CN105452276A

CN105452276A - 一种小盐芥脱水素蛋白dh3及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105452276A
Application number: CN201380078594.1A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 陈文华; 孙超
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2016-03-30
Also published as: WO2015042746A1

Abstract

一种来源于小盐芥的脱水素蛋白ThDH3及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

种小盐芥脱水素蛋白 HJ及其编码基因与应用技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于小盐芥的脱水素蛋白 /¾?及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。背景技术

温度、盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害，导致作物产量降低，品质下降，严重威胁农业生产和自然环境。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、半干旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200— 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米，因缺水而少收粮食 350— 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗旱性受到周期长、优异种质资源缺乏的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应，以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径及多基因产物的复杂过程。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境的生物化学和生理学响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了小盐芥的一个脱水素蛋白（本文命名为 DH3 的编码基因，并测定了其 DNA 序列。并且发现将其导入植物超量表达后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供小盐芥的一个脱水素蛋白 Dm 的编码基因（本文命名为

ThDH3) ，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图 2所示的 35S-7 )H3-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途; 优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。附图说明图 1是 T DH3的植物表达载体 C35S-7 )H3-2300)的构建流程（图 la-lb)。

图 2是 T DH3的植物表达载体 C35S-7 )H3-2300)的质粒图。

图 3是 7 )H3 T1代转基因拟南芥植株（图中， T1C5 ) 和作为对照的非转基因拟南芥植株（图中， CK ) 的耐旱模拟实验结果。（图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株；图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。

图 4是转基因 T1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。 M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa), 1-6为耐旱转基因拟南芥 T1代植株（依次为： T1C1、 T1C2、 T1C3、 T1C4、 T1C5、 T1C6)， 7-11为不耐旱转基因拟南芥 T1代植株， 12-15为非转基因拟南芥对照。具体实施方式下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。实施例 1、干旱胁迫下小盐芥 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验中以生长过程中干旱处理的小盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为样本（tester), 以未处理的小盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为对照（driver)。具体步骤如下：

( 1 ) 供试材料：

小盐芥（ T ellungiella halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色植物园盐生植物繁育中心），播种到灭过菌的蛭石上，在 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗（光强 2000— 3000 Lx)条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（ 9.39 mM KN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM NH₄N0₃ , 0.75 mM MgS0₄， 1.5 mM CaCl₂， 50 μΜ KI， 100 μΜ Η₃ΒΟ₃， 100 M MnSO₄， 30 μΜ ZnS0₄, 1 μΜ Να₂Μο0₄, 0.1 μΜ CoCl₂, 100 μΜ Na₂EDTA, 100 M FeSO₄) —次。当苗株培养 1个月左右时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，停止浇灌，处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70 °C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的小盐芥叶片 0. 1 g，用植物 RNA提取试剂盒（购自 Invitrogen) 提取小盐芥叶片的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高；用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒（purification of poly A+ RNA from total RNA, 从总 RNA中纯化 polyA+ RNA)分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA,再以 2 Tester cDNA禾 P 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段，使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签（Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区，本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR 扩增，最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega)的说明，将上述合并的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次 PCR产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在 200 μΐ PCR管中依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ1、 2χΤ4连接酶缓冲液 5 μ1、 pGEM-T Easy载体 1 μ1、 T4 DNA连接酶 1 μ1，于 4°C连接过夜。然后取 10 连接反应产物，加入到 100 μL感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、 42°C热休克 60 s、冰浴 2 min,另加 250 μL LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone,购自 OXOID)、 0.5% 酵母提取物（Yeast Extract, 购自 OXOID ) 禾 P 1% NaCl (购自国药））置于 37°C 摇床中，以 225 r/min振荡培养 30 min, 然后从中取 200 μ 菌液涂布于含 50 g/ml氨苄青霉素、 40 g/mL X-gal、 24 g/mL IPTG (X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷) 和 IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）购自 TAKARA) 的 LB固体培养板上， 37°C培育 18小时。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 198个白色菌落 (编号： YLS-001至 YLS-198)。将所挑取的白色菌落分别接种于 96孔细胞培养板 (CORNING)中含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度 20% (体积比），于 -80°C保存备用。对所培养的菌落克隆以巢式 PCR (引物 Primer 1和 Primer 2R, 来自 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒）进行菌液 PCR扩增验证，得到 166个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后，共得到 123 个 EST(unigene)₀ 经分析有 22个重叠群，有 101个单一的序列。经 BlastN发现其中 53条 unigene在 GenBank 中有同源序列， 21条 EST功能未知或者为假定蛋白，另有 27条未获得同源匹配，推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短序列。实施例 2 小盐芥脱水素蛋白编码基因 ThDH3的克隆

克隆子 YLS-37去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID NO: 3，序列分析表明该序列的编码的蛋白质属于脱水素蛋白，本文将克隆子 YLS-37对应的全长编码基因命名为 T DH3，其对应的蛋白命名为 £>H3。

SEQ ID NO: 3

1 CTACTACTAC TACTACTGCT GAAGGAGAGG TGAAAACAGA GGAGGAGAAA AAAGGGTTCA

61 TGGAGAAGCT GAAGGAGAAG CTTCCAGGAC ACGGAAAGAA GCCTGAAGAT GCCTCAGCCG

121 CCGCCCCCGC CGCACCTGTT GTTGTTCCTC CGGTGGAGGA AGCGCATCGG GCGGAGAAGA 181 AGGGGATTTT GGAGAAGATT AAGGAGAAGC TTCCAGGATA CCATCCCAAG ACCGTAGAGG

241 AGGAGAAGAA GGAAAAGGAA TCTGGTTAAG ACGAAGAAAA AGCGGATGAT CATTATTAAT

301 ATGAATAATG ATGATGGGAG ATTTGCTTT

DH3全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列分析： SEQ ID NO: 3 为编码基因 7 )H3 的 3端序列. 根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列，设计如下三条特异性引物，作为反转录引物及 5 'RACE的特异性引物。

YLS-37GSP 1： SEQ ID NO: 4：

GCTTCTCCTTAATCTTCTCC YLS-37GSP2： SEQ ID NO: 5：

CCGATGCGCTTCCTCCACCG YLS-37GSP3 : SEQ ID NO:6:

CTACTACTACTGCTGAAGGAGAG 试剂盒自带通用引物：

AAP : SEQ ID NO: 7：

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG AUAP : SEQ ID NO: 8：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作（5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

以 YLS-37GSP1(SEQ ID NO: 4)为反转录引物，以干旱处理组小盐芥叶片提取的 mRNA为模板进行反转录，获得 cDNA模板，然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾，以加尾后的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA、 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 7 各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C预变性 5 min, 33个循环（94 °C 变性 45s, 52 °C退火 45 s， 72 °C延伸 1 min) , 72 °C延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5与通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ Ι Ο Χ Εχ Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μΐ Ex Taq 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5禾 P SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94 °C变性 45 s， 60 °C退火 45 s， 72 °C延伸 1 min)， 72 °C延伸 10 min。回收第二次 PCR产物中约为 550bp 大小的条带（ Gel Extraction Kit购自 OMEGA) , 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector载体，然后转化到 JM109 (具体方法同上），随机挑取 10 个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度 20% (体积比）， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 5与 3 '端引物 SEQ ID NO: 6进行菌液 PCR 扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆（01、 03和 06)，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。

所得的 5 'RACE产物克隆子 06测序获得序列为 SEQ ID NO : 9：

1 GGGGGGGGGG TTGCGAGTCT TTTCTGGATA ACTATGGCGG AGGAAACCAA GAACGTTCAT

61 GAGCAAGAGG TCCCAAGGGT AGCGACAGAG GAATCGCCGG CGGCGACGGC AGAGGTTACG 121 GATCGTGGAC TATTCGATTT CTTGGGGAAG AAGAAGGAGG AAACAAAACC AGAGGGGACA

181 ATCGACTCAG AGTTTGAGCA AAAGGTTCAG ATTTCGGAGC CGGCGCCGGA GGTTAAACAC

241 GAGGAAGAAG AGAAGAAGCC GAGTCTCTTG GAGAAGCTTC ACCGAAGTGA CAGCTCTTCT

301 AGCTCCTCAA GCGAGGAAGA AGGTGAAGAT GGTGAGAAGA GGAAGAAGAA GAAGAAGGAT

361 AAGAAGAAGA CTACTACTAC TACTACTGCT GAAGGAGAGG TGAAAACAGA GGAGGAGAAA

421 AAAGGGTTCA TGGAGAAGCT GAAGGAGAAG CTTCCAGGAC ACGGAAAGAA GCCTGAAGAT

481 GCCTCAGCCG CCGCCCCCGC CGCACCTGTT GTTGTTCCTC CGGTGGAGGA AGCGCATCGG 将5 '1 。£获得的序列8£0 10 ^^0 _: 9，与获得的序列 SEQ ID NO : 3拼接，获得 SEQ ID NO: 10 :

1 GGGGGGGGGG TTGCGAGTCT TTTCTGGATA ACTATGGCGG AGGAAACCAA GAACGTTCAT

61 GAGCAAGAGG TCCCAAGGGT AGCGACAGAG GAATCGCCGG CGGCGACGGC AGAGGTTACG

121 GATCGTGGAC TATTCGATTT CTTGGGGAAG AAGAAGGAGG AAACAAAACC AGAGGGGACA

181 ATCGACTCAG AGTTTGAGGA AAAGGTTCAG ATTTCGGAGC CGGCGCCGGA GGTTAAACAC

241 GAGGAAGAAG AGAAGAAGCC GAGTCTCTTG GAGAAGCTTC ACCGAAGTGA CAGCTCTTCT

301 AGCTCCTCAA GCGAGGAAGA AGGTGAAGAT GGTGAGAAGA GGAAGAAGAA GAAGAAGGAT

361 AAGAAGAAGA CTACTACTAC TACTACTGCT GAAGGAGAGG TGAAAACAGA GGAGGAGAAA

421 AAAGGGTTCA TGGAGAAGCT GAAGGAGAAG GTTCCAGGAC ACGGAAAGAA GCCTGAAGAT

481 GCCTCAGCCG CCGCCCCCGC CGCACCTGTT GTTGTTCCTC CGGTGGAGGA AGCGCATCGG

541 GCGGAGAAGA AGGGGATTTT GGAGAAGATT AAGGAGAAGC TTCCAGGATA CCATCCCAAG

601 ACCGTAGAGG AGGAGAAGAA GGAAAAGGAA TCTGGTTAAG ACGAAGAAAA AGCGGATGAT

661 CATTATTAAT ATGAATAATG ATGATGGGAG ATTTGCTTT 根据 SEQ ID NO : 10序列分析， SEQ ID NO: 10 为 7¾DH3的全长序列根据 SEQ ID NO: 10 序列设计一对引物如下：

ThDH3F : SEQ ID NO: 1 1：

ATGGCGGAGGAAACCAAGA

ThDH3R: SEQ ID NO: 12：

TTAACCAGATTCCTTTTCCTTC AP : SEQ ID NO: 13：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 通过 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12来克隆 ThDH3全长编码序列。

提取干旱处理组小盐芥的 RNA作为模板，以引物 SEQ ID NO: 13为反转录引物，反转录获取小盐芥 cDNA，然后采用 stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以上述获得的小盐芥 cDNA 为模板进行 PCR 反应。 50 μΐ PCR 反应体系： 5 μΐ 10 X PfuUltra II reaction Buffer 0.5 μΐ 25 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 1 1和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预变性 2 min, 35个循环（95 °C变性 25 s， 54°C退火 25 s， 72°C延伸 30min) ， 72°C延伸 5 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物补水至 400 μ 1，先用氯仿抽提一遍去除蛋白，吸取上清加入 3M 醋酸钠溶液 40 μ1，加入 2倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μΐ双蒸水溶解。加入 2.5 μΐ 10 X Ex Buffer、 0.5 μΐ 5 mM 的 dATP禾 P 1.0 μΐ Ex Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到的约 600bp的 DNA 片段回收（Omega回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上（得到 7¾DH3-pGEM 质粒），然后转化 JM109, 随机挑取 8个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度 20% (体积比）， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 11与 SEQ ID NO: 12进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1

DH3蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MAEETK VHE QEVPRVATEE SPAATAEVTD RGLFDFLGKK KEETKPEGTI DSEFEQKVQI

61 SEPAPEVKHE EEEKKPSLLE KLHRSDSSSS SSSEEEGEDG EKRKKKKKDK KKTTTTTTAE

121 GEVKTEEEKK GF EKLKEKL PGHGKKPEDA SAAAPAAPW VPPVEEAHPA EKKGILEKIK 181 EKLPGYHPKT VEEEKKEKES G

7¾DH3编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGCGGAGG AAACCAAGAA CGTTCATGAG CAAGAGGTCC CAAGGGTAGC GACAGAGGAA

61 TCGCCGGCGG CGACGGCAGA GGTTACGGAT CGTGGACTAT TCGATTTCTT GGGGAAGAAG

121 AAGGAGGAAA CAAAACCAGA GGGGACAATC GACTCAGAGT TTGAGCAAAA GGTTCAGATT 181 TCGGAGCCGG CGCCGGAGGT TAAACACGAG GAAGAAGAGA AGAAGCCGAG TCTCTTGGAG

241 AAGCTTCACC GAAGTGACAG CTCTTCTAGC TCCTCAAGCG AGGAAGAAGG TGAAGATGGT

301 GAGAAGAGGA AGAAGAAGAA GAAGGATAAG AAGAAGACTA CTACTACTAC TACTGCTGAA

361 GGAGAGGTGA AAACAGAGGA GGAGAAAAAA GGGTTTATGG AGAAGCTGAA GGAGAAGCTT

421 CCAGGACACG GAAAGAAGCC TGAAGATGCC TCAGCCGCCG CCCCCGCCGC ACCTGTTGTT 481 GTTCCTCCGG TGGAGGAAGC GCATCCGGCG GAGAAGAAGG GGATTTTGGA GAAGATTAAG

541 GAGAAGCTTC CAGGATACCA TCCCAAGACC GTAGAGGAGG AGAAGAAGGA AAAGGAATCT

601 GGTTAA

实施例 3 7¾DH3基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 CaMV35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。在 Pnos启动子的上游插入 35S启动子及终止子 Tnos分别作为 ThDH3基因的启动子和终止子， ThDH3基因在所述 35 S启动子和 Tnos终止子之间。

用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。

50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μΐ ρΒΙ121 1.0 μΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300 (Promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 14 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 15：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG 使用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ1 ρΒΙ121、 1.0 μΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72°C延伸 30 s)， 72 °C延伸 10 min。通过 Sacl、 EcoRI酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300-l ( Promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。 SEQ ID NO: 16：

AAGG^GCJCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 17：

TCKGAA rrCCC AGTGAATTCCCGATCT AGT A 使用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΙ ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μΐ稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒、 1.0 μΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 的引物 8£0 10 ^^0: 18和 8£0 10 ^^0: 19各2.0 ^，以及 31 μΐ 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C变性 30 s， 50°C退火 30 s, 72°C延伸 30 s)， 72°C延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切后将所得 PCR产物连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO: 18：

ACT^GCrJATGGTGGAGCACGACACTCT

SEQ ID NO: 19：

TGACJGC^GAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC 使用引物 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21扩增 ThDH3 (模板是实施例 2所获得的阳性 7¾DH3-pGEM质粒），采用 stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ lOxPfuUltra II reaction Buffer、 0.5μ1 25 mM的 dNTP、 2.0 μΐ ThDH3-pGEM质粒、 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:20和 SEQ ID NO: 21各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预变性 2 min，35个循环（95 °C变性 25 s，51 °C退火 25 s，72°C延伸 30s)，72°C延伸 5 min。通过 Pstl、 Sacl酶切后将所得 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 35S-7¾DH3-2300。

SEQ ID NO: 20：

AACJGC^GATGGCGGATCATCCTCGTTC

SEQ ID NO: 21：

AAGGAGCTC CTAGGTTTCCTTCTTCTTCTC 实施例 4 35S-ThDH3-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备：提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ_§/ιη1利福平和 50 μ_§/ιη1链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD_6(K)值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（ 1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 g/ml利福平和 50 g/ml 链霉素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5小时至 OD₆。。=0.8。冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次，使细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min，弃上清液；加入一定量冰预冷的 10%甘油（体积）重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min，收集沉淀；用冰预冷的 10%甘油（体积）重复洗 3-4次；加入适量冰预冷的 10%甘油（体积）重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞，以 40 μΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，向 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3 中所得的阳性 35S-7 )H3-2300 质粒，混匀后冰浴约 10 min。将所述感受态细胞和 35S-ThDH3-2300质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯（购自 bio-rad)中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部，注意不要有气泡。将电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1 cm 规格的电击杯， MicroPulser (购自 bio-rad)的程序设置为 "Agr"，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用移液枪将感受态细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm 摇动培养 1小时。取 100-200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 g/ml链霉素和 50 g/ml卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。

实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥

待转化植株培养：拟南芥种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）播种在泥炭土中，经 4°C低温处理 3天后，置于 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽。 7-10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 ) 的口径为 7.5 cm 的塑料钵中，每钵栽种 6株，置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长。移栽前每钵浇 1/2MS培养基（9.39 mM KN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM H₄N0₃, 0.75 mM MgS0₄， 1.5 mM CaCl₂, 50 μΜ ΚΙ, 100 μΜ Η₃ΒΟ₃， 100 M MnSO₄， 30 M ZnSO₄， 1 μΜ Na₂Mo0₄, 0.1 μΜ CoCl₂, 100 μΜ Na₂EDTA, 100 μΜ FeS0₄) 40 ml, 移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。按需要每 3-4周一次（或者时间更长）。为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。当大多数花序约 1-10 cm高（剪去第一个花序后约 4-8天）时准备浸染。

农杆菌的培养：取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基（含 75 mg/L利福平、 100 mg/L链霉素和 100 mg/L卡那霉素）中， 28°C恒温下 250 r/min振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1%-2% 的体积比接种到 200 mL无菌 LB液体培养基（含 75 mg/L利福平、 100 mg/L链霉素和 100 mg/L卡那霉素）中， 28 °C下 250 171^^【亘温振摇使农杆菌的浓度达到00₆₍₎₍₎=1.8，然后在 4 °。下 3000 r/min离心 15 min, 弃去上清液后用浸染培养基（该浸染培养基是 1/2MS培养基里加 5.0%的蔗糖（w/v)和 0.05% ( 500 μΙ7ί) 的 Silwet L-77) 重新悬浮农杆菌，悬浮至 OD₆QQ约 0.80。

花序的浸染：将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中，每个口径 9 cm的容器中加入 200-300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。将植株倒置，使地上组织全部浸没在农杆菌悬浮液中 3-5 s，并要轻轻搅动。浸润后植株上应该有一层液体膜。浸染过的植株放在塑料盘中，用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿，然后放置在弱光或暗处过夜，注意小心防止阳光直射植株。处理后约 12-24 小时去掉覆盖。正常培养植株，植株进一步生长 3-5周，直至角果变褐变干。收获种子，并将种子用离心管在 4 °C下干燥贮存。转基因种子筛选：配制含 1/4 MS (4.695 mM KN0₃， 0.3125 mM KH₂P0₄， 5.15 mM H4NO3, 0.375 mM MgS0₄， 0.75 mM CaCl₂, 25 μΜ ΚΙ, 50 μΜ Η₃ΒΟ₃， 50 M MnSO₄， 15 M ZnS0₄， 0.5 μΜ Να₂Μο0₄, 0.05 M CoCl₂， 50 μΜ Na₂EDTA, 50 M FeSO4)大量元素的水溶液，加入 0.8 % 琼脂粉，用微波炉加热至琼脂完全溶化，待冷却到 50°C 左右，加入所需量的终浓度为 50 mg 的卡那霉素，摇匀后每培养皿中倒入 25 mL ，置实验台冷却凝固后即可播种。把称量好的种子倒在一张普通复印纸上，用手指轻敲复印纸，将种子均匀地播种在琼脂胶上，盖上培养皿盖，置 4 °C 冰箱冷处理 72小时后，移至 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽，定期统计种子发芽和幼苗生长情况，将抗性幼苗及时移栽到营养土中。移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。取生长 20天的拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA，用 SEQ ID NO: l l : 禾 P SEQ ID NO: 12扩增 ThDH3 ， 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ DNA、 1.0 μ1 Εχ Τα 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12 各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C变性 45 s， 51 °C退火 45 s, 72°C 延伸 45 s)， 72°C延伸 7 min，将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号（T1C1-T1C12), 并保存。实施例 6 过表达 ThDH3的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1C1-T1C6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石上，每盆播种 10颗种子，25 °C、10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS, 培养 20天之后，每盆保留大小较一致的 4-5棵苗，用于干旱实验。转基因拟南芥、对照拟南芥干旱 14天（不浇水）， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株（T0代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 TICK T1C2、 T1C3、 T1C4、 T1C5、 T1C6 六个株系共 24棵（每株系各 4-5棵）拟南芥中 21棵能够存活并继续生长，显现出明显的耐旱性（参见图 3a和 3b，以 T1C5为例， TICK T1C2、 T1C3、 TIC 4、 T1C6 的结果与 T1C5类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 ThDH3蛋白表达

分别取对照拟南芥植株、耐旱转基因拟南芥 T1代植株 (分别属于 T1C1、T1C2、T1C3、 T1C4、 T1C5、 T1C6六个株系）、和不耐旱转基因拟南芥 T1代植株的干旱 10天的叶片各 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 Invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（2 μg总 RNA作为模板，反转录引物为 SEQ ID NO: 13)。通过 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12扩增 ThDH3，检测 DH3蛋白相对表达情况。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA 1.0 μΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11禾 P SEQ ID NO: 12 各 2.0 μ1，以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 29个循环（94°C 变性 45 s， 5 C退火 45 s， 72°C延伸 45s) ， 72°C延伸 10 min。

产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, TakaRa) ， 1-6 为耐旱转基因拟南芥 T1代植株（依次为： T1C1、 T1C2、 T1C3、 T1C4、 T1C5、 T1C6)， 7-11为不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株，12-15为非转基因拟南芥对照。图中所示 PCR 产物电泳条带大小与 J )H3的大小一致（约 600bp) 。结果表明，对照拟南芥没有 ThDH3转录，耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 ThDH3的转录较强，不耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 ThDH3的转录很弱。

Claims

权利要求书

1. 一个小盐芥脱水素编码基因编码的蛋白，其氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
2. 编码权利要求 1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。 3. 一种重组表达载体，其含有权利要求 2所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体，其为附图 2所示的 35S-7¾DH3-2300载体。
5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求

3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是拟南芥。