - 20° n° de sementes- o comprimento da planta no 20° nó da ponta do ramo lateral.
[00445] Número de ramos laterais - número total de ramos laterais, média de três plantas por canteiro.
[00446] Altura do ramo principal [cm] - comprimento total do ramo principal.
[00447] Posição min. do ramo lateral - nó mais baixo no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.
[00448] Posição max. do ramo lateral - nó mais alto no ramo principal que desenvolveu o ramo lateral.
[00449] Número máximo de nós no ramo lateral - o número mais alto de nós que um ramo lateral teve por planta.
[00450] Comprimento máximo do ramo lateral [cm] - o maior comprimento do ramo lateral por planta.
[00451] Diâmetro máximo do ramo lateral [mm] - o maior diâmetro de base que um ramo lateral teve por planta.
[00452] Teor de Óleo - A análise indireta do teor de óleo foi realizada utilizando a Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin/Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)]; Peso fresco (planta única) (gr/planta) - peso fresco médio de três plantas por canteiro medido no meio da estação. Diâmetro base do ramo principal [mm] - o diâmetro base do ramo principal, média de três plantas por canteiro.
[00453] 1000 Sementes [gr] - peso de 1000 sementes por canteiro. Número total de vagens no ramo principal - número total de vagens no ramo principal, média de três plantas por canteiro. Ramo principal dist. 1-20 - o comprimento entre a vagem mais jovem e a vagem número 20 do ramo principal, média de três plantas por canteiro.
[00454] Número total de vagens no ramo lateral - número total de vagens no ramo lateral, média de três plantas por canteiro. Ramo lateral dist. 1-20 - o comprimento entre a vagem mais jovem e a vagem número 20 do ramo lateral, média de três plantas por canteiro.
[00455] Peso seco/planta - peso das plantas totais por canteiro na colheita após três dias em forno sob 60° C normalizado para o número de plantas por canteiro.
[00456] Área total da folha - A área total da folha por canteiro foi calculada com base em três plantas aleatórias e normalizada para o número de plantas por canteiro.
[00457] Perímetro Total - o perímetro total das folhas foi calculado com base em três plantas aleatórias e normalizado para o número de plantas por canteiro. Resultados experimentais
[00458] Duas variedades de B. juncea foram cultivadas sob sete diferentes densidades de população e caracterizadas por 29 parâmetros, conforme especificado abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos na Tabela 16 abaixo. A análise subsequente de correlação entre a expressão de genes selecionados em vários conjuntos de expressão de transcriptom e os parâmetros médios, foi conduzida. Os resultados foram então integrados à base de dados e fornecidos na Tabela 26 abaixo, sob a coluna conjuntos de vetor, densidades de população Juncea. Tabela 16 Parâmetros medidos em adesões de B. juncea em várias densidades de
Figure img0017
[00459] Tabela 16: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de B. juncea (ID da semente) em sete densidades de população (Densidade de População) sob condições normais. Param. = parâmetro. EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE SORGO E ALISE DE ALTA CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS RELACIONADOS COM RENDIMENTO, NUE E ABST MEDIDOS EM CAMPOS UTILIZANDO MICROMATRIZES DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K
[00460] Para produzir uma análise de alta correlação de produção entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de Sorgo, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de Sorgo. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com ABST, parâmetros relacionados ao rendimento ou vigor, várias características de planta de 17 diferentes híbridos de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00461] Correlação de variedades de Sorgo ao longo de ecotipos cultivados sob baixo nitrogênio, crescimento regular e condições severas de estiagem Procedimentos experimentais
[00462] Dezessete variedades de Sorgo foram cultivadas em três canteiros repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de crescimento foi o seguinte: Condições de cultivo regular: plantas de sorgo foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação.
[00463] Condições de fertilização com baixo nitrogênio: plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos nitrogênio no campo que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento regular de crescimento. Todo o fertilizante foi aplicado antes do florescimento.
[00464] Estresse de estiagem: as sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas sob condição normal até cerca de 35 dias após a semeadura, perto do V8. Nesse momento, a irrigação foi para e foi desenvolvido um estresse de estiagem severo. Para definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados com NUE, estiagem e componentes rendimento as 17 diferentes variedades de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00465] Tecidos de Sorgo Analisados - Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados por cada tratamento. Tecidos de planta [Flor da bandeira, Meristema da flor e Flor] sendo cultivados sob condições de baixo nitrogênio, estresse de estiagem severo e plantas cultivada sob condições normais foram amostradas e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.
[00466] Os seguintes parâmetros foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área Média do Grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Uma amostra de 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A área do grão foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos
[00467] Comprimento Médio do Grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Uma amostra de 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A soma dos comprimentos do grão (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.
[00468] Área Média da Cabeça (cm2) - No fim do período de cultivo cinco 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. A área da 'Cabeça' foi medida a partir das imagens e divida pelo número de 'Cabeças'. Comprimento Médio da Cabeça
[00469] (cm2) - No fim do período de cultivo cinco 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. O comprimento da 'Cabeça' foi medido a partir das imagens e divida pelo número de 'Cabeças'.
[00470] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, que consiste em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00471] Parâmetros adicionais foram coletados por amostragem de cinco plantas por canteiro ou pela medição de parâmetro ao longo de todas as plantas dentro do canteiro.
[00472] Peso médio das sementes por Cabeça (gr) - Ao final do experimento ('Cabeças' de plantas), as cabeças dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e pesadas. O peso médio dos grãos por cabeça foi calculado dividindo o peso total dos grãos pelo número de cabeças totais por canteiro (com base no canteiro). Em caso de cinco cabeças, o peso total dos grãos de cinco cabeças foi dividido por 5.
[00473] Peso Fresco de Cabeça por Planta gr - Ao final experimento (quando as cabeças foram colhidas) total e cinco cabeças selecionadas por canteiro dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e cinco) foram pesadas (gr.) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total (Peso Fresco da Cabeça/Planta gr com base no canteiro) e para as cinco (Peso Fresco da Cabeça/Planta gr com base em cinco plantas).
[00474] Altura das plantas - As plantas foram caracterizadas quanto à sua altura durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, as alturas das plantas foram medidas utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do chão até o topo da folha mais longa.
[00475] Número de folhas das plantas - As plantas foram caracterizadas quanto ao seu número de folhas durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, o número de folhas das plantas foi medido, contando todas as folhas das três plantas selecionadas por canteiro.
[00476] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando as Fórmulas X e XI, conforme segue: Fórmula X Taxa de crescimento relativo da altura da planta = Coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do curso de tempo. Fórmula XI Taxa de crescimento relativo do número de folhas da planta = Coeficiente de regressão do número de folhas da planta ao longo do curso de tempo.
[00477] SPAD - 0 conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro.
[00478] Peso seco vegetativo e Cabeças - Ao final do experimento, (quando a Inflorescência estava seca) todo material vegetativo e as Inflorescências dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. A biomassa e o peso das cabeças de cada canteiro foram separados, medidos e divididos pelo número de Cabeças.
[00479] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 70°C em forno por 48 horas.
[00480] Índice de colheita (IC) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XII. Fórmula XII: Índice de Colheita = Média de peso seco de grãos por Cabeça /(Média de peso seco vegetativo por Cabeça + Média de peso seco de Cabeça)
[00481] Peso Fresco de Cabeças (Peso Fresco de Cabeças + Peso Fresco de Plantas) - 0 peso fresco total de cabeças e sua respectiva biomassa de planta foi medida no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e das plantas. Resultados experimentais
[00482] 17 variedades diferentes de híbridos de sorgo foram cultivadas e caracterizadas para diferentes parâmetros: A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 1721) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 26 abaixo) sob os conjuntos de vetores "Campo Vetores de Sorgo Normal" ou "Campo Vetores de Sorgo NUE".Tabela 17 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)
Figure img0018
[00483] Tabela 17. São fornecidos os parâmetros correlacionados de Sorgo (vetores), "gr" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "FW" = Peso Fresco da Planta; "DW" = Peso seco da planta; "normal" = condições normais de crescimento. Tabela 18 Parâmetros medidos em adesões de Sorgo sob condições normais
Figure img0019
[00484] Tabela 18: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de Sorgo (ID da semente) sob condições normais. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 19 Parâmetros medidos em adesões de Sorgo sob baixas condições de nitrogênio
Figure img0020
[00485] Tabela 19: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de Sorgo (ID da semente) sob baixas condições de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 20 Parâmetros adicionais medidos em adesões de Sorgo sob baixas condições crescimento com nitrogênio
Figure img0021
[00486] Tabela 20: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de Sorgo (ID da semente) sob baixas condições de nitrogênio. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 21 Parâmetros medidos em adesões de Sorgo sob condições de estiagem
Figure img0022
[00487] Tabela 21: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de Sorgo (ID da semente) sob condições de estiagem. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOM DE MILHO E ANÁLISE DE ALTA CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS RELACIONADOS AO RENDIMENTO UTILIZANDO MICROMATRIZES DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 44K
[00488] Para produzir uma análise de alta correlação de produção entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene os presentes inventores utilizaram uma micromatriz de oligonucleotídeo de milho, produzida pela Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) chem. (dot) agilent (dot) com/Scripts/PDS (dot) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo de matriz representa cerca de 44.000 genes e transcrições de milho. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento ou NUE, várias características de planta de doze diferentes híbridos de milho foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos abrangendo a variância observada foram selecionadas para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00489] Correlação dos híbridos de milho ao longo de ecotipos cultivados sob condições regulars de crescimento Procedimentos experimentais
[00490] Doze híbridos de milho foram cultivadas em três canteiros repetitivos, em campo. As sementes de milho foram plantas e as plantações foram cultivadas no campo utilizando protocolos de fertilização e irrigação comercial. A fim de definir correlações entre os níveis de expressão de RNA com parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de rendimento e NUE, as doze diferentes variedades de híbridos de milho foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos abrangendo a variância observada foram selecionados para a análise da expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson.
[00491] Tecidos de Sorgo Analisados - Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados por cada tratamento. Tecidos de planta [Flor da bandeira, Meristema da flor, Grão, Espiga, Nós Internos] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.
[00492] Os seguintes parâmetros foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área do Grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A área do grão foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.
[00493] Comprimento e Largura do Grão (cm) - No final do período de cultivo os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de 200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito acima. A soma dos comprimentos/larguras do grão (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de grãos.
[00494] Área da Espiga (cm) - No fim do período de cultivo cinco espigas foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. A área da espiga foi medida a partir das imagens e divida pelo número de espigas.
[00495] Comprimento e Largura da Espiga (cm) - No fim do período de cultivo cinco espigas foram fotografadas e as imagens processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito. O comprimento e a largura da espiga (eixo mais longo) foi medida a partir das imagens e divida pelo número de espigas.
[00496] Foi utilizado o sistema de processamento de imagem, que consiste em um computador pessoal tipo desktop (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, que foi desenvolvido no U.S National Institutes of Health e livremente disponível na internet no endereço Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área e comprimento da semente foram salvos aos arquivos de texto e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Parâmetros adicionais foram coletados pela amostragem de seis plantas por canteiro ou ela medição do parâmetro ao longo de todas as plantas dentro do canteiro.
[00497] Peso Normalizado de Grão por planta (gr) - Ao final do experimento todas as espigas dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas. 6 espigas foram debulhadas separadamente e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e pesadas. O peso médio dos grãos por espiga foi calculado dividindo o peso total dos grãos pelo número de espigas totais por canteiro (com base no canteiro). Em caso de seis espigas, o peso total dos grãos de seis espigas foi dividido por 6.
[00498] Peso Fresco da Espiga (gr.) - No fim do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e seis espigas selecionadas por canteiro dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas (total e com seis) foram pesadas (gr.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada quanto ao total (Peso Fresco da Espiga por canteiro) e quanto a seis (Peso Fresco da Espiga por planta).
[00499] Altura da planta e Altura da espiga - As plantas foram caracterizadas quanto à sua altura durante a colheita. Em cada medição, as alturas de seis plantas foram medidas utilizando uma fita métrica. A altura foi medida do nível do chão até o topo da planta abaixo da borla. A altura da espiga foi medida do nível do chão até o local onde a espiga principal está localizada
[00500] Número de folhas por plantas - As plantas foram caracterizadas quanto ao seu número de folhas durante o período de cultivo em cinco momentos. Em cada medição, o número de folhas das plantas foi medido, contando todas as folhas das três plantas selecionadas por canteiro.
[00501] A Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando as Fórmulas X e XI (descrito acima).
[00502] SPAD - 0 conteúdo de clorofila foi determinado pela utilização de medidor de clorofila Minolta SPA 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor de SPAD foram feitas em folhas jovens completamente desenvolvidas. Três medidas por folha foram tiradas por canteiro. Os dados foram coletados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS)
[00503] Peso seco por planta - Ao final do experimento, (quando a Inflorescência estava seca) todo material vegetativo dos canteiros dentro dos blocos A-C foram coletadas.
[00504] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (exceto as raízes) após a secagem a 70°C em forno por 48 horas. Índice de colheita (IC)
[00505] (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula Fórmula XIII: Índice de Colheita = Média de peso seco de grãos por Espiga/(Média de peso seco vegetativo por Espiga + Média de peso seco de Espiga )
[00506] Porcentagem de Preenchimento da Espiga [%] - foi calculado como porcentagem da área da Espiga com grãos da espiga total.
[00507] Diâmetro da espiga [cm] - O diâmetro da espiga sem grãos foi medido utilizando uma régua.
[00508] Número de Fileiras de Cerne por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. Resultados experimentais
[00509] Doze variedades diferentes de híbridos de milho foram cultivadas e caracterizadas quanto a diferentes parâmetros: A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 2225) e uma análise de correlação subsequente foi realizada (Tabela 26 abaixo) utilizando o "Vetores de Milho Normal". Tabela 22 Parâmetros correlacionados de milho (vetores)
Figure img0023
[00510] Tabela 22. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Nível de clorofila após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS) . Tabela 23 Parâmetros medidos em adesões de Milho sob condições normais
Figure img0024
[00511] Tabela 23. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de milho (ID da semente) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 24 Parâmetros adicionais medidos em adesões de milho sob condições regulares de crescimento
Figure img0025
[00512] Tabela 24. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de milho (ID da semente) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 25 Parâmetros adicionais medidos em adesões de milho sob condições regulares de crescimento
[00513] Tabela 25. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em adesões de milho (ID da semente) sob condições normais de crescimento. As condições de crescimento são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 9 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO
[00514] A tabela 26 abaixo fornece resultados representatives das análises de correlação descritas nos Exemplos 2-8 acima. Tabela 26 Análises de correlação
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[00515] Tabela 26: Análises de Correlação. EXEMPLO 10 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E HOMÓLOGOS QUE AUMENTAM O RENDIMENTO, BIOMASSA, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, TEOR DE ÓLEO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO DE PLANTAS E EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO
[00516] Com base nas ferramentas experimentais e de bioinformática descritas acima, os presentes inventores identificaram 217 genes que possuem um grande impacto no rendimento, rendimento da semente, rendimento do óleo, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, rendimento da fibra, qualidade da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de nitrogênio quando a expressão presente for aumentada em plantas. Os genes identificados (incluindo os genes identificados por ferramentas de bioinformática e suas sequências curadas), e as sequências de polipeptídeo codificadas são resumidas na Tabela 27, logo abaixo. Tabela 27 Polinucleotídeos identificados que afetam o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio de uma planta
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[00517] Tabela 27: São apresentados os genes identificados, sua anotação, organismo e polinucleotídeo e identificadores de sequência polipeptídica, "polinucl." = polinucleotídeo; "polipep." = polipeptídeo. EXEMPLO 11 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM O RENDIMENTO DA SEMENTE, O RENDIMENTO DO ÓLEO, A TAXA DE CRESCIMENTO, O TEOR DE ÓLEO, O RENDIMENTO DA FIBRA, A QUALIDADE DA FIBRA, A BIOMASSA, O VIGOR, A ABST E/OU A NUE DE UMA PLANTA
[00518] Os conceitos de ontologia e paralogi a foram recentemente aplicados a caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações de genoma total. Os ortólogos e os parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: Os primeiros evoluíram de um ancestral comum por especialização e os outros estão relacionados por eventos de duplicação. Assume-se que os parálogos resultantes de eventos de duplicação de ancestrais provavelmente divergiram em termos de função enquanto que os reais ortólogos são mais prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução.
[00519] Para identificar supostos ortólogos dos genes que afetam o rendimento da planta, o rendimento de óleo, o teor de óleo, o rendimento de semente, a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, a tolerância ao estresse abiótico e/ou a eficiência no uso de nitrogênio, todas as sequências foram alinhadas utilizando a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool [Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local]). Sequências similares o suficiente foram tentativamente agrupadas. Esses supostos ortólogos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como sendo uma representação das relações de evolução entre a taxa biológica. Os supostos grupos ortólogos foram analisados quanto à sua concordância com o filograma e em casos de desacordos esses grupos ortólogos foram devidamente quebrados.
[00520] Os dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos padrão, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram perfil similar de expressão através do desenvolvimento com regulação ascendente em estágio específico, tal como o estágio de preenchimento da semente) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que apresentam perfil similar de expressão em todos os seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, tais como a semente). As anotações de todos os ESTs em cluster para um gene foram analisadas estatisticamente por comparação com sua frequência no cluster versus sua abundância na base de dados, permitindo a construção de um perfil de expressão numérico e gráfico daquele gene, que é denominado "expressão digital". A justificativa de utilizar esses dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, SNPs e correlação de expressão de fenótipo é baseado na suposição de que ortólogos reais são prováveis de manter a função idêntica no decorrer do tempo de evolução. Esses métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações em similaridades de função entre dois genes homólogos, similaridades no nível de sequência - aminoácidos idênticos nos domínios de proteína e similaridade em perfis de expressão.
[00521] A busca e identificação de genes homólogos envolve a triagem das informação de sequência disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, tais como a base de dados de DNA do Japão (DDBJ), Genbank, e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) ou versões destas ou a base de dados MIPS. Diversos diferentes algoritmos de pesquisa foram desenvolvidos, incluindo entre outros, o conjunto de programas denominado programas BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetados para filas de sequência de nucleotídeo (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e dois projetados para filas de sequência protéica (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Esses métodos envolvem o alinhamento e a comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula a identidade de sequência percentual e realiza a análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização da análise BLAST está disponível ao público através do National Centre for Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia]. Outros softwares ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para descobrir o alinhamento de duas sequências completas que aumentam o número de correspondências e reduzem o número de gaps.
[00522] Esses genes homólogos podem pertencer à mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada utilizando a análise de similaridade da sequência. Para realizar essa análise, pode-se utilizar programas padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de junção de vizinhança das proteínas homólogas aos genes nesta invenção pode ser utilizada para prover uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento conforme descrito acima. Espera-se que outras plantas carreguem um gene de função similar (ortólogo) ou uma família de genes similares e esses genes proverão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, esses membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção. Exemplos de outras plantas aqui incluídos, entre outros, são cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), óleo- semente de nabo (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), cana de açúcar (Saccharum officinarum), sorgo (Sorghum bicolor), soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum), trigo (Triticum aestivum).
[00523] As análises de homologia de sequência acima mencionadas podem ser realizadas em uma sequência de comprimento total, porém podem ser também baseadas em uma comparação de determinadas regiões, por exemplo, domínios conservados. A identificação desses domínios também estaria na esfera de conhecimento do técnico no assunto e envolveria, por exemplo, um formato legível por computador dos ácidos nucleicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações disponíveis ao público sobre domínios de proteína, tópicos e caixas conservados. Essas informações estão disponíveis da base de dados PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) biochem (dot) ucl (dot) ac (dot) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (dot) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol://pir (dot) Georgetown (dot) edu/) ou Pfam (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) sanger (dot) ac (dot) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequência projetados para a busca de tópico podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionado acima. Os programas de computador preferidos incluem, entre outros, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.
[00524] Um técnico no assunto pode utilizar as sequências homólogas aqui fornecidas para encontrar sequências similares em outra espécie e em outros organismos. Homólogos de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similar à da proteína não modificada da qual são derivados. Para produzir esses homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades similares (alterações conservativas, tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensidade similares para formar ou quebrar estruturas a-helicoidais ou estruturas de 3 folhas). As tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Homólogos de um ácido nucleico abrangem ácidos nucleicos tendo substituições, deleções e/ou inserções de nucleotídeo em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e tendo atividade biológica e funcional similar às do ácido nucleico não modificado do qual são derivados.
[00525] A tabela 28, logo abaixo, lista um resumo de sequências ortólogas e homólogas das sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo apresentadas na tabela 27, acima, que foram identificadas a partir de bases de dados utilizando o software NCBI BLAST ( por exemplo, utilizando os algoritmos Blastp e tBlastn) e agulha (pacote EMBOSS) como sendo pelo menos 80% homólogos aos polipeptídeos e polinucleotídeos selecionados, esperando-se que eles aumentem o rendimento da planta, o rendimento da semente, o rendimento do óleo, teor do óleo, a taxa de crescimento, rendimento da fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor, ABST e/ou NUE de uma planta. Tabela 28 Polinucleotídeos e polipeptídeos homólogos que podem aumentar o rendimento da planta, o rendimento de semente, o rendimento de óleo, o teor de óleo, a taxa de crescimento, o rendimento da fibra, a qualidade da fibra, a biomassa, o vigor, a ABST e/ou a NUE de uma planta
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[00526] Tabela 28: São apresentados polinucleotídeos (Polinuc.) e polipeptídeos (Polipep.) que são homólogos aos polinucleotídeos ou polipeptídeos identificados da Tabela 27. Homol. = homólogo; "Algor." = Algoritmo; EXEMPLO 12 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA A EXPRESSÃO DA PLANTA
[00527] Para validar seu papel na melhoria no teor de óleo, no rendimento da planta, no rendimento de semente, no teor de óleo, na biomassa, na taxa de crescimento, no rendimento da fibra, na qualidade da fibra, ABST, NUE e/ou vigor, os genes selecionados foram superexpressos em plantas, como a seguir. Estratégia de clonagem
[00528] Os genes citados nos Exemplos 10 e 11 aqui logo acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, o quadro de leitura aberta (ORF) de comprimento total foi primeiro identificado. No caso de clusters ORF-EST e em alguns casos já publicados, as sequências de mRNA foram analisadas para identificar todo o quadro de leitura aberta por comparação dos resultados de vários algoritmos de translação a proteínas conhecidas de outra espécie de planta. Para clonar os cDNAs de comprimento total, a transcrição reversa (RT) seguida da reação em cadeia de polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído de folhas, flores, síliquas ou outros tecidos de planta, cultivadas sob condições normais. O RNA total foi extraído conforme descrito em "MÉTODOS GERAIS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA" acima. A produção de cDNA e a amplificação de PCR é realizada utilizando protocolos padrão descritos (Sambrook J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) e bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Os produtos da PCR são purificados utilizando o kit de purificação por PCR (Qiagen). No caso em que toda a sequência de codificação não foi encontrada, o kit RACE da Invitrogen (RACE = R apid A ccess to cDNA E nds) [Rápido Acesso às Extremidades de cDNA] foi utilizado para acessar a transcrição completa do cDNA do gene a partir das amostras de RNA descritas acima. Os produtos do RACE foram clonados em vetor de alta cópia seguido de sequenciamento ousequenciados diretamente.
[00529] As informações do procedimento RACE foram utilizadas para clonagem de todo o comprimento ORF dos genes correspondentes.
[00530] Caso o DNA genômico tenha sido clonado, os genes foram amplificados por PCR direta em DNA genômico extraído do tecido de folha utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. No. 69104).
[00531] De modo geral, 2 conjuntos de primers são sintetizados para a amplificação de cada gene de um cDNA ou de uma sequência genômica; um conjunto externo de primers e um conjunto interno (primers PCR em ninho). Quando necessário (por exemplo, quando a primeira reação PCR não resulta em um produto satisfatório para o sequenciamento), outro primer (ou outros dois) dos primers PCR em ninho foram utilizados.
[00532] Para facilitar a clonagem dos cDNAs/ sequências genômicas, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada ao 5' de cada primer. A extensão do primer inclui um sítio de restrição de endonuclease. Os sítios de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a). O local não existe na sequência de cDNA; e (b). Os sítios de restrição nos primers forward e reverso foram projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na formação sense no vetor binário utilizado para a transformação.
[00533] Cada produto de PCR digerido foi inserido em um vetor high copy pBlue-script KS plasmid vector [pBlue-script KS plasmid vector, http://www (ponto) stratagene (ponto) com/manuals/212205 (ponto) pdf] ou pUC19 (New England BioLabs Inc], ou em plasmídeos provenientes desses vetores. Em alguns casos, o produto não digerido de PCR foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen). No caso do vetor de alta cópia pBlue-script KS plasmid (pGXN), o produto de PCR foi inserido acima do plasmídio de alta cópia do terminador NOS (SEQ ID NO:8092) originado do vetor binário pBI 101.3 (Aquisição do GenBank No. U12640, nucleotídeos 4356 a 4693) e abaixo do promotor 35S.
[00534] O sequenciamento dos produtos PCR amplificados foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Em alguns casos, após a confirmação da sequência dos genes clonados, o cDNA clonado acompanhado ou não com o terminador NOS foi introduzido em um vetor binário modificado pGI contendo o promotor At6669 ou o promotor 35S (SEQ ID NO: 8094), por meio da digestão com as endonucleases de restrição devidas. Em qualquer caso, a inserção foi seguida de uma cópia simples do terminador NOS (SEQ ID NO:8092). Os produtos digeridos e o vetor de plasmídio linearizado são ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase (Roche, Suíça).
[00535] Plasmídeos de alta cópia contendo os genes clonados foram digeridos com endonucleases de restrição (New England Biolabs Inc) de acordo com os locais designados nos primers e clonados em vetores binários de acordo com a Tabela 29, abaixo. Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas por um fornecedor comercial, a saber, GeneArt, GmbH [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) geneart (dot) com/)]. O DNA sintético foi projetado em silico. Locais adequados de restrição de enzimas foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para possibilitar a clonagem posterior nos vetores binários pQFN (Figura 2) a jusante do promotor At6669 (SEQ ID NOs: 8093 e 8096).
[00536] Vetores binários utilizados para clonagem: O pPI plasmídeo é construído através da inserção de uma sequência de sinais poli-(A) sintéticos, provenientes de vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; bp 4658-4811) no local de restrição HindilI do vetor binário pBI101,3 (Clontech, Acc. No. U12640). O pGI (pBXYN) é semelhante ao pPI, entretanto o gene original na espinha dorsal, o gene GUS, é substituído pelo gene GUS-Intron seguido pelo terminador NOS (SEQ ID NO: 8092) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). O pGI foi utilizado no passado para clonar as sequências de polinucleotídeo, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 February 1985); SEQ ID N0:8094].
[00537] O vetor pGI modificado (pQXYNc na Figura 12, ou pQFN e pQFN na Figura 2, ou pQYN_6669 na Figura 1) são versões modificadas do vetor pGI em que o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, de modo que o gene e seu promotor correspondente estão próximos da borda direita e o gene NPTII está próximo da borda esquerda.
[00538] At6669, a sequência promotora do Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 8096) é inseridade no vetor binário modificado pGI, a montante dos genes clonados, seguida pela ligação de DNA e extração de plasmídeo binário de colônia positivas de E. coli, conforme descrito acima.
[00539] As colônias são analisadas por PCR utilizando os primers cobrindo a inserção, que são projetado para abranger o promotor e o gene introduzidos. Plasmídeos positivos são identificados, isolados e sequenciados.
[00540] Os genes que foram clonados pelos presentes inventores são apresentados na Tabela 29 abaixo. Tabela 29 Genes clonados em plasmídeos de número de alta cópia
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Tabela 29. EXEMPLO 13 PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS ARABIDOPSIS EXPRESSANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS DE ALGUMAS APLICAÇÕES DA INVENÇÃO Métodos Experimentais
[00541] Produção de células de agrobacterium tumefaciens abrigando os vetores binários de acordo com algumas aplicações da invenção - Cada um dos vetores binários descritos no Exemplo 12 acima foi utilizado para transformar as células de Agrobacterium. Duas construções binárias adicionais, tendo somente o promotor 35S ou At6669 ou nenhum promotor adicional foram utilizadas como controles negativos.
[00542] Os vetores binários foram introduzidos às Agrobacterium tumefaciens GV301, ou células competentes LB4404 (cerca de 109 células / mL) por eletroporação. A eletroporação foi realizada utilizando um electroporator MicroPulser (BioRad), cubetas 0,2 cm (BioRad) e programa de eletroporação EC-2 (BioRad). As células tratadas foram cultivadas em meio LB líquido a 28 °C por 3 horas, então postas em ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para as cepas de Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg / L; para cepas de Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28°C por 48 horas. Colônias de Abrobacterium que foram desenvolvidas no meio seletivo, foram analisadas ainda por PCR utilizando os primers projetados para abranger a sequência inserida no pPI plasmídeo. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados para verificar se as sequência corretas de polinucleotídeo da invenção foram introduzidas corretamente às células de Agrobacterium.
[00543] Preparação das plantas de Arabidopsis para transformação - A Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas To) foram transformadas de acordo com o procedimento Floral Dip [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: um método simplificado para transformação em meio de Agrobacterium em Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 73543; and Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Tecidos reprodutivos femininos são os alvos principais da transformação em meio de Agrobacterium em Arabidopsis pelo método floral-dip. Plant Physiol. 123(3): 895-904] com pequenas modificações. Resumindo, as plantas Arabidopsis thaliana Columbia (Co10) To foram semeadas em vasos de 250 ml cheios de uma mistura de cultivo à base de turfa úmida. Os vasos foram cobertos com folha de papel alumínio e uma cobertura plástica, mantidos a 4°C por 3 a 4 dias, e então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento a 18-24 em ciclos de 16/8 horas de luz/escuro. As plantas TO estavam prontas para a transformação seis dias antes da antese.
[00544] Preparação da Agrobacterium transportando os vetores binários para transformação em plantas de Arabidopsis - Colônias únicas de Agrobacterium transportando os vetores binários abrigando os genes de algumas aplicações da invenção foram cultivadas em meio LB suplementadas com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28°C por 48 horas sob agitação intensa e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os pellets compreendendo células Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação, que contém metade da dose (2,15 g / L)-Murashige Skoog (Duchefa); 0,044 gM benzilaminopurina (Sigma); 112 gg/L vitamina B5 Gamborg (Sigma); 5% de sacarose e 0,2 ml / L Silwet L-77 (Especialistas OSI, CT) em água bidestilada, com pH de 5,7.
[00545] Transformação de plantas Arabidopsis com a agrobacterium. A Transformação de planta Tofoi realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o tecido da planta acima do solo ficasse submerso por 3 a 5 segundos.
[00546] Cada planta To inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja plástica, e então coberta com uma tampa de plástico transparente para manter a umidade e foi mantida no escuro em temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e a transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então descobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas em uma estufa por 3 a 5 semanas até que as síliquas estivessem marrons e secas, e então as sementes foram colhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiente até a semeadura.
[00547] Geração de plantas transgênicas Ti e T2 - Para gerar plantas transgênicas T1 e T2 contendo os genes, as sementes coletadas de plantas To transgênicas tiveram a superfície esterilizada por embebimento em etanol a 70% por 1 minuto, seguida do embebimento em hipoclorito de sódio a 5% e triton a 0,05% por 5 minutos. As sementes com superfície esterilizada foram totalmente lavadas em água destilada estéril e então colocadas em placas de cultura contendo meia potência de Murashig-Skoog (Duchefa); sacarose a 2%; ágar de planta a 0,8%; canamicina 50 mM; e carbenicilina 200 mM (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas e, então, transferidas para um sala de cultivo a 25°C por uma semana adicional de incubação. As plantas Arabidopsis T1 vitais foram transferidas para placas de cultura fresca para mais uma semana de incubação. Após a incubação, as plantas T1 foram retiradas das placas de cultura e plantadas em mix de crescimento contido em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa até a maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e cresceram até a maturidade assim como as plantas T2 sob as mesmas condições de cultivo e crescimento das plantas T1. EXEMPLO 14 AVALIAÇÃO DO NUE DA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES BAIXAS OU NORMAIS DE NITROGÊNIO UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO (CULTURA DE TECIDO, PLANTAS T1 E T2)
[00548] Ensaio I: crescimento da planta sob níveis de concentração baixo e favorável de nitrogênio.
[00549] As sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em meio basal [50 % meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente solidificaste] na presença de canamicina (utilizada com um agente de seleção). Após a semeação, as placas foram transferidas por 2-3 dias para estratificação a 4°C e, então, cultivadas a 25°C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuro por 7 a 10 dias. Nesse momento, as mudas escolhidas aleatoriamente foram transferidas cuidadosamente para placas contendo meio V2 MS (15 mM N) para o tratamento da concentração normal de nitrogênio e 0,75mM de nitrogênio para tratamentos de baixa concentração de nitrogênio. Para experimentos realizados em linha T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (replicatas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, pelo menos quatro ou cinco eventos independentes de transformação foram analisados de cada construção. Para experimentos realizados em linha Ti, cada placa continha 5 mudas de 5 eventos transgênicos independentes e 3 a 4 placas diferentes (replicatas) foram plantadas. No total, para linha Ti, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam os polinucleotídeos da invenção foram comparadas à medição média das plantas controle (vetor vazio ou gene repórter GUS sob o mesmo promotor) utilizadas no mesmo experimento.
[00550] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon EF-S series), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que inclui 4 unidades de luz (4 lâmpadas de 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizado para a captura de imagens de pequenas plantas semeadas em placas de ágar quadradas.
[00551] O processo de capturação de imagem foi repetido a cada 3-4 dias começando no dia 1 até o dia 10 (vide, por exemplo, as imagens nas Figuras 3A-F). Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem baseado em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em http://rsbweb(ponto)nih(ponto)gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00552] Análise da muda - Por meio de análise digital, os dados da muda foram calculado, incluindo a área foliar, a cobertura de raiz e o comprimento da raiz.
[00553] A taxa de crescimento relativo para os diversos parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas XIV, V (descrita acima) e XV. Fórmula XIV Taxa de crescimento relativo da área foliar = Coeficiente de regressão da área da folha ao longo do curso do tempo. Fórmula XV: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz ao longo do tempo.
[00554] Ao final do experimento, as pequenas plantas foram retiradas do meio e pesadas para a determinação do peso fresco da planta. As plântulas foram, então, secadas por 24 horas em 60°C e pesadas novamente para medir o peso seco da planta para análise estatística posterior. Os pesos seco e fresco são fornecidos para cada planta Arabidopsis. A taxa de crescimento foi determinada comparando a cobertura da área da folha, a cobertura da raiz e o comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados são utilizados para determinar o efeito do gene introduzido no vigor da planta sob condições ideais. De forma semelhante, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando o peso fresco e seco da planta ao das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou o gene repórter GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada construção criada, 3 a 5 eventos independentes de transformação são examinados em replicatas.
[00555] Análises estatísticas - Para identificar os genes conferindo tolerância significativamente maior ao vigor da planta ou maior arquitetura de raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados aos obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene sob um controle, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos para p <0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Resultados Experimentais:
[00556] Os genes apresentados na Tabela 30 demonstraram uma melhora significante no NUE da planta já que eles produziram maior biomassa na planta (pesos seco e fresco da planta) na geração T2 quando cultivados sob condições limites de crescimento em nitrogênio, comparados às plantas de controle. Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669, SEQ ID NO: 8096) ou Ca35S (SEQ ID NO: 8094). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Os resultados obtidos nesses segundos experimentos também foram significantemente positivos. Tabela 30 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob Baixas condições de nitrogênio sob regulação do promotor 6669
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[00557] Tabela 30. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta.
[00558] Os genes apresentados nas Tabelas 31 e 32 demonstraram uma melhora significaste no NUE da planta, já que elas produziram uma maior biomassa da folha (área da folha) e biomassa da raiz (comprimento e cobertura da raiz) (Tabela 31) e uma taxa de crescimento relativo mais alta da área da folha, cobertura e comprimento da raiz (Tabela 32) quando cultivadas sob condições de crescimento em limite de nitrogênio, comparadas a outras plantas. Plantas que produzem maior biomassa de raiz têm melhores possibilidades de absorver uma grande quantidade de nitrogênio do solo. Plantas que produzem maior biomassa de folha têm melhor capacidade de produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulação do promotor constitutivo (At6669) ou o promotor preferido da raiz (RaizP). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Esse segundo experimento confirmou a significaste melhora no desempenho da folha e da raiz. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes. Tabela 31 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob Baixas condições de nitrogênio sob regulação do promotor 6669
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[00559] Tabela 31. "CONT . " - Controle; "Méd." - Média; "% Aum. " = % aumento; "p-val. " - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta. Tabela 32 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob Baixas condições de nitrogênio sob regulação do promotor 6669
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[00560] Tabela 32. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta.
[00561] Os genes apresentados na Tabela 33 demonstraram uma melhora significante no desempenho da planta já que eles produziram maior biomassa na planta (pesos seco e fresco da planta) na geração T2 quando cultivados sob condições normais de crescimento em nitrogênio, comparados às plantas de controle. Os genes foram clonados sob a regulação de um promotor constitutivo (At6669, SEQ ID NO: 8096) ou 35S (SEQ ID NO: 8094). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Os resultados obtidos nesses segundos experimentos também foram significantemente positivos. Tabela 33 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor 6669
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[00562] Tabela 33. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta
[00563] Os genes apresentados nas Tabelas 34 e 35 demonstraram uma melhora significante no desempenho da planta, já que elas produziram uma maior biomassa da folha (área da folha) e biomassa da raiz (comprimento e cobertura da raiz) (Tabela 34) e uma taxa de crescimento relativo mais alta da área da folha, cobertura e comprimento da raiz (Tabela 35) quando cultivadas sob condições de crescimento normais em de nitrogênio, comparadas a outras plantas. Plantas que produzem maior biomassa de raiz têm melhores possibilidades de absorver uma grande quantidade de nitrogênio do solo. Plantas que produzem maior biomassa de folha têm melhor capacidade de produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulação do promotor constitutivo (At6669) ou o promotor preferido da raiz (RaizP) . A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos . Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Esse segundo experimento confirmou a significante melhora no desempenho da folha e da raiz. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes . Tabela 34 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor 6669
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[00564] Tabela 34. "CONT . " - Controle; "Méd." - Média; "% Aum. " = % aumento; "p-val . " - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta. Tabela 35 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulação do promotor 6669
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[00565] Tabela 35. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Os valores são fornecidos por planta. Resultados das plantas T1
[00566] Os genes apresentados nas Tabelas 36-39 demonstraram uma melhora significante na biomassa da planta e desenvolvimento da raiz, já que elas produziram uma maior biomassa de raiz e folha (cobertura e comprimento da raiz) (Tabela 36), uma maior biomassa de raiz e folha (área da folha, comprimento e cobertura da folha; Tabela 37), uma taxa de crescimento relativo maior da área da folha, cobertura e comprimento da folha (Tabela 38), e um maior peso fresco e seco (Tabela 39) quando cultivadas sob condições padrão ou com baixo nitrogênio, comparada a outras plantas. Plantas que produzem maior biomassa de raiz têm melhores possibilidades de absorver uma grande quantidade de nitrogênio do solo. Plantas que produzem maior biomassa de folha têm melhor capacidade de produzir assimilados). Os genes foram clonados sob a regulação do promotor constitutivo (At6669; SEQ ID NO: 8096) ou o promotor preferido da raiz (RaizP). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos. Esse segundo experimento confirmou a significante melhora no desempenho da folha e da raiz. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes. Tabela 36 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob Baixas condições de nitrogênio sob regulação do promotor
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[00567] Tabela 36. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. * - medição no dia 9 da plantação Tabela 37 Genes demonstrando desempenho melhorado sob condições padrão de crescimento (geração de IT) sob a regulação do promotor At6669
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[00568] Tabela 37. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = aumento; "p-val." - valor p. * - medição no dia 5 da plantação Tabela 38 Genes demonstrando taxa de crescimento melhorada sob condições padrão de crescimento (geração de IT) sob a regulação do promotor At6669
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*
[00569] Tabela 38. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p. Tabela 39 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob Baixas condições de nitrogênio sob regulamentação do promotor 6669
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[00570] Tabela 39. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p. EXEMPLO 15 AVALIAÇÃO DO NUE, RENDIMENTO E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL OU BAIXA DE NITROGÊNIO EM ENSAIO DE ESTUFA
[00571] Ensaio I: Eficiência no uso de nitrogênio: A biomassa da planta do rendimento da semente e a taxa de crescimento da planta com concentração ideal e limitada de nitrogênio sob condições de estufa - Esse ensaio segue a produção do rendimento da semente, a formação de biomassa e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas na estufa sob condições de nitrogênio para crescimento limitantes e não-limitantes. As sementes transgênicas de Arabdopsis foram semeadas em um meio de agar suplementadas com meio V2 MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litros com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram alcançadas pela irrigação das plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 suplementado com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KC1, 2 mM de CaC12 e microelementos, enquanto os níveis normais de nitrogênio foram alcançados aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaC12 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes amadurecerem. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa restante da planta (o tecido acima do solo) também foi colhido e pesado imediatamente ou após a secagem no forno a 50° C por 24 horas.
[00572] Cada construção foi validada como sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma construção conformada por um vetor vazio transportando o promotor 35S e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.
[00573] As plantas foram analisadas quanto ao tamanho geral, taxa de crescimento, florescimento, rendimento de semente, peso de 1000 sementes, matéria seca e índice de colheita (IC - rendimento de semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas é comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Mock- plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou até mesmo com nenhum gene, foram utilizados como controle sob o mesmo promotor.
[00574] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes em nichos [nested] randomizados. Para cada gene da invenção 3 de cada 5 eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construção.
[00575] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, o qual consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acompanhada de uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S series), instalada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui quatro unidades de luz (4 x lâmpadas de 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de plantas.
[00576] O processo de captura de imagens foi repetido a cada dois dias a partir do 1 ° dia após o transplantio até o dia 15. A mesma câmera, posicionada em uma moldura de ferro customizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serrada em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas tem sua forma quadrada e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, os vasos são colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras.
[00577] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem baseado em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em http://rsbweb(ponto)nih(ponto)gov/]. As imagens são capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00578] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da roseta, o diâmetro da roseta, a área do limbo da folha.
[00579] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) do número da folha [fórmula XI (descrito acima)], área da roseta (fórmula XVI), cobertura do canteiro (fórmula XVII) e do índice da colheita (fórmula IV) foi calculada com as fórmulas indicadas. Fórmula XVI: Taxa de crescimento relativo da área rosácea = coeficiente de regressão da área rosácea ao longo do curso do tempo. Fórmula XVII Taxa de crescimento relativo da cobertura plana = coeficiente de regressão da cobertura plana ao longo do curso do tempo.
[00580] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes são coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e foi tirada uma foto. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00581] Peso seco e produção de semente - Por volta do dia 80 de semeação, as plantas são colhidas e deixadas secando a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso das sementes de cada lote é medido e dividido pelo número de plantas em cada lote. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) após secagem a 30°C em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso de semente total por planta (g). Peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (gr.).
[00582] O índice de colheita (IC) foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima.
[00583] Percentual de óleo nas sementes - No final do experimento todas as sementes de cada canteiro foram coletadas. Sementes de 3 canteiros são misturadas e trituradas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat. No. 080951 Biolab Ltd.) são utilizados como solvente. A extração foi realizada por 30 horas com temperatura média de 50° C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador sob 35° C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. As informações obtidas do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Politechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foram utilizadas para criar uma curva de calibração para a NMR de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a NMR de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00584] Análise do comprimento da síliqua - No dia 50 após a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada canteiro são amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas são verde-amarelas e são coletadas das partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.
[00585] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem uma tolerância a estresses abióticos aperfeiçoada significativamente, os resultados obtidos com as plantas transgênicas são comparados com os obtidos a partir de plantas controle. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados são analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software de estatística J1MP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Tabela 40 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00586] Tabela 40. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. * - foi regulado pelo promotor 35S (SEQ ID NO: 8094). Tabela 41 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00587] Tabela 41. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Tabela 42 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00588] Tabela 42. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Tabela 43 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00589] Tabela 43. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. * - foi regulado pelo promotor 35S (SEQ ID NO: 8094). Tabela 44 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00590] Tabela 44. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. * - foi regulado pelo promotor 35S. EXEMPLO 16 AVALIAÇÃO DO NUE, RENDIMENTO E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL OU BAIXA DE NITROGÊNIO EM ESTUDO DE ESTUFA
[00591] Ensaio 2: Eficiência no Uso de Nitrogênio medida até o pRtAain de neneiracão. a biomassa da planta do rendimento da semente e a taxa de crescimento da planta com concentração ideal e limitada de nitrogênio sob condições de estufa - Esse ensaio segue a formação de biomassa da planta e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas na estufa sob condições de nitrogênio para crescimento limitantes e não-limitantes. As sementes transgênicas de Arabdopsis foram semeadas em um meio de agar suplementadas com meio V2 MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litros com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram alcançadas pela irrigação das plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3 suplementado com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KC1, 2 mM de CaC12 e microelementos, enquanto os níveis normais de nitrogênio foram alcançados aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaC12 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes amadurecerem. A biomassa da planta (o tecido acima do solo) foi pesada diretamente após a colheita da roseta (peso fresco da planta [Peso Fresco]).
[00592] Em seguida, as plantas foram secas em um forno a 50° C por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [Peso Seco]).
[00593] Cada construção foi validada como sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma construção conformada por um vetor vazio transportando o promotor 35S e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.
[00594] As plantas foram analisadas pelo seu tamanho geral, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas é comparado ao das plantas controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. Mock- plantas transgênicas expressando o gene repórter uidA (GUS-Intron) ou até mesmo com nenhum gene, foram utilizados como controle sob o mesmo promotor.
[00595] O experimento foi planejado em uma distribuição de lotes em nichos [nested] randomizados. Para cada gene da invenção 3 de cada 5 eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construção.
[00596] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, o qual consiste de uma câmera digital reflex (Canon EOS 300D) acompanhada de uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon EF-S series), instalada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui quatro unidades de luz (4 x lâmpadas de 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de plantas.
[00597] O processo de captura de imagens foi repetido a cada dois dias a partir do 1 ° dia após o transplantio até o dia 15. A mesma câmera, posicionada em uma moldura de ferro customizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serrada em cubas brancas em uma estufa controlada ambientalmente. As cubas tinham sua forma quadrada e incluíam bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, os vasos foram colocados debaixo do cavalete de ferro, evitando a luz solar direta e incidência de sombras.
[00598] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador pessoal (Intel P4 3.0 GHz de processador) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [Programa de processamento de imagem baseado em Java que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e está disponível gratuitamente na Internet em http://rsbweb(ponto)nih(ponto)gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (padrão Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JIMP (instituto SAS).
[00599] Análise da folha - Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número de folhas, a área da roseta, o diâmetro da roseta, a área do limbo da folha.
[00600] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (TCR) do número da folha [Fórmula XI (descrita acima)], área da roseta (fórmula XVI, descrita acima) e cobertura do canteiro (fórmula XVII, descrita acima) é calculada com as fórmulas indicadas.
[00601] Peso Fresco e Seco da Planta Por volta do dia 80 da semeadura, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para a determinação do peso fresco da planta (FW) e colocadas em uma câmara de secagem a 50°C por 48 horas para secagem antes da pesagem para determinar o peso seco da planta (DW).
[00602] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem uma tolerância a estresses abióticos aperfeiçoada significativamente, os resultados obtidos com as plantas transgênicas foram comparados com os obtidos a partir de plantas controle. Para identificar os genes e construções com desempenho superior, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando o Teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software de estatística JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Resultados Experimentais:
[00603] Os genes listados nas Tabelas 45-48 melhoraram o NUE da planta quando cultivados sob níveis normais de concentração de nitrogênio. Esses genes produziram plantas maiores com uma maior área fotossintética e biomassa (peso fresco, peso seco, diâmetro da roseta, área da roseta e cobertura do canteiro) quando cultivados sob condições normais de nitrogênio. Os genes foram clonados sob a regulamentação do promotor constitutivo (At6669; SEQ ID NO: 8096) e o promotor preferido da raiz (RaizP). A avaliação de cada um dos genes foi realizada testando o desempenho de um diferente número de eventos. Eventos com valores p <0,1 foram considerados estatisticamente significantes . Tabela 45 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00604] Tabela 45. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. * - medição no dia 9 da plantação Tabela 46 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00605] Tabela 46. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Tabela 47 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00606] Tabela 47. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. Tabela 48 Genes demonstrando desempenho melhorado da planta sob condições normais sob regulamentação do promotor 6669
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[00607] Tabela 48. "CONT." - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % aumento; "p-val." - valor p, L- p<0,01. EXEMPLO 17 IDENTIFICAÇÃO DE UM NOVO PROMOTOR DA ARABIDOPSIS
[00608] W02004/081173 divulga o promotor At6669 (SEQ ID NO: 8093 no presente) que é capaz de expressar um polinucleotídeo heterólogo conectado de forma operável em uma célula hospedeira. Procedimentos Experimentais
[00609] Isolamento de elementos regulatórios de DNA (DREs): Um método de alta produção de clonagem de elementos reguladores de DNA (DREs) utilizando um tubo único de reação, o método referido aqui como de "um tubo" foi utilizado a fim de permitir uma produção em larga escala de plantas transformadas de DRE. Dessa forma, o DNA genômico (gDNA) foi extraído das folha de Arabidopsis thaliana utilizando o Mini Kit de Fácil Retirada de DNA de Plantas (Qiagen, Alemanha).
[00610] Os primers para amplificação de PCR de DREs foram projetados utilizando o software PRIMER3 e modificados para conter locais de restrição ausentes da sequência de DRE, para inserção do produtor de PCR no plasmídeo pQYN.
[00611] Ampliação da nova sequência do promotor AT6669 - O promotor foi clonado de um DNA genômico de Arabidopsis thaliana utilizando os seguintes primers:
[00612] Primer de avanço (sem restrição de local): 5'- TATACCAGTGGAGACGAAAGC (SEQ ID N0:8098); e Primer reverse (que inclui um local de restrição Sail): 5'- TAATAAATAGTCGACTCTTTGGGG (SEQ ID N0:8099).
[00613] As análises da reação de cadeira da polimerase foram realizadas utilizando o Kit de PCR de Modelo Longo de Expansão Taq (Roche), de acordo com as instruções do fabricante, utilizando como um ciclo térmico: 92 °C/2 min 10 x [94 °C/10 min -> 55 °C/30 seg. -> 68 °C/5 min] -> 18 x [94 °C/10 min -»• 55 °C/30 sec. -»• 68 °C/5 min (+ 20 sec. cada ciclo)] - »• 68 °C/7 min.
[00614] O produto de PCR amplificado foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e Sail e foi designado como 6669 Cid506.
[00615] Vetor pQYN - O plasmídeo de início é o pQYN (Pid #1468; Figura 5). Esse plasmídeo tem como base o plasmídeo pBII01 (Clontech, Laboratories, Inc. Mountain View, CA 94043) e contém as seguintes características diferentes do pBII01: (i) o sinal PoliA foi inserido antes do MCS (multi cloning site - local de clonagem múltipla) (a montante do local de restrição Hindlll); (ii) o gene GUS foi substituído pelo gene GUS intron; (iii) Originalmente o cassete de expressão pBI101 NPTII estava próximo à extremidade direita do DNA. No pQYN, a região entre as extremidades esquerda e direita (não incluindo as extremidades) foi invertida a fim de aproximar o cassete da expressão NPTII da extremidade esquerda e de aproximar o cassete da expressão intron GUS da extremidade direita.
[00616] Clonagem da sequência promotora no vetor pQYN - O vetor pQYN foi digerido com HindllUSall. O 6669 Cid506 que foi digerido em HindllUSall foi ligado ao plasmídeo pQYN (Pid #1468) digerido por HindllUSall, criando o plasmídeo pQYN_6669 (Pid# 1996). Para facilitar a clonagem no plasmídeo pQYN_6669 (Pid# 1996), o MCS expandido + terminador NOS foi ligado ao pQYN 6669 (Pid# 1996) digerido com SalUEcoRl, substituindo o MCS + intron GUS + terminador NOS existentes. Não houve mudança na sequência do terminador NOS. O plasmídeo resultante foi projetado para pQFN (Pid# 2054) (Figura 6).
[00617] Geração de uma construção de ácido nucleico, incluindo o novo promotor e uma sequência heteróloga de codificação (ex.: um gene repórter). I. Cassette de expressão repórter GUS
[00618] Geração do promotor do cassete de expressão 6669 Cid506 + intron GUS + terminador NOS (cassete de expressão intron GUS At6669) - o intron GUS + cassete terminador NOS foi extraído do pQXYN (Pid# 1481) digerindo com enzimas de restrição SmaUEcoRl e ligado ao pQFN (Pid# 2054), o qual também foi digerido com SmaUEcoRl, gerando o plasmídeo final pQFYN (Pid# 2431; Figura 8) . Não houve mudança na sequência do terminador NOS.
[00619] A transformação de agrobacterium com o cassete de expressão intron At6660-GUS e ainda com Arabidopsis thaliana Columbia (para plantas) foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 13 logo acima utilizando o cassete de expressão intron At6660-GUS. Além disso, a geração de plantas transgênicas T1 e T2 abrigando o cassete de expressão intron At6660-GUS foi realizada conforme descrito no Exemplo 13 logo acima. Avaliação da atividade do promotor
[00620] Avaliação da nova atividade de sequência do promotor AT6669 em plantas transgênicas.
[00621] A capacidade do DRE de promover expressão de gene em plantas foi determinada com base na expressão do gene repórter GUS. Dessa forma, as pequenas plantas transgênicas Arabdopsis em diferentes estágios de desenvolvimento foram sujeitas a ensaios de GUS utilizando um protocolo de coloração GUS padrão [Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. 1987. Fusões de GUS: beta-glucuronidase como marcador de fusão versátil e sensível de gene em plantas mais altas. EMBO J. 6(13): 3901-7], Resultados experimentais
[00622] Identificação de um novo promotor At6669 com dois novos elementos regulatórios -
[00623] Os presente inventores divulgaram de forma surpreendente que durante o procedimento de clonagem uma nova sequência (descrito pelo SEQ ID NO: 8096) que inclui algumas mutações com respeito ao promotor At6669 divulgado previamente (SEQ ID NO: 8093) foi obtida. Uma comparação da sequência entre os dois promotores é fornecida na Figura 5 com os nucleotídeos não correspondidos sendo sublinhados. Conforme mostrado pelo alinhamento da sequência (Figura 5), o novo promotor identificado no presente exibe três locais de elementos regulatórios comparado ao promotor At669 previamente divulgado, conforme segue: o elemento regulatório "YACT" (Y pode ser um nucleotídeo de timidina ou uma citosina) na posição 862-865 do SEQ ID NO: 8096; e dois locais do elemento regulatório "AAAG" nas posições 2392-2395 e 2314-2317 do SEQ ID NO: 8096.
[00624] 0 novo At6669 compreende um elemento regulatório YACT adicional que é capaz de direcionar um módulo de expressão mesophyll - Altas taxas de fotossíntese, maior eficiência no uso de água maior eficiência no uso de nitrogênio de plantas C4 são atribuídas ao modo único de assimilação de carbono nessas plantas, que inclui uma estrita compartimentação das enzimas assimilatórias em células mesófilas [que incluem a carboxilase fosfenol piruvato (ppcAl)] e células de pacote
[00625] de bainha [que incluem a ribulose bifosfato carboxilase/oxigenase]. O elemento regulatório "YACT" foi considerado por Gowik U, et al., 2004 (cis-Regulatory elements for mesophyll-specific gene expression in the C4 plant Flaveria trinervia, the promoter of the C4 phosphoenolpyruvate carboxylase gene; Plant Cell. 16:10771090) como sendo um importante componente do módulo 1 de expressão mesófila (Meml) do ppcAl na dicotiledônea LA F. trinervia. Além disso, quando utilizada em um sistema de expressão heterólogo a sequência regulatória do YACT foi mostrada necessária e suficiente para alta expressão de mesofílicos específicos (repórter de 3-glucuronidade, e como um melhorador que direciona a expressão específica de mesofílico do promotor ppcAl da planta C3 F. pringlei (Gowik U, et al., 2004, Supra).
[00626] 0 novo At6669 compreende dois locais adicionais de elementos regulatórios AAAG, o local principal de ligação para os fatores de transcrição Dof - O elemento regulatório AAAG é o local principal necessário para a ligação das proteínas Dof no milho (Z.m.). As proteínas Dof são proteínas de ligação do DNA, com presumidamente somente um dedo de zinco, e são únicas às plantas. Há quatro proteínas Dof conhecidas: Dofl, que melhora a transcrição dos promotores ambos da quinase do ortofosfafo citosólico (CyPPDK) e um gene não-fotossintético PEPC; Dof2, que suprime o promotor C4PEPC; Dof3; e PBF, que é uma proteína Dof específica de endosperma que liga-se à caixa de prolamina [Yanagisawa S, Schmidt RJ, Diversity and similarity among recognition sequences of Dof transcription factors. Plant J, 17:209-214 (1999)]. Os fatores de transcrição Dofl e Dof2 são associados com a expressão de múltiplos genes envolvidos no metabolismo de carbono no milho [Yanagisawa S, Plant J 21:281-288 (2000)].
[00627] Em conjunto, esses resultados mostram que o novo promotor identificado no presente pode dirigir a expressão de polinucleotídeos heterólogos em uma célula hospedeira com alta eficiência.
[00628] Caracterização da nova sequência do promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096) - A capacidade do promotor At6669 de promover a expressão de gene em plantas foi determinada com base na expressão o gene repórter GUS. Diversas características do promotor isolado At6669 de algumas aplicações da invenção são descritas nas Figuras 9A-D, 10A-D e 11A-L. Como é evidente a partir dos experimento, o promotor At6669 é expressado de forma constitutiva no modelo da planta em diversos estágios de desenvolvimento, incluindo os estágios precoces vegetativos da muda (ex.: dia 10-11; Figuras 9A-D), o estágio de peneiração no qual a planta é desenvolvida em direção ao estágio reprodutor (ex.: dia 20, Figuras 10A-D), e o estágio reprodutor maduro (ex.: dia 40-41; Figuras 11A-L) no qual vários tecidos expressam o gene reporter sob o novo promotor At6669 (SEQ ID NO: 8096), incluindo as raízes, folhas, caules e flores, com uma forte expressão em folhas e flores.
[00629] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto em aplicações específicas dela, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles que tenham habilidade na técnica. Consequentemente, ela pretende envolver todas as alternativas, modificações e variações que estejam dentro do espírito e do amplo escopo das reivindicações anexas.
[00630] Todas as publicações, patentes e solicitações de patentes mencionadas nessa especificação estão incorporadas aqui na íntegra por referência na especificação, como se cada publicação, patente ou solicitação de patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada aqui como referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência nessa solicitação não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível antes da técnica da presente invenção. Na extensão de que os títulos da seção sejam utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (8)

1. Método de aumento de produção de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância à deficiência de nitrogênio, eficiência no uso de nitrogênio e/ou redução do tempo para florescimento de uma planta, caracterizado por superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico mostrada na: (i) SEQ ID NO: 34 ou 317, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521; (ii) SEQ ID NO: 907, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4938, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4938; (iii) SEQ ID NO: 908, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4939, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4939; (iv) SEQ ID NO: 909, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4940, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4940; (v) SEQ ID NO: 910, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4941, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4941; ou (vi) SEQ ID NO: 911, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4942, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4942.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado na SEQ ID NO: 34 ou 317, que codificam o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado nas SEQ ID Nos: 34, 317, 907, 908, 909, 910 ou 911.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado na SEQ ID NO: 34 ou 317.
5. Método para produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de compreender transformar uma planta com uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico como mostrado na: (i) SEQ ID NO: 34 ou 317, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521; (ii) SEQ ID NO: 907, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4938, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4938; (iii) SEQ ID NO: 908, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4939, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4939; (iv) SEQ ID NO: 909, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4940, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4940; (v) SEQ ID NO: 910, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4941, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4941; ou (vi) SEQ ID NO: 911, que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4942, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4942; e um promotor heterólogo para direcionar a transcrição de dita
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado na SEQ ID NO: 34 ou 317, que codificam o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam dito polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 521.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado nas SEQ ID Nos: 34, 317, 907, 908, 909, 910 ou 911.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo é mostrado na SEQ ID NO: 34 ou 317.
BR112012016033-8A 2009-12-28 2010-12-22 métodos de aumento de produção de semente, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância à deficiência de nitrogênio, eficiência no uso de nitrogênio e/ou redução do tempo de florescimento de uma planta, e, para produzir uma planta transgênica BR112012016033B1 (pt)

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Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
CN101948846A (zh) 2004-06-14 2011-01-19 伊沃基因有限公司 参与植物纤维发育的多核苷酸和多肽和使用它们的方法
MX350551B (es) 2005-10-24 2017-09-08 Evogene Ltd Polipeptidos aislados, polinucleotidos que los codifican, plantas transgenicas que expresan los mismos y metodos para usarlos.
MX349479B (es) 2006-12-20 2017-07-31 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos involucrados en el desarrollo de fibra vegetal y metodos de uso.
MX2009010858A (es) 2007-04-09 2009-11-02 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos y metodos para aumentar el contenido de aceite, la velocidad de crecimiento y biomasa de las plantas.
BR122020022203B1 (pt) 2007-07-24 2021-04-20 Evogene Ltd método de aumento da taxa de crescimento de uma planta
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
CN101977928B (zh) 2007-12-27 2014-12-10 伊沃基因有限公司 用于改进植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物胁迫耐受性、产量和生物量的分离多肽、多核苷酸
CA3148194A1 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and peptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
BRPI0912898B1 (pt) 2008-08-18 2022-04-12 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta
US10412901B2 (en) * 2008-10-30 2019-09-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. System for selecting plants from among a population of plants
EP2347014B1 (en) 2008-10-30 2016-09-21 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficieny
MX340023B (es) 2008-12-29 2016-06-22 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos codificados, y metodos para utilizarlos para aumentar la tolerancia al estres abiotico, biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan.
CA3123543A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
EP2440033B1 (en) 2009-06-10 2017-03-15 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
US8937215B2 (en) 2009-08-04 2015-01-20 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides for increasing desirable plant qualities
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
EP2519097B1 (en) 2009-12-28 2016-03-02 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
AU2011246876B2 (en) 2010-04-28 2016-06-23 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
BR112013004851A2 (pt) 2010-08-30 2016-06-07 Evogene Ltd método de aumento de eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, polinucleotídeo isolado, estrutura de ácido nucleio, polipeptídeo isolado, célula vegetal e planta transgêncica
BR122021002248B1 (pt) 2010-12-22 2022-02-15 Evogene Ltd Método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, e/ou taxa de crescimento de uma planta
WO2012150598A2 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
WO2013027223A2 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA116089C2 (uk) * 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
EP2755467B1 (en) 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
CN104254242A (zh) 2011-11-21 2014-12-31 先正达参股股份有限公司 用于增强植物中的线虫抗性的组合物和方法
WO2013080203A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
BR122020022832B1 (pt) 2011-12-28 2021-08-17 Evogene Ltd Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, energia e/ou produção de semente de uma planta em comparação com uma planta nativa, e, construção de ácido nucleico isolado
WO2013128448A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
MX360866B (es) 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
CA2873846A1 (en) 2012-05-28 2013-12-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
BR122019028124B1 (pt) 2012-08-27 2022-08-09 Evogene Ltd Método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética, eficiência do uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, método para produzir uma colheita, construto de ácido nucleico, e, método de cultivar uma cultura
CN104870647A (zh) 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
BR112015015415B1 (pt) 2012-12-25 2022-08-16 Evogene Ltd. Métodos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, taxa de crescimento, biomassa, rendimento da semente, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir de uma cultura, para cultivar uma colheita, e, para selecionar uma planta
BR122020018366B1 (pt) 2012-12-26 2022-03-29 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
WO2014164797A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2910097A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
CA2916060A1 (en) 2013-08-27 2015-03-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
WO2015032428A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Bayer Cropscience Nv Plants with increased growth over expressing a mitochondrial glycine decarboxylase complex subunit
CN105452276A (zh) * 2013-09-27 2016-03-30 创世纪种业有限公司 一种小盐芥脱水素蛋白dh3及其编码基因与应用
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
WO2015074992A1 (en) * 2013-11-19 2015-05-28 Vib Vzw Protection of plants against oxidative stress
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
WO2015095636A2 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 The Children's Hospital Of Philadelphia Interferon regulatory factor 1 (irf1) decoys and methods of use thereof
EP3116303B1 (en) 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
AU2015265412B2 (en) 2014-05-28 2021-03-25 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
US10858403B2 (en) 2014-08-27 2020-12-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
PL3256589T3 (pl) 2015-01-22 2022-02-21 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontrolowania leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
US10766935B2 (en) 2015-12-28 2020-09-08 Evogene Ltd. Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides
CN105567703A (zh) * 2016-02-29 2016-05-11 江苏省农业科学院 赋予植物黄萎病抗性的lrk1基因及其应用
CN105586348A (zh) * 2016-02-29 2016-05-18 江苏省农业科学院 赋予植物黄萎病抗性的lrk2基因及其应用
CN106967732B (zh) * 2017-02-23 2020-05-29 河南大学 棉花谷胱甘肽过氧化物酶GhGPX8及应用
JP2021508244A (ja) 2017-12-15 2021-03-04 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｒｎａの増幅のための方法及び組成物
CN112457380B (zh) * 2019-09-09 2022-07-05 中国科学院遗传与发育生物学研究所 调控植物果形和/或果汁含量的蛋白质及其相关生物材料和应用
KR102353488B1 (ko) * 2019-11-25 2022-01-20 고려대학교 산학협력단 목질화 관련 유전자 및 이의 용도
CN113968899B (zh) * 2020-07-23 2023-08-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种长果番茄材料的制备方法
CN112724218B (zh) * 2021-01-28 2022-04-22 华中农业大学 一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用
WO2023147050A1 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Pivot Bio, Inc. Assessing relative plant nitrogen in a field environment
CN117683103B (zh) * 2023-11-24 2024-05-14 南京林业大学 一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用
CN118325952B (zh) * 2024-05-10 2024-10-11 东北农业大学 利用红三叶TpLHCA1编码基因提高拟南芥在铅胁迫下抗性的应用

Family Cites Families (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
JPS6054684A (ja) 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
JPS6314693A (ja) 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
EP0278667B1 (en) 1987-02-09 1994-07-20 Mycogen Plant Science, Inc. Hybrid RNA virus
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5495070A (en) 1988-10-04 1996-02-27 Agracetus, Inc. Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US6329570B1 (en) 1989-07-19 2001-12-11 Calgene, Llc Cotton modification using ovary-tissue transcriptional factors
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5859330A (en) 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
DE69230290T2 (de) 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag, Basel Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
EP0612208B1 (en) 1991-10-04 2004-09-15 North Carolina State University Pathogen-resistant transgenic plants
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5356816A (en) 1991-11-19 1994-10-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5296462A (en) 1992-11-19 1994-03-22 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and compositions using polypeptides of arabidopsis thaliana
US5521708A (en) 1992-11-25 1996-05-28 Canon Information & Systems, Inc. Correlated color temperature detector
ZA939767B (en) 1993-01-21 1994-09-14 Univ North Carolina State Nematode-resistant transgenic plants
EP0670670A4 (en) 1993-09-30 1996-04-24 Agracetus HETEROLOGICAL PEROXIDASE PROCESSING TRANSGENIC COTTON PLANTS.
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
CA2221747A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Kevin Mcbride Cotton fiber transcriptional factors
JPH0967270A (ja) 1995-08-31 1997-03-11 Res Dev Corp Of Japan 水晶体混濁の予防および治療法、並びにそのための薬 剤
US6084153A (en) 1996-02-14 2000-07-04 The Governors Of The University Of Alberta Plants having enhanced nitrogen assimilation/metabolism
JPH1094392A (ja) 1996-09-20 1998-04-14 Nisshinbo Ind Inc ワタ遺伝子
EP0905242A4 (en) 1996-10-24 2001-11-07 Japan Tobacco Inc METHOD FOR CONTROLLING THE WATER CONTENT OF A PLANT
CA2278796A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 Monsanto Company Strawberry promoters and genes
TR200000547T2 (tr) 1997-08-27 2001-05-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Lignin biyosentezi için enzimleri kodlayan genler ve bunların kullanımı.
US20090093620A1 (en) 2000-09-05 2009-04-09 David Kovalic Annotated Plant Genes
ATE528401T1 (de) 1998-08-04 2011-10-15 Cropdesign Nv Gene, welche an der toleranz gegenüber umweltstress beteiligt sind
US6313375B1 (en) 1998-08-13 2001-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize aquaporins and uses thereof
US6313376B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize aquaporins and uses thereof
US7511190B2 (en) 1999-11-17 2009-03-31 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
US6717034B2 (en) 2001-03-30 2004-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Method for modifying plant biomass
JP3178672B2 (ja) 1998-10-14 2001-06-25 農林水産省国際農林水産業研究センター所長 環境ストレス耐性植物
EP1033405A3 (en) 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
WO2000066610A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 Agritope, Inc. Apple promoters for expression of transgenes in plants
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US20110214206A1 (en) 1999-05-06 2011-09-01 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US8877916B2 (en) 2000-04-26 2014-11-04 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US6559363B1 (en) 1999-07-05 2003-05-06 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Cotton plants with improved cotton fiber characteristics and method for producing cotton fibers from these cotton plants
WO2001006006A1 (fr) 1999-07-19 2001-01-25 Japan Science And Technology Corporation Gene de resistance au stress ambiant
US6472588B1 (en) 1999-09-10 2002-10-29 Texas Tech University Transgenic cotton plants with altered fiber characteristics transformed with a sucrose phosphate synthase nucleic acid
US6359196B1 (en) 1999-09-23 2002-03-19 Finn Lok Germination-specific plant promoters
US6403862B1 (en) 1999-09-24 2002-06-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from maize
AU783169B2 (en) 1999-09-27 2005-09-29 Monsanto Technology Llc Methods for determining oils in seeds
US6407315B1 (en) 1999-11-02 2002-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from barley
US6828476B1 (en) 1999-12-02 2004-12-07 The Regents Of The University Of California Cotton transcription factors and their uses
EP2285104A1 (en) 2000-03-31 2011-02-16 United Video Properties, Inc. System and method for reducing cut-offs in program recording
DE60141547D1 (de) 2000-04-07 2010-04-22 Basf Plant Science Gmbh Stress-gekoppelte Protein-Phosphatase und ihre Verwendung in Pflanzen
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
US20040181830A1 (en) 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
AU8681101A (en) 2000-08-24 2002-03-04 Scripps Research Inst Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methodsof use
US20020170088A1 (en) 2000-11-03 2002-11-14 The Regents Of The University Of California Novel auxin binding proteins and uses thereof
CA2430642A1 (en) 2000-12-01 2003-02-20 John B. Ohlrogge Plant seed specific promoters
CN1326996C (zh) 2000-12-08 2007-07-18 联邦科学及工业研究组织 蔗糖合酶的基因表达在植物组织中的修饰及其用途
US7214786B2 (en) 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
ATE540575T1 (de) 2001-03-16 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Regulatoren des zucker- und lipidstoffwechsels in pflanzen
AU2002302595B2 (en) 2001-05-03 2006-07-13 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Freeze-tolerant eukaryotic cells
WO2003020025A2 (en) 2001-08-31 2003-03-13 The Dow Chemical Company Nucleic acid compositions conferring insect control in plants
US7038111B2 (en) 2001-09-06 2006-05-02 The Arizona Board Of Regents Method for increasing stress tolerance in plants
US20050108791A1 (en) 2001-12-04 2005-05-19 Edgerton Michael D. Transgenic plants with improved phenotypes
AU2003233489B2 (en) 2002-04-08 2008-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced silk exsertion under stress
CN1653174A (zh) 2002-05-08 2005-08-10 巴斯福植物科学有限公司 用于提高植物含油量的方法
US20030221218A1 (en) 2002-05-17 2003-11-27 The Regents Of The University Of California Bioengineering cotton fiber properties
JP2005185101A (ja) 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
ATE495259T1 (de) 2002-07-10 2011-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verwendung eines gens um den ölgehalt in pflanzen zu erhöhen
WO2004053055A2 (en) 2002-12-04 2004-06-24 Monsanto Technology Llc Transgenic maize with enhanced phenotype
DE10260903A1 (de) 2002-12-20 2004-07-08 Henkel Kgaa Neue Perhydrolasen
WO2004058963A2 (en) * 2002-12-31 2004-07-15 University Of Delhi A novel gene osisap1 of rice confers tolerance to stresses and a method thereof
BRPI0408735A (pt) 2003-03-12 2006-03-07 Evogene Ltd polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucléico, célula transgênica, organismo transgênico, vegetal transgênico, método para produzir um vegetal transgênico, método para expressar um polinucleotìdeo de interesse em uma célula, e método para co-expressar dois polinucleotìdeos de interesse em uma célula
AU2004230490C1 (en) 2003-04-15 2012-08-16 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
WO2004092367A1 (en) 2003-04-16 2004-10-28 Basf Plant Science Gmbh Use of genes for increasing the oil content in plants
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
BR122016024209B1 (pt) 2003-05-22 2019-08-20 Evogene Ltd. Método para aumentar a biomassa e/ou tolerância de uma planta ao estresse salino e construto de ácido nucleico
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
EP1636333A4 (en) 2003-06-19 2007-10-24 Evogene Ltd NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR REGULATING GENE EXPRESSION IN VEGETABLE TRICHROMES, AND HYBRID GENES AND METHODS IN WHICH THEY INTERVENE
JP4452876B2 (ja) 2003-08-06 2010-04-21 国立大学法人 香川大学 ＬＫＰ２部分ｃＤＮＡを用いた遺伝子導入による植物体の種子収量、乾燥重量の制御
US7803983B2 (en) 2004-06-30 2010-09-28 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
US7884261B2 (en) 2004-06-30 2011-02-08 CERES,Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
US20060143729A1 (en) 2004-06-30 2006-06-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US20060150283A1 (en) 2004-02-13 2006-07-06 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7989676B2 (en) 2006-08-31 2011-08-02 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
US20060048240A1 (en) 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20060107345A1 (en) 2003-09-30 2006-05-18 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
EP2302062A1 (en) 2003-10-20 2011-03-30 CropDesign N.V. Identification of E2F target genes and uses thereof
WO2005084331A2 (en) 2004-03-01 2005-09-15 Syngenta Participations Ag Sorghum gene expression profiling
US8049069B2 (en) 2004-03-31 2011-11-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
AU2005229157B2 (en) 2004-03-31 2011-07-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
DE602005027191D1 (de) 2004-04-23 2011-05-12 Ceres Inc Nukleotidsequenzen und davon kodierte polypeptide zur änderung von leistungseigenschaften der stickstoffverwendung bei pflanzen
CA2564202A1 (en) 2004-05-05 2005-11-17 The Royal Veterinary And Agricultural University Ammonium/ammonia transporter
CN101948846A (zh) 2004-06-14 2011-01-19 伊沃基因有限公司 参与植物纤维发育的多核苷酸和多肽和使用它们的方法
MX2007004884A (es) 2004-10-22 2007-06-22 Agrinomics Llc Generacion de plantas con contenido alterado de aceite.
WO2006076099A2 (en) 2004-12-08 2006-07-20 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant size and biomass in plants
WO2008069878A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Ceres, Inc. Modulating lignin in plants
US20070294782A1 (en) * 2004-12-21 2007-12-20 Mark Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
PT1827078E (pt) 2004-12-21 2014-05-26 Monsanto Technology Llc Plantas transgénicas com características agronómicas melhoradas
US20080148432A1 (en) 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
EP1882392A4 (en) 2005-05-10 2009-07-01 Monsanto Technology Llc GENES AND THEIR USES FOR PLANT IMPROVEMENTS
US7707483B2 (en) 2005-05-25 2010-04-27 Intel Corporation Technique for performing cyclic redundancy code error detection
US20060288451A1 (en) 2005-05-26 2006-12-21 Monsanto Technology, L.L.C. Elevation of oil in monocot plants
WO2006138012A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Ceres Inc. P450 substrates and methods related thereto
US20080301839A1 (en) 2005-08-30 2008-12-04 Ravanello Monica P Transgenic plants with enhanced agronomic traits
MX350551B (es) 2005-10-24 2017-09-08 Evogene Ltd Polipeptidos aislados, polinucleotidos que los codifican, plantas transgenicas que expresan los mismos y metodos para usarlos.
CA2644675A1 (en) 2006-01-13 2007-07-26 Greg Nadzan Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring improved nitrogen use efficiency characteristics in plants
EP2010661A2 (en) 2006-03-24 2009-01-07 BASF Plant Science GmbH Proteins associated with abiotic stress response and homologs
WO2007113237A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Basf Plant Science Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
MX349479B (es) 2006-12-20 2017-07-31 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos involucrados en el desarrollo de fibra vegetal y metodos de uso.
MX2009010858A (es) 2007-04-09 2009-11-02 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos y metodos para aumentar el contenido de aceite, la velocidad de crecimiento y biomasa de las plantas.
EP2573178A3 (en) 2007-07-10 2013-07-24 Monsanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
BR122020022203B1 (pt) 2007-07-24 2021-04-20 Evogene Ltd método de aumento da taxa de crescimento de uma planta
US8362325B2 (en) 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
CN101977928B (zh) 2007-12-27 2014-12-10 伊沃基因有限公司 用于改进植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物胁迫耐受性、产量和生物量的分离多肽、多核苷酸
CA3148194A1 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and peptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
EP2297336A1 (en) 2008-05-29 2011-03-23 Vib Vzw Minichromosome maintenance complex interacting protein involved in cancer
BRPI0912898B1 (pt) 2008-08-18 2022-04-12 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio e/ou tolerância à deficiência de nitrogênio de uma planta
EP2347014B1 (en) 2008-10-30 2016-09-21 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficieny
MX340023B (es) 2008-12-29 2016-06-22 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos codificados, y metodos para utilizarlos para aumentar la tolerancia al estres abiotico, biomasa y/o rendimiento en plantas que los expresan.
CA3123543A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
EP2440033B1 (en) 2009-06-10 2017-03-15 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
US8937215B2 (en) 2009-08-04 2015-01-20 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides for increasing desirable plant qualities
US20110080674A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Joel Durand Magnetic azimuth adjustment for tonearm
EP2519097B1 (en) 2009-12-28 2016-03-02 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
AU2011246876B2 (en) 2010-04-28 2016-06-23 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
BR112013004851A2 (pt) 2010-08-30 2016-06-07 Evogene Ltd método de aumento de eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, conteúdo de óleo, rendimento da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, polinucleotídeo isolado, estrutura de ácido nucleio, polipeptídeo isolado, célula vegetal e planta transgêncica
BR122021002248B1 (pt) 2010-12-22 2022-02-15 Evogene Ltd Método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, e/ou taxa de crescimento de uma planta
WO2012150598A2 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
WO2013027223A2 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
CN104254242A (zh) 2011-11-21 2014-12-31 先正达参股股份有限公司 用于增强植物中的线虫抗性的组合物和方法
WO2013080203A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
BR122020022832B1 (pt) 2011-12-28 2021-08-17 Evogene Ltd Método para aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa, energia e/ou produção de semente de uma planta em comparação com uma planta nativa, e, construção de ácido nucleico isolado
WO2013128448A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
CA2873846A1 (en) 2012-05-28 2013-12-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
BR122019028124B1 (pt) 2012-08-27 2022-08-09 Evogene Ltd Método para aumentar o rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética, eficiência do uso de nitrogênio, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, método para produzir uma colheita, construto de ácido nucleico, e, método de cultivar uma cultura
BR112015015415B1 (pt) 2012-12-25 2022-08-16 Evogene Ltd. Métodos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, taxa de crescimento, biomassa, rendimento da semente, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir de uma cultura, para cultivar uma colheita, e, para selecionar uma planta
BR122020018366B1 (pt) 2012-12-26 2022-03-29 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado
CA2910097A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
CA2916060A1 (en) 2013-08-27 2015-03-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
AU2015265412B2 (en) 2014-05-28 2021-03-25 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides, polypeptides and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and yield of plants
US10858403B2 (en) 2014-08-27 2020-12-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
US10766935B2 (en) 2015-12-28 2020-09-08 Evogene Ltd. Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides

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