CN104968787A

CN104968787A - 一种棉花同源异型-亮氨酸拉链蛋白HDbZIP-1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104968787A
Application number: CN201380069812.5A
Authority: CN
Inventors: 陈文华; 孙超; 崔洪志; 王君丹
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2015-10-07
Also published as: WO2014107863A1

Abstract

提供了植物蛋白及其编码基因与应用，特别提供了一个来源于棉花的同源异型-亮氨酸拉链蛋白HDbZIP-1及其编码基因，及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花同源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-1及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的同源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。背景技术温度、盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害，导致作物产量降低，品质下降，严重威胁农业生产和自然环境。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计, 世界干旱、半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、半干旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200— 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米，因缺水而少收粮食 350— 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状,利用常规育种方法改良作物的抗旱性受到周期长、优异种质资源缺乏的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力,已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应，以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径及多基因产物的复杂过程。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。发明内容

本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE (cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆出了棉花的一个同源异型-亮氨酸拉链蛋白（本文命名为 HDbZIP) 的编码基因，并测定了其 DNA序列。并且发现将其导入植物超量表达后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个同源异型-亮氨酸拉链蛋白 HDbZIP-1 的编码基因 (本文命名为 GhHDbZIP-1 ) ，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图 2所示的 35S-GhHDbZIP-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如

SEQ ID NO: 1所示。附图说明图 1是 GhHDbZIP-1的植物表达载体 (358-011111¾21?-1-2300；)的构建流程（图 la-lb)。图 2是 GhHDbZIP-1的植物表达载体 (35S-GhHDbZIP-l-2300)的质粒图。

图 3是 GhHDbZIP-1 T1代转基因拟南芥植株（图中， T1D2; T1D4) 和作为对照的非转基因拟南芥植株（图中， CK1、 CK2 ) 的耐旱模拟实验结果。（图 3a为正常生长 20 天的拟南芥植株；图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。

图 4干旱胁迫和正常生长条件下的 T1代转基因拟南芥植株及对照植株 ABA含量变化检测结果。 1-8依次为株系： T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5、 T1D6、 CK1、 CK2, 其中 T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5、 T1D6为转基因植株， CK1、 CK2为对照植株。图 5是转基因 T1代拟南芥植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。 M为 DNA Ladder Marker (DL5000,TakaRa) ， 1-5为耐旱转基因拟南芥 Tl 代植株（依次为株系： T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5 ) ， 6-8为非转基因拟南芥对照， 9-11为不耐旱转基因拟南芥 T1代植株。具体实施方式下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。实施例 1、干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为样本 (tester), 以未处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为对照（driver)。具体步骤简述如下：

(1) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25°C、光周期 16h光照 /8h黑暗（光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（9.39 mMKN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mM NH4NO3, 0.75 mMMgSO₄， 1.5 mMCaCl₂， 50 μΜ KI， 100 μΜΗ₃ΒΟ₃， 100 MMnSO₄， 30 MZnSO₄， 1 μΜΝα₂Μο0₄, 0.1 μΜ CoCl₂, 100 μΜ Na₂EDTA, 100 MFeSO₄) — 次。当苗株高达 25-30 cm时用于实验。

(2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25°C、光周期 16h光照 /8h黑暗条件下培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25°C、光周期 16h 光照 /8h黑暗条件下培养，停止浇灌，处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

(3) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片 0.5 g，用植物 RNA提取试剂盒（购自 invitrogen) 提取棉花叶片的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆。/OD₂₈。比值为 1.8-2.0，表明总 RNA 纯度较高；用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒（purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 Tester cDNA禾 P 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合, 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签（Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区，本实验同时用内切酶 Haelll 按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR 扩增，最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒的程序，将上述合并的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接，其具体步骤如下：用 200 μΐ PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ1， 2χΤ4连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μΐ ，于 4°C连接过夜。取 10 连接反应产物，加入到 100 感受态大肠杆菌 JM109(购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min,另力口 250 μL LB培养液（ 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl 购自国药）置 37°C水浴中，以 225 r/min振荡培养 30 min,取 200 μL菌液涂布于含 50 g/mL 氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG ( X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上， 37°C培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 266个白色菌落 (编号： Gh-A001至 Gh-A266)。将所有白色克隆分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 -80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增，得到 216个阳性克隆，然后将所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

(6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后，共得到 173 个 EST(unigene)₀ 经分析有 27个重叠群，有 146个单一的序列。经 BlastN发现其中 85条 unigene在 GenBank 中有同源序列（蛋白同源性 50%以上）， 29条 EST功能未知或者为假定蛋白，另有 32 条未获得同源匹配，推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短序列。实施例 2 棉花同源异型 -亮氨酸拉链蛋白编码基因 GhHDbZIP-1的克隆

克隆子 Gh-A137去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列的编码的蛋白质属于同源异型 -亮氨酸拉链蛋白，本文将克隆子 Gh-A137对应的全长编码基因命名为 GhHDbZIP-l，其对应的蛋白命名为 HDbZIP-l。

SEQ ID No: 3

1 TCTATAAGAG ATGCAATGAG GAATCC A A TGTACTAATT GTGGTGGTCC GGCTATTATT

61 GGTGATATGT CACTTGAAGA ACAACTTCTT AGAATCGAAA ATGCTCGTTT AAAAGA GAA

121 TTAGATCGTG TTTGTGCACT TGCTGGTAAG TTTTTAGGTC GTCCAATTAC AGGACCTCCA

181 TTACCAAACT CAAGTTTAGA GGTTGGTGTT GGCACCAATG GTACTTTTGG AACCACTATG

241 GCTACTACTA CAACATTGCC TTTAGGACAT GATGCTTTAC CAACAATGGT TGTTCCTAGT

3 01 AATAGACCGG CAACAACACT CGATCGATCG ATGTTTTTGG AACTTGCTTT GGCTGCCATG

361 GATGAACTTG TTAAGATGGC ACAAACTGAT GAGCCATTAT GGATTAAGAA CATAGAAGGT

421 GGAAGAGAAA TGTTGAACCA TGATGAGTAT TTAAGGACAT TTACACCTTG TATTGGTTTA

481 AAACCAAATG GTTTTGTCAC TGAAGCGTCA AGGGAGACTG GTGTAGTGAT TA CAACAGT

541 CTAGCCCTTG TTGAAACATT AGTGGACTCG AATCGTTGGG CAGAGATGTT TCATTGTATG

601 ATTGC AGAA CATCAACAAC TGATGTGATA TCTAATGGCA TGGGAGGAAC CAGAAATGGT

661 GCACTTCAAC A GAATGC TGAGCTTCAA ATCCTTTCAC CTTTAGTTCC TGTTCGTGAA

721 GTAAGTTTCT TAAGGTTCTG TAAACAACAT GCTGAAGGTG TTTGGGCTGT GGTTGATGTA

781 TCCGTTGATA C A CAAAGA AAGTACTACA TTTGTTACCT GTAGGAGACT TCCTTCTGGT

841 TGTGTTGTTC AAGA ATGCC TAATGGTTAC TCCAAGGTTA TATGGGTTGA ACATGCT

HDbZIP-l全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计如下三条特异性引物，作为 3'RACE 的 5'端特异性引物。 GhA137 GSP1 : SEQ ID NO: 4：

TCTATAAGAGATGCAATGAGG

GhA137 GSP2: SEQ ID NO: 5：

ACTAATTGTGGTGGTCCGGC

GhA137 GSP3 : SEQ ID NO: 6：

AGGCATATCTTGAACAACAC

试剂盒自带通用引物：

AP: SEQ ID NO: 7：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT AUAP: SEQ ID NO: 8：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC

实验步骤按试剂盒说明书操作（ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 8 (试剂盒自带的 AUAP引物），以 SEQ ID NO: 7弓 I物（试剂盒自带的 AP弓 I物）和棉花 mRNA反转录得到的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 8 各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5与通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO:8各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C 预变性 5 min， 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。回收第二次 PCR产物中约为 2.1 kbp大小的条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA), 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然后转化到大肠杆菌 JM109 (具体方法同上），随机挑取 6个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行菌液 PCR扩增（反应体系及条件同上），得到 3个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA的 3'端。

所得的 3'RACE产物克隆子 GhHD-2测序获得序列为 SEQ ID NO: 9：

1 ACTAATTGTG GTGGTCCGGC TATTATTGGT GATATGTCAC TTGAAGAACA ACTTCTTAGA

61 A CGAAAATG CTCGTTTAAA AGATGAAT A GATCGTGTTT GTGCACTTGC TGGTAAGTTT

121 TTAGGTCGTC CAATTACAGG ACCTCCATTA CCAAACTCAA GTTTAGAGCT TGGTGTTGGC

181 ACCAATGGTA CTTTTGGAAC CACTATGGCT ACTACTACAA CATTGCCTTT AGGACATGAT

241 GCTTTACCAA CAATGGTTGT TCCTAGTAAT AGACCGGCAA CAACACTCGA TCGATCGATG

3 01 TTTTTGGAAC TTGCTTTGGC TGCCATGGAT GAACTTGTTA AGATGGCACA AACTGATGAG

361 CCATTATGGA TTAAGAACAT AGAAGGTGGA AGAGAAATGT TGAACCATGA TGAGTATTTA

421 AGGACATTTA CACCTTGTAT TGGTTTAAAA CCAAATGGTT TTGTCACTGA AGCGTCAAGG

481 GAGACTGGTG TAGTGATTAT CAACAGTCTA GCCCTTGTTG AAACATTAAT GGACTCGAAT

541 CGTTGGGCAG AGATGTTTCA TTGTATGATT GCTAGAACAT CAACAACTGA TGTGATATCT

601 AATGGCATGG GAGGAACCAG AAATGGTGCA CTTCAACTTA TGAATGCTGA GCTTCAAATC

661 CTTTCACCTT TAGTTCCTGT TCGTGAAGTA AGTTTCTTAA GGTTCTGTAA ACAACATGCT

721 GAAGGTGTTT GGGCTGTGGT TGATGTATCC GTTGATACTA TCAAAGAAAG TACTACATTT

781 GTTACCTGTA GGAGACTTCC TTCTGGTTGT GTTGTTCAAG ATATGCCTAA TGGTTACTCC

841 AAGGTTATAT GGGTTGAACA TGCTGAA AT GATGAGAGCC AAGTTCATCA ACTATACCGG

901 CCTTTACTAA GTTCCGGCGT GGGCTTCGGT GCCCAACGGT GGGTGGCGGC CCTTCAACGG

961 CAATGCGAAT GCCTTGCCAT ACTCATGTCC TCCACCGTTC CCACTAGAGA CCACACCGCT

1021 ATAACTGCGA GTGGGAGACG GAGCATGTTA AAGCTAGCTC AACGGATGAC AGATAACTTC

1081 TGTGCCGGGG TTTGTGCATC GACAGTTCAT AAATGGAACA AGCTTAACGC CGGGAATGTA

1141 GACGAAGACG TTAGGGTTAT GACTAGGAAA AGCATTGACG ACCCCGGCGA ACCGCCAGGG

12 01 ATCGTACTAA GCGCCGCCAC TTCGGTTTGG TTGCCGGTGT CACCGCAACG GCTTTTCGAT

1261 TTCCTACGCG ACGAACGGTT GAGGAGCGAG TGGGACATAT TGTCAAATGG CGGACCTATG

1321 CAAGAGATGG CACACATTGC CAAAGGCCAA GATCATGGCA ATTGCGTTTC CCTCCTGCGT

1381 GCCAGTGCCA TGAACGCAAA TCAGAGCAGC ATGCTGATAT TGCAGGAAAC ATGCATAGAC

1441 GCAGCAGGGT CGCTTGTAGT GTACGCGCCA GTTGATATTC CAGCCATGCA CGTTGTCATG

1501 AACGGTGGTG ATTCCGCTTA CGTCGCACTT TTACCTTCGG GATTCGCCAT TGTCCCGGAC

1561 GGTCCTGGGT CTCATGGACC TATCTCTAAC GGACATGTTA ACGGAAACAC CGGCGGAGGG

1621 TCGTCAAGAG TCGGTGGATC GCTTCTCACG GTAGCTTTTC AAATATTGGT AAACAGTTTA

1681 CCAACGGCTA AACTGACCGT CGAATCGGTT GAAACGGTTA ATAATC GAT TTCGTGTACT

1741 GTCCAAAAGA TCAAAGCTGC CCTTTCAATG CGAAAGTTGA TGACTCAGTG AGTTGGGTAA

18 01 TTTTAGTTAT TAATATAGGT TTTGGTTGTG GTTAAAGAGT GTGCGACTCA GTAAGTTGGG

1861 ACGAGTGGGG GTATTGAGTC AAGAACGAAC CGCGCGTGGA GAATCATTGT ATGGTGGTGA

1921 TCAAAGGGAC AAGGGTGGTG GTTCGGGTAT TGACTCAGGT CGACCCTTTG AGTTGGCTCG

1981 CCGGGACCAG AAAAGAAAGT CAAAACTCAA ACAGCGTCGT ATTTGGTGTA CTAATCCAAT

2 041 TCTCTTTTC CTAGGGATTT AATGTCAATG AACATTATTG TATTGAGTTG TCACTTTCTT

2101 TTTTTAGGGG TTTGGCTTTT GGAAACTTAC TAATTTAA A TATTAATTTC ACACTTCAAT

2161 TTAAAAAAAA AAAAAAAAA 根据已经获得的 SEQ ID NO: 9序列，设计如下三条特异性引物，作为反转录引物及 5'RACE的 3 '端特异性引物。

GhHD-2 GSP 1： SEQ ID NO: 10：

CAAGTTCATCCATGGCAGCC

GhHD-2 GSP2: SEQ ID NO: 1 1：

GATCGAGTGTTGTTGCCGGTC

GhHD-2 GSP3 : SEQ ID NO: 12：

ACTAATTGTGGTGGTCCGGC

试剂盒自带通用引物：

AAP: SEQ ID NO: 13：

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 实验步骤按试剂盒说明书操作（ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒购自 invitrogen公司）。

以 GhHD-2 GSP1 ( SEQ ID NO: 10) 为反转录引物，以棉花 mRNA为模板进行反转录，获得 cDNA模板，然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾，以加尾后的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 10与通用引物 SEQ ID NO: 13 (试剂盒自带， I 为次黄嘌吟修饰的 a， c, g，或 t)，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 13 各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 11与通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（ 94 变性 30 s， 53 °C 退火 30 s， 72V 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min。回收第二次 PCR产物中约为 900 bp大小的条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA), 并将其连接到 pGEM-T Easy Vector, 然后转化到 JM109 (具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 μ_§/η 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 11与 3'端引物 SEQ ID NO: 12进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆（GhHD21-l， GhHD21-3 _; GhHD22-5 ) ，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。所得的 5'RACE产物克隆子 GhHD22-5测序获得序列为 SEQ ID NO: 14：

1 T GA GAATT TTGGGGGGTT TATAGATGAT AGTTCTGGTC CTAATGACGG TCTTGGTGGT

61 GCAAGAA AG TTGCAGACGT ACCTTATAAC ACCCCCACCA TGCCTACTGG TGTTTTCTCT

121 CAACCCCGCC TTGTTTCTTC TTCAATTCCT AAGAACATGT TCAACTCACC AGGCCTTTCT

181 CTTGCTCTTC AACCCAATAT AGA AATCAA GGAGATGAGA CTAGATTAGG TGAGAATTTT

241 GAAGGAAGTA TTGGGAGAAG AAGCAGAGAA GAAGAACATG AAAGTAGATC TGGGAGTGAT

3 01 AATATGGATG GTGGTTCCGG TGATGATCAT GACCCCACCA CCGCGGCAGG TGATAAACCG

361 CCGAGGAAAA AGAGA ACCA CCGTCATACA CCTCAACAAA TCCAAGAGCT TGAAGCTCTC

421 TTTAAGGAGT GTCCTCATCC AGA GAAAAA CAGAGATTAG AGCTTAGTAA AAGGCTTTGT

481 TTAGAAACCA GACAAGTTAA GTTTTGGTTC CAAAACAGGC GTACTCAAAT GAAGACACAA

541 TTAGAGCGAC ATGAGAACTC ATTGTTGAGA CAGGAGAATG ATAAGCTTAG AGCTGAAAAC

601 ATGTCTATAA GAGATGCAAT GAGGAATCCT ATATGTACTA ATTGTGGTGG TCCGGCTATT

661 ATTGGTGATA TGTCACTTGA AGAACAACTT CTTAGAATCG AAAATGCTCG TTTAAAAGAT

721 GAAT AGA C GTGTTTGTGC ACTTGCTGGT AAGTTTTTAG GTCGTCCAAT TACAGGACCT

781 CCATTACCAA ACTCAAGTTT AGAGCTTGGT GTTGGCACCA ATGGTACTTT TGGAACCACT

841 ATGGCTACTA CTACAACATT GCCTTTAGGA CATGATGCTT ACCAACAAT GGTTGTTCCT

901 AGTAATAGAC CGGCAACAAC ACTCGATCGA C

将 5'RACE获得的序列 SEQ ID NO: 14，与 3'RACE获得的序列 SEQ ID NO: 9拼接，获得 SEQ ID NO: 15:

1 TTGATGAATT TTGGGGGGTT TATAGATGAT AGTTCTGGTC CTAATGACGG TCTTGGTGGT

61 GCAAGAATAG TTGCAGACGT ACCTTATAAC ACCCCCACCA TGCCTACTGG TGTTTTCTCT

121 CAACCCCGCC TTGTTTCTTC TTCAATTCCT AAGAACATGT TCAACTCACC AGGCCTTTCT

181 CTTGCTCTTC AACCCAATAT AGATAATCAA GGAGATGAGA CTAGATTAGG TGAGAATTTT

241 GAAGGAAGTA TTGGGAGAAG AAGCAGAGAA GAAGAACATG AAAGTAGATC TGGGAGTGAT

3 01 AATATGGATG GTGGTTCCGG TGATGATCAT GACCCCACCA CCGCGGCAGG TGATAAACCG

361 CCGAGGAAAA AGAGATACCA CCGTCATACA CCTCAACAAA TCCAAGAGCT TGAAGCTCTC

421 TTTAAGGAGT GTCCTCATCC AGATGAAAAA CAGAGATTAG AGCTTAGTAA AAGGCTTTGT

481 TTAGAAACCA GACAAGTTAA GTTTTGGTTC CAAAACAGGC GTACTCAAAT GAAGACACAA

541 TTAGAGCGAC ATGAGAACTC ATTGTTGAGA CAGGAGAATG ATAAGCTTAG AGCTGAAAAC

601 ATGTCTATAA GAGATGCAAT GAGGAATCCT ATATGTACTA ATTGTGGTGG TCCGGCTATT

661 ATTGGTGATA TGTCACTTGA AGAACAACTT CTTAGAATCG AAAATGCTCG TTTAAAAGAT

721 GAATTAGATC GTGTTTGTGC ACTTGCTGGT AAGTTTTTAG GTCGTCCAAT TACAGGACCT

781 CCATTACCAA ACTCAAGTTT AGAGCTTGGT GTTGGCACCA ATGGTACTTT TGGAACCACT

841 ATGGCTACTA CTACAACATT GCCTTTAGGA CATGATGCTT TACCAACAAT GGTTGTTCCT

901 AGTAATAGAC CGGCAACAAC ACTCGATCGA TCGATGTTTT TGGAACTTGC TTTGGCTGCC

961 ATGGATGAAC TTGTTAAGAT GGCACAAACT GATGAGCCAT TATGGATTAA GAACATAGAA

1021 GGTGGAAGAG AAATGTTGAA CCATGATGAG TATTTAAGGA CATTTACACC TTGTATTGGT 1081 TTAAAACCAA ATGGTTTTGT CACTGAAGCG TCAAGGGAGA CTGGTGTAGT GATTATCAAC

1141 AGTCTAGCCC TTGTTGAAAC ATTAATGGAC TCGAATCGTT GGGCAGAGAT GTTTCATTGT

12 01 ATGATTGCTA GAACA CAAC AACTGATGTG ATATCTAATG GCATGGGAGG AACCAGAAAT

1261 GGTGCACTTC AACTTATGAA TGCTGAGCTT CAAATCCTTT CACCTTTAGT TCCTGTTCGT

1321 GAAGTAAGTT TCTTAAGGTT CTGTAAACAA CATGCTGAAG GTGTTTGGGC TGTGGTTGAT

1381 GTATCCGTTG ATACTATCAA AGAAAGTACT ACATTTGTTA CCTGTAGGAG ACTTCCTTCT

1441 GGTTGTGTTG TTCAAGA AT GCCTAATGGT TACTCCAAGG TTATATGGGT TGAACATGCT

1501 GAA A GA G AGAGCCAAGT TCATCAACTA TACCGGCCTT TACTAAGTTC CGGCGTGGGC

1561 TTCGGTGCCC AACGGTGGGT GGCGGCCCTT CAACGGCAAT GCGAATGCCT TGCCATACTC

1621 ATGTCCTCCA CCGTTCCCAC TAGAGACCAC ACCGCTATAA CTGCGAGTGG GAGACGGAGC

1681 ATGTTAAAGC TAGCTCAACG GATGACAGAT AACTTCTGTG CCGGGGTTTG TGCATCGACA

1741 GTTCATAAAT GGAACAAGCT TAACGCCGGG AATGTAGACG AAGACGTTAG GGTTATGACT

18 01 AGGAAAAGCA TTGACGACCC CGGCGAACCG CCAGGGATCG TACTAAGCGC CGCCACTTCG

1861 GTTTGGTTGC CGGTGTCACC GCAACGGCTT TTCGATTTCC TACGCGACGA ACGGTTGAGG

1921 AGCGAGTGGG ACATATTGTC AAATGGCGGA CCTATGCAAG AGATGGCACA CATTGCCAAA

1981 GGCCAAGATC ATGGCAATTG CGTTTCCCTC CTGCGTGCCA GTGCCATGAA CGCAAATCAG

2 041 AGCAGCATGC TGATATTGCA GGAAACATGC ATAGACGCAG CAGGGTCGCT TGTAGTGTAC

2101 GCGCCAGTTG ATATTCCAGC CATGCACGTT GTCATGAACG GTGGTGATTC CGCTTACGTC

2161 GCACTTTTAC CTTCGGGATT CGCCATTGTC CCGGACGGTC CTGGGTCTCA TGGACCTATC

2221 TCTAACGGAC ATGTTAACGG AAACACCGGC GGAGGGTCGT CAAGAGTCGG TGGATCGCTT

2281 CTCACGGTAG CTTTTCAAAT ATTGGTAAAC AGTTTACCAA CGGCTAAACT GACCGTCGAA

2341 TCGGTTGAAA CGGTTAATAA TCTGATTTCG TGTACTGTCC AAAAGA CAA AGCTGCCCTT

24 01 TCAATGCGAA AGTTGATGAC TCAGTGAGTT GGGTAATTTT AGTTATTAAT ATAGGTTTTG

2461 GTTGTGGTTA AAGAGTGTGC GACTCAGTAA GTTGGGACGA GTGGGGGTAT TGAGTCAAGA

2521 ACGAACCGCG CGTGGAGAAT CATTGTATGG TGGTGATCAA AGGGACAAGG GTGGTGGTTC

2581 GGGTATTGAC TCAGGTCGAC CCTTTGAGTT GGCTCGCCGG GACCAGAAAA GAAAGTCAAA

2641 ACTCAAACAG CGTCGTATTT GGTGTACTAA TCCAATTTCT CTTTTCCTAG GGATTTAATG

2701 TCAATGAACA TTATTGTATT GAGTTGTCAC TTCTTTTTT TAGGGGTTTG GCTTTTGGAA

2761 ACTTACTAAT TTAATATATT AATTTCACAC TTCAATTTAA AAAAAAAAAA AAAAA 根据 SEQ ID NO: 15序列设计一对引物如下:

GhHDbZIP-lF: SEQ ID NO: 16：

TTGATGAATTTTGGGGGGTT

GhHDbZIP-lR: SEQ ID NO: 17：

CATCAACTTTCGCATTGAAAG 通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17来克隆 GhHDbZIP-1全长编码序列。

采用 stratagene的 PfUUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer, 0.5 μΐ 25 mM 的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95°C预变性 2min， 35个循环（95°C 变性 25 s， 54°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin30s)， 72 °C 延伸 5 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μΐ双蒸水溶解。加入 2.5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 0.5 μΐ 5 mM的 dATP ， 1.0 μΐ Ex Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 2.4 Kbp的 DNA片段回收（Omega 回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上（得到 GhHDbZIP-1-pGEM质粒），然后转化 JM109(方法同上），随机挑取 8个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 16与 SEQ ID NO: 17进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQIDNO: 2，其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQIDNO: 1

HDbZIP-1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 NFGGFIDDS SGPNDGLGGA RIVADVPYNT PT PTGVFSQ PRLVSSSIPK N FNSPGLSL

61 ALQPNIDNQG DETRLGENFE GSIGRRSREE EHESRSGSDN DGGSGDDHD PTTAAGDKPP

121 RKKRYHRHTP QQIQELEALF KECPHPDEKQ RLELSKRLCL ETRQVKFWFQ NRRTQ KTQL

181 ERHENSLLRQ ENDKLRAEN SIRDA RNPI CTNCGGPAII GD SLEEQLL RIENARLKDE

241 LDRVCALAGK FLGRPITGPP LPNSSLELGV GTNGTFGTT ATTTTLPLGH DALPT VVPS

301 NRPATTLDRS FLELALAA DELVK AQTD EPLWIKNIEG GRE LNHDEY LRTFTPCIGL

361 KPNGFVTEAS RETGVVIINS LALVETL DS NRWAE FHC IARTSTTDVI SNG GGTRNG

421 ALQL NAELQ ILSPLVPVRE VSFLRFCKQH AEGVWAVVDV SVDTIKESTT FVTCRRLPSG

481 CVVQD PNGY SKVIWVEHAE YDESQVHQLY RPLLSSGVGF GAQRWVAALQ RQCECLAIL

541 SSTVPTRDHT AITASGRRS LKLAQR TDN FCAGVCASTV HKWNKLNAGN VDEDVRV TR

601 KSIDDPGEPP GIVLSAATSV WLPVSPQRLF DFLRDERLRS EWDILSNGGP QE AHIAKG

661 QDHGNCVSLL RASA NANQS S LILQETCI DAAGSLVVYA PVDIPA HVV NGGDSAYVA

721 LLPSGFAIVP DGPRSHGPIS NGHVNGNTGG GSSSVGGSLL TVAFQILVNS LPTAKLTVES

781 VETVNNLISC TVQKIKAALQ CES*

GhHDbZIP-1编码基因的核苷酸序列： SEQIDNO: 2

1 ATGAATTTTG GGGGGTTTAT AGATGATAGT TCTGGTCCTA ATGACGGTCT TGGTGGTGCA

61 AGAATAGTTG CAGACGTACC TTATAACACC CCCACCATGC CTACTGGTGT TTTCTCTCAA

121 CCCCGCCTTG TTCTTCTTC AATTCCTAAG AACATGTTCA ACTCACCAGG CCTTTCTCTT

181 GCTCTTCAAC CCAA A AGA TAATCAAGGA GATGAGACTA GATTAGGTGA GAATTTTGAA 241 GGAAGTATTG GGAGAAGAAG CAGAGAAGAA GAACATGAAA GTAGATCTGG GAGTGATAAT

3 01 ATGGATGGTG GTTCCGGTGA TGATCATGAC CCCACCACCG CGGCAGGTGA TAAACCGCCG

361 AGGAAAAAGA GATACCACCG TCATACACCT CAACAAATCC AAGAGCTTGA AGCTCTCTTT

421 AAGGAGTGTC CTCATCCAGA TGAAAAACAG AGATTAGAGC TTAGTAAAAG GCTTTGTTTA

481 GAAACCAGAC AAGTTAAGTT TTGGTTCCAA AACAGGCGTA CTCAAATGAA GACACAATTA

541 GAGCGACATG AGAACTCATT GTTGAGACAG GAGAA GA A AGCTTAGAGC TGAAAACATG

601 TCTATAAGAG ATGCAATGAG GAATCC A A TGTACTAATT GTGGTGGTCC GGCTATTATT

661 GGTGATATGT CACTTGAAGA ACAACTTCTT AGAATCGAAA ATGCTCGTTT AAAAGA GAA

721 TTAGATCGTG TTTGTGCACT TGCTGGTAAG TTTTTAGGTC GTCCAATTAC AGGACCTCCA

781 TTACCAAACT CAAGTTTAGA GCTTGGTGTT GGCACCAATG GTACTTTTGG AACCACTATG

841 GCTACTACTA CAACATTGCC TTTAGGACAT GATGCTTTAC CAACAATGGT TGTTCCTAGT

901 AATAGACCGG CAACAACACT CGATCGATCG ATGTTTTTGG AACTTGCTTT GGCTGCCATG

961 GATGAACTTG TTAAGATGGC ACAAACTGAT GAGCCATTAT GGATTAAGAA CATAGAAGGT

1021 GGAAGAGAAA TGTTGAACCA TGATGAGTAT TTAAGGACAT TTACACCTTG TATTGGTTTA

1081 AAACCAAATG GTTTTGTCAC TGAAGCGTCA AGGGAGACTG GTGTAGTGAT TA CAACAGT

1141 CTAGCCCTTG TTGAAACATT AATGGACTCG AATCGTTGGG CAGAGATGTT TCATTGTATG

12 01 ATTGC AGAA CATCAACAAC TGATGTGATA TCTAATGGCA TGGGAGGAAC CAGAAATGGT

1261 GCACTTCAAC A GAATGC TGAGCTTCAA ATCCTTTCAC CTTTAGTTCC TGTTCGTGAA

1321 GTAAGTTTCT TAAGGTTCTG TAAACAACAT GCTGAAGGTG TTTGGGCTGT GGTTGATGTA

1381 TCCGTTGATA C A CAAAGA AAGTACTACA TTTGTTACCT GTAGGAGACT TCCTTCTGGT

1441 TGTGTTGTTC AAGATATGCC TAATGGTTAC TCCAAGGTTA TATGGGTTGA ACATGCTGAA

1501 TATGATGAGA GCCAAGTTCA TCAACTATAC CGGCCTTTAC TAAGTTCCGG CGTGGGCTTC

1561 GGTGCCCAAC GGTGGGTGGC GGCCCTTCAA CGGCAATGCG AATGCCTTGC CATACTCATG

1621 TCCTCCACCG TTCCCACTAG AGACCACACC GCTATAACTG CGAGTGGGAG ACGGAGCATG

1681 TTAAAGC AG CTCAACGGAT GACAGATAAC TTCTGTGCCG GGGTTTGTGC ATCGACAGTT

1741 CATAAATGGA ACAAGCTTAA CGCCGGGAAT GTAGACGAAG ACGTTAGGGT TATGACTAGG

18 01 AAAAGCA G ACGACCCCGG CGAACCGCCA GGGATCGTAC TAAGCGCCGC CACTTCGGTT

1861 TGGTTGCCGG TGTCACCGCA ACGGCTTTTC GATTTCCTAC GCGACGAACG GTTGAGGAGC

1921 GAGTGGGACA TATTGTCAAA TGGCGGACCT A GCAAGAGA TGGCACACAT TGCCAAAGGC

1981 CAAGATCATG GCAATTGCGT TTCCCTCCTG CGTGCCAGTG CCATGAACGC AAATCAGAGC

2 041 AGCATGTTGA TATTGCAGGA AACATGCATA GACGCAGCAG GGTCGCTTGT AGTGTACGCG

2101 CCAGTTGATA TTCCAGCCAT GCACGTTGTC ATGAACGGTG GTGATTCCGC TTACGTCGCA

2161 CTTTTACCTT CGGGATTCGC CATTGTCCCG GACGGTCCTA GGTCTCATGG ACCTATCTCT

2221 AACGGACATG TTAACGGAAA CACCGGCGGA GGGTCGTCGA GTGTCGGTGG ATCGCTTCTC

2281 ACGGTAGCTT TTCAAA A GGTAAACAGT TTACCAACGG CTAAACTGAC CGTCGAATCG

2341 GTTGAAACGG TTAATAATCT GATTTCGTGT ACTGTCCAAA AGATCAAAGC TGCCCTTCAA

24 01 TGCGAAAGTT GA 实施例 3 GhHDbZIP-1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的 35S启动子及终止子 Tnos分别作为 GhHDbZIP-1基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ ρΒΙ121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID ΝΟ: 18禾 Ρ SEQ ID NO: 19各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。 SEQ ID NO : 18 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO : 19：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 20禾 P SEQ ID NO: 21以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 20禾 P SEQ ID NO: 21各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 (94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 Sacl、 EcoRI 酶切后将所得 PCR 产物连接到 pCAMBIA2300-lCpromega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO : 20：

AAGdCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO : 21：

CAGAA rrCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 22和 SEQ ID NO: 23以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增拟南芥 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP， 1.0 μΐ 稀释 50 倍的 pCAMBIA2300 质粒， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO :22禾 P SEQ ID NO :23各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94°C 变性 30 s， 50°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s；)， 72 °C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切后将所得 PCR产物连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO : 22：

ACTA^CHATGGTGGAGCACGACACTCT

SEQ ID NO : 23：

TGA d AGAGATAGATTTGTAGAGAGAGAC

SEQ ID NO: 24和 SEQ ID NO: 25扩增 GhHDbZIP-1 (模板是实施例 2所获得的阳性 GhHDbZIP-1-pGEM质粒），采用 stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer, 0.5μ1 25 mM的 dNTP, 2.0 μΐ GhHDbZIP-l-pGEM质粒， 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO :24禾 P SEQ ID NO: 25各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 95 °C预变性 2 min， 35个循环 (95 °C 变性 25 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin30s), 72 °C 延伸 5 min。通过 BamHI、 Sacl酶切后将所得 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 35S-GhHDbZIP-l-2300。 SEQ ID NO : 24：

GAGGA ΓίΤ TTGATGAATTTTGGGGGGTT

SEQ ID NO : 25：

AAGdCTCCATCAACTTTCGCATTGAAAG 实施例 4 35S-GhHDbZIP-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc) 感受态细胞的制备：提前 1-2天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 1^含50 4_§/1^利福平和50 4_§/1^链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD_6QQ值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h至 OD₆。。=0.8。冰浴菌液 10 min，每隔 3 min摇匀一次，使细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min，弃上清液；加入一定量冰预冷的 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min，收集沉淀；用冰预冷的 10%甘油重复洗 3-4次；加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀，以 40 μΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3 中所得的阳性 35S-GhHDbZIP-l-2300质粒，混匀后冰浴约 10 min。将所述感受态细胞和质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用移液枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。取 100— 200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 μ_§/ιη1链霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70 °C保存备用。实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥

待转化植株培养：拟南芥种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）播种在泥炭土中，经 4°C低温处理 3天后，置于 23 °C、 16h光照 /8h黑暗的培养箱中发芽。 7— 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 ) 的口径为 7.5 cm的塑料钵中，每钵栽种 6株，置于 23 °C， 16h光照 /8h黑暗的培养箱中生长。移栽前每钵浇营养液 40 ml，移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。按需要每 3-4周一次（或者时间更长）。为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。当大多数花序约 l_10 cm高（剪去第一个花序后 4_8 d) 时准备浸染。

农杆菌的培养：取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中（含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素和 100 mg/ L卡那霉素）， 28 °C恒温下 250 r/ min振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1%— 2%的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB 液体培养基中， 28 °C恒温振摇使农杆菌的浓度达到 OD_6QQ=1.8，然后在 4 °C下 3000 r/min离心 15 min, 弃去上清液后用浸染培养基（该浸染培养基含有 5.0%的蔗糖和 0.05% (500 μΙΤί) 的 Silwet L-77) 重新悬浮农杆菌，悬浮至 OD_6QQ约 0.80。

花序的浸染：将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中，每个口径 9 cm的容器中加入 200— 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。将植株倒置，使地上组织全部浸没在农杆菌悬浮液中 3— 5 s, 并要轻轻搅动。浸润后植株上应该有一层液体膜。浸染过的植株放在塑料盘中，用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿，然后放置在弱光或暗处过夜，注意小心防止阳光直射植株。处理后约 12— 24 h去掉覆盖。正常培养植株，植株进一步生长 3— 5周，直至角果变褐变干。收获种子，并将种子用离心管在 4 °C下干燥贮存。

转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素的水溶液,加入 0.8 % 琼脂粉,用微波炉加热至琼脂完全溶化,待冷却到 50°C 左右,加入所需量的终浓度为 50 mg ¹ 的卡那霉素,摇匀后每培养皿中倒入 25 mL ,置实验台冷却凝固后即可播种。把称量好的种子倒在一张普通复印纸上,用手指轻敲复印纸,将种子均匀地播种在琼脂胶上,盖上培养皿盖，置 4 °C 冰箱冷处理 72 h后,移至 23 °C、 16h光照 /8h黑暗的培养箱中发芽,定期统计种子发芽和幼苗生长情况,将抗性幼苗及时移栽到营养土中。移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌营养液。取生长 20天的拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA，用 SEQ ID NO: 16：和 SEQ ID NO: 17扩增 GhHDbZIP-1 ： ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s, 54°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min)，将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号（T1D1-T1D16), 并保存。实施例 6 过表达 GhHDbZIP-1的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1D1-T1D6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石上，每盆播种 10颗种子， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS, 培养 20天之后，每盆保留大小较一致的 4棵苗，用于干旱实验。转基因拟南芥、对照拟南芥干旱 14天 (不浇水)， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株（T0 代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5、 T1D6 六个株系共 24 (每株系各 4棵）拟南芥中 21能够存活并继续生长显现出明显的耐旱性（参见图 3a和 3b，以 T1D2、 T1D6为例， T1D1、 T1D3、 T1D4、 T1D5的结果与 T1D2、 T1D6 类似，在此未示出）。实施例 7 干旱胁迫后 ABA变化的测定

ABA是公认的与逆境胁迫相关的一种植物激素,可以作为信号分子调控多个逆境诱导基因的表达,从而提高植物的抗逆能力。我们取干旱胁迫 10天和正常生长条件下的转基因植株（T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5、 T1D6)及对照植株（CK1、 CK2) 叶片各 0.2 g左右，用中国农业大学作物化控研究中心制备的试剂盒测定 ABA含量（见图 4)。实验结果表明，无论干旱处理还是对照条件下，转基因植株的 ABA含量均高于对照（CK1、 CK2), 证明 GhHDbZIP-1基因可以正调控植物内源的 ABA含量。实施例 8 在转录水平上验证 GhHDbZIP蛋白表达

分别取对照拟南芥植株、耐旱转基因拟南芥 T1 代植株（分别属于 T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5、 T1D6六个株系）、和不耐旱转基因拟南芥 Tl代植株的干旱 10天的叶片各 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen) 提取的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA 浓度。依照 invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（2 μ_β总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 7)。通过 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17扩增 GhHDbZIP, 检测 HDbZIP蛋白相对表达情况。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1，以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 29个循环（ 94°C 变性 30 s， 54 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 2min) ， 72 °C 延伸 10 min。

产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL5000, TakaRa) ， 1-5 为耐旱转基因拟南芥 Tl代植株（依次为： T1D1、 T1D2、 T1D3、 T1D4、 T1D5 ) ， 6-8 为非转基因拟南芥对照， 9-1 1为不耐旱转基因拟南芥 T1代植株。图中所示 PCR产物电泳条带大小与 GhHDbZIP-1的大小一致（约 2.4 Kbp ) 。结果表明，对照拟南芥没有 GhHDbZIP-1转录，耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 GhHDbZIP-1的转录较强，不耐旱转基因拟南芥 T1代植株没有转录或转录很弱。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个同源异型-亮氨酸拉链蛋白的编码基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。
2. 一种重组表达载体，其含有权利要求 1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
3. 权利要求 2所述的载体，其为附图 2所示的 35S-GhHDbZIP-l-2300载体。
4. 一种重组细胞，其含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5. 一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求 1所述的基因或者权利要求 2 或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
6. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物组织。
7. 权利要求 6所述的方法，其中所述植物是拟南芥。
8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利要求 4 所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。
9. 权利要求 8所述的用途，其中所述植物是拟南芥。
10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。